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Departamento de Inmunología, Inmunologia, Mikrobiologia
Microbiología y Parasitología eta Parasitologia Saila
Facultad de Farmacia Farmazi Fakultatea
Obtención y caracterización de antígenos de Toxocara canis que intervienen en reacciones de
hipersensibilidad mediada por IgE en el hospedador definitivo y en el hombre
TESIS DOCTORAL
María García Ricobaraza
Vitoria-Gasteiz, 2010
Departamento de Inmunología, Inmunologia, Mikrobiologia
Microbiología y Parasitología eta Parasitologia Saila
Facultad de Farmacia Farmazi Fakultatea
TESIS DOCTORAL
Obtención y caracterización de antígenos de Toxocara canis que intervienen en reacciones de
hipersensibilidad mediada por IgE en el hospedador definitivo y en el hombre
Memoria presentada por:
Dña. María García Ricobaraza
para optar al grado de Doctor
Vitoria-Gasteiz, 2010
La presente Tesis Doctoral ha sido financiada mediante un Proyecto
Universidad-Empresa de la U.P.V./E.H.U. con PHADIA Spain, S.L. Para
el desarrollo de este trabajo se disfrutó de un Beca para la Formación de
Investigadores, modalidad predoctoral (AE), del Departamento de
Educación, Universidades e Investigación del Gobierno Vasco.
Quisiera aprovechar esta oportunidad para agradecer a todas las
personas que me han ayudado a llegar hasta aquí y que de alguna manera u
otra han contribuido a la elaboración de esta Tesis Doctoral:
Al Dr. Ramón Cisterna Cáncer, por haberme permitido formar parte del
Departamento que dirige.
Al Dr. Jorge Guisantes del Barco, por la dirección de esta Tesis Doctoral y la
confianza que ha depositado en mí a lo largo de estos años y su dedicación en
la elaboración de esta Tesis Doctoral.
A la Dra. Idoia Postigo Resa, por la dirección de esta Tesis Doctoral, por su
paciencia para enseñarme y por su ayuda que siempre la he tenido cuando la
he necesitado.
Al Dr. Jorge Martínez Quesada, por su asesoramiento científico, dedicación y
por hacerme entender de una forma sencilla cosas que para mí resultaban
complicadas.
A la Dra. Ester Suñén Pardo por su ayuda y colaboración desinteresada.
A Mariángel Lozoya Nieto por su ayuda inestimable a lo largo de estos años
en todos los trámites administrativos.
Al Dr. Guillermo Alberto Cardona Valencia por su buen humor, la alegría de
todos los días y su amistad.
A Toño, por realizar este camino juntos, por sus valores, su amistad y sus
chistes malos.
A “Lost” del labo, Irati, Ilargi, Ceci, Andrea “Kate”, Raúl. Quisiera daros las
gracias de verdad porque seguro que sin vuestro apoyo en los altibajos,
ánimos y consejos no estaría aquí.
A Eva por ser mi constante, siempre, en los buenos momentos y en los no tan
buenos.
A Esther, por su amistad y su apoyo tan necesario estos últimos años.
A Neka, Pilo, Helen, May, Crisan y Charo por haberme dado su amistad
cuando más lo necesitaba.
A Bless, Lina y Barredo, porque siempre están conmigo a pesar de que
estemos lejos.
A Laura, Álvaro y Ami, por formar parte de mi vida.
A mamá, por su apoyo en todo, sus consejos que siempre me los ha dado
desde el amor incondicional y porque estoy segura de que esta Tesis es una
pequeña recompensa a su sufrimiento.
A papá, por quererme como soy, sus consejos con voz “fuerte” y por su amor
siempre desinteresado.
A Nacho, por haber llegado a mi vida en el momento perfecto.
A mi madre, María Soledad
A b r e v i a t u r a s
1
1D: electroforesis unidimensional ABA-1: grupo de proteínas alergénicas de nematodo de Ascaris suum Abs: absorbancia 2D: electroforesis bidimensional ADN: ácido desoxirribonucleico ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario APS: persulfato amónico ARN: ácido ribonucleico ARNm: ácido ribonucleico mensajero ATP: adenosina-5´-trifosfato BSA: seroalbúmina bovina CHAPS: 3-[(3-colaminidopropil)-dimetilamonio-propanosulfato dNTPs: desoxinucleótidos trifosfato DEPC: dietilpirocarbonato DO600: densidad óptica (600nm) DTT: ditiotreitol EDTA: ácido etilendiaminotetracético EIA: enzimoinmunoensayo (Enzyme Immuno Assay) ELISA: enzimoinmunoensayo en placa de poliestireno (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) E-SL2: extracto de los productos de excreción-secreción de las larvas infectantes L2 de T. canis IAA: iodoacetamida IEF: isoelectroenfoque Kb: kilobases kV: kilovoltios
A b r e v i a t u r a s
2
L2: segundo estadio larvario infectante de T. canis LMO: Síndrome de Larva Migrans Ocular LMV: Síndrome de Larva Migrans Visceral MALDI: matrix-assisted laser desorption/ionization MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight MS: espectrometría de masas pb: pares de bases PBS: tampón salino fosfato PBS-T: tampón PBS-Tween 20 PCR: Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa PMSF: fenilmetilsulfonil fluoruro PVDF: fluoruro de ponivinilideno SDS: Dodecil Sulfato de Sodio SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de Dodecil Sulfato de Sodio TBA-1: grupo de proteínas alergénicas de nematodo de Toxocara canis TBE: tampón Tris-Borato-EDTA TE: tampón Tris-EDTA Temed: tetrilmetilendiamina TGF-β: Transforming Growth Factor Beta Treg: células T reguladoras Vh: voltios-hora X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
ÍNDICE
ÍNDICE
4
Abreviaturas…..………………………………………………….……….1
Índice…………………………………………………………….……….3
Índice de figuras……………………………………………………………………….9
Índice de tablas………………………………………………………………..……...12
Introducción…………………………………………………………......14
Objetivos…………………………………………………………...…....36
Materiales y Métodos………………………………………………..…...39
1. Obtención del material parasitario…………………………………………………40
1.1. Sacrificio y necropsia de los perros……………………………………………….40
1.2. Obtención de los sueros caninos………………………………………………....41
1.3. Examen parasitológico del intestino delgado……………………………………..41
1.4. Obtención de larvas infectantes (L2) de Toxocara canis mediante cultivo in
Vitro………………………………………………………………………………….42
1.5. Obtención de los productos de excreción-secreción de las larvas L2 de Toxocara
canis…………………………………………………………………………………...44
2. Caracterización Bioquímica del E-SL2 de Toxocara canis……………………………47
2.1. Determinación del contenido proteico…………………………………………...47
2.2. Análisis del perfil proteico mediante electroforesis unidimensional…...……....…..49
2.2.1. Preparación de los geles y electroforesis………………………………………..50
2.2.2. Visualización del perfil proteico del E-SL2 mediante tinción Azul de
Coomassie………………………………………………………………………...….51
2.3. Análisis del perfil proteico mediante electroforesis bidimensional…………….….52
ÍNDICE
5
2.3.1. Primera dimensión: Isoelectroenfoque…………………………...…….……….53
2.3.1.1. Equilibrado………………………………………………………….………..53
2.3.2. Segunda dimensión…………………………………………………..…………54
2.3.3. Visualización del perfil proteico del E-SL2 mediante tinción Azul de
Coomassie………………………………………………………………….……........55
2.3.4. Visualización del perfil proteico mediante tinción con plata……………………55
3. Caracterización Inmunoquímica…………………………………………….….…..56
3.1 Selección de sueros……………………………………………………….………56
3.1.1. Sueros caninos…………………………………………………………………56
3.1.2. Sueros humanos………………………………………………………………..56
3.2. Electrotransferencia de proteínas del E-SL2 a membranas
inmovilizantes……………………………………………………………………..….57
3.3. Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE………………………………….58
3.3.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgE canina…...…………58
3.3.1.1. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis
unidimensional…………………………………………………………………….…58
3.3.1.2. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis
bidimensional…………………………………………………………………...…….59
3.3.2. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgE humana……….……61
3.3.2.1. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis
unidimensional……………………………………………………………………….61
3.3.2.2. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis
bidimensional………………………………………………………………………....62
ÍNDICE
6
3.4. Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgG………………………………….63
3.4.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgG canina separadas
mediante electroforesis unidimensional………………………………………………63
3.4.2. Determinación de IgG específica humana frente al E-SL2 de Toxocara canis…….64
4. Evaluación de la reactividad cruzada entre Anisakis simplex y Toxocara
canis…………………………………………………………………….……………..65
4.1. Marcado del E-SL2 con biotina……………………………………………….….66
4.2. Fluoroenzimoinnmunoensayo (FEIA)..…………………………………………..67
5. Análisis de la huella peptídica mediante secuenciación……………………………..68
6. Obtención del gen que codifica para TES-32………………………………………69
6.1. Extraccción de ARN total………………………………………………………..69
6.1.1. Preparación de la muestra………………………………………………….…...70
6.1.2. Extracción………………………………………………………………...…....70
6.2. Extraccción de ARN mensajero…………………………………………….……71
6.3. Síntesis del ADN complementario (ADNc)……………………………...……….74
6.4. Amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa del fragmento de ADN
correspondiente al gen TES-32………………………………………………….……75
6.4.1. Electroforesis en gel de agarosa…………………………………………….…..76
6.4.2. Purificación del fragmento amplificado………………………………………....78
6.5. Clonación del gen TES-32 en el vector pCR2.1…………………………………..79
6.6. Identificación de colonias recombinantes…………………..……………….….....82
6.6.1. Análisis mediante PCR…………………………………………………………82
6.6.2. Análisis mediante enzimas de restricción……………………………………….83
ÍNDICE
7
6.7. Secuenciación…………………………………………………………………….84
6.8. Almacenamiento de los clones…………………………………………………....86
Resultados……………………………………………………………….87
1. Obtención de larvas infectantes (L2) de Toxocara canis mediante cultivo in vitro…......88
2. Caracterización bioquímica del E-SL2……………………………………………...90
2.1. Análisis del perfil proteico del E-SL2 mediante electroforesis unidimensional
(1D)…………………………………………………………………………………..90
2.2. Análisis del perfil proteico mediante electroforesis bidimensional (2D)…………..92
3. Caracterización Inmunoquímica…………………………………………………....94
3.1. Resultados obtenidos en sueros caninos………………………………………….94
3.1.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgE…………….……….94
3.1.1.1. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis unidimensional
(1D-Inmunodetección)……………………………………………………….94
3.1.1.2. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis bidimensional
(2D-Inmunodetección)……………………………………………………….96
3.1.2. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgG………..………….100
3.1.2.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgG separadas mediante
electroforesis unidimensional (1D-Inmunodetección)………………....……..100
3.2. Resultados obtenidos en sueros humanos…………………………………….....103
3.2.1. Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE…………………….…………103
3.2.1.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 separadas mediante electroforesis
unidimensional (1D-Inmunodetección)………………………………...…....103
ÍNDICE
8
3.2.1.2. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis bidimensional
(2D-Inmunodetección)………………………………………………....……104
3.2.2. Medida y evaluación de proteínas fijadoras de IgG……………………...……..108
3.2.2.1. Determinación de IgG específica humana frente al E-SL2 de Toxocara canis....108
4. Evaluación de la reactividad cruzada entre Anisakis simplex y Toxocara canis……..…110
5. Obtención del gen que codifica para TES-32…………………………………..…110
5.1. Extracción de ARN total y Síntesis de ADNc………………………………...…110
5.2. Amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa del fragmento de
ADN correspondiente al gen TES-32…………………………………...…...111
5.3. Clonación en el vector pCR2.1………………………………………………….111
5.4. Identificación de colonias recombinantes……………………………………….112
5.4.1. Análisis mediante PCR………………………………………………………...112
5.4.2. Comprobación por análisis mediante enzimas de restricción……………….….113
5.5. Secuenciación…………………………………………………………………...115
Discusión………………………………………………………………123
Conclusiones……………………………………………………...……149
Bibliografía……………………………………………………………..152
Anexo 1: medios de cultivo y tampones……………………………………………..169
Í N D I C E D E F I G U R A S
9
Figura 1. Adultos Toxocara canis……………………………………………………....15
Figura 2. Cavidad oral de T. canis (izquierda) y morfología de las aletas cervicales
(derecha)……………………………………………………………………………...16
Figura 3. Huevo embrionado de T. canis……………………………………………..17
Figura 4. Larva L2 de T. canis………………………………………...……………...17
Figura 5. Anatomía de la larva infectante de T. canis…………………………………18
Figura 6. Esquema del ciclo biológico de T. canis en el hospedador
definitivo………………………………………………………………….………….20
Figura 7. Esquema del ciclo biológico de T. canis en el hospedador
aberrante…………………………………………………………………………......23
Figura 8. Proceso de recogida del E-SL2 y mantenimiento del
cultivo………………………………………………………………………...……...46
Figura 9. Proceso de eclosión de huevos de T. canis…………….……………………89
Figura 10. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis en gel de poliacrilamida al 12,5%. M:
marcador; E: extracto de los productos de excreción-secreción de larvas L2 de T.
canis…………………………………………………………………………………..90
Figura 11. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis mediante 2D y teñido con azul de
Coomassie. M: marcador; pI: punto isoeléctrico.……………………………...……...92
Figura 12. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis mediante 2D y teñido con tinción de
plata. M: marcador; pI: punto isoeléctrico…………………………………………… 92
Figura 13. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del extracto E-SL2 de
T.canis. M: marcador; Calles 1-20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis; Calles
21-25: sueros de perros sanos y libres de helmintos…………………………………..94
Í N D I C E D E F I G U R A S
10
Figura 14. 2D-Inmunodetección de alérgenos del extracto E-SL2 de T.canis utilizando la
mezcla de los 20 sueros de perros con toxocarosis…………………………………..96
Figura 15. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente al
alérgeno identificado como TES-32………………………………………………...98
Figura 16. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente al
alérgeno identificado como TES-70.........................................................................99
Figura 17. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgG del extracto E-SL2 de
T.canis. M: marcador; Calles 1-20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis y
confirmados por necropsia; Calles 21-25: sueros de perros sanos libres de
helmintos…………………………………………………………………………....100
Figura 18. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del extracto E-SL2 de
T.canis. M: marcador; Calles 1-11: sueros de pacientes con toxocarosis Calle 12: mezcla
de sueros negativos………………………………………………………………….103
Figura 19. 2D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del extracto E-SL2 de
T.canis……………..………………………………………………………...………104
Figura 20. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI de la lectina tipo C TES-
32………………………………………………………………………….………..106
Figura 21. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI de la lectina tipo C TES-
70..........................................................................................................................107
Figura 22. Visualización en gel de agarosa al 1% del fragmento amplificado. M:
marcador HyperLadder IV; Calle 1: ADN T. canis; Calle 2: control reacción; Calle 3:
control negativo……………………………………………………………………..111
Í N D I C E D E F I G U R A S
11
Figura 23. Comprobación mediante PCR de la ligación del inserto al vector pCR 2.1 en
gel de agarosa al 1%. M1: marcador HyperLadder I; M2: marcador HyperLadder IV; Calle
1-8: ADN plasmídico de 8 colonias recombinantes elegidas al azar; Calle 9: control de
reacción; Calle 10: control negativo…………………………………………………112
Figura 24. Comprobación de la inserción del gen TES-32 en el vector pCR 2.1
mediante digestión con enzima de restricción EcoR I en gel de agarosa al 0,8%. M1:
marcador HyperLadder I; M2: marcador HyperLadder IV; Calle 1-8:ADN plasmídico de 8
colonias recombinantes elegidas al azar..……….……………………………………114
Figura 25. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AF041023.1……..116
Figura 26. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AB009305.2….….118
Figura 27. Árbol de distancias evolutivas de la secuencia TES-32 clonada en nuestro
laboratorio con las secuencias de la lectinas tipo C Tc-ctl-4 y la secuencia
Smp_scaff016249…………………………………………………………......…….120
Figura 28. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AF126830.1……..121
Figura 29. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia
FN373540.1………………………………………………………………………....121
Í N D I C E D E T A B L A S
12
Tabla 1. Relación de proteínas antigénicas nativas y recombinantes utilizadas para el
diagnóstico de la toxocarosis humana………………………………………………...28
Tabla 2. Alérgenos de nematodos incluidos en la nomenclatura oficial de alérgenos....28
Tabla 3. Pesos moleculares de las proteínas fijadoras de IgE del extracto E-SL2. S1-
S20: sueros caninos parasitados sólo por T. canis……………………………………...95
Tabla 4. Resultados del análisis de huella peptídica y búsqueda en la base de datos
MASCOT de los componentes 1 y 2……………………………………………...….97
Tabla 5. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-32)………..…..98
Tabla 6. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-70)………...….99
Tabla 7. Masas moleculares del perfil antigénico de las proteínas fijadoras de IgG del
extracto E-SL2. S1-S20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis y confirmados
por necropsia………………………………………………………………...…..….101
Tabla 8. Resultados del análisis de huella peptídica y búsqueda en la base de datos
MASCOT de los dos grupos de alérgenos identificados…………………………..…105
Tabla 9.Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-32)…………...106
Tabla 10. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-70)………….107
Tabla 11. Características demográficas y clínicas de la población con anticuerpos frente
al E-SL2 de T. canis……………………………...……………………………..…....108
Tabla 12. Valores de IgE específica obtenidos mediante FEIA con un pool de 11
sueros de pacientes diagnosticados de toxocariosis…………………………………..110
Tabla 13. Resultado de la búsqueda en la base de datos BLAST…………………….115
Tabla 14. Resultado del alineamiento de secuencias de diferentes helmintos que
presentaban alguna similitud con nuestra secuencia del TES-32………….………….119
Í N D I C E D E T A B L A S
13
Tabla 15. Subfamilias de lectinas alergénicas………………………………………..146
INTRODUCCIÓN
I N T R O D U C C I Ó N
15
Toxocara canis es un nematodo parásito de cánidos y félidos que puede
infectar a un amplio rango de mamíferos incluido el hombre (Glickman y
Schantz, 1981; Lewis y Maizels, 1993). Según la clasificación de Adamson
(1987) Toxocara canis es un helminto rhabditoide perteneciente a la familia de
los ascáridos. Dentro de la familia Ascarididae conforma un único género, el
género Toxocara.
Aunque han sido descritas once especies de Toxocara (Warren, 1970) sólo
dos, T. canis (Werner, 1782) y T. cati (Schrank, 1788) son reconocidas como
agentes causantes de
enfermedad en el hombre
(Nagakura y col., 1990). Los
adultos del género Toxocara
parasitan la parte superior del
tracto intestinal de sus
hospedadores definitivos. Son
relativamente grandes, de
color blanquecino y con una
cutícula que posee finas
estriaciones transversales
(Figura 1).
Figura 1. Adultos Toxocara canis
http://cal.vet.upenn.edu/projects/merialsp/nems_msp/nm_1sp.htm
I N T R O D U C C I Ó N
16
Las hembras de T. canis tienen una longitud entre 6 a 18 cm y los machos
miden entre 4 y 10 cm. En la parte anterior destaca la cavidad oral formada
por tres labios (Figura 2) sin interlabios. Lateralmente se perciben dos aletas
cervicales que miden 2,5 x 0,2 mm con forma de punta de lanza, importante
para la identificación taxonómica y diferenciación con otras especies y
géneros. Poseen un ventrículo posterior en la base del esófago y carecen de
ciegos intestinales. El extremo posterior es romo en las hembras y digitiforme
en los machos, con dos espículas desarrolladas.
Figura 2. Cavidad oral de T. canis (izquierda) y morfología de las aletas cervicales (derecha)
http://www.asthrografic.com http://stopwormsdead.co.uk
I N T R O D U C C I Ó N
17
Los huevos de T. canis (Figura 3) son
subesféricos, oscuros, de color marrón, de
superficie irregular y de un tamaño entre
75-90 µm. Se distingue una membrana
externa gruesa y rugosa y una membrana
interna lisa, no siempre visible. En el
interior, se aprecia que el embrión ocupa
casi la totalidad del espacio interno. Estos
huevos son eliminados junto con las heces del hospedador definitivo al medio
externo, donde embrionan y pueden permanecer viables hasta más de un año
(Glickman y Shantz, 1981).
Al igual que otros nematodos, T.
canis atraviesa diferentes estadios de
desarrollo desde huevo hasta adulto,
pasando por 4 estadios larvarios (L1,
L2, L3, L4). La fase infectante de este
nematodo es el segundo estadio larvario
o L2 (Figura 4) que permanece dentro del huevo, después de la primera muda,
hasta su ingestión por un futuro hospedador. La eclosión de la L2 se produce
Figura 3. Huevo embrionado de T. canis
http://helios.bto.ed.ac.uk
Figura 4. Larva L2 de T. canis
http://helios.bto.ed.ac.uk
I N T R O D U C C I Ó N
18
en el estómago del hospedador definitivo debido a la acción química de los
jugos gástricos.
Las larvas L2, ya eclosionadas, miden 400 µm de largo por 20 µm de
ancho. Desde el punto de vista morfológico, es de destacar su sistema
secretor. Se trata de un sistema compuesto por dos columnas laterales que
convergen y se abren en la superficie anterior de la larva, a través de un único
conducto de secreción (Figura 5). En la región anterior de la larva, el esófago
está bien definido y está adherido a una larga glándula esofágica dorsal. En la
zona posterior, el vestigio del tracto intestinal es no funcional y está cerrado.
Figura 5. Anatomía de la larva infectante de T. canis
Page y col. (1992)
I N T R O D U C C I Ó N
19
En el interior del conducto de secreción existen unos canalículos
centrales que se desarrollan a las 24 horas de la eclosión, al tiempo en que el
antígeno excretor-secretor del segundo estadio larvario (E-SL2) se expresa por
primera vez (Maizels y col., 1987; Kennedy y col., 1987).
