PAOLA BENEIT VILLENA

14/DIC/2010

Citogenética Convencional Estudio citogenético convencional de las

neoplasias hematológicas En SP y MO Citogenética: Estudio de los cromosomas

de las células hematopoyéticas en su fase de máxima concentración (metafase)

Cariotipo: Ordenación de los cromosomas en 22 parejas de cromosomas autosómicos y una pareja de cromosomas sexuales

Ventajas

En un solo experimento, analizamos todo el genoma celular, con información de todos los cromosomas

Bajo coste económico Disponibilidad Alteraciones cromosómicas numéricas y

estructurales Significación clínica establecida

Inconvenientes Requiere cultivo de tejido fresco Analiza células sólo