Estudios de inmunofluorescencia realizados con anticuerpos anti-T. canis
(Hogarth-Scott, 1966) han confirmado que las zonas de mayor expresión de
este antígeno son las columnas celulares de secreción así como el orificio
bucal y el poro secretor.
El ciclo biológico de este parásito en el hospedador definitivo (Figura 6),
se inicia cuando las hembras fecundadas de T. canis depositan huevos sin
segmentar en el intestino delgado del perro y éstos son eliminados con las
heces al medio externo. Bajo condiciones óptimas de humedad, temperatura y
tensión de oxígeno, los huevos embrionan llegando en 2-5 semanas al estadio
de larva infectante (L2) pudiendo permanecer viables hasta ser ingeridos por
un futuro hospedador (Glickman y Shantz, 1981).
Una vez ingeridos los huevos embrionados pasan al estómago, donde la
cubierta externa se rompe debido a la acción de los ácidos gástricos. Las larvas
infectantes eclosionan penetrando en la mucosa intestinal y pasan a la
circulación sanguínea para iniciar una larga migración intraorgánica. A las 24-
48 horas llegan al hígado por vía portal, continúan hacia los pulmones
I N T R O D U C C I Ó N
20
pasando por las venas hepática y cava posterior hasta llegar a la cavidad
derecha del corazón y la arteria pulmonar. Durante esta migración, algunas
larvas quedan retenidas en los tejidos a causa de reacciones inflamatorias
tisulares.
Figura 6. Esquema del ciclo biológico de T. canis en el hospedador definitivo
http://www.balgownievet.com
Tras llegar a los pulmones, pueden seguir dos rutas de migración en
función de la edad del perro parasitado. En cachorros menores de seis
semanas se produce una migración traqueodigestiva. Las L2 atraviesan los
alvéolos y ascienden por el árbol bronquial para ser deglutidas con las
I N T R O D U C C I Ó N
21
secreciones traqueobronquiales y así llegan al aparato digestivo. El desarrollo
de las larvas continúa en el estómago y finaliza en el intestino, realizando una
nueva muda y alcanzando el estado adulto a las 3-5 semanas.
En perros de más de seis semanas es más frecuente una migración
somática. En este caso, las L2 no pasan a la luz alveolar sino que a través del
torrente sanguíneo son distribuidas por el organismo invadiendo diferentes
órganos como pulmones, hígado, riñones, útero, glándulas mamarias, etc. En
este punto las larvas pueden quedar retenidas en los tejidos durante meses e
incluso años sin ningún desarrollo. Este fenómeno es conocido como
hipobiosis (Sprent, 1952).
Estas larvas en estado hipobiótico se pueden reactivar en el tercer
trimestre de embarazo. Pueden migrar hacia la placenta produciéndose la
infección transplacental de los cachorros gestantes y también hacia las
glándulas mamarias pasando al calostro dando lugar a una infección postnatal
(Burke y Robertson, 1985). Esto supone que las hembras son el principal
reservorio de infección de T. canis al reactivarse las larvas con cada nueva
camada, por eso, la mayoría de los perros recién nacidos están parasitados por
T. canis (Maizels y Loukas, 2001).
La capacidad de supervivencia de las larvas L2 de T. canis se pone de
manifiesto al existir casos en los que se han encontrado larvas latentes en
I N T R O D U C C I Ó N
22
tejidos del hospedador definitivo hasta nueve años después de una infección
(Beaver, 1962; Beaver, 1966).
En cultivos in vitro, las larvas L2 se mantienen viables durante un máximo
de 18 meses (de Savigny, 1975). Si bien en este periodo no hay desarrollo
morfológico, sí hay una elevada actividad física y metabólica que depende de
un aporte regular de glucosa y aminoácidos (Maizels y Loukas, 2001).
T. canis sólo alcanza el estadio adulto en el hospedador definitivo, pero
existe un amplio rango de mamíferos, incluido el hombre, susceptibles de ser
infectados por la ingestión de huevos embrionados.
En el hombre (Figura 7) el ciclo comienza con la ingestión accidental de
huevos que se pueden encontrar en el suelo de los parques públicos, en
vegetales contaminados por heces de perro, o puede adquirirse por la
ingestión de carne mal cocinada de hospedadores paraténicos como pollo
(Nagakura y col., 1990), conejo (Stürchler y col., 1990), hígado de pato
(Hoffmeister y col., 2007) y cordero (Salem y Schantz, 1992). Como
consecuencia, se produce la migración somática que da lugar al desarrollo del
Síndrome de Larva Migrans (Magnaval y col., 2001).
I N T R O D U C C I Ó N
23
Figura 7. Esquema del ciclo biológico de T. canis en el hospedador aberrante
Tradicionalmente se describen dos formas de toxocarosis dependiendo
de la localización de las larvas en los tejidos del hospedador aberrante que se
denominan Síndrome de Larva Migrans Ocular (LMO) y Síndrome de Larva
Migrans Visceral (LMV).
Síndrome de Larva Migrans Ocular (LMO) (Wilder, 1950).
Los pacientes suelen ser niños y adultos jóvenes que presentan una
pérdida de visión, acompañada a veces por estrabismo cuya duración puede
ser de días o semanas. En el examen del fondo ocular se pueden observar:
endoftalmitis granulomatosa, uveítis y granulomas retinianos, papilitis o masas
2. Ingestión accidental de huevos e inicio de la infección.
3. Los huevos eclosionan en el intestino delgado y penetran en la pared intestinal.
4. Las larvas migran a todos los órganos por el torrente sanguíneo.
PATOLOGÍA
1. Diseminación de huevos de T. canis por el hospedador definitivo.
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24
inflamatorias en el vítreo periférico. La consecuencia más grave de la infección
es la invasión de la retina que puede derivar en ceguera.
La infección ocular puede ser también subclínica y solamente detectada
en un control rutinario de los ojos. En estos pacientes no se suele encontrar
eosinofilia.
Síndrome de Larva Migrans Visceral (LMV) (Beaver y col., 1952)
Los pacientes suelen ser niños de entre 2 y 7 años con un historial de
geofagia y contacto estrecho con mascotas. Los síntomas asociados a la
migración hepática y pulmonar de las larvas son: dolor abdominal, pérdida de
apetito, fiebre, tos, asma y hepatomegalia con una marcada eosinofilia,
leucocitosis e hipergammaglobulinemia. La localización e intensidad de los
síntomas depende de la cantidad de larvas, el establecimiento de las mismas y
de la respuesta inmunitaria del hospedador. Los casos de LMV con
condiciones clínicas severas son poco comunes y las posibles consecuencias
de una prolongada eosinofilia son la fibrosis pulmonar (Phan y Kunkel, 1992)
y la miocarditis eosinofílica (Abe y col., 2002).
En las últimas dos décadas se han descrito otras formas clínicas de
toxocarosis que se citan a continuación:
I N T R O D U C C I Ó N
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Toxocarosis común (Glickman y col., 1987)
Se presenta con astenia crónica asociada con desórdenes digestivos y
manifestaciones alérgicas (hipereosinofilia moderada e incremento de la IgE
total). Algunas veces estos síntomas pueden estar acompañados de
manifestaciones dérmicas como prurito, eczema y urticaria.
Toxocarosis subclínica o encubierta (Taylor y col., 1988)
En este caso las manifestaciones clínicas son poco específicas y de poca
gravedad como: fiebre, anorexia, tos, dolor abdominal, dolor de cabeza,
insomnio, vómitos, letargia, trastornos del sueño y del comportamiento,
faringitis, neumonía, linfadenitis cervical y hepatomegalia. No suele haber
eosinofilia marcada pero sí un elevado título de anticuerpos anti-Toxocara. Es
la forma más frecuente de toxocarosis humana aunque en la mayoría de los
casos suele quedar sin diagnosticar (Magnaval y col., 2001).
Toxocarosis neurológica (Beautyman y Woolf, 1951)
Puede afectar tanto al Sistema Nervioso Central (SNC) como al Sistema
Nervioso Periférico (SNP). Entre las manifestaciones neurológicas en el SNC
se encuentran la meningitis, encefalitis y mielitis eosinofílicas, vasculitis
cerebral, neuritis óptica y epilepsia. Sólo hay 50 casos en los que se ha
relacionado la toxocarosis con el SNC y se ha visto que no discrimina ni por
edad ni por sexo.
I N T R O D U C C I Ó N
26
En cuanto al SNP, las manifestaciones son raras y comprende
radiculitis, afección de los nervios craneales y afección del músculo esquelético
(Finsterer y Auer, 2007).
ANTÍGENOS DE TOXOCARA CANIS
La mayoría de las investigaciones sobre la biología molecular de T. canis
se ha centrado en las proteínas excretoras-secretoras del estadio infectante L2
de este parásito (Despommier, 2003). Estas proteínas han demostrado ser de
gran utilidad en el diagnóstico inmunológico de los Síndromes de LMV y
LMO (Despommier, 2003). En relación con su función, se cree que estas
proteínas están implicadas en la evasión de la respuesta inmunitaria del
hospedador por parte del parásito (Despommier, 2003) idea que se refuerza al
tener en cuenta que este grupo de proteínas de excreción-secreción está
constituido en su mayor parte por una familia de al menos 6 mucinas con un
elevado poder antigénico (Doedens y col., 2001). Las larvas L2 alteran
periódicamente estas mucinas (Badley y col., 1987) que recubren la superficie
larvaria (Page y col., 1992) con la intención de desviar la acción de la respuesta
inmunológica del hospedador (Maizels y Holland, 1998).
Otro grupo de proteínas descritas en el conjunto de los productos de
excreción-secreción son las lectinas tipo C (Maizels y Loukas, 2001). Se trata
de una familia de proteínas que unen carbohidratos, desde simples
I N T R O D U C C I Ó N
27
monosacáridos hasta complejos glicoconjugados, de una manera dependiente
de Ca2+ (Weis y col., 1998). En general, las lectinas están implicadas en la
activación del sistema inmunológico tanto en vertebrados como en
invertebrados, lo que sugiere que estas proteínas pueden intervenir en la
relación parásito-hospedador, sobre todo en la evasión del sistema
inmunológico (Loukas y Maizels, 2000).
De todos los antígenos identificados e individualizados de Toxocara
(Tabla 1) sólo el grupo de poliproteínas TBA-1 (Yahiro y col., 1998; Kennedy,
2000) ha sido asociado al término alérgeno por su similitud estructural con el
grupo ABA-1 descrito en Ascaris spp. (Xia y col., 2000). Se trata de un grupo
de polipéptidos capaces de unir lípidos. En el momento inicial de su síntesis
son secretados en forma de grandes polímeros y a medida que son excretados,
son digeridos en pequeños polipéptidos con un peso aproximado de 15 kDa
(Despommier, 2003). Estas pequeñas subunidades son las que parecen inducir
la respuesta alérgica en un amplio número de hospedadores (Despommier,
2003).
Sin embargo, aunque TBA-1 es estructuralmente similar a ABA-1,
actualmente se desconoce su relevancia tanto diagnóstica como clínica en los
procesos de hipersensibilidad mediada por IgE (Yahiro y col., 1998).
I N T R O D U C C I Ó N
28
Tabla 1. Relación de antígenos nativos y recombinantes de Toxocara canis Antígenos Nativos Maizels y col., (1984)
Antígenos Recombinantes Maizels y Loukas, (2001); Yahiro y col.,
(1998) Excreción-Secreción
Superficie Larvaria
MM (kDa) MM (kDa) MM (kDa) Características 26 Proteína de unión a
fosfatidiletanolamina 32 32 32 Lectina tipo C
(dependiente de calcio) 45 Lectina (no confirmado) 55 Componentes
intermedios 55 Lectina
70 70 Lectina tipo C 120 120 120 Mucina 400 400 Análogo de proteoglicanos 15 Poliproteína TBA-1
Por otra parte tan sólo diez antígenos de nematodos forman parte de la
lista oficial de alérgenos (www.allergen.org); de los cuales no hay ninguno que
se asocie al género Toxocara como fuente alergénica (Tabla 2).
Tabla 2. Alérgenos de nematodos incluidos en la nomenclatura oficial de alérgenos Anisakis simplex Ani s 1 24 kDa Ani s 2 Paramiosina 97 kDa Ani s 3 Tropomiosina 41 kDa Ani s 4 Cisteína inhibidora de proteasa 9 kDa Ani s 5 Familia de proteínas SXP/RAL-2 15 kDa Ani s 6 Serina inhibidora de proteasa Ani s 7 139 kDa Ani s 8 Familia de proteínas SXP/RAL-2 Ani s 9 Familia de proteínas SXP/RAL-2 Ascaris suum Asc s 1 10 kDa
I N T R O D U C C I Ó N
29
Por tanto, desde el punto de vista alergológico en el momento actual no
existen datos que permitan definir alérgenos relevantes que posibiliten abordar
reacciones de hipersensibilidad asociada a la presencia de Toxocara.
HIPERSENSIBILIDAD Y HELMINTOS
La hipersensibilidad mediada por IgE es conocida también como
hipersensibilidad tipo I, hipersensibilidad inmediata o alergia (Meeusen, 1999).
La alergia ocurre normalmente en individuos atópicos que presentan una
predisposición genética a padecer enfermedades alérgicas como asma, rinitis
alérgica y dermatitis atópica (Petrov y Fireman, 2006). Estos individuos
presentan niveles elevados de inmunoglobulina E junto con una reactividad
aumentada en las pruebas cutáneas con extractos alergénicos (Petrov y
Fireman, 2006).
Como consecuencia de la interacción de los alérgenos con el sistema
inmunológico, las células T estimulan la producción de citoquinas IL4, IL5,
IL9 e IL13. Estas citoquinas interactúan con sus receptores para estimular la
producción de IgE y aumentar el número de eosinófilos, mastocitos y
basófilos, desencadenando una reacción inflamatoria de tipo alérgico en el
tejido afectado (Meeusen, 1999).
I N T R O D U C C I Ó N
30
Esta fuerte respuesta inmunológica tipo Th2 es también característica en
las infecciones producidas por helmintos parásitos (Erb, 2007), siendo el sello
distintivo de estas infecciones la gran cantidad de IgE detectada en suero
(Erb, 2007).
En las dos últimas décadas, las cifras de prevalencia de la atopia se han
incrementado muy significativamente, siendo los países industrializados los
que parecen sufrir de manera especial dicho incremento (Romagnani, 2004)
que, por otra parte, no se ha observado de forma evidente en los países en
vías de desarrollo (Ndiaye y Bousquet, 2004). Para explicar este hecho, se ha
desarrollado la “Teoría de la Higiene” (Strachan, 1996) cuya hipótesis sugiere
que la mejora de la higiene, el aumento de las vacunas y el uso de antibióticos
durante la primera infancia, altera el sistema inmunológico de tal manera que
responde inadecuadamente a los alérgenos ambientales. Es decir, hay un
desequilibrio entre la respuesta inmunológica Th1, desencadenada típicamente
frente al ataque de bacterias y virus, y la respuesta Th2 implicada en las
infecciones helmínticas y la alergia (Elston, 2006).
Este hecho ha llevado a los investigadores a interesarse cada vez más en
el posible papel modulador que ejercen las parasitosis sobre la expresión
clínica de alergia en todas sus formas: asma, rinitis, conjuntivitis, etc. (von
Mutius y col., 2006).
I N T R O D U C C I Ó N
31
Para explicar cómo los helmintos pueden alterar las reacciones alérgicas,
se han postulado en los últimos años dos teorías principales: 1) la “Hipótesis
del bloqueo de IgE” y 2) la “Teoría de las células reguladoras (Treg)”. La
primera propone que la IgE no específica inducida por el parásito puede
proteger al hospedador de la reacción alérgica, al ocupar los lugares de unión
de IgE en mastocitos y basófilos, inhibiendo de esta manera la unión a estas
células de la IgE específica inducida por los alérgenos (Erb, 2007).
En el segundo caso, “Teoría de las células reguladoras”, se propone que
estas células pueden actuar como mediadores principales en la interacción
inmunológica entre la infección y la alergia (Maizels, 2005).
En apoyo a la primera teoría está el hecho de que los efectos protectores
de las infecciones helmínticas sobre las reacciones alérgicas se han asociado
con altos niveles séricos de IgE policlonal (Lynch y col., 1987; Lynch y col.,
1993). La inducción de la producción de IgE policlonal por el helminto podría
proteger al parásito de los mecanismos de defensa del hospedador, inhibiendo
la unión a los mastocitos o basófilos de la IgE específica producida contra el
parásito (Erb, 2007). Esto también explicaría, por qué los helmintos inducen
una producción masiva de IgE no específica en primer lugar y por qué los
humanos infectados con helmintos rara vez desarrollan reacciones
anafilácticas en comparación con los individuos atópicos (Erb, 2007).
I N T R O D U C C I Ó N
32
Sin embargo, los estudios realizados por Mitre y col. (2005) en
poblaciones con altos índices de parasitosis indican que en las infecciones por
helmintos y en particular las infecciones por filarias, la relación entre la IgE
policlonal inducida por el parásito y la IgE específica producida frente a
alérgenos no alcanza los niveles necesarios para inhibir la unión de la IgE
específica al receptor de alta afinidad FcεRI y suprimir la degranulación de
mastocitos y basófilos inducida por los alérgenos. De la misma forma, Cooper
y col. (2008) afirman que no existe una evidencia consistente que indique que
la IgE sea el mecanismo efector primario en la protección inmunológica frente
a la infección por helmintos, aunque podría estar involucrada de alguna
manera.
Aunque las respuestas Th2 son las predominantes durante una infección
por helmintos, éstos también inducen fuertes respuestas reguladoras, una de
las más importantes es la inducción de células T Foxp3+ CD4+ ó también
denominadas células T reguladoras (Treg) (Wilson y col., 2005).
Esta teoría, últimamente la más aceptada, sugiere que la IL-10 y/o el
TGF-β que secretan las células presentadoras de antígeno o las células Treg en
respuesta a las infecciones crónicas por helmintos, interfieren directamente
con los mecanismos efectores de la alergia mediante la inhibición de la
I N T R O D U C C I Ó N
33
degranulación de los mastocitos o inhibiendo la proliferación de células Th2
(Yazdanbakhsh y col., 2002; Maizels, 2005).
Dentro de las relaciones parásito-hospedador los helmintos han
desarrollado a lo largo de su co-evolución con el hospedador, métodos
moleculares muy sofisticados de evasión del sistema inmunológico (Maizels y
col., 2005). En concreto, las larvas infectantes L2 de T. canis son capaces de
excretar-secretar una serie de macromoléculas que parecen ser los candidatos
perfectos como mediadores de la evasión del sistema inmunitario (Maizels y
Loukas, 2001). Entre los antígenos excretados-secretados por T. canis, la
proteína TES-32, expresada en la epicutícula de la larva infectante es la más
abundante (Page y col., 1992). Esta proteína comparte secuencia y similitud
con la estructura de las lectinas tipo C dependientes de calcio de los
mamíferos, por lo que también se denomina CTL-1 (Loukas y col., 1999).
El dominio C-terminal de TES-32 es semejante a las lectinas relacionadas
con el sistema inmunitario del hospedador, como el receptor de unión de
manosa al macrófago, la E-selectina y la proteína A de unión a macrófagos
(Loukas y col., 1999). Aunque se ha especulado con el papel
inmunomodulador de estas lectinas, su probable interacción con el sistema
inmunitario del hospedador es hipotética (Loukas y Maizels, 2000).
I N T R O D U C C I Ó N
34
Actualmente se sabe que muchas proteínas alergénicas tienen homólogos
en los parásitos metazoos, y parece ser que lo que hace que algunas proteínas
sean alérgenos reside en la larga co-evolución entre estos parásitos y los
hospedadores vertebrados (Fitzsimmons y Dunne, 2009).
Los alérgenos se han definido como antígenos no parasitarios capaces de
estimular reacciones de hipersensibilidad tipo I en individuos atópicos
(Fitzsimmons y Dunne, 2009), pero existe un número muy limitado de
moléculas que sean capaces de convertirse en antígenos fijadores de IgE.
Según Fitzsimmons y Dunne (2009), el término "inmunógenos parasitarios de
metazoos" definiría los antígenos IgE de parásitos metazoos que son capaces
de producir respuestas de hipersensibilidad tipo I. La identificación de estas
proteínas y su comparación con las familias de alérgenos existentes,
proporcionaría información adicional sobre la estructura de los epitopos que
actúan de diana para la IgE, así quizá podríamos entender por qué ciertas
proteínas vegetales son alérgenos (Fitzsimmons y Dunne, 2009).
A la vista de todos estos datos, podemos afirmar que la naturaleza de las
proteínas y su pertenencia a una determinada familia de proteínas
(http://www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam/) es una de las claves para el
estudio de la respuesta mediada por IgE. Sólo determinadas familias de
proteínas parece que pueden estimular la respuesta IgE frente a parásitos y
I N T R O D U C C I Ó N
35
desencadenar la respuesta alérgica mediada por IgE. En este sentido, el
modelo de infección por Toxocara nos podría permitir estudiar qué proteínas
estarían asociadas a ambos fenómenos. El estudio de las respuestas mediadas
por IgE en hospedadores definitivos e intermediarios nos permitirían conocer
la naturaleza de las proteínas implicadas en el fenómeno alérgico y su posible
relación con otros alérgenos procedentes de fuentes no helmínticas.
Dada la escasez de datos que existen sobre la respuesta IgE frente a la
parasitación por Toxocara y los alérgenos que la inducen, en este trabajo se
propuso investigar los posibles alérgenos de T. canis, enfocando el estudio en
los productos de excreción-secreción larvarios.
Por otra parte y dado que los productos de excreción de las larvas de
tipo 2 intervienen de forma decisiva en las relaciones parasitarias tanto del
hospedador definitivo (perro) como del hospedador intermediario (hombre),
se planteó estudiar las respuestas mediadas por IgE y por IgG en ambos
hospedadores para evaluar qué antígenos/alérgenos pudieran intervenir en el
desarrollo de las mismas.
OBJETIVOS
O B J E T I V O S
37
La mayoría de las investigaciones sobre biología molecular de T. canis se
han centrado en las proteínas excretoras-secretoras del estadio infectante L2
(E-SL2) de este parásito (Despommier, 2003). Desde el punto de vista
inmunológico, no existen datos que nos permitan definir antígenos relevantes
de Toxocara canis asociados a reacciones de hipersensibilidad mediada por IgE.
Aunque el grupo de poliproteínas alergénicas de nematodo (NPA) de Toxocara
canis (TBA-1) está asociado al término alérgeno -dada su similitud al grupo
ABA-1 de Ascaris- no se ha demostrado que induzca una respuesta
inmunológica mediada por IgE (Yahiro y col., 1998).
Asimismo, se conoce que entre las proteínas E-SL2 de T. canis, la
proteína TES-32 es la más abundantemente secretada y la más estudiada tanto
a nivel molecular como bioquímico, pero hasta el momento no se ha
determinado su capacidad como proteína fijadora de IgE. Lo mismo sucede
con otras proteínas de E-S de Toxocara canis.
Por los antecedentes expuestos anteriormente y partiendo de la hipótesis
de que las proteínas E-SL2 de T. canis pudieran ser proteínas alergénicas, será
objetivo de este estudio identificar las proteínas E-SL2 fijadoras de IgE en el
hospedador intermediario y en el hospedador definitivo. Para ello se estudiará
una población de perros naturalmente infectada por T. canis así como una
población humana infectada y sensibilizada a dicho parásito. Esto nos
O B J E T I V O S
38
permitirá identificar los alérgenos relevantes en dichos productos de
excreción-secreción larvarios.
Este objetivo general se abordará planteando los siguientes objetivos
parciales:
1. Obtener las proteínas E-SL2 a partir del cultivo de larvas de Toxocara
canis.
2. Realizar la caracterización bioquímica de las proteínas E-SL2 de
Toxocara canis.
3. Realizar la caracterización inmunoquímica e identificación de las
proteínas E-SL2 de T. canis que estimulan la producción de anticuerpos
IgG/IgE en una población de perros naturalmente infectados por T. canis.
4. Realizar la caracterización inmunoquímica e identificación de
proteínas E-SL2 de T. canis que estimulan la producción de anticuerpos IgE en
una población de pacientes diagnosticados de toxocarosis.
5. Obtener genes que codifican para las proteínas de E-SL2 de Toxocara
canis y que inducen la producción de IgE.
MATERIALES Y MÉTODOS
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
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1. OBTENCIÓN DEL MATERIAL PARASITARIO
Los ejemplares adultos de Toxocara canis se obtuvieron a partir del análisis
del contenido intestinal de 430 perros procedentes del Centro de Protección
Animal de Armentia (Vitoria) y del Centro de Acogida de Animales de
Logroño (La Rioja), sacrificados de acuerdo con la normativa legal.
1.1. SACRIFICIO Y NECROPSIA DE LOS PERROS
A cada animal se le administró inicialmente como preanestésico, maleato
de acepromazina (Calmo Neosan, SmithKline Beecham) por vía
intramuscular, a la dosis recomendada de 0,5 ml/10 kg de peso.
A continuación, se tomó una muestra de sangre a partir de la vena
cefálica y por la misma se administró tiopental sódico (Pentothal Sódico.
Laboratorios Abbott), a una dosis de 4 mg/kg de peso, para anestesiar
completamente al animal. Por último, se administró por vía intramuscular
cloruro de suxametonio (Anectine Wellcome) como agente letal, a una dosis
de 50 mg/ml.
La extracción del intestino delgado se realizó tras una incisión abdominal
media, ligadura del extremo superior del intestino a nivel del píloro y ligadura
del extremo inferior a nivel de la unión íleo-cecal. Cada intestino fue
almacenado y correctamente etiquetado para su posterior estudio en el
laboratorio.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
41
1.2. OBTENCIÓN DE LOS SUEROS CANINOS
Las muestras de sangre obtenidas de cada animal fueron centrifugadas en
el laboratorio durante 20 minutos a 5.000 r.p.m. para la obtención del suero.
Estos sueros fueron correctamente identificados y almacenados a -40°C para
su uso posterior.
1.3. EXAMEN PARASITOLÓGICO DEL INTESTINO DELGADO
El examen parasitológico se llevó a cabo mediante el análisis
macroscópico del contenido intestinal, de acuerdo a los procedimientos
recomendados (Eckert y col., 1981).
Se realizó la disección longitudinal del intestino y se procedió a la
recogida de los adultos encontrados de Toxocara canis y otros helmintos
enteroparásitos que se mantuvieron en PBS con una mezcla de antibióticos al
1% (PBS+antibióticos 1%), constituidos por 10.000 unidades de penicilina, 10
mg de estreptomicina, 25 µg de anfotericina B/ml (Sigma). La limpieza e
identificación de los helmintos enteroparásitos se llevó a cabo bajo lupa con
ayuda de agujas enmangadas, eliminando cualquier resto de microvellosidad
intestinal que pudiera haber quedado adherida al parásito.
Tras el examen parasitológico, los diferentes helmintos hallados en cada
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
42
animal fueron identificados para su uso posterior. Al mismo tiempo, se realizó
una base de datos en la que se incluyeron los datos de parasitación junto con
la identificación del suero procedente de cada animal.
1.4. OBTENCIÓN DE LARVAS INFECTANTES (L2) DE
TOXOCARA CANIS MEDIANTE CULTIVO IN VITRO
DESOVE IN VITRO DE HEMBRAS DE TOXOCARA CANIS E INDUCCIÓN DE LA ECLOSIÓN
DE LAS LARVAS
Los parásitos adultos, aislados a partir del intestino delgado de los perros
e identificados como T. canis, fueron lavados exhaustivamente en
PBS+antibióticos 1%. Cada hembra se depositó en un frasco de cultivo
celular conteniendo 5 ml de PBS más la mezcla de antibióticos al 1%. Cada
frasco se incubó en cámara de cultivo celular durante 24 horas, a una
temperatura de 37°C, con una atmósfera del 5% de CO2 y en oscuridad.
Durante este periodo de incubación se produjo el desove de las hembras
y se examinó la fertilidad de los huevos mediante observación microscópica.
A continuación las hembras se retiraron de cada frasco de cultivo y se
congelaron en una solución que contenía PBS, PMSF y EDTA a -40°C.
Posteriormente se añadió a cada frasco de cultivo donde desovaron las
hembras 5 ml de hipoclorito sódico (lejía comercial) al 6,6% en agua estéril
(medio de mantenimiento) y se incubaron entre 28 y 30 días a 27°C, con luz
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
43
permanente y con una humedad relativa del 80% en un incubador Sanyo
Incubator MIR-153.
Medio de Mantenimiento
PBS+antibióticos 1%
Hipoclorito sódico 6,6%
El desarrollo de los embriones hasta el estadio de larva infectante L2, fue
monitorizado diariamente mediante la observación bajo microscopio óptico
invertido.
Todo el procedimiento se llevó a cabo en campana de flujo laminar
vertical y en condiciones de esterilidad.
Los cultivos se dejaron reposar en el interior de la campana de flujo
laminar durante una hora para precipitar los huevos. Se retiraron 7 ml por
frasco del medio de mantenimiento y se añadieron 10 ml del medio de
eclosión.
Medio de Eclosión
Solución Hipoclorito Sódico (lejía comercial)/NaOH 2%
Medio de Cultivo
Medio RPMI 1640 (Sigma)
Solución antibiótica-antimicótica 100X: 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de
estreptomicina, 100 µg/ml de anfotericina B (Sigma)
Glucosa 10X (Panreac)
Nistatina 100X (Sigma)
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
44
Posteriormente, se incubaron durante 30 minutos a temperatura
ambiente con agitación esporádica, y continua observación al microscopio
para detectar la degradación de las cubiertas proteica y lipídica del huevo. Una
vez eliminadas las cubiertas, los cultivos se centrifugaron a 2.500 r.p.m
durante 5 minutos a temperatura ambiente para facilitar la eclosión de las
larvas. A continuación, se retiró el sobrenadante y se añadieron 20 ml de
medio RPMI precalentado a 37°C y antibióticos al 1% para realizar un primer
lavado. Esta operación de centrifugado y lavado se repitió 3 veces más, hasta
conseguir la completa limpieza y eclosión de la mayoría de las larvas. Retirado
el sobrenadante del último centrifugado, se recogió el precipitado y se
depositó en un nuevo frasco de cultivo celular conteniendo 10 ml de medio
de cultivo fresco y precalentado a 37°C. Se incubó durante toda la noche a
37°C y en agitación (200 r.p.m.) para asegurar que todas las larvas quedaran
libres en el medio.
1.5. OBTENCIÓN DE LOS PRODUCTOS DE EXCRECIÓN–
SECRECIÓN DE LAS LARVAS L2 DE TOXOCARA CANIS
El extracto de los productos de excreción-secreción de las larvas L2 (E-
SL2) de Toxocara canis fue obtenido siguiendo el método previamente descrito
por de Savigny (1975), en el medio de cultivo antes detallado.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
45
Todo el procedimiento se llevó a cabo en campana de flujo laminar
vertical y en condiciones de esterilidad.
Los cultivos larvarios se dejaron reposar en el interior de la campana, en
posición vertical durante 1 hora para que las larvas se depositaran en el fondo
del frasco de cultivo celular.
Cada tres días se recogieron 7 ml de medio de cada tubo de cultivo, que
contenía los productos de excreción-secreción de las larvas L2. El volumen
recogido se depositó en un tubo estéril de 50 ml para su posterior
procesamiento.
El volumen de medio de cultivo recogido se repuso añadiendo 10 ml de
medio RPMI precalentado a 37°C, filtrado a través de un filtro de 0,22 µm
diámetro de poro. Posteriormente, se añadieron 100 µl de la mezcla de
antibióticos, 240 µl de nistatina y 1 ml de glucosa por cada 10 ml de medio de
cultivo. Todo el proceso de recogida y reposición del medio de cultivo se
muestra en la Figura 8.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
46
Figura 8. Proceso de recogida del E-SL2 y mantenimiento del cultivo
a) Reposo de los cultivos
b) Recogida del medio conteniendo los
E-SL2
c) Reposición del medio de cultivo
d) Adición de antibióticos, nistatina y glucosa
El medio de cultivo recogido durante 16 meses se procesó en volúmenes
de 500 ml que se filtraron utilizando membranas de nitrocelulosa de 0,22 µm
de diámetro de poro (Millipore).
Después del filtrado, el volumen recogido se dializó frente a agua
destilada en una relación 1:20, mediante membrana de diálisis con un punto de
corte de 7000 daltons (Medicell International Ltd). El volumen obtenido se
almacenó a -40°C para su posterior liofilización.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
47
El producto liofilizado fue considerado el extracto de excreción-
secreción larvario (E-SL2).
2. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DEL E-SL2 DE
TOXOCARA CANIS
2.1. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO PROTEICO
La determinación del contenido proteico del extracto se efectuó
utilizando el método del Ácido bicinconínico, basado en la técnica
originalmente propuesta por Lowry y col. (1951).
Se elaboró una curva patrón con diluciones seriadas a la mitad y por
duplicado de seroalbúmina bovina (Sigma) en tampón PBS. El rango de
concentraciones abarcó desde 1 mg/ml a 0,125 mg/ml.
Reactivos
Reactivo A: Ácido bicinconínico (Sigma)
Reactivo B: Sulfato de Cobre (II) pentahidratado al 4% (Sigma)
Reactivo C: mezclar Reactivo A y Reactivo B en una relación 50:1
El extracto liofilizado se preparó de la misma manera que la curva
patrón, abarcando el mismo rango de concentraciones.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
48
Se distribuyeron 200 µl por pocillo de reactivo C en placas de
poliestireno MaxiSorp™ (Nunc™).
Posteriormente se añadieron 30 µl/pocillo de cada una de las diluciones
preparadas con anterioridad. Las muestras, incluida la curva patrón, se
distribuyeron por filas, en orden decreciente y por duplicado. También se
incluyó un pocillo conteniendo 30 µl de PBS que actuó como control.
Cada placa se incubó durante 30 minutos a 37°C en cámara húmeda.
Transcurrido el periodo de incubación, la lectura de los resultados se
realizó en un lector de placas de ELISA Multiskan® Bichromatic (Labsystems) a
una longitud de onda de 560 nm.
Los valores que se obtienen para cada muestra por duplicado, permiten
la obtención de un valor medio de absorbancia que se representa de forma
gráfica frente a la concentración de proteína. La linealidad que se produce con
los puntos de la curva patrón, permite elaborar una recta de regresión en la
que se integran los valores medios de absorbancia obtenidos para cada
muestra problema. De esta forma se calcula la concentración de proteína que
contiene cada extracto. El resultado se expresa como porcentaje de proteína
por peso de extracto.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
49
2.2. ANÁLISIS DEL PERFIL PROTEICO MEDIANTE
ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL
La separación de las proteínas contenidas en el extracto se realizó
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de Dodecil
Sulfato de Sodio (SDS-PAGE), en condiciones reductoras y con un sistema
discontinuo, según el método de Laemmli (1970).
Tampón de Muestra Tampón de Electroforesis (pH 8.7-8.8)
Tris-HCl pH 6,8 62,5 mM Tris base 0,025 M
Glicerol 10% Glicina 0,19 M
Azul de bromofenol 0,0125% SDS 1%
SDS 2%
2-β-mercaptoetanol 5%
La muestra se preparó mezclando el extracto liofilizado con el tampón
de muestra a una concentración de 4 mg de proteína del extracto liofilizado
por ml de tampón.
Se hirvió durante 5 minutos para provocar la reducción de los puentes
disulfuro y tras su enfriamiento, los restos insolubles se eliminaron por
centrifugación durante 5 minutos a 10.000 r.p.m. Como patrón de pesos
moleculares se utilizó el marcador preteñido Precision Plus Protein Dual Color
Standards (Bio-Rad).
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
50
Tanto la muestra como el patrón se almacenaron a -20°C hasta su
utilización.
2.2.1. PREPARACIÓN DE LOS GELES Y ELECTROFORESIS
La separación de los componentes proteicos del E-SL2 se realizó en gel
de poliacrilamida al 12,5%. Las cantidades necesarias así como los
componentes utilizados fueron los siguientes:
Gel separador 4%
Solución Acrilamida/Bis-Acrilamida 40% 29:1 (Bio Rad) 3,1 ml
Agua destilada 4,3 ml
Tris-HCl 1,5M pH 8,8 2,5 ml
SDS 10% 100 µl Persulfato amónico (Bio-Rad) 75 µl
Temed (Sigma) 20µl
Gel separador 12,5%
Solución Acrilamida/Bis-Acrilamida 40% 29:1 (Bio 1 ml
Agua destilada 6,4 ml
Tris-HCl 0,5M pH 8,8 2,5 ml
SDS 10% 100 µl Persulfato amónico (Bio-Rad) 75 µl
Temed (Sigma) 20µl
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
51
La electroforesis se llevó a cabo a diferente amperaje según el
procedimiento descrito por Del Águila y col. (1988). Se aplicó un amperaje de
25mA en el gel apilador y de 30mA en el gel separador
La duración de la electroforesis fue de 10 minutos hasta que el frente
penetró en el gel separador y de 50 minutos hasta que la proteína de 25 kDa
del marcador de peso molecular alcanzó el frente del gel.
2.2.2. VISUALIZACIÓN DEL PERFIL PROTEICO DEL E-SL2 MEDIANTE TINCIÓN AZUL DE
COOMASSIE
Los geles se sumergieron en solución colorante durante 1 hora a
temperatura ambiente y en agitación. Transcurrido este tiempo, el exceso de
colorante se eliminó sumergiendo los geles en solución decolorante.
Solución Colorante Solución Decolorante
Coomassie R-250 1 g Metanol 400 ml
Solución decolorante 1 L Ácido acético 100ml
Agua destilada 500ml
Se retiró la solución decolorante y los geles se mantuvieron en agua
destilada hasta su digitalización y posterior evaluación mediante el programa
informático Quantity One (Bio-Rad).
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
52
2.3. ANÁLISIS DEL PERFIL PROTÉICO MEDIANTE
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
La electroforesis bidimensional (2D-electroforesis) permite obtener una
mejor resolución de los componentes proteicos de un extracto, debido a que
las proteínas se separan según dos parámetros: el punto isoeléctrico (pI) y el
peso molecular. Se abordó la separación de proteínas del extracto de los
productos de excreción-secreción de las larvas L2 por 2D en un rango de pH
de 3-10.
Tampón de Solubilización
Urea 8M
Chaps 4%
Anfolitos pH 3-10 al 0,2%
Azul de bromofenol al 0,0002%
Ditiotreitol (DTT) 50mM
Agua ultrapura
Tampón de Equilibrado
Urea 6M
SDS 20%
Tris HCl 1,5M pH 8,8
Glicerol 50%
Agua ultrapura
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
53
2.3.1. PRIMERA DIMENSIÓN: ISOELECTROENFOQUE
La primera dimensión se realizó en tiras de geles con un gradiente de pH
inmovilizado de 3 a 10 y de 7 cm de longitud (Bio-Rad). La muestra se
preparó en tampón de solubilización a una concentración de 300 µg de
proteína por ml de tampón y se dispuso en la bandeja de isoelectroenfoque en
un volumen final de 250 µl por tira de gel utilizada. Tras una hora de
incubación con la muestra, las tiras se cubrieron con aceite mineral y la
bandeja se conectó a la unidad de isoelectroenfoque Protean IEF Cell (Bio-
Rad). Las condiciones del isoelectroenfoque fueron las siguientes:
Etapa Voltios Voltios/hora
S1 250
S2 4.000
S3 4.000-20.000
S4 500
2.3.1.1. EQUILIBRADO
Antes de realizar la segunda dimensión es necesario solubilizar las
proteínas separadas por su punto isoeléctrico en tampones conteniendo SDS.
Tampón de Equilibrado I Tampón de Equilibrado II
Urea 6 M Urea 6 M
Tris-HCl pH 8,8 0,05M Tris-HCl pH 8,8 0,05 M
SDS 2% SDS 2%
Glicerol 20% Glicerol 20%
DTT 2% Iodoacetamida 2,5%
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
54
Para ello, cada tira se incubó durante diez minutos en agitación fuerte,
primero en tampón de equilibrado I conteniendo ditiotreitol (DTT) al 2%,
consiguiendo así reducir los grupos sulfidrilo de las proteínas; después, se
realizó una segunda incubación de diez minutos en tampón de equilibrado II
conteniendo iodoacetamida (IAA) al 2,5% para alquilizar los grupos sulfidrilo,
permitiendo así que las proteínas se separen únicamente por su peso
molecular en la segunda dimensión.
2.3.2. SEGUNDA DIMENSIÓN
La segunda dimensión separa las proteínas por su peso molecular
mediante geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE). Las
soluciones y reactivos utilizados en su preparación así como el proceso de
electroforesis, se llevó a cabo tal y como se explica en el apartado 2.2.1. de
este capítulo.
La tira de isoelectroenfoque ya equilibrada se colocó sobre el gel
separador con un porcentaje de acrilamida del 12,5%. Para mantener el
contacto entre geles, sobre la tira se añadieron 100 µl de agarosa al 0,1% en
tampón de electroforesis. En un pocillo a parte se incluyó el marcador de
pesos moleculares Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio-Rad).
La electroforesis se llevó a cabo a 90 V durante 110 minutos utilizando el
sistema Mini PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad).
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
55
2.3.3 VISUALIZACIÓN DEL PERFIL PROTEICO DEL E-SL2 MEDIANTE TINCIÓN AZUL DE
COOMASSIE
Los geles se sumergieron en solución colorante durante 1 hora a
temperatura ambiente y en agitación. Transcurrido este tiempo, el exceso de
colorante se eliminó sumergiendo los geles en solución decolorante.
Se retiró la solución decolorante y los geles se mantuvieron en agua
destilada hasta su digitalización y posterior evaluación mediante el programa
informático PD Quest (Bio-Rad).
2.3.4. VISUALIZACIÓN DEL PERFIL PROTEICO MEDIANTE TINCIÓN CON PLATA
Para realizar esta tinción se utilizaron los reactivos Silver Stain Plus (Bio-
Rad). Las siguientes soluciones fueron preparadas en un volumen de 50 ml
acorde a las dimensiones del gel.
Solución Fijadora Solución Reveladora
Metanol 50% Solución complejo de plata 5%
Ácido acético 10% Solución reductora 5%
Concentrado fijador 5% Reactivo desarrollo 5%
Agua destilada ultrapura 35% Reactivo acelerador 50%
Agua destilada ultrapura 35%
Los geles se fijaron manteniéndolos durante 20 minutos en Solución
fijadora a temperatura ambiente y en agitación suave. A continuación se
lavaron dos veces con agua destilada ultrapura durante 10 minutos.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
56
Posteriormente, el gel se introdujo en la Solución de revelado de 10 a 30
minutos en agitación, controlando permanentemente el proceso de revelado.
La reacción se paró con ácido acético al 7% una vez visualizadas las proteínas.
3. CARACTERIZACIÓN INMUNOQUÍMICA
3.1. SELECCIÓN DE SUEROS
3.1.1. SUEROS CANINOS
A partir de la seroteca del Laboratorio de Parasitología, se seleccionaron
20 sueros de perros infectados naturalmente por Toxocara canis y
diagnosticados por necropsia.
Como sueros control se emplearon 5 sueros de perros sanos y libres de
helmintos procedentes de los Laboratorios Charles River (Charles River
Laboratory Inc.) y certificados por la compañía.
3.1.2. SUEROS HUMANOS
Para la identificación de los posibles alérgenos presentes en el extracto de
excreción-secreción de L2 de T. canis se seleccionaron 11 sueros de pacientes
diagnosticados de toxocarosis mediante enzimoinmunoensayo (EIA Toxocara
canis IgG. Test-Line, Clinical Diagnostics) y procedentes de la seroteca
conservada en el Laboratorio de Parasitología.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
57
3.2. ELECTROTRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 A
MEMBRANAS INMOVILIZANTES
Las proteínas del E-SL2 separadas por electroforesis unidimensional y
bidimensional fueron electrotransferidas a membranas inmovilizantes de
fluoruro de polivinilideno (PVDF) Immun-Blot ® (Bio-Rad). La
electrotransferencia se realizó en un sistema horizontal semi seco, según el
método descrito por Towbin (1979).
Tampón de Transferencia
Glicerina 39 mM
Tris HCl 48 mM
SDS 0,0375%
Metanol 20%
Agua destilada ultra pura hasta 1 L
Antes de realizar la electrotransferencia se cambió la hidrofobicidad de la
membrana sumergiéndola unos segundos en metanol, dos minutos en agua
destilada y dos minutos en tampón de transferencia.
Sobre la placa del ánodo se colocó papel Extra Thick Blot (Bio-Rad)
impregnado en el tampón de transferencia.
La membrana se cortó a la misma medida que la superficie del gel a
transferir y se colocó encima del papel. Seguidamente se colocó el gel y
encima de éste otro papel Extra Thick Blot embebido en el tampón de
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
58
transferencia. Se cubrió todo con la placa-electrodo cátodo y se aplicó un
amperaje constante de 0,24 mA durante 20 minutos.
3.3. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE
3.3.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgE CANINA
3.3.1.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS SEPARADAS MEDIANTE ELECTROFORESIS
UNIDIMENSIONAL
Tampón de Bloqueo (TBS-leche)
Leche desnatada en polvo 88g
Tris (hidroximetil) aminometano 6,05g
NaCl 11,70g
Agua destilada ultrapura Ajustar a 1 L
Una vez transferidas las proteínas, la membrana se saturó mediante
incubación en tampón de bloqueo durante 1 hora en agitación y temperatura
ambiente. Tras realizar 3 lavados de 10 minutos cada uno con TBS, la
membrana se cortó en tiras que se incubaron individualmente con los 25
sueros de perros seleccionados para este estudio a una dilución 1:100 en TBS-
leche. La incubación se realizó durante toda la noche a 4 °C y en agitación. A
continuación, y después de lavar las tiras por tres veces con TBS durante 10
minutos, se añadió a cada una 1 ml de inmunoglobulina G anti-IgE de perro
producidas en ratón (ICN), a una dilución 1:30 en tampón de bloqueo.
Después de 3 lavados con TBS, se añadió como conjugado inmunoglobulinas
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
59
anti-IgG de ratón unidas a peroxidasa (Sigma) a una dilución 1:100 en tampón
de bloqueo. La incubación con cada uno de los anticuerpos fue de 1 hora a
temperatura ambiente y en agitación suave. Para eliminar el conjugado no
fijado, se realizaron tres lavados de 10 minutos con TBS.
Como substrato de la reacción se utilizó 4-Cloro-1-Naftol (Bio-Rad) al
0,3% disuelto en metanol más peróxido de hidrógeno al 0,01%.
La membrana se incubó con la solución de revelado en reposo,
oscuridad y temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se lavó con
agua y se dejó secar para su posterior evaluación mediante el programa
informático Quantity One (Bio-Rad).
3.3.1.2 INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 SEPARADAS MEDIANTE
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Tampón de Bloqueo (TBS-Tween 20) 0,1%
Tris 6,05g
NaCl 11,70g
Tween 20 1 ml
Agua destilada ultrapura Ajustar a 1 L
Una vez transferidas las proteínas, la membrana se saturó mediante
incubación en tampón de bloqueo TBS-T 20 al 0,1% durante 1 hora en
agitación y a temperatura ambiente.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
60
Tras realizar 3 lavados de 10 minutos con TBS-T 20 al 0,1%, la
membrana se incubó con una mezcla de los 20 sueros de perros seleccionados
para este estudio a una dilución 1:5 en tampón de bloqueo durante toda la
noche a 4°C y en agitación suave.
Tras la incubación, se realizaron 3 lavados de 10 minutos con tampón
TBS-T 20 al 0,1% en agitación fuerte y a temperatura ambiente. Tras los
lavados, la membrana se incubó con anticuerpos anti-IgE canina unida a
peroxidasa (GenTex, Inc.) a una dilución 1:2000 en tampón TBS-T 20 al 0,1%
durante 1 hora en agitación y a temperatura ambiente.
Para eliminar el conjugado no fijado, se realizaron 3 lavados de 10
minutos con TBS- T 20 al 0,1% y un cuarto lavado sólo con TBS.
Para la detección de proteínas fijadoras de IgE se procedió al revelado
por quimioluminiscencia utilizando el sistema ECL-Plus Western Blotting
detection System (GE Healthcare).
Reactivos
Solución A: Tampón Tris
Solución B: Solución Acridan en Dioxano y Etanol
Solución de detección: mezclar Solución A y Solución B en una relación 40:1
Una vez retirado el exceso de tampón TBS de las membranas se
colocaron en un pliego de papel plástico transparente SaranWrap™. A
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
61
continuación, la membrana fue cubierta en toda su superficie con 1 ml de
solución de detección y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura
ambiente y en oscuridad.
Tras la incubación, se retiró el exceso de reactivo y se procedió a su
visualización mediante el sistema ChemiDoc™XRS (Bio-Rad). Los resultados
quedaron almacenados como archivo fotográfico para su posterior evaluación
mediante el programa informático PD Quest (Bio-Rad).
3.3.2. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgE HUMANA
3.3.2.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS SEPARADAS MEDIANTE ELECTROFORESIS
UNIDIMENSIONAL
Una vez transferidas las proteínas, la membrana se saturó mediante
incubación en tampón de bloqueo TBS-T 20 al 0,1 % durante 1 hora en
agitación y temperatura ambiente. Posteriormente, la membrana se cortó en
tiras que se incubaron individualmente con 500 µl de los 11 sueros de
pacientes seleccionados sin diluir y se incubaron durante toda la noche a 4 °C
y en agitación. Tras la incubación con los sueros, los anticuerpos no fijados se
eliminaron mediante 3 lavados de 10 minutos con tampón TBS-T 20 al 0,1%
en agitación fuerte y a temperatura ambiente.
Como anticuerpo secundario se utilizaron inmunoglobulinas anti-IgE
humanas producidas en conejo y unidas a peroxidada (DAKO A/S) a una
dilución 1:10.000 en TBS-T 20 al 0,1%. La incubación con este anticuerpo fue
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
62
de 1 hora en agitación suave y a temperatura ambiente. Tras la incubación, se
realizaron tres lavados de 10 minutos cada uno con TBS-T al 0,1% y un
último lavado con TBS
La detección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgE se realizó mediante
quimioluminiscencia, tal y como se indica en el apartado 3.3.1.2. de este
capítulo.
Posteriormente se procedió a su visualización mediante el sistema
sistema ChemiDoc™XRS (Bio-Rad). Los resultados quedaron almacenados
como archivo fotográfico para su posterior evaluación mediante el programa
informático Quantity One (Bio-Rad).
3.3.2.2. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS SEPARADAS MEDIANTE ELECTROFORESIS
BIDIMENSIONAL
Tras la transferencia de las proteínas, la membrana se saturó mediante
incubación en tampón de bloqueo TBS-T 20 al 0,1 % durante 1 hora en
agitación y temperatura ambiente. Posteriormente, la membrana se incubó con
una mezcla de los 11 sueros de pacientes seleccionados durante toda la noche
a 4°C y en agitación. Tras la incubación con los sueros, los anticuerpos no
fijados se eliminaron mediante 3 lavados de 10 minutos con tampón TBS-T
20 al 0,1% en agitación fuerte y a temperatura ambiente.
Como anticuerpo secundario se utilizaron inmunoglobulinas anti-IgE
humanas producidas en conejo y unidas a peroxidada (DAKO A/S) a una
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
63
dilución 1:10.000 en TBS-T 20 al 0,1%. La incubación con el anticuerpo
secundario fue de 1 hora en agitación suave y a temperatura ambiente. Tras la
incubación, se realizaron tres lavados de 10 minutos cada uno con TBS-T al
0,1% y un último lavado con TBS.
La detección de proteínas fijadoras de IgE se realizó mediante
quimioluminiscencia, tal y como se indica en el apartado 3.3.1.2. de este
capítulo.
Posteriormente se procedió a su visualización mediante el sistema
ChemiDoc™XRS (Bio-Rad). Los resultados quedaron almacenados como
archivo fotográfico para su posterior evaluación mediante el programa
informático PD Quest (Bio-Rad).
3.4. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgG
3.4.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgG CANINA
SEPARADAS MEDIANTE ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL
La detección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgG canina y separadas
mediante electroforesis unidimensional se llevó a cabo tal y como se indica en
el apartado 3.3.1.1. de este capítulo. Como anticuerpo secundario se utilizaron
inmunoglobulinas anti-IgG caninas unidas a peroxidada (Sigma) a una
dilución 1:500 en tampón TBS- leche.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
64
Como substrato de la reacción se utilizó 4-Cloro-1-Naftol (Bio-Rad) al
0,3% disuelto en metanol más peróxido de hidrógeno al 0,01%.
Los resultados se evaluaron posteriormente mediante el programa
informático Quantity One (Bio-Rad).
3.4.2. DETERMINACIÓN DE IgG ESPECÍFICA HUMANA FRENTE AL E-SL2 DE TOXOCARA
CANIS
Se determinó la IgG específica de 655 sueros de pacientes de una
población infantil procedente de la seroteca del Laboratorio frente a los
antígenos de excreción-secreción de larvas L2 de T. canis mediante
enzimoinmunoensayo (EIA Toxocara canis IgG. Test-Line, Clinical
Diagnostics).
Como población control se seleccionaron 310 sueros de donantes sanos
adultos procedentes de una población general.
El procedimiento fue realizado siguiendo las instrucciones del fabricante.
Como controles del ensayo y para determinar la positividad o negatividad de
un suero, en cada placa se dispusieron un blanco cuya absorbancia fue
siempre menor de 0,15, tal y como indica el control de calidad del ensayo; un
control negativo, cuyos valores de absorbancia fueron siempre menores o
iguales a 0,25; un control que determina el valor del punto de corte con
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
65
absorbancias entre 0,25 y 0,8 y por último un control positivo cuya
absorbancia fue siempre superior a 0,8.
La interpretación de los resultados se realizó en base a los valores de
absorbancia que se obtuvieron para cada suero y que fueron utilizados para
calcular el índice de positividad.
El índice de positividad (IP) viene determinado por la siguiente fórmula:
IP= Absorbancia de cada muestra/ Absorbancia media del punto de
corte
En función de este cálculo los resultados se interpretaron de la siguiente
manera:
Índice de Positividad Interpretación
Valores menores de 0,9 Negativo
Valores entre 0,9-1,1 Indeterminado
Valores mayores de 1,1 Positivo
4. EVALUACIÓN DE LA REACTIVIDAD CRUZADA
ENTRE TOXOCARA CANIS Y ANISAKIS SIMPLEX
Para la evaluación de la reactividad cruzada entre A. simplex y T. canis se
utilizó una mezcla de 11 sueros de pacientes diagnosticados de toxocarosis y
seleccionados tal y como se indica en el apartado 3.1.2. de este capítulo.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
66
La determinación de IgE específica se realizó mediante
fluoroenzimoinmunoensayo (FEIA), utilizando como fase sólida dos
extractos: 1) el extracto E-SL2 marcado con biotina acoplado a discos de
celulosa activados con estreptavidina y conjugados (Streptavidin
ImmunoCAP™); y 2) el extracto comercial de Anisakis simplex (Ref.: 14-4475-
01 Phadia) y se analizaron automáticamente en un analizador de
fluoroenzimoinmunoensayo UNICAP® 100 (Phadia).
4.1. MARCADO DEL E-SL2 CON BIOTINA
Para el marcado del E-SL2 con biotina se utilizó el sistema Biotin Labellin
Kit (Roche).
Reactivos
Solución de Bloqueo
PBS
Biotin-7-NHS (D-Biotinoil-Ácido ε aminocapróico-N hidroxisuccinimida)
Dimetilsulfóxido (DMSO)
Columnas de Sephadex G25
El extracto alergénico con un contenido del 40% de proteína, dializado y
liofilizado, se disolvió en 1 ml de tampón fosfato salino (PBS), a una
concentración final de 0,4 mg de proteína por ml.
Se diluyó 1 vial de 5 mg de la solución Biotin-7-NHS en 250µl de
DMSO agitando varias veces con vórtex. Posteriormente, se añadió el
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
67
volumen necesario de esta dilución a la solución del extracto alergénico en
PBS para una relación molar final 1:5 extracto-biotina y se incubó durante 2
horas a temperatura ambiente y con agitación suave.
La biotina no fijada a las proteínas, se separó mediante cromatografía de
exclusión a través de una columna de Shephadex® G-25. Para ello, la columna
fue lavada con 30 ml de PBS y bloqueada con 5 ml de solución de bloqueo.
A continuación, el extracto marcado con biotina fue añadido a la
columna y lavado con 2,5 ml de PBS. Para la elución de las proteínas
marcadas, se añadieron 3,5 ml de PBS a la columna y se recogieron alícuotas
de 0,5 ml. Para cada alícuota recogida se determinó la absorbancia a una
longitud de onda de 280 nm en un espectrofotómetro SmartSpec™ 3000 (Bio
Rad). Los viales con valores de absorbancia entre 0,9 y 1,0 fueron mezclados y
almacenados a -20ºC para su utilización.
4.2. FLUOROENZIMOINMUNOENSAYO (FEIA)
Para la determinación de IgE específica se siguió el protocolo
normalizado del uso del Streptavidin ImmunoCAP™ en UniCAP 100®
(Phadia). Brevemente, los Streptavidin ImmunoCAP™ previamente lavados,
fueron incubados con 50 µl del extracto biotinilado durante 1 h a 37ºC. Tras
el proceso de incubación la determinación de IgE específica fue realizada de
forma automatizada por el sistema.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
68
Como anticuerpo secundario se utilizaron anticuerpos monoclonales
anti-IgE humana conjugados a β-galactosidasa, producidos en ratón (Phadia).
Como sustrato para el revelado del análisis se utilizó 4-metil-umbeliferil-
β-D-galactosidasa al 0,01% y la reacción fue parada con carbonato sódico al
4%.
La lectura de los resultados se realizó automáticamente por el analizador.
Los datos fueron almacenados en la aplicación UDM (Phadia) para su análisis
posterior. Se utilizaron como valores de referencia los suministrados por la
casa comercial Phadia.
5. ANÁLISIS DE LA HUELLA PEPTÍDICA MEDIANTE
SECUENCIACIÓN
Las proteínas del E-SL2 identificadas como fijadoras de IgE canina y
humana fueron enviadas para su secuenciación a la Unidad de Proteómica de
la Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares del
Instituto Carlos III (Madrid). La secuenciación e identificación de cada una de
ellas se realizó mediante espectrometría de masas utilizando un sistema
MALDI-TOF/TOF-MS/MS y posterior búsqueda en las bases de datos
mediante el sistema Mascot.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
69
6. OBTENCIÓN DEL GEN QUE CODIFICA PARA TES-32
6.1. EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL
La extracción del ARN total fue realizada mediante el sistema de
aislamiento en kit RNA Isolation Kit (Stratagene). Este sistema utiliza tiocianato
de guanidina (Chomczynski y Sacchi, 1987) como desnaturalizante de
proteínas, inactivando RNasas y protegiendo al RNA de la degradación. Para
la extracción de ARN total de larvas el protocolo se adaptó a la extracción de
ARN total en células crecidas en suspensión, utilizando 2 ml de medio de
cultivo que contenía 4000 larvas como material de partida.
Reactivos para la extracción de ARN total mediante RNA Isolation Kit (Stratagene)
Agua DEPC
Tampón Tris HCl 5 M pH 7.5
Solución desnaturalizante: Isotiocianato de guanidina 4M, Citrato sódico 0,02 M, Sarcosil 0,5%
Acetato sódico 2 M pH 4.0
Cloroformo: Isoamilalcohol
Isopropanol
Fenol equilibrado pH 5.3-5.7 con ácido succínico 0,1M
Β-Mercaptoetanol 14,4 M
Etanol 100% (en agua DEPC)
Etanol 70% (en agua DEPC)
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
70
6.1.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
La solución de homogeneización fue preparada añadiendo 100 µl de β-
mercaptoetanol a 14 ml de solución desnaturalizante.
A continuación, se recogieron 2 ml de medio de cultivo, conteniendo un
promedio de 4000 L2 que fueron centrifugados a 13.000 r.p.m. durante 3
minutos. Una vez retirado el sobrenadante, se añadieron 5 ml de solución de
homogeneización al precipitado. La mezcla fue homogeneizada hasta su
rotura total en un homogeneizador manual con la ayuda de un émbolo.
Esta suspensión se incubó durante 1 minuto a temperatura ambiente y
fue transferida a un tubo de centrífuga de 15 ml.
6.1.2. EXTRACCIÓN
A la muestra en suspensión se le añadieron 0,5 ml de acetato sódico 2 M
(pH 4,0) y 5 ml de fenol (pH: 5,3-5,7) que fueron mezclados por inversión.
A continuación, se añadió 1 ml de cloroformo-isoamilalcohol y se agitó
vigorosamente con vórtex durante 10 segundos.
Tras 15 minutos de incubación en hielo, la muestra fue centrifugada a
13.000 r.p.m. durante 20 minutos y a una temperatura de 4°C, de tal forma
que se separó la fase acuosa, en la parte superior, de la fenólica, zona inferior.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
71
La fase acuosa conteniendo el ácido nucléico fue transferida a un nuevo
tubo al que se añadió un volumen igual al recogido de isopropanol y se
mezcló por inversión. Posteriormente se dejó precipitando a -20°C durante
toda la noche.
Tras la precipitación, la muestra se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 20
minutos y a 4°C. El precipitado obtenido (ARN) se disolvió en 1,5 ml de
solución de homogeneización. A esta solución se le añadió el mismo volumen
de isopropanol, se mezcló y se incubó durante 1 hora a -20°C .
Tras un nuevo paso de centrifugación a 13.000 r.p.m. durante 10
minutos a 4°C, el precipitado se lavó con etanol al 70%, se dejó secar y se
resuspendió en 500 µl de agua DEPC.
6.2. EXTRACCIÓN DE ARN MENSAJERO
Una vez obtenido el ARN total de las larvas, se extrajo el ARN
mensajero (ARNm) mediante el sistema de extracción en kit QuickPrep™ Micro
mRNA Purification Kit (Amersham Biosciences) que combina la capacidad
disruptiva y protectora del tiocianato de guanidina con la selectividad de una
cromatografía de afinidad utilizando una columna de oligo (dT) celulosa para
aislar el ARN poliadenilado.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
72
Reactivos para la extracción de ARN mensajero mRNA Purification Kit (Stratagene)
Columnas de Oligo (dT) celulosa: suspendidas en tampón de almacenamiento
conteniendo 0,15% de Biocida Kathon™ CG/1CP
Tampón de Extracción: Solución acuosa tamponada conteniendo tiocianato de
guanidina y N-lauril sarcosina
Tampón de alto contenido en sales: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 0,5 M
Tampón de bajo contenido en sales: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 0,1 M
Tampón de elución: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA
Tampón de muestra: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 3 M NaCl
Glicógeno: 5-10 mg de glicógeno en agua DEPC
Solución de Acetato Potásico 2,5 M (pH 5,0)
A 200 µl de ARN total obtenido mediante el sistema de aislamiento en
kit RNA Isolation Kit (Stratagene) se le añadieron 0,4 ml de tampón de
extracción. La muestra se diluyó añadiendo 0,8 ml de tampón de elución. A su
vez, 0,5 ml del tampón de elución se dejaron incubando a 65°C hasta su
posterior utilización.
La resina de oligo (dT) se resuspendió y se tomó una alícuota de 1 ml. A
continuación, la muestra y el oligo (dT) se centrifugaron a 13.000 r.p.m.
durante 1 minuto y a temperatura ambiente.
Se eliminó el sobrenadante del tubo que contenía el oligo (dT) y se le
añadió 1 ml del sobrenadante de la muestra. Se agitó durante 3 minutos hasta
conseguir una suspensión.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
73
Posteriormente, se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 10 segundos y se
eliminó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en 1 ml de tampón de
alto contenido en sales.
Se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 10 segundos y se eliminó el
sobrenadante. El lavado con el tampón de alto contenido en sales se repitió 4
veces más. El precipitado obtenido tras la última centrifugación se
resuspendió en 1 ml de tampón de bajo contenido en sales. Se centrifugó a
13.000 r.p.m. durante 10 segundos y se eliminó el sobrenadante. El lavado con
el tampón de bajo contenido en sales se repitió una vez más.
La resina obtenida se resuspendió en 300 µl de tampón de bajo
contenido en sales y esa suspensión se transfirió a una columna colocada en
un tubo de 1,5 ml.
Se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 5 segundos y se descartó el eluído.
Este proceso se repitió utilizando 500 µl del tampón de bajo contenido en
sales teniendo cuidado de no tocar la resina.
Se colocó la columna en un nuevo tubo y se añadieron 200 µl de tampón
de elución previamente calentado a 65°C y se centrifugó a 13.000 r.p.m.
durante 5 segundos.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
74
Se recogió el eluído que contenía el ARN mensajero y se precipitó
durante toda la noche a -80°C añadiendo 1/40 parte de glicógeno, 1/10 parte
de acetato potásico 2 M y 2 volúmenes de etanol al 100% preenfriado.
Tras la precipitación, el ARNm se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 1
hora a 4°C. Se retiró el sobrenadante, el precipitado se lavó con etanol al 70%
y se dejó secar a temperatura ambiente.
Finalmente el ARNm se resuspendió en 20 µl de agua DEPC.
6.3. SÍNTESIS DE ADN COMPLEMENTARIO (ADNc)
La síntesis del ADNc se realizó utilizando el sistema en kit cDNA
Synthesis Kit (Bioline) a partir de 100 ng de ARNm obtenido mediante el
sistema de aislamiento en kit QuickPrep™ Micro mRNA Purification Kit
(Amersham Biosciences) y utilizando los siguientes reactivos:
La muestra se incubó durante 10 minutos a 65°C. A continuación, se
enfrió durante 2 minutos en hielo.
Reactivos
Oligo (dT)18 1 µl
10 mM dNTPs 1 µl
ARNm 100ng
Agua DEPC hasta 10 µl
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
75
La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo con los siguientes
reactivos:
Reactivos
Tampón 5X RT 4 µl
Inhibidor de RNAsas 1 µl
Transcriptasa Reversa (200 U/ µl) 0,25 µl
Agua DEPC hasta 10 µl
Diez microlitros de esta reacción se añadieron a la muestra del ARN con
el Oligo(dT)18 y se incubó a 42°C durante 1 hora. Posteriormente la
transcriptasa inversa se inactivó a 70°C durante 15 minutos.
6.4. AMPLIFICACIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE
LA POLIMERASA DEL FRAGMENTO DE ADN
CORRESPONDIENTE AL GEN TES-32
La amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se
realizó a partir del ADNc obtenido mediante el sistema en kit cDNA Synthesis
Kit (Bioline).
Se diseñaron dos cebadores tomando como referencia la secuencia del
gen TES-32 (GenBank AF041023.1) y usando el programa OligoPerfect™
Designer de Invitrogen. La secuencia de oligonucleótidos de los cebadores
empleados para la reacción fue la siguiente:
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
76
TES-32F, 5´-GAATTCACGAGCCAACAACCACACA-3´
TES-32R, 5´-GGATCCAGCAGGAAACGAAGACGC-3´
La reacción de amplificación se llevó a cabo con los siguientes reactivos:
Reactivos
MgCl (Applied Biosystems) 2mM
GenAmp PCR Gold Buffer (Applied Biosystems) 1x
dNTPs (Bioline) 800µM
Iniciadores (Invitrogen) 0,5 µM
AmpliTaq® Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) 1U
Agua (libre DNasas, RNasas) hasta 50µl
La amplificación se llevó a cabo en un termociclador 2720 Thermal
Cycle (Applied Biosystem) con un paso inicial de desnaturalización a 94 °C
durante 5 minutos seguido de 30 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 52 °C
durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, y un paso de extensión final a
72°C durante 7 minutos.
6.4.1. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
El ADN de la secuencia amplificada se separó electroforéticamente en
un gel de agarosa al 1%.
Eco R I
Bam h I
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
77
Reactivos
Tampón TAE 50x (National Diagnostics) 1x
Tampón de carga 5x (Sigma) 1x
Agarosa (Pronadisa) 1%
Bromuro de Etidio 10 mg/ml (Sigma) 2 µg/ml
El gel se preparó disolviendo agarosa al 1% en tampón TAE, por
calentamiento hasta ebullición en un microondas. Se enfrió hasta 50°C y se
añadió el bromuro de etidio.
La solución se dispensó sobre un molde al que se colocó previamente un
peine para formar los pocillos y así poder depositar las muestras. Se dejó
solidificar por enfriamiento. El gel fue finalmente introducido en una cubeta
horizontal Mini-Sub® Cell (Bio-Rad) y cubierto con tampón TAE.
Se cargaron 10 µl de la muestra de ADN amplificado y 2 µl de tampón
de carga. Como patrón de pesos moleculares se utilizó el HyperLadder I
(Bioline).
La electroforesis se realizó a un voltaje constante de 90 V hasta que el
azul de bromofenol alcanzó la mitad del gel.
El resultado se visualizó utilizando el sistema ChemiDoc™XRS (Bio-
Rad).
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
78
6.4.2. PURIFICACIÓN DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO
El producto de PCR obtenido se purificó con el kit High Pure PCR
Product Purification Kit (Roche).
Reactivos
Tampón de Unión (3M Tiocianato de guanidina, 10mM Tris-HCl, 5% de Etanol, pH 6,6)
Tampón de Lavado (20mM NaCl, 2mM Tris-HCl pH 7,5, 90% de Etanol)
Tampón de Elución (10mM Tris-HCl pH 8,5)
Tras la amplificación por PCR, se ajustó el volumen de la muestra a 100
µl y se añadieron 500 µl de tampón de unión.
A continuación, se insertó una columna de purificación en un tubo
colector y se transfirió la muestra anteriormente preparada. Se centrifugó
durante 1 minuto a 13.000 r.p.m. a una temperatura de 22°C.
A continuación, se eliminó el eluído, se añadieron a la columna 500 µl de
tampón de lavado y se centrifugó 1 minuto a 13.000 r.p.m.
Tras la centrifugación se volvió a eliminar el eluído, se añadieron 200 µl
de tampón de lavado y se centrifugó 1 minuto a 13.000 r.p.m.
Posteriormente se eliminó el eluído, se añadieron 50 µl de tampón de
elución y se volvió a centrifugar durante 1 minuto a 13.000 r.p.m.
El ADN purificado se centrifugó durante 3 minutos a 13.000 r.p.m. para
eliminar las posibles fibras de cristal que pudiera haber en el eluído final.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
79
El producto de PCR purificado se cuantificó mediante el
espectofotómetro NanoDrop® ND-1000 (Thermo Scientific) y se almacenó a
-20°C en tampón de elución para su posterior utilización.
6.5. CLONACIÓN DEL GEN TES-32 EN EL VECTOR pCR2.1
El producto de PCR purificado se ligó al vector de clonación TA
Cloning® Kit (Invitrogen). La Taq polimerasa añade al producto de PCR una
deoxiadenosina en el extremo 3´, que junto a la deoxitimidina que lleva
incorporada el vector pCR 2.1 en el extremo 3´, asegura la ligación del
producto de PCR y el vector.
Se utilizaron 50 ng de vector y 9 ng del producto de PCR. La reacción de
ligación se llevó a cabo con los siguientes reactivos:
Reactivos
Producto de PCR 1 µl
Buffer de Ligación 10x 1 µl
Vector pCR®2.1 (25ng/µl) 2 µl
Agua hasta 9 µl
T4 ADN ligasa (4 unidades) 1 µl
La reacción se incubó durante toda la noche a 14 °C.
Se utilizaron 10 µl de producto de ligación para transformar 200 µl de
células competentes E. coli TOP 10 F´. Para realizar la identificación de
colonias recombinantes (blancas) se añadió IPTG y X-Gal a las placas. El
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
80
color blanco de la colonia indica que el gen TES-32 se insertó en el vector en
el sitio correcto, es decir, interrumpiendo el gen lacZ e inactivando la enzima
β-galactosidasa. De este modo, al no ser hidrolizado el sustrato cromogénico
X-Gal, no se produce coloración azul de las colonias.
Para ello se mantuvo esta mezcla de células-producto de ligación en
hielo durante 45 minutos. Posteriormente, se sometió a un choque térmico a
42°C durante 2 minutos y se introdujo nuevamente en hielo. Se añadieron 800
µl de medio SOC atemperado y se incubó durante 1 hora a 37°C con
agitación.
Para la selección de las células transformadas se sembraron 200 µl en
placas de agar LB suplementado con kanamicina (50µg/ml) y X-Gal y se
incubaron durante toda la noche a 37°C.
De la población crecida se seleccionaron 8 colonias blancas (color
correspondiente a los clones que contienen el plásmido recombinante) y se
sembraron en 4 ml de caldo LB suplementado con kanamicina a una
concentración de 50µg/ml. Se incubaron durante toda la noche a 37°C en
agitación (250 r.p.m.) en un incubador (Sanyo Orbital Incubator).
Tras la incubación se procedió a realizar la extracción de ADN
plasmídico por el método de lisis alcalina descrito por Birnboim y Doly
(1979).
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
81
Reactivos
Solución de Lisis I (50 mM Glucosa, 25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8)
Solución NaOH-SDS (0,2 M NaOH, 1% SDS, agua destilada)
Solución de Lisis III (5 M Acetato Potásico, Ácido acético glacial, agua destilada)
Tampón TE-RNasa (50 µl de TE y 0,5 µl de RNAsa a 1mg/ml)
Se recogieron las células crecidas durante toda la noche en caldo LB
suplementado con kanamicina a 37°C en agitación (250 r.p.m.) y se
centrifugaron a 13.000 r.p.m. durante 3 minutos a temperatura ambiente.
El precipitado se resuspendió en 200 µl de Solución de Lisis I y se dejó
incubando 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron
400 µl de Solución NaOH-SDS, se mezcló con movimiento de muñeca y se
dejó 5 minutos incubando en hielo. Tras la incubación, se añadieron 300 µl de
Solución de Lisis III, se mezcló de forma similar y se dejó incubando en hielo
durante 15 minutos.
Posteriormente, se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos a
temperatura ambiente y el sobrenadante se transfirió a otro tubo de centrífuga.
Se añadió un volumen de fenol-cloroformo, se agitó con vórtex durante
2 minutos y se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos a temperatura
ambiente.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
82
Al sobrenadante se le añadieron 2 volúmenes de etanol al 100%
previamente enfriado, se mezcló con movimiento de muñeca y se incubó a -
20ºC durante 30 minutos.
Tras la precipitación, se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 20 minutos a
temperatura ambiente y el precipitado se lavó con 500 µl de etanol al 70%
previamente enfriado. El precipitado se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 5
minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante y se dejó secar durante 15 minutos
a 37°C.
Finalmente el precipitado se resuspendió en 40 µl de tampón TE-RNasa
durante toda la noche a 4°C.
6.6. IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS RECOMBINANTES
6.6.1. ANÁLISIS MEDIANTE PCR
Cada una de las colonias seleccionadas fue diluída en 7,5 µl de agua
ultrapura que sirvió como ADN molde. La reacción de PCR se llevó a cabo
con los mismos cebadores diseñados tomando como referencia la secuencia
del gen TES-32 (GenBank AF041023.1).
La reacción de amplificación se llevó a cabo con los siguientes reactivos:
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
83
Reactivos
MgCl (Applied Biosystems) 2mM
GenAmp PCR Gold Buffer (Applied Biosystems) 1x
dNTPs (Bioline) 800µM
Iniciadores (Invitrogen) 0,5 µM
AmpliTaq® Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) 1U
Agua (libre DNasas, RNAsas) hasta 50µl
La amplificación se llevó a cabo en un termociclador 2720 Thermal
Cycle (Applied Biosystem), con un paso inicial de desnaturalización a 94 °C
durante 5 minutos seguido de 30 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 52 °C
durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, y un paso de extensión final a
72°C durante 7 minutos.
6.6.2. ANÁLISIS MEDIANTE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
El análisis mediante enzimas de restricción se utiliza como proceso de
confirmación de las colonias positivas. Para ello el ADN plasmídico fue
digerido con el enzima de restricción EcoR I (Takara). La digestión se llevó a
cabo durante 1 hora a 37°C, utilizando los siguientes reactivos:
Reactivos
Tampón H 10X (500 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 M NaCl) 1X
Enzima EcoR I 50U 1U
ADN plasmídico 1 µg
Agua (libre DNAsas, RNAsas) hasta 20 µl
Finalmente el enzima se inactivó a 70°C durante 15 minutos.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
84
6.7. SECUENCIACIÓN
EL ADN clonado se purificó mediante el sistema de purificación de
ADN plasmídico en kit High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche).
Reactivos
Tampón de Suspensión (50 mM Tris-HCl y 10 mM EDTA pH 8,0)
RNAsa A (0,1 mg/ml)
Tampón de Lisis (0,2 M NaOH y 1% SDS)
Tampón de Unión (4M Hidroclorido de guanidina y 0,5 M de acetato potásico pH 4,2)
Tampón de Lavado (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl pH 7,5, 80% Etanol)
Tampón de Elución (10 mM Tris-HCl pH 8,5)
Para ello se preparó un cultivo de 4 ml en caldo LB suplementado con
kanamicina (50µg/ml) a partir de una colonia recombinante, analizada por
PCR y confirmada por digestión con el enzima de restricción EcoR I, y se
creció durante toda la noche a 37°C en agitación (250 r.p.m.).
Las bacterias se centrifugaron a 13.000 r.p.m. durante 3 minutos a
temperatura ambiente y se retiró el sobrenadante. A continuación, se
añadieron 250 µl de tampón de suspensión más RNAsa y se agitó hasta
resuspender toda la suspensión celular.
Una vez resuspendida, se añadieron 250 µl de tampón de lisis, se mezcló
por inversión y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
85
Posteriormente se añadieron 350 µl de tampón de unión previamente
enfriado en hielo, se mezcló por inversión y se dejó incubar durante 5 minutos
en hielo. A continuación, se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos.
Se insertó una columna de purificación en un tubo colector y se
transfirió la muestra. Se centrifugó durante 1 minuto a velocidad máxima
(13.000 r.p.m.) a una temperatura de 22 °C.
Se eliminó el eluído, se añadieron a la columna 700 µl de tampón de
lavado y se centrifugó 1 minuto a velocidad máxima.
De nuevo se eliminó el eluído y se centrifugó 1 minuto a velocidad
máxima para eliminar todo el tampón de lavado. Se retiró el eluído, se
añadieron 100 µl de agua destilada ultrapura y se centrifugó 1 minuto a
velocidad máxima.
El ADN plasmídico purificado se centrifugó durante 3 minutos a
velocidad máxima para eliminar las posibles fibras de cristal que pudiera haber
en el eluído final.
Para la identificación del inserto clonado en el vector pCR 2.1 por
secuenciación de ADN, las muestras se cuantificaron mediante el
espectofotómetro NanoDrop® ND-1000 (Thermo Scientific) y fueron enviadas
al Servicio de Secuenciación de Sistemas Genómicos S. L. (Valencia).
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
86
6.8. ALMACENAMIENTO DE LOS CLONES
Una vez comprobado que el gen clonado era TES-32, se preparó un
stock bacteriano en glicerol. Para ello se inocularon 10 ml de caldo LB
suplementado con kanamicina (50µg/ml) con una colonia positiva. Se incubó
durante toda la noche a 37°C y con agitación (250 r.p.m.). Posteriormente se
añadió 4,5 ml de medio glicerol-líquido al cultivo, se mezcló bien y se alicuotó
en tubos de 1 ml. El stock en glicerol de las bacterias con el inserto se
almacenó a -80ºC.
RESULTADOS
R E S U L T A D O S
88
1. OBTENCIÓN DE LARVAS INFECTANTES (L2) DE
TOXOCARA CANIS MEDIANTE CULTIVO IN VITRO
Las hembras fecundadas de T. canis, obtenidas del intestino delgado del
hospedador definitivo, desovaron a las 24 horas de su incubación a 37 °C.
El desarrollo in vitro de larvas infectantes de T. canis se produjo en un
periodo máximo de 31 días, en unas condiciones de 27°C de temperatura y
una humedad relativa del 80%. El periodo de supervivencia de las larvas fue
de 16 meses con una mortalidad del 20%. Eclosionaron 2000 larvas
infectantes por ml de medio de cultivo.
Las imágenes del proceso de eclosión de los huevos de T. canis se
muestran en la Figura 9.
R E S U L T A D O S
89
Figura 9. Proceso de eclosión de huevos de T. canis
a) Ruptura de la cubierta proteica
b) Ruptura de las cubiertas proteica y lipídica
c) Larva eclosionando
d) Larvas libres en medio de cultivo
R E S U L T A D O S
90
2. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LOS
PRODUCTOS DE EXCRECIÓN-SECRECIÓN DE LAS
LARVAS L2 (E-SL2)
La concentración de proteínas totales del E-SL2, obtenida mediante la
técnica del ácido bicinconínico, fue del 40% (mg proteína/100 mg de extracto
liofilizado).
2.1. ANÁLISIS DEL PERFIL PROTEICO DEL E-SL2 MEDIANTE
ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL (1D)
Los resultados obtenidos del perfil proteico en gel de acrilamida al 12,5%
se muestran en la Figura 10.
Figura 10. Perfil proteico del E-SL2 de T.
canis en gel de poliacrilamida al 12,5%.
M: marcador de masa molecular. E: extracto
de los productos de excreción-secreción de
larvas L2 de T. canis
kDa M E
250- 150- 100- 75-
50
37-
25-
37
50
73-77
30-35
R E S U L T A D O S
91
El E-SL2 analizado en gel de poliacrilamida al 12,5% mostró un perfil
proteico constituido por 8 componentes de naturaleza proteica con masas
moleculares entre 25 y 77 kDa. Dentro de este rango, destacan dos bandas de
37 y 50 kDa y otros dos grupos de componentes de 30-35 y 73-77 kDa que se
tiñeron con más intensidad.
Para una mejor resolución de estos componentes proteicos se abordó la
separación mediante 2D-electroforesis cuyos resultados se muestran a
continuación.
R E S U L T A D O S
92
2.2. ANÁLISIS DEL PERFIL PROTEICO MEDIANTE
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D)
Los resultados obtenidos del perfil proteico mediante 2D se muestran
en las Figuras 11 y 12.
Figura 11. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis
mediante 2D y teñido con azul de Coomassie
M: marcador de masa molecular
pI: punto isoeléctrico
Figura 12. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis
mediante 2D y teñido con tinción de plata
M: marcador de masa molecular
pI: punto isoeléctrico
M 3 pI 10 M 3 pI 10
Como puede observarse en las Figuras 11 y 12, en la 2D-electroforesis
realizada con el E-SL2 se identificaron 40 proteínas distribuidas en un rango
de pH de 5,3 a 9,8 y con masas moleculares entre los 30 y 100 kDa.
kDa
75
50
37
25
kDa
75
50
37
25
R E S U L T A D O S
93
Los patrones que se revelan con las dos tinciones son distintos. En el
perfil proteico resultante de la 2D-electroforesis y tinción con azul de
Coomassie (Figura 11) aparecen tres componentes de masa molecular 100
kDa y pI entre 9,3 y 9,6 que no se observan en la tinción de plata. Así mismo,
en el perfil proteico resultante de la 2D-electroforesis y tinción de plata
(Figura 12) aparece un componente de 50 kDa y pI 7 y una serie de
componentes con masa molecular de 75 kDa y en el rango de pI de 5,3 a 9,8,
que no se observan en la tinción con azul de Coomassie.
Sin embargo, tanto en el perfil proteico resultante de la 2D-
electroforesis y tinción con azul de Coomassie (Figura 11) como en la tinción
de plata (Figura 12), destacan dos grupos de componentes: un grupo entre los
30 y 37 kDa y pI entre 5,5 y 9,8; y otro grupo de componentes proteicos entre
los 65 y los 75 kDa y con un pI entre 5,3 y 9,8.
R E S U L T A D O S
94
3. CARACTERIZACIÓN INMUNOQUÍMICA
3.1. RESULTADOS OBTENIDOS CON SUEROS CANINOS
3.1.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgE
3.1.1.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE SEPARADAS MEDIANTE
ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL (1D-Inmunodetección)
Los resultados de la 1D-Inmunodetección se muestran en la Figura 13.
Figura 13. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del E-SL2 de T.canis
M: marcador de masa molecular
Calles 1-20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis; calles 21-25: sueros de perros sanos
y libres de helmintos
kDa M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
150
75
50
37
25
En la Tabla 3 se muestran las masas moleculares de cada antígeno tras
realizar el análisis de imagen con el programa informático Quantity One (Bio-
Rad).
R E S U L T A D O S
95
Tabla 3. Masas moleculares de las proteínas fijadoras de IgE del E-
SL2. S1-S20: sueros caninos parasitados sólo por T. canis
S1 >200 200 140 120 110 80 75
S2 >200 200 140 120 110 80 75
S3
S4 >200 140 120 95 80 75
S5 >200 95 80 75
S6 >200 140 120 95 80 75 42
S7 >200 140 120 110 95 80 75 35 32
S8
S9 >200 120 110 95 80 75 50 35 32
S10 >200 120 110 95 80 75
S11 >200 200 120 110 95 80 75 70
S12 >200 200 120 110 95 80 75 70
S13 >200 200
S14 200 120 110 95 80 75 70
S15 200 120 110 95 80
S16 200 120 110 95 80 75
S17 >200 200 120 110 95 80 75
S18 >200 200 120 110 95 80 75 70
S19 >200 200 120 110 95 80 75 70
S20 >200 200
Los diferentes sueros mostraron un perfil antigénico con 13
componentes de masas moleculares entre los 32 y 200 kDa. El 80% de los
sueros reconocieron el componente proteico con MM de 80 kDa. Tanto el
grupo de componentes con MM >200 kDa como los componentes de 120 y
75 kDa fueron reconocidos por el 75% de los sueros de la muestra. El
componente con MM de 95 kDa fue reconocido por el 70% de los sueros de
este estudio. El componente con MM de 110 kDa fue reconocido por el 65%
R E S U L T A D O S
96
de los sueros de perros naturalmente infectados por T.canis. El 25% de los
sueros de este estudio reconocieron el componente con MM de 70 kDa.
En la zona de bajo peso molecular, los componentes de 50 y 42 kDa
fueron reconocidos por el 5% de los sueros de perros naturalmente infectados
por T. canis y el 10% de estos sueros reconocieron los componentes con MM
de 35 y 32 kDa.
Los sueros utilizados como controles no reconocieron ningún antígeno
capaz de fijar IgE en el E-SL2.
3.1.1.2. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE SEPARADAS MEDIANTE
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D-Inmunodetección)
En la Figura 14 se muestran los resultados de la 2D-Inmunodetección
del E-SL2, para el rango de isoelectroenfoque de pH 3-10, utilizando la
mezcla de los 20 sueros caninos de toxocarosis. Las flechas indican las
proteínas que fueron enviadas a secuenciar.
Figura 14. 2D-Inmunodetección de alérgenos del E-SL2 de T.canis utilizando la mezcla de
los 20 sueros de perros de toxocarosis
kDa
75
50
37
25
M 3 pI 10
1
2
R E S U L T A D O S
97
El análisis reveló 20 proteínas alergénicas con masas moleculares entre
los 32 y los 75 kDa con un rango amplio de pI (3-10). Podemos distinguir dos
zonas de inmunorreacción, una de 30-40 kDa y pI entre 3 y 10; y otra zona
entre los 50-75 kDa y pI entre 5 y 10.
Se secuenciaron los componentes 1 (32 kDa y pI 7,3) y 2 (50 kDa y pI
6,3) (Figura 14).
Los resultados de la secuenciación obtenidos mediante análisis de la
huella peptídica y búsqueda en la base de datos MASCOT se muestran en la
Tabla 4.
Tabla 4. Resultados del análisis de huella peptídica y búsqueda en la base de datos MASCOT de
los componentes 1 y 2
MUESTRA Nº Descripción de Proteína Identificada Mm (Da) pI Identidad
1 gi|2773355 Lectina tipo C TES-32 Toxocara canis 24519 8,1 16%
2 gi|4838459 Lectina tipo C o TES-70 Toxocara canis 31621 5,67 6%
El componente 1 mostró una identidad del 16% con la Lectina tipo C
TES-32 de T.canis y el componente 2 mostró una identidad del 6% con la
Lectina tipo C TES-70 de T. canis. En las Figuras 15 y 16 se muestran los
espectros de fragmentación y los resultados de la búsqueda en la base de datos
MASCOT (Tabla 5 y 6) correspondientes a las proteínas identificadas como
TES-32 (Figura 15) y TES-70 (Figura 16).
R E S U L T A D O S
98
Figura 15. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente al alérgeno
identificado como TES-32.
Tabla 5. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-32).
Nombre de la muestra MUESTRA 1
pM/pI observados 32 kDa/7,3
pM/pI teóricos 24.5 kDa/8,13
Descripción de la proteína identificada Lectina tipo C de excreción secreción TES-32 T.canis
Secuencia identificada ACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFLFNQASDWC TQTGSR
Porcentaje de cobertura 16%
Puntuación total 172
Valor esperado 3.30E-11
Resultado mediante el sistema NCBI gi|2773355
R E S U L T A D O S
99
Figura 16. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente al alérgeno
identificado como TES-70.
Tabla 6. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-70).
Nombre de la muestra MUESTRA 1
pM/pI observados 50 kDa/6,3
pM/pI teóricos 31.6 kDa/5,67
Descripción de la proteína identificada Lectina tipo C Tc-ctl-4 TES-70 T. canis
Secuencia identificada GVQTYWLGLNR NPQG FICK
Porcentaje de cobertura 6%
Puntuación total 134
Valor esperado 1.60E-07
Resultado mediante el sistema NCBI gi|4838459
R E S U L T A D O S
100
3.1.2. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgG
3.1.2.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgG SEPARADAS
MEDIANTE ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL (1D-Inmunodetección)
En la Figura 17 se muestra el perfil antigénico del E-SL2.
Figura 17. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgG del E-SL2 de T.canis.
M: marcador de masa molecular.
Calles 1-20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis y confirmados por necropsia; Calles
21-25: sueros de perros sanos libres de helmintos.
kDa M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
En la Tabla 7 se muestran las masas moleculares correspondientes a los
antígenos detectados.
200
75
50
37
25
R E S U L T A D O S
101
Tabla 7. Masas moleculares del perfil antigénico de las proteínas fijadoras de IgG del E-
SL2. S1-S20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis y confirmados por necropsia.
S1 >200 200 140 120 110 95 80
S2 >200 200 140 120 100 95 80 55 42 37 35 32
S3 >200 140 120 110 95 80 55 42 35 32
S4 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 42 37 35 32
S5 >200 200 140 120 110 95 80 35
S6 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32
S7 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32
S8
S9 >200 200 140 120 95 80 55 37 35 32
S10 >200 200 140 120 110 95 80 37 35 32
S11 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32
S12 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32
S13 37 35
S14 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32
S15 >200 200 55 50 42
S16 >200 200
S17 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32
S18 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32
S19 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32
S20 200 95 80
Los diferentes sueros mostraron un perfil antigénico con 14
componentes de masas moleculares entre los 32 y 200 kDa. El grupo de
componentes con MM > 200 kDa fueron reconocidos por el 85% de los
sueros empleados en este estudio. Los componentes con MM de 80 y 95 kDa
fueron reconocidos por el 80% de los sueros de perros naturalmente
infectados por T. canis. Tres de estos antígenos con MM de 35, 120 y 140 kDa,
R E S U L T A D O S
102
fueron reconocidos por el 75% de los sueros de perros naturalmente
infectados por T. canis. El componente de 110 kDa fue reconocido por el 70%
de los sueros de este estudio. El 65% de los sueros caninos reconocieron los
componentes con MM de 32, 37 y 55 kDa. El componente con MM de 42
kDa fue reconocido por el 60% de los sueros de perros naturalmente
infectados por T. canis. Tanto el componente de 50 kDa como el de 70 kDa
fueron reconocidos por el 45% de los sueros caninos empleados en este
estudio.
Ningún suero control reconoció antígenos del extracto.
R E S U L T A D O S
103
3.2. RESULTADOS OBTENIDOS EN SUEROS HUMANOS
3.2.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE
3.2.1.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE DEL E-SL2 SEPARADAS
MEDIANTE ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL (1D-Inmunodetección)
En la Figura 18 se muestra la 1D-Inmunodetección de proteínas
fijadoras de IgE del E-SL2 con los 11 sueros de pacientes pediátricos
seropositivos asintomáticos.
Figura 18. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de
IgE del E-SL2 de T.canis.
M: marcador de masa molecular.
Calles 1-11: sueros de pacientes pediátricos seropositivos;
Calle 12: mezcla de sueros negativos.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
kDa
100
75
50
37
25
R E S U L T A D O S
104
Los resultados muestran 8 proteínas capaces de fijar IgE con masas
moleculares de 25, 27, 32, 35, 40, 45, 75 y 100 kDa. Entre ellas, la proteína de
35 kDa fue reconocida por el 90% de los sueros de pacientes.
La mezcla de sueros negativos no reconoció ningún antígeno del E-SL2.
3.2.1.2. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE SEPARADAS MEDIANTE
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D-Inmunodetección)
En la Figura 19 se muestran los resultados obtenidos mediante 2D-
Inmunodetección utilizando la mezcla de los 11 sueros de individuos
seropositivos.
Figura 19. 2D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del E-SL2 de T.canis
Se detectaron 17 alérgenos con pesos moleculares entre los 32 y los 100
kDa y pI entre 3 y 9.
GRUPO 2
GRUPO 1
R E S U L T A D O S
105
Para facilitar la interpretación de los resultados obtenidos mediante
análisis de la huella peptídica y búsqueda en la base de datos MASCOT de los
17 componentes identificados, las proteínas alergénicas detectadas se
dividieron en dos grupos.
En el grupo 1 (Figura 19), diez de los componentes mostraron identidad
peptídica (entre 10-28%) con la proteína TES-32 de T. canis. En el grupo 2
(Figura 19), tres de los componentes fueron identificados como TES-70 (entre
3-6% de identidad peptídica). Cuatro de las proteínas alergénicas enviadas a
secuenciar no pudieron ser identificadas.
En la Tabla 8 se muestran los resultados del análisis de huella peptídica y
búsqueda en la base de datos MASCOT para los dos grupos de alérgenos
identificados.
Tabla 8. Resultados del análisis de huella peptídica y búsqueda en la base de datos
MASCOT de los dos grupos de alérgenos identificados.
MUESTRA Nº Descripción de la proteína Mm pI Identidad
GRUPO 1 gi|2773355 Lectina tipo C TES-32 Toxocara canis 24519 8,13 10-28%
GRUPO 2 gi|4838459 Tc-ctl-4 Lectina tipo C o TES-70 31621 5,67 3-6%
En las Figuras 20 y 21 se muestran los espectros de fragmentación y los
resultados de la búsqueda en la base de datos MASCOT (Tabla 9 y 10)
correspondientes a las proteínas identificadas como TES-32 (Figura 20) y
TES-70 (Figura 21).
R E S U L T A D O S
106
Figura 20. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente a los alérgenos
identificados como TES-32.
Tabla 9. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-32).
Nombre de la muestra GRUPO 1
pM/pI observados 32 kDa/3-9
pM/pI teóricos 24.5 kDa/8,13
Descripción de la proteína identificada Lectina tipo C de excreción secreción TES-32 T.canis
Secuencia identificada ACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFLFNQASDWCTQTGSR. YWIGVNR
Porcentaje de cobertura 10-28%
Puntuación total 200
Valor esperado 5.20E-14
Resultado mediante el sistema NCBI gi|2773355
R E S U L T A D O S
107
Figura 21. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente a los alérgenos
identificados como TES-70
Tabla 10. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-70)
Nombre de la muestra GRUPO 2
pM/pI observados 50-70 kDa/5-6,6
pM/pI teóricos 31.6 kDa/5,67
Descripción de la proteína identificada Lectina tipo C Tc-ctl-4 TES-70 T. canis
Secuencia identificada GVQTYWLGLNR. NPQGFICK
Porcentaje de cobertura 3-6%
Puntuación total 136
Valor esperado 1.30E-07
Resultado mediante el sistema NCBI gi|4838459
R E S U L T A D O S
108
3.2.2. MEDIDA Y EVALUACIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgG
3.2.2.1. DETERMINACIÓN DE IgG ESPECÍFICA HUMANA FRENTE AL E-SL2 DE
TOXOCARA CANIS MEDIANTE ENZIMOINMUNOENSAYO
Los resultados de la prueba de ELISA IgG (EIA Toxocara canis IgG.
Test-Line, Clinical Diagnostics) de los 655 sueros de una población infantil
revelaron una prevalencia de toxocarosis de 0,017.
Los sueros de los 11 pacientes seropositivos fueron utilizados en la
detección mediante 1D-Inmunodetección de alérgenos del E-SL2 de T. canis.
En la Tabla 11 se indican los resultados obtenidos junto a otros datos de
interés.
Tabla 11. Características demográficas y clínicas de la población con anticuerpos frente al
E-SL2 de T. canis
MUESTRA EDAD ATOPIAA EOSINOFILIAB ECPC sIgED sIgGE
1 > 5 Sí Normal No realizada + +
2 > 5 Sí Normal 18 + +
3 > 5 No Aumentada 11 + +
4 > 5 Sí Aumentada 6 + +
5 > 5 Sí No realizada 37 + +
6 < 5 No Normal 29 + +
7 < 5 No Aumentada 200 + +
8 < 5 No Normal 32 + +
9 < 5 No Aumentada 15 + +
10 < 5 Sí Aumentada 32 + +
11 < 5 Sí Aumentada 31 + +
R E S U L T A D O S
109
A. Valoración de la atopia mediante Phadiatop y fx 5 (Phadia). Los resultados positivos se
refieren a la positividad de cualquiera de las dos pruebas y los negativos a la negatividad de
ambas.
B. Se consideran valores elevados cuando exceden de 500 eosinófilos/mm3.
C. Se consideran valores positivos los situados por encima de 29 mcg/l (87% percentil)
D. IgE específica mediante SDS-PAGE Inmunotransferencia con E-SL2.
E. IgG específica mediante ELISA frente a T. canis.
R E S U L T A D O S
110
4. EVALUACIÓN DE LA REACTIVIDAD CRUZADA
ENTRE ANISAKIS SIMPLEX Y TOXOCARA CANIS
Los resultados obtenidos de la determinación de IgE específica mediante
fluoroenzimoinmunoensayo (FEIA) para evaluar la reactividad cruzada entre
A. simplex y T. canis se muestran en la Tabla 12. Se consideraron valores
positivos los superiores a 0,1 kU/L.
Tabla 12. Valores de IgE específica obtenidos mediante FEIA con un pool de 11 sueros de
pacientes diagnosticados de toxocariosis
IgE específica T. canis 4,7 kU/L
IgE específica A. simplex 0,49 kU/L
La respuesta IgE del pool de sueros de pacientes diagnosticados de
toxocariosis frente al E-SL2 fue claramente positivo. Asimismo este pool de
sueros de pacientes, que no poseen ningún indicio clínico sugestivo de
anisakidosis, origina una respuesta ligeramente positiva al extracto completo
de Anisakis simplex.
5. OBTENCIÓN DEL GEN QUE CODIFICA PARA TES-32
5.1. EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL Y SÍNTESIS DE ADN c
A partir de 0,2 ml de L2 se obtuvieron 7,5 µg/µl de ARN total. De éstos,
2 µg fueron utilizados en la síntesis de ADNc.
R E S U L T A D O S
111
5.2. AMPLIFICACIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE
LA POLIMERASA (PCR) DEL FRAGMENTO DE ADN
CORRESPONDIENTE AL GEN TES-32
Los resultados de la amplificación (Figura 22) mostraron un único
fragmento de ADN con un tamaño de 700 pb.
Figura 22. Visualización en gel de agarosa al 1% del fragmento
amplificado
M: marcador HyperLadder IV
Calle 1: ADN T. canis; Calle 2: control reacción; Calle 3: control
negativo
M 1 2 3
5.3. CLONACIÓN EN EL VECTOR pCR2.1
El porcentaje de colonias recombinantes obtenidas fue del 86%.
1000- 900- 800- 700- 600- 500- 400- 300-
200-
100-
R E S U L T A D O S
112
5.4. IDENTIFICACIÓN DE LAS COLONIAS RECOMBINANTES
5.4.1. ANÁLISIS MEDIANTE PCR
La Figura 23 muestra el resultado de la amplificación mediante PCR de 8
colonias recombinantes seleccionadas al azar.
Figura 23. Comprobación mediante PCR de la ligación del inserto al vector pCR 2.1
en gel de agarosa al 1%
M1: marcador HyperLadder I
M2: marcador HyperLadder IV
Calle 1-8: ADN plasmídico de 8 colonias recombinantes elegidas al azar; Calle 9:
control de reacción; Calle 10: control negativo
M1 M2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Se observó que las 8 colonias elegidas al azar habían incorporado el
inserto de 700 pb.
800
1500
5000
R E S U L T A D O S
113
5.4.2. COMPROBACIÓN POR ANÁLISIS MEDIANTE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
A su vez se comprobó el tamaño del inserto mediante digestión con el
enzima EcoR I. El vector de clonación pCR 2.1 tiene una secuencia EcoR I a
ambos lados del sitio de clonación, permitiendo la liberación del inserto
clonado.
Tras la separación electroforética de los productos de restricción se
esperó obtener dos fragmentos, uno de 3931 pb correspondiente al vector de
clonación pCR2.1 y otro de 700 pb correspondiente al inserto. Como se
puede observar en la Figura 24, las colonias 1, 4, 5 y 7 habían incorporado el
inserto de 700 pb.
R E S U L T A D O S
114
Figura 24. Comprobación de la inserción del gen TES-32 en el
vector pCR 2.1 mediante digestión con enzima de restricción
EcoR I en gel de agarosa al 0,8%
M1: marcador HyperLadder I
M2: marcador HyperLadder IV
Calle 1-8:ADN plasmídico de 8 colonias recombinantes elegidas
al azar
M1 M2 1 2 3 4 5 6 7 8
Se realizó un stock de las colonias que habían incorporado el inserto de
700 pb para su conservación y posterior utilización.
800
1500
5000
R E S U L T A D O S
115
5.5. SECUENCIACIÓN
Los resultados de la secuenciación obtenidos mediante la búsqueda en la
base de datos BLAST se muestran en la Tabla 13.
Tabla 13. Resultado de la búsqueda en la base de datos BLAST
Nº Acceso Descripción Alineamiento
con la secuencia
Identificación
Máxima
AF041023.1 Toxocara canis TES-32 Lectina tipo C 98% 98%
La secuencia comparte 689 pb y presenta un alineamiento del 98% con
la secuencia de la Lectina tipo C TES-32 de Toxocara canis descrita por Loukas
y col. (1999), difiriendo en tan sólo 9 nucleótidos.
En la Figura 25 se muestra el alineamiento de la secuencia clonada con la
secuencia AF041023.1.
R E S U L T A D O S
116
Figura 25. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AF041023.1
1 TCGTCGTTTTGTTATGNCTCCACCTGTCCGCCACTAATGCTTGCGCCACCAACAATGACT 60 39 ................T............A....A......................... 98 61 GTGGTATTTTCCAAGTGTGCGTTAACAACGTCTGCGTTGCCAATAACCAAGGATGCAATC 120 99 ............................................................ 158 121 CGCCTTGTGTGGCTCCGCAGGTTTGCGTTGCACCAATGTGTGTCGCCCCTCCACCGGCAG 180 159 ............................................................ 218 181 CCACTACAACTGCAGCTCCAGGCGTTACAACTACAAGACCACGTGTCTGCCCACCCAATT 240 219 .............................................C.............. 278 241 AGACGCCGTTCAACAACAATTGCTATATCGCCTCTCTACCTGGACGCTTCCTTTTCAACC 300 279 G........................................................... 338 301 AAGCTAGCGACTGGTGTACACAGACCGGCTCAAGAGTTGTGTGGTTCGACCAGTCGACTG 360 339 .........................T.................................. 398 361 TAGGAAACTTCGGCAGCGAACTGAACTTCGTCAACAGTTTCGCTCTCGGTCGTGGAGTAA 420 399 ............................................G.T............. 458 421 CCAGGTACTGGATAGGAGTGAACAGACAGTTCGGCCAGTGGGTGTTTACGAATGGAAGTC 480 459 ....A....................................................... 518 481 CAGTGATATTTTCGAACTGGAGGCCTAGTCAACCGGACGGATGCTGTGGTTCCAACGTCA 540 519 ............................................................ 578 541 CGTGTGCGTTCGTTAATTACGCGAACTTCCTCGGCCAATGGGATGATGCCCCATGCGGAA 600 579 ............................................................ 638 601 GTTTGTTTACGACTCCACAAGGCTTCGTATGCAAGAGACCTCTCTAGATTCAATGCCTGC 660 639 ............................................................ 698 661 TGCGCTGATGGCGTCTTCGTTTCCTGCTG 689
699 ............................. 727
R E S U L T A D O S
117
Así mismo, se realizó un alineamiento mediante BLAST y mediante la
base de datos de www.nematode.net, con genes de diferentes especies de
helmintos (Toxascaris leonina, Toxocara cati, Ascaris suum, Anisakis simplex,
Ancylostoma caninum, Uncinaria stenocephala, Necator americanus, Schistosoma mansoni,
Schistosoma japonicum, Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, Trichuris
trichiura, Caenorhabditis elegans y Taenia saginata) para ver el grado de similitud
existente entre la secuencia TES-32 clonada en el laboratorio, a partir de ahora
se denominará TES-32 C, y las secuencias de genes descritos de dichos
parásitos.
Mediante BLAST se llevaron a cabo dos tipos de alineamiento, uno
para secuencias muy similares y otro alineamiento para secuencias con alguna
similitud.
El alineamiento de secuencias mediante BLAST de genes de dichos
helmintos que fuesen muy similares a nuestra secuencia, mostró que TES-32
C presentaba una homología del 91% con la secuencia de la proteína del
proteoglicano del core de Toxocara canis (AB009305.2) descrita por Yamasaki y
col. (2000)(Figura 26).
R E S U L T A D O S
118
Figura 26. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AB009305.2.
1 TCGTCGTTTTGTTATGNCTCCACCTGTCCGCCACTAATGCTTGCGCCACCAACAATGACT 60 36 ................T........C........C......................... 95 61 GTGGTATTTTCCAAGTGTGCGTTAACAACGTCTGCGTTGCCAATAACCAAGGATGCAATC 120 96 ............................................................ 155 121 CGCCTTGTGTGGCTCCGCAGGTTTGCGTTGCACCAATGTGTGTCGCCCCTCCACCGGCAG 180 156 ...........C................................................ 215 181 CCACTACAACTGCAGCTCCAGGCGTTACAACTACAAGACCACGTGTCTGCCCACCCAATT 240 216 .............................................C.............. 275 241 AGACGCCGTTCAACAACAATTGCTATATCGCCTCTCTACCTGGACGCTTCCTTTTCAACC 300 276 G........................................................... 335 301 AAGCTAGCGACTGGTGTACACAGACCGGCTCAAGAGTTGTGTGGTTCGACCAGTCGACTG 360 336 .........................T.................................. 395 361 TAGGAAACTTCGGCAGCGAACTGAACTTCGTCAACAGTTTCGCTCTCGGTCGTGGAGTAA 420 396 ............................................................ 455 421 CCAGGTACTGGATAGGAGTGAACAGACAGTTCGGCCAGTGGGTGTTTACGAATGGAAGTC 480 456 ............................................................ 515 481 CAGTGATATTTTCGAACTGGAGGCCTAGTCAACCGGACGGATGCTGTGGTTCCAACGTCA 540 516 ............................................................ 575 541 CGTGTGCGTTCGTTAATTACGCGAACTTCCTCGGCCAATGGGATGATGCCCCATGCGGAA 600 576 ............................................................ 635 601 GTTTGTTTACGACTCCACAAGGCTTCGTATGCAAGAGACCTCTCTAGATTCAATGCCTGC 660 636 ...........................................................- 694 661 TGCGCTGATGGCGTCTTCGTTTCCTGCTG 689 695 .......................... 720
R E S U L T A D O S
119
Por otro lado, el alineamiento de secuencias de genes de diferentes
especies de helmintos que presentasen algún tipo de similitud con nuestra
secuencia se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14. Resultado del alineamiento de secuencias de diferentes helmintos que presentaban alguna
similitud con nuestra secuencia del TES-32
Nº Acceso Descripción Alineamiento con la secuencia
Identificación Máxima
AF126830.1 Tc-ctl-4 Lectina tipo C o TES-70 73% 69%
NW003037474.1 Smp_scaff016249 de S. mansoni1 3% 95%
XM002570961.1 Proteína hipotética (Smp_191120) S. mansoni1 3% 95%
FN357436.1 Smp_scaff000145 de Schistosoma mansoni1 4% 83%
FN373540.1 Smp_scaff016249 de Schistosoma mansoni 3% 95%
AY814075.1 SJCHGC09458 Schistosoma japonicum1 3% 88%
U88310.1 Cósmido C24G7 Caenorhabditis elegans1 3% 91%
Se realizó un árbol de distancias evolutivas del alineamiento de las
secuencias con alguna similitud con la secuencia TES-32 clonada en nuestro
laboratorio (Figura 27). Sólo se pudieron incluir las secuencias con número de
acceso AF126830.1 y FN373540.1, ya que las otras secuencias no se solapan
suficientemente con la secuencia clonada para formar el árbol.
R E S U L T A D O S
120
Figura 27. Árbol de distancias evolutivas de la secuencia TES-32 clonada en nuestro
laboratorio con las secuencias de la lectinas tipo C Tc-ctl-4 y la secuencia Smp_scaff016249
Lectina tipo C de T.canis
Schistosoma mansoni Smp_scaff016249
Secuencia TES-32 clonada en nuestro laboratorio
R E S U L T A D O S
121
En las Figuras 28 y 29 se muestra el alineamiento de nuestra secuencia
clonada con las secuencias AF126830.1 (Figura 28) y FN373540.1 (Figura 29).
Figura 28. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AF126830.1.
129 AGGATGCAATCCGCCTTGTGTGGCTCCGCAGGTTTGCGTTGCACCAATGTGTGTCGCCCC 188 345 ............T..A....CA..AAAT...........G..T..G.AC..C...C.GG. 404 189 TCC---ACCGGCAGCC--ACTA-CAACTGCAGCTCCAGGCGTTACAACTACAAGACCACG 242 405 A..CAT....C..C..GC..A.T....CA..A..G.GCCT.CA.....GCG.GC.....C 464 243 TGTCTGCCCACCCAATTAGACGCCGTTCAACAACAATTGCTATATCGCCTCTCTACCTGG 302 465 .TCT..........G..G.T.........G.GGTC....T..CTA..TGG..G.---... 521 303 ACGCTTCCTTTTCAACCAAGCTAGCGACTGGTGTACACAGACCGGCTCAAGAGTTGTGTG 362 522 .TCG.................CTCA........C..G......AA.......CC...C.. 581 363 GTTCGACCAGTCGACTGTAGGAAACTTCGGCAGCGAACTGAACTTCGTCAACAGTTTCGC 422 582 ......T.....A.AC.....T.CA......GC...G..CT.T...A.....GT.C.... 641 423 TCTCGGTCGTGGAGTAACCAGGTACTGGATAGGAGTGAACAGACAGTTCGGCCAGTGGGT 482 642 .GCTTC......T...CAA.CT......C.C..GC.C.....G.....T.....A..... 701 483 GTTTACGAATGGAAGTCCAGTGATATTTTCGAACTGGAGGCCTAGTCAACCGGACGGATG 542 702 C.GG..A..C..C.....GT.......C...........AGGG...G....A........ 761 543 CTGTGGTTCCAACGTCACGTGTGCGTTCGTTAATTACGCGAACTTCCTCGGCCAATGGGA 602 762 T.....CGG.........T..C...C.T..C..C.....C...CC.T.T..A..G..... 821 603 TGATGCCCCATGCGGAAGTTTGTTTACGACTCCACAAGGCTTCGTATGCAA 653 822 .......GG......C.ACA.C.GG.GA.A...T.....T...A....... 872
Figura 29. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia FN373540.1.
393 CAGCGAACTGAACTTCGTCAAC 414 1885 ..............C....... 1864
R E S U L T A D O S
122
De todas las secuencias de helmintos comparadas mediante BLAST
con la secuencia TES-32 C, sólo se encuentra un 98% de homología con la
secuencia TES-32 descrita por Loukas y col. (1999), un 91% de homología
con la secuencia del proteoglicano del core de T. canis descrita por Yamasaki y
col. (2000) y una alta homología (72%) con la secuencia correspondiente a la
lectina tipo C Tc-ctl-4 ó TES-70 para el TES-70 (Loukas y col., 2000)
No se encuentran homologías relevantes con otras proteínas de
helmintos ya descritas.
En el alineamiento mediante la base de datos Washington University
Parasitic Nematode EST Sequencing Project (www.nematode.net) de la secuencia
TES-32 C con las de los genes de diferentes especies de helmintos, tampoco
se encontraron homologías relevantes con otras secuencias de helmintos
descritas en esa base de datos.
DISCUSIÓN
D I S C U S I Ó N
124
Las infecciones por nematodos y otros helmintos están frecuentemente
asociadas con eosinofilia y altos niveles de IgE, hechos que también son
característicos de pacientes con reacciones de hipersensibilidad tipo I o
hipersensibilidad mediada por IgE frente a determinados antígenos (Meeusen,
1999).
Es bien conocido que los helmintos poseen un elevado número de
componentes que son capaces de modular la respuesta inmunitaria frente a la
infección (Falcone y col., 2004; Maizels y col., 2004), de los que un número
relevante pueden mostrarse como antígenos capaces de intervenir en el
desarrollo de esa respuesta inmunitaria. De este panel de antígenos, algunos
pueden comportarse como alérgenos, es decir, fijadores de IgE (Sereda y col.,
2008).
De los diferentes estadios de T. canis que a lo largo de su ciclo biológico
interactúan con el hospedador definitivo (Cordero del Campillo y Rojo-
Vázquez, 1999), es el estadio de larva infectante L2 el que es capaz de infectar
también a hospedadores aberrantes, incluido el hombre, pudiendo dar lugar al
desarrollo del Síndrome de Larva Migrans (Magnaval y col., 2001; Despomier,
2003).
Además, las larvas infectantes L2 de T. canis son capaces de excretar-
secretar una serie de componentes que pueden estar relacionados con la
D I S C U S I Ó N
125
modulación de la respuesta inmunitaria e incluso pueden estar implicados en
los mecanismos de evasión de la misma (Maizels y Loukas, 2001).
Por estas dos circunstancias, los productos de excreción-secreción
larvarios se han elegido para estudiar la respuesta inmunitaria mediada por IgE
que T. canis induce tanto en el hospedador definitivo como en el hospedador
intermediario aberrante (hombre).
Desde hace unos años, la caracterización de antígenos de T. canis se ha
enfocado fundamentalmente desde el punto de vista molecular, en estudios de
inmuno-evasión y diagnóstico de la toxocarosis (Maizels y Loukas, 2001;
Yamasaky y col., 2000), pero desde el punto de vista inmunológico no hay
datos que permitan definir alérgenos relevantes de T. canis asociados a
respuestas Th2 (asociadas también a hipersensibilidad tipo I).
Al respecto, aunque el grupo de proteínas alergénicas de nematodo
(NPA) de Toxocara canis (TBA-1) está asociado al término alérgeno, dada su
similitud al grupo ABA-1 de Ascaris, hasta la fecha no se ha demostrado que
dichas proteínas induzcan una respuesta inmunológica mediada por IgE
(Yahiro y col., 1998).
En este trabajo, como una primera aproximación a la identificación de
posibles alérgenos de Toxocara, se realizó un estudio en una población de
perros naturalmente infectada por este nematodo.
D I S C U S I Ó N
126
Como se sabe, la infección natural por T. canis es común en diferentes
poblaciones caninas de todo el mundo (Rubel y col., 2003). En Europa, estos
datos son más elevados, destacando la elevada prevalencia (82,6%) en
ciudades como Dublín (O'Lorcain, 1994) con datos cercanos al 33% en países
como Polonia (Luty, 2001) e Italia (Habluetzel y col., 2003). En España, los
datos de prevalencia van desde el 4,5% en una población de perros de Badajoz
(Pérez-Martín y col., 1992) y del 5,6% en Álava (Benito y col., 2003) hasta el
33% en Salamanca (Conde-García y col., 1989).
Hasta la realización del presente estudio, los ensayos realizados en el
hospedador definitivo estaban basados en la respuesta inmunológica del perro
mediante la determinación de los niveles de IgG utilizando la técnica de
ELISA (Deplazes y col., 1995; Rubel y col., 2003), pero no existían estudios de
determinación de los niveles de IgE en perros infectados naturalmente por T.
canis.
En 1975 de Savigny publicó que las larvas L2 de T. canis se pueden
mantener in vitro durante largos periodos de tiempo, a fin de obtener sus
productos de excreción-secreción.
En nuestro laboratorio hemos conseguido mantener in vitro las larvas
infectantes basándonos en éste y otros métodos descritos por diferentes
autores. En primer lugar, se consiguió reducir el tiempo de embrionamiento
D I S C U S I Ó N
127
de los huevos de 38 días a un mínimo de 28, manteniendo los cultivos en
presencia de luz, según describen Del Águila y col. (1988), a una temperatura
constante de 27°C y con una humedad relativa del 80% (Cordero del Campillo
y Rojo-Vázquez, 1999).
El método de eclosión utilizado fue similar al descrito por Del Águila y
col. (1988), pero la incubación con tampón carbonato/bicarbonato se
sustituyó por una incubación de 30 minutos en la mezcla de hipoclorito
sódico/NaOH 2%, permitiendo una supervivencia mayor de las larvas. Se
incluyeron varios lavados mediante centrifugación y se introdujo un paso final
de incubación a 37 °C y en agitación, que permitió la eclosión del 100% de los
huevos.
El mantenimiento in vitro de las larvas L2 se realizó según el método
desarrollado por de Savigny (1975) con modificaciones. Esta metodología
permitió la obtención de los productos de excreción-secreción larvarios con
un rendimiento en proteínas del 40%.
La obtención del E-SL2 permitió realizar la caracterización bioquímica e
inmunoquímica de sus componentes proteicos frente a sueros de perros
naturalmente infectados por T. canis y sueros humanos de pacientes
diagnosticados de toxocarosis.
D I S C U S I Ó N
128
El resultado del perfil proteico del E-SL2 de T. canis mediante
electroforesis unidimensional fue similar al descrito por Maizels y col. (1984)
que mostraba componentes proteicos entre los 32 y los 400 kDa. El perfil que
se ha caracterizado está constituido por 8 componentes de naturaleza proteica
con masas moleculares entre 25 y 77 kDa. Dentro de este rango, destacan dos
bandas de 37 y 50 kDa y otros dos grupos de componentes de 30-35 y 73-77
kDa que se tiñeron con más intensidad indicando que son los componentes
más abundantes en este extracto.
Para una mejor resolución de estos componentes proteicos se abordó la
separación mediante 2D-electroforesis, obteniendo así un perfil proteico en el
que observamos 40 proteínas distribuidas en un rango de pH de 5,3 a 9,8 y
con masas moleculares entre los 30 y 100 kDa. El número de componentes
observados fue mayor al descrito por Page y col. (1991) que detectaron 30
proteínas mediante electroforesis bidimensional.
Los patrones que se revelan con las dos tinciones utilizadas en la
electroforesis bidimensional son distintos.
En el perfil proteico resultante de la 2D-electroforesis y tinción con
azul de Coomassie aparecen tres componentes de masa molecular 100 kDa y
pI entre 9,3 y 9,6 que no se observan en la tinción de plata. Así mismo, en el
perfil proteico resultante de la 2D-electroforesis y tinción de plata aparece un
D I S C U S I Ó N
129
componente de 50 kDa y pI 7 y una serie de componentes con masa
molecular de 75 kDa y en el rango de pI de 5,3 a 9,8, que no se observan en la
tinción con azul de Coomassie.
La detección de un mayor número de componentes en la 2D-
electroforesis y tinción de plata se debe a la mayor sensibilidad de esta última
tinción, dado que con la tinción con azul de Coomassie el límite de detección
es de 40 ng de proteína por punto, con la tinción de plata se pueden detectar 1
ng de proteína por punto. Esto podría explicar el mayor numero de
componentes de naturaleza proteica detectados en la 2D-electroforesis y
tinción con plata.
Sin embargo, independientemente de la tinción utilizada, destacan dos
grupos de componentes: un grupo entre los 30 y 37 kDa y pI entre 5,5 y 9,8; y
otro grupo de componentes proteicos entre los 65 y los 75 kDa y con un pI
entre 5,3 y 9,8.
Estos resultados obtenidos mediante la electroforesis tanto
unidimensional como bidimensional indican que los productos de excreción-
secreción a partir de cultivos in vitro de larvas L2 de Toxocara contienen los
principales componentes proteicos (32 kDa y otro alrededor de los 75 kDa)
descritos en la literatura por otros autores (Maizels y col., 1984) y que se han
utilizado para propuestas diagnósticas.
D I S C U S I Ó N
130
Como se ha comentado anteriormente, hasta la fecha no existían
estudios sobre la respuesta inmunitaria mediada por IgE que las L2 podrían
inducir en el hospedador definitivo, por lo que la caracterización
inmunoquímica del E-SL2 en una población de perros naturalmente
infectados por T. canis aporta datos inéditos sobre la naturaleza de las
proteínas que inducen la síntesis de IgE y por consiguiente del mayor
conocimiento sobre la relación parásito-hospedador.
Así, se ha comprobado que los productos de excreción-secreción
larvarios son capaces de inducir en los perros una respuesta humoral mediada
por IgE.
En la inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE, separadas
mediante 1D-Inmunodetección, se detectaron 13 componentes diferentes con
un rango de masas moleculares entre los 32 y 200 kDa. Siete de estos
componentes, con masas moleculares de 75, 80, 95, 110, 120 kDa y dos
componentes de más de 200 kDa, fueron reconocidos por el 65-80% de los
sueros de perros naturalmente infectados por T. canis. En el rango de baja
masa molecular, entre los 32 y los 50 kDa, entre el 5 y el 10% de los 20 sueros
reconocieron proteínas capaces de unir IgE. Los componentes fijadores de
IgE que se revelaron en más del 50% (75, 80, 95, 110, 120 kDa y dos
D I S C U S I Ó N
131
componentes de más de 200kDa) de los sueros de perros naturalmente
infectados por T. canis se pueden considerar alérgenos mayores.
La inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE canina con la mezcla
de los 20 sueros de perros naturalmente infectados por T. canis y separadas
mediante 2D, reveló 20 componentes inmunoreactivos capaces de fijar IgE
con un rango de pesos moleculares entre los 32 y los 75 kDa. Los resultados
del análisis de la huella peptídica identificaron dos alérgenos correspondientes:
uno con la lectina tipo C TES-32 y otro, con la lectina tipo C Tc-ctl-4/TES-70
de Toxocara canis, dos de las proteínas más abundantemente secretadas por las
larvas de T. canis (Page y col., 1992; Maizels y Loukas, 2001) pero no
identificadas como alérgenos hasta este estudio.
Los patrones alergénicos resultantes de la 1D-inmunodetección y la 2D-
inmunodetección con sueros de perros naturalmente infectados por T. canis
son distintos. Si bien en la 1D-inmunodetección tan sólo en tres de los 20
sueros estudiados el antígeno de 32 kDa fue capaz de fijar IgE, en la 2D-
inmunodetección, el pool de esos mismos 20 sueros permitió identificar
principalmente diferentes isoformas de esta proteína. Esta diferencia puede
ser debida a la técnica utilizada a la hora de abordar tanto la electroforesis
como la inmunodetección. Mientras que la 1D-electroforesis desnaturaliza los
componentes del E-SL2 y los separa sólo por su masa molecular, la 2D-
D I S C U S I Ó N
132
electroforesis consigue una mejor separación de los componentes proteicos
puesto que los separa primero por su pI y después por su masa molecular,
siendo por lo tanto una técnica más resolutiva para separar mezclas complejas
de proteínas.
En cuanto a la inmunodetección hay que tener en cuenta que el revelado
por quimioluminiscencia es una metodología mucho más sensible que el
revelado colorimétrico por 4-Cloro-1-Naftol.
Por tanto y a la vista de nuestros resultados, se propone utilizar la 2D-
inmunodetección y revelado por quimioluminiscencia como técnica más
apropiada en la identificación de alérgenos por su mayor capacidad de
resolución analítica.
Los alérgenos identificados en este estudio son lectinas de tipo C que
coinciden con los antígenos descritos por Maizels y col. (1984) y Maizels y
Loukas (2001) quienes proponen que dichas proteínas pueden ser marcadores
diagnósticos de la infección por Toxocara. (Magnaval y col., 1991; Maizels y
Loukas, 2000; Smith y col., 2009). Como hemos comprobado, estas proteínas
son fijadoras de IgE por el hospedador definitivo, aunque se necesitan
estudios complementarios para poder definir estos alérgenos como “alérgenos
mayores” del perro. Las limitaciones de la SDS-PAGE-IgE
inmunotransferencia observadas en este estudio no permitieron estudiar el
D I S C U S I Ó N
133
porcentaje de animales que individualmente respondieron específicamente a
este alérgeno por lo que la obtención individualizada de esta proteína es
relevante para la realización de dicho objetivo.
La respuesta Th2 mediada por IgE parece tener una relación directa con
los mecanismos de defensa natural del hospedador definitivo frente a la
invasión parasitaria por helmintos (Hagan y col., 1991) y además, reforzaría la
cada vez más evidente teoría de que dicha respuesta inmunitaria ha
evolucionado en los hospedadores vertebrados para limitar la carga de
parásitos metazoos (Fitzsimmons y Dunne, 2009).
Cabe señalar que no habiéndose encontrado otros helmintos en el
intestino de los perros estudiados y que los sueros de perros libres de
helmintos utilizados como control negativo no reconocieron ninguna proteína
en el E-SL2, se puede deducir que los alérgenos identificados en este estudio
son específicos y podrían ser utilizados para el diagnóstico rutinario de la
toxocarosis en el hospedador definitivo.
Por otro lado, en el presente estudio la inmunodetección de proteínas
fijadoras de IgG canina separadas mediante 1D mostró un perfil de 14
proteínas capaces de fijar IgG. Doce de estos componentes, con masas
moleculares de 32, 35, 37, 42, 55, 80, 95, 110, 120, 140, y dos componentes
con masa molecular mayor de 200 kDa, fueron reconocidos por el 60%-80%
D I S C U S I Ó N
134
de los sueros de perros naturalmente infectados por T. canis, por lo que
podrían ser considerados, en su definición clásica, como antígenos mayores de
las L2 de T. canis.
Hasta el momento y que se haya comprobado, no existen estudios
previos en la literatura que describan patrones de componentes capaces de
fijar tanto IgE como IgG en los sueros de perros, haciendo difícil comparar
nuestros resultados con otros ya existentes.
Se sabe que existen dos hechos dominantes en las infecciones
helmínticas: uno, son de larga duración y tienden a cronificarse, permitiendo a
los parásitos de lenta maduración el acceso a los órganos diana y su
reproducción; y dos, son eficientes inductores de respuestas Th2
(Yazdanbahsah y col., 2001).
La verificación de respuesta específica a estas lectinas mediada tanto por
IgG como por IgE indican que la población estudiada ha estado expuesta de
forma prolongada a la infección por larvas de T. canis y que éstas intervienen
en las respuestas Th2.
Cuando se compara la respuesta IgG/IgE del E-SL2 en cánidos, se
identifica una respuesta homogénea frente a siete componentes con masas
moleculares de 80, 95, 110, 120, 140 kDa y dos componentes con masas
D I S C U S I Ó N
135
moleculares mayores de 200 kDa, que son identificados por el 70% de los
sueros de perros naturalmente infectados por T. canis.
Este hecho nos hace considerar que: primero, estos componentes son
antígenos mayores en su definición clásica ya que son reconocidos por el 70%
de los sueros caninos naturalmente infectados por T. canis y, segundo, que los
componentes del E-SL2 son capaces de inducir respuesta IgG y respuesta
IgE, confirmando, tal y como Schultz y Halliwell (1985) sugirieron, que la IgE
podría reforzar la respuesta del hospedador definitivo frente a antígenos
parasitarios.
Una vez constatado que los perros presentan una respuesta inmunitaria
humoral IgE frente al extracto E-SL2 además de una respuesta IgG, el
siguiente propósito de nuestro estudio fue caracterizar los posibles alérgenos
en una población de pacientes (hospedador intermediario aberrante)
diagnosticados de toxocarosis asintomática.
La inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del E-SL2 con 11
sueros de pacientes diagnosticados de toxocarosis, mostró 8 alérgenos
diferentes de 25, 27, 32, 35, 40, 45, 75 y 100 kDa, en el que cabe destacar la
proteína de 35 kDa que fue reconocida por el 90% de los sueros de pacientes
de este estudio. La mezcla de sueros negativos no reconoció ningún antígeno
D I S C U S I Ó N
136
fijador de IgE del E-SL2, por lo que se puede deducir que la respuesta es
debida a los antígenos capaces de fijar IgE de Toxocara canis.
Este perfil de proteínas fue similar a los perfiles de proteínas fijadoras de
IgG mencionados en la literatura. Al respecto, señalar que Speiser y Gottstein
(1984) detectaron entre 10 y 14 componentes fijadores de IgG; Maizels y col.
(1984) describieron 5 componentes principales (32, 55, 70, 120 y 400 kDa); y
Magnaval y col. (1991) describieron 7 proteínas de excreción-secreción
fijadoras de IgG de 24, 28, 30, 35, 132, 147 y 200 kDa con 10 sueros de
pacientes diagnosticados de toxocarosis.
Sin duda alguna, y aunque el patrón de alérgenos de T. canis y antígenos
fijadores de IgG descritos en la literatura sean parecidos, la combinación de
técnicas que revelan la respuesta IgE con la combinación de técnicas que
revelan la respuesta IgG, ofrece más información inmunopatológica de la
infección por Toxocara en el hospedador intermediario aberrante y
probablemente esta combinación de técnicas también se podría aplicar en el
hospedador definitivo.
Magnaval y col. (1991) afirman que los antígenos de menor peso
molecular, entre los 24 y los 35 kDa, son los más específicos para el
diagnóstico de la toxocarosis humana sin describir cúal es la naturaleza de
estos antígenos. Es muy probable que el antígeno de 35 kDa descrito por
D I S C U S I Ó N
137
Magnaval y col. (1991) se corresponda con la lectina tipo C TES-32
identificada por Loukas y col. (1999). Nuestros resultados muestran que este
antígeno de 35 kDa también induce una respuesta IgE en el hombre y además
en este estudio se ha identificado como lectina de tipo C TES-32. El hecho de
que TES-32 pueda inducir una respuesta Th2 mediada por IgE y dado que
filogenéticamente tampoco se han encontrado secuencias similares a esta
lectina en otros helmintos, corroboraría la especificidad de TES-32 que
propusieron Magnaval y col. (1991).
En relación con lo antedicho, algunos autores indican que la detección
de IgE específica frente a los antígenos de excreción-secreción de T. canis,
junto con la determinación de la proteína catiónica eosinofílica (ECP) son
marcadores de infección activa en la toxocarosis humana (Genchi y col., 1988;
Magnaval y col., 2001). Según esto, 6 de los 11 pacientes seropositivos frente
al antígeno E-S de Toxocara podrían corresponder a formas activas de
toxocarosis, aunque en ninguno de ellos se pudieron demostrar indicios de
dicha actividad manifiesta (asintomáticos o toxocarosis encubierta).
Además, los 11 sueros de pacientes estudiados también mostraron una
respuesta IgG/IgE frente a las proteínas E-SL2 de T. canis. Hasta la fecha
existen pocos trabajos que estudien la respuesta inmunológica humoral en el
hospedador intermediario frente a la infección por larvas de Toxocara
D I S C U S I Ó N
138
analizando al mismo tiempo anticuerpos de las clases IgE e IgG (Genchi y
col., 1988; Magnaval y col., 2002; Guisantes y col., 2007). Esta respuesta
IgE/IgG sugiere, al igual que en el hospedador definitivo, una respuesta
conjunta frente a la infección en la que la IgE podría reforzar la respuesta del
hospedador intermediario frente a los antígenos de E-SL2 de Toxocara canis.
Por otra parte, se sabe que en la infección por Toxocara la coexistencia de
IgG e IgE específicas pueden competir por los mismos antígenos del E-SL2,
pudiéndose producir un enmascaramiento de la presencia de los anticuerpos
IgE por inhibición competitiva con los de la clase IgG que están en
concentraciones muy superiores (Genchi y col., 1988). Por tanto y desde el
punto de vista serológico la determinación de anticuerpos frente al E-SL2
pertenecientes a ambos isotipos aportaría un valor añadido al diagnóstico de
esta parasitosis, lo que apoyaría los resultados obtenidos por Magnaval y col.
(2002).
Como hemos comentado anteriormente, varios autores hablan de la
especificidad que los componentes de 24-35 kDa del E-SL2 confieren a las
técnicas para diagnóstico de la toxocarosis (Magnaval y col. 1991; Smith y col,
2009). Asimismo, estudios realizados por diferentes autores (Magnaval y col
1991, Park y col, 2000, Nunes y col, 1999, Lynch y col 1988) indican que
existe reactividad cruzada entre los componentes de alto peso molecular del
D I S C U S I Ó N
139
E-SL2 (>32 kDa) con anticuerpos de helmintos relacionados
filogenéticamente (Ascaridida, Filarioidea, Strongyloididae) y no tanta
reactividad cruzada con otros helmintos menos relacionados
filogenéticamente: Taeniidae, Trematoda, Cestoda (Ishida y col, 2003).
En la actualidad la reactividad cruzada, término difícil de definir, se
considera un término inmunológico que expresa la homología entre antígenos
diferentes y este concepto se puede asociar a los conceptos bioquímicos entre
homología de genes de expresión y homología entre secuencias de proteínas
(Ferreira y col., 2004).
Se acepta actualmente que aquellas proteínas o genes que codifican
proteínas que tienen un porcentaje de homología superior al 70% sean
antígenos que generan reactividad cruzada entre ellos (Ferreira y col., 2004).
En este sentido no se conocen estudios de reactividad cruzada de TES-
32 con otros antígenos individualizados de helmintos. Tanto la secuencia
obtenida por Loukas y col (1999) como la nuestra -que codifican para TES-
32- se ha podido demostrar en el presente trabajo que no se parecen a
estructuras descritas para otros helmintos, por lo que asumimos que el TES-
32 puede constituir un antígeno/alérgeno específico de Toxocara canis.
Conjuntamente con los estudios de otros autores hemos visto que sueros
reactivos a Toxocara de pacientes que no poseen ningún indicio clínico
D I S C U S I Ó N
140
sugestivo de anisakidosis, originan reacciones cruzadas débiles a extractos
alergénicos de Anisakis. Anadón y col. (2010) hablan de la especificidad de
alérgenos relevantes de Anisakis, Ani s 1 y Ani s 7, que son alérgenos
específicos de larvas y no encuentran homología con ninguna secuencia
descrita. Por lo cual, la reacción cruzada que se ha encontrado en este estudio
se puede deber a componentes de Anisakis no descritos y con alguna
homología con TES-32 o con otros componentes del E-SL2 que no sean
TES-32. Tanto nosotros como otros autores (Anadón y col., 2010) parecen
indicar que la reactividad cruzada entre Anisakis y Toxocara, dos especies del
grupo de los ascáridos, se debería más a componentes distintos a TES-32,
Anis 1 y Ani s 7
En cuanto a la caracterización inmunoquímica de proteínas fijadoras de
IgE humana separadas mediante 2D, nuestros resultados muestran un patrón
de hasta 17 componentes alergénicos, 13 de los cuales fueron identificados
mediante el análisis de la huella peptídica como diferentes isoformas de dos
lectinas de Toxocara canis: la lectina tipo C TES-32 y la lectina tipo C Tc-CTL-4
ó TES-70.
Algunos de los componentes enviados a secuenciar no pudieron ser
identificados. En la actualidad se está intentando obtener más información de
esos componentes.
D I S C U S I Ó N
141
Si comparamos los antígenos que intervienen en la respuesta Th2 que T.
canis induce tanto en el hospedador definitivo como en el hombre,
encontramos dos patrones distintos según la técnica empleada para separar los
mismos. Mientras que en la inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE,
separadas mediante electroforesis unidimensional, con los sueros caninos se
detectaron componentes de bajo peso molecular (15-30) en un bajo
porcentaje de sueros, en la inmunodetección con los sueros de pacientes
diagnosticados de toxocarosis los componentes de bajo peso molecular fueron
reconocidos por la gran mayoría de los sueros de pacientes de este estudio,
con patrones similares a los ya descritos por otros autores (Maizels y col.,
1984; Magnaval y col, 1991).
Sin embargo, cuando comparamos los patrones resultantes de la 2D-
inmunodetección en el hospedador definitivo y en el hombre, podemos
afirmar que la respuesta IgE frente a T. canis es muy similar. En ambas
inmunodetecciones se identificaron los mismos alérgenos correspondientes
uno con la lectina tipo C TES-32 y otro, con la lectina tipo C Tc-ctl-4/TES-70
de Toxocara canis.
Las lectinas tipo C, identificadas en nuestro estudio como alérgenos de
T. canis, son una de las 7 familias que posee la superfamilia de C type lectin-like
superfamily. Son proteínas que unen carbohidratos de una manera Ca2+
D I S C U S I Ó N
142
dependiente y podrían jugar un papel importante en la evasión de la respuesta
inmunitaria e intervenir en el reconocimiento y establecimiento del parásito en
los tejidos del hospedador (Loukas y Maizels, 2000)
Muchas de estas lectinas tipo C son receptores celulares de superficie
con un papel pivotante en la activación del sistema inmunitario de los
vertebrados (Weiss y col., 1998). Sus funciones serían la defensa frente a
patógenos, tráfico celular, regulación inmunitaria y la prevención de la
autoinmunidad (Cambi y Figdor, 2003). TES-32 es la primera lectina tipo C
descrita en un parásito helminto (Loukas y col., 1999) y además es la más
secretada por T. canis siendo su ARNm es el más expresado de todos,
representando el 6% de todos los transcritos (Loukas y Maizels, 2000).
Recientemente se ha observado que TES-32 contiene un dominio N-terminal
rico en cisteína y un dominio C-terminal lectina tipo C que presenta
similitudes tanto en la secuencia como en la estructura con las lectinas tipo C
relacionadas con el sistema inmunitario del hombre (Loukas y Maizels, 2000),
siendo considerada como una de las principales proteínas que utiliza el
parásito para modular el sistema inmunitario del hospedador (Loukas y col.,
1999).
D I S C U S I Ó N
143
Además, TES-32 ha sido localizada en la epicutícula de larvas de T. canis
y se postula que su ruta de secrección es transcuticular, aunque el mecanismo
involucrado no se conoce (Loukas y Maizels, 2000).
Nuestros resultados demuestran que TES-32 puede ser considerada
como la principal proteína fijadora de IgE (alérgeno) de Toxocara canis, en
sujetos con toxocarosis asintomática o encubierta.
Los otros componentes alergénicos identificados mediante el análisis de
huella peptídica tanto en el hospedador definitivo como en el hombre, se
correspondieron con la lectina tipo C Tc-CTL-4 ó TES-70.
TES-70 es otra de las glicoproteínas más abundantemente secretadas por
T. canis (Maizels y Loukas, 2001) y como lectina es capaz de unirse de una
manera Ca2+ dependiente a la superficie de células endoteliales de mamífero.
Esto sugiere que los glicanos del hospedador implicados en la inmunidad, son
ligandos para estas lectinas de T. canis (Loukas y Maizels, 2000).
En relación con su función, se ha sugerido que los organismos
patógenos utilizan selectivamente lectinas para modular la respuesta Th de sus
hospedadores (Loukas y Maizels, 2000). En el caso de Toxocara se ha
demostrado que los productos de excreción-secreción larvarios contienen
antígenos que estimulan respuestas Th2 (Del Prete y col., 1991; Allen y
MacDonald, 1998). De estos antígenos se cree que las lectinas tipo C podrían
D I S C U S I Ó N
144
ser las principales candidatas a producir este tipo de modulaciones en la
respuesta inmunitaria el hospedador (Loukas y Maizels, 2000) y por tanto,
cruciales en la evasión de dicha respuesta (Loukas y Maizels, 2000).
Se considera que las respuestas Th2, en las que intervienen la IgE y las
respuestas efectoras asociadas también a los fenómenos de hipersensibilidad,
forman parte de la respuesta protectora frente a parásitos metazoos
(Fitzsimmons y Dunne, 2009). En estos casos el hospedador inicia una
respuesta Th2 característica, aumentando la producción de IgE así como el
reclutamiento, proliferación y activación de eosinófilos y mastocitos
(Perrigoue y col. 2008).
Por su parte, los parásitos son capaces de diseñar estrategias altamente
sofisticadas, que a lo largo de su evolución han sido adoptadas por ellos con
eficacia y que han tenido como objetivo la evasión de la respuesta inmunitaria
desarrollada por los hospedadores haciendo que el establecimiento de los
parásitos sea más eficaz. Dichas estrategias son de muy diversa índole y van
desde la variación antigénica hasta el mimetismo molecular (Yazdanbakhsh y
Sacks, 2010).
Por otra parte, en este estudio se ha podido demostrar que los
hospedadores, tanto definitivo como intermediario, reconocen esas moléculas
D I S C U S I Ó N
145
(TES-32 y TES-70) y son capaces de responder frente a las mismas con
respuestas Th2 mediadas por IgE.
Pero, ¿qué pasa cuando el hospedador presenta hipersensibilidad tipo I o
hipersensibilidad mediada por IgE frente a determinados antígenos sin estar
presente el parásito? Los antígenos serían el punto de unión clave entre las
respuestas mediadas por IgE frente a parásitos y las respuestas alérgicas dónde
no está presente el parásito.
En la actualidad se acepta cada vez más que lo que hace que una proteína
se defina como un alérgeno es que dicha proteína se pueda incluir en una de
las familias de proteínas que se saben incluyen a los alérgenos, y que dichas
proteínas tengan sus homólogas en aquellas de origen parasitario que tienen la
capacidad de originar respuestas Th2 con intervención de la IgE (Fitzsimmons
y Dunne, 2009, Radauer y col., 2008).
Por tanto la actividad alergénica está asociada/restringida a aquellas
proteínas que estructuralmente estarían relacionadas con un limitado número
de proteínas parasitarias que estimulan la respuesta Th2, considerada como la
respuesta natural de los hospedadores mamíferos frente a parásitos
principalmente helmintos.
En la base de datos Allfam (Radauer y col., 2008) que agrupa las
proteínas alergénicas por familias, parece que sólo determinadas familias de
D I S C U S I Ó N
146
proteínas pueden estimular la respuesta IgE frente a parásitos y desencadenar
la respuesta alérgica mediada por IgE (Fitzsimmons y Dunne, 2009).
Dentro de estas familias alergénicas encontramos 4 subfamilias de
lectinas alergénicas (Tabla 15) de origen no helmíntico, principalmente de
plantas.
Tabla 15. Subfamilias de lectinas alergénicas
Nº Acceso Nombre Nº de alérgenos
AF034 Lectina Leguminosa 4
AF039 Proteína inactivadora de ribosoma 8
AF043 Dominio como Heveína 11
AF078 Dominio Peritrofin-A de unión a Quitina 4
Dada la naturaleza de lectinas de los dos alérgenos de Toxocara canis
(TES-32 y TES-70) identificados en una población de pacientes con
toxocarosis asintomática y dado que existen proteínas dentro de la familia de
las lectinas que son capaces de estimular la respuesta alérgica mediada por
IgE, se debería incluir en esta base de datos una nueva subfamilia, las lectinas
tipo C con dos nuevos alérgenos, TES-32 y TES-70.
D I S C U S I Ó N
147
Según Fitzsimmons y Dune (2009) la alergia podría tener un origen
parasitario y podemos suponer por tanto que estas lectinas parasitarias que
nosotros hemos descrito como alérgenos de Toxocara canis podrían formar
parte del origen de las respuestas alérgicas a sustancias que contienen lectinas
y que no se incluyen en los grupos de parásitos.
Es de suponer que existe alguna relación entre las respuestas IgE
mediadas a lectinas de T. canis y las lectinas procedentes de fuentes alergénicas
no helmínticas y en este sentido, sería de gran interés un estudio más
pormenorizado de estas glicoproteínas tanto a nivel inmunoalergológico como
a nivel bioquímico-estructural.
Por otra parte, la tecnología del ADN recombinante nos ha permitido
obtener y clonar el gen que codifica para la proteína alergénica TES-32. El
alineamiento realizado en nuestro estudio de la secuencia del gen que codifica
para TES-32 con otros genes de nematodos en distintas bases de datos:
BLAST y Washington University Parasitic Nematode EST Sequencing Project
(Wylie y col., 2004) nos aporta datos interesantes. Existe una homología del
98% de nuestra secuencia con la secuencia descrita por Loukas y col. (1999) y
una homología del 91% de nuestra secuencia con la secuencia descrita por
Yamashaki, (2000) y es muy probable que estas tres proteínas sean la misma
dado el porcentaje de homología existente. También se ha comprobado que
D I S C U S I Ó N
148
existe una alta homología (70%) entre TES 32 y TES-70. De cualquier
manera, el hecho de que TES-32 y TES-70 pertenezcan a la misma familia de
proteínas y que su porcentaje de homología sea del 70%, sugiere que entre
estas dos proteínas exista un elevado nivel de reactividad cruzada.
No se han encontrado homologías relevantes con otros genes de
nematodos, lo que no implica que existan lectinas alergénicas en parásitos
diferentes a T. canis y que por tanto puedan tener una implicación importante
en el desarrollo de la respuesta alérgica.
Por otro lado, el mantenimiento de este gen en un sistema microbiano
implica su posible expresión como proteína recombinante, lo cual
proporcionaría una fuente constante de obtención de esta proteína
individualizada, que podría ser una herramienta estándar para futuros estudios.
Asimismo, nos permitiría conocer si esta proteína juega un papel importante
en otras formas clínicas como, por ejemplo, en la urticaria asociada a Toxocara
o en formas clínicas activas.
CONCLUSIONES
C O N C L U S I O N E S
150
1. Se describen por primera vez patrones de componentes proteicos en el
E-SL2 de Toxocara canis capaces de inducir una respuesta mediada por
isotipos tanto de la clase IgG como IgE en el hospedador definitivo.
2. Dichos componentes tienen masas moleculares de 80, 95, 110, 120, 140
y 200 kDa.
3. Los componentes del E-SL2 con masas moleculares de 80, 95, 110,
120, 140 y 200 kDa son reconocidos por el 70% de la población canina
estudiada y pueden ser considerados como antígenos/alérgenos
mayores.
4. T. canis induce una respuesta mediada por isotipos tanto de la clase IgG
como IgE en el hombre.
5. Las lectinas de tipo C TES 32 y TES 70 reaccionan de forma específica
con anticuerpos de la clase IgE tanto en el hospedador definitivo como
en el hombre.
6. La lectina de tipo C TES 32 se puede considerar como alérgeno mayor
de Toxocara canis dado que reacciona con más del 55 % de los sueros
estudiados, y se propone introducirlo en la nomenclatura de alérgenos
como Tox c 1.
C O N C L U S I O N E S
151
7. La ausencia de descripciones de genes homólogos en otras especies de
helmintos (BLAST y Washington University Parasitic Nematode EST
Sequencing Project) refuerza la especificidad de especie de esta proteína.
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ANEXO 1
A N E X O 1 : M e d i o s d e c u l t i v o y t a m p o n e s
170
Caldo LB
Formula (g/l de agua destilada)
NaCl 10g
Triptona 10g
Extracto de Levadura 5g
Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 litro y ajustar el pH a
7.0 con 5N NaOH.
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Agar LB
Formula (g/l de agua destilada)
NaCl 10g
Triptona 10g
Extracto de Levadura 5g
Agar bacteriológico 20g
Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 litro y ajustar el pH a
7.0 con 5N NaOH.
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Dispensar en placas
de Petri estériles.
A N E X O 1 : M e d i o s d e c u l t i v o y t a m p o n e s
171
Caldo LB con Suplementos
Preparar 1 litro de caldo LB y añadir los siguientes suplementos
esterilizados por filtración:
Formula (g/l de agua destilada)
1 M MgSO4 10 ml
2 M Maltosa 3 ml
Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 litro y ajustar el pH a
7.0 con 5N NaOH.
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Agar NZY
Formula (g/l de agua destilada)
NaCl 5g
MgSO4 . 7H2O 2 g
Extracto de Levadura 5g
Casaminoácidos 10g
Agar bacteriológico 15g
Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 litro y ajustar el pH a
7.5 con NaOH.
A N E X O 1 : M e d i o s d e c u l t i v o y t a m p o n e s
172
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Dispensar en placas
de Petri estériles.
Caldo NZY
Formula (g/l de agua destilada)
NaCl 5g
MgSO4 . 7H2O 2 g
Extracto de Levadura 5g
Casaminoácidos 10g
Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 litro y ajustar el pH a
7.5 con NaOH.
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Agar Top NZY
Preparar 1 litro de caldo NZY y añadir agarosa al 0.7% (p/v).
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
A N E X O 1 : M e d i o s d e c u l t i v o y t a m p o n e s
173
Medio SOC
Formula (g/l de agua destilada)
Extracto de Levadura 0.5%
Triptona 2 %
NaCl 10mM
KCl 2,5mM
MgCl2 10mM
MgSO4 10mM
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
Añadir glucosa 20 mM después de autoclavar, y esterilizar mediante filtro
de 0,2µm
Tampón SM
Formula (g/l de agua destilada)
NaCl 5.8g
MgSO4 . 7H2O 2 g
1 M Tris-HCl (pH 7.5) 50 ml
Gelatina 2% (p/v) 5 ml
Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 litro.
A N E X O 1 : M e d i o s d e c u l t i v o y t a m p o n e s
174
Tampón TE
Tampón STE 10X
Formula (g/l de agua destilada)
1 M NaCl
200 mM Tris-HCl (pH 7.5)
100 mM EDTA
Tampón de carga 2X
Formula (g/l de agua destilada)
Glicerol 200 µl
Azul de bromofenol saturado 46 µl
5 M NaOH 5 µl
Agua destilada ultrapura 750 µl
Formula
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA (pH 8.0)
Toxocara canis es un nematodo parásito de cánidos y félidos que puede
infectar a un amplio rango de mamíferos incluido el hombre (Glickman y
Schantz, 1981; Lewis y Maizels,
1993). Según la clasificación de
Adamson (1987), Toxocara canis es
un nematodo rhabditoide
perteneciente a la familia de los
ascáridos. Dentro de la familia
Ascarididae conforma un único
género, el género Toxocara.
Aunque han sido descritas once especies de Toxocara (Warren G,
1970), sólo dos, T. canis (Werner, 1782) y T. cati (Schrank, 1788), son
reconocidas como agentes causantes de enfermedad en el hombre
(Nagakura y col., 1990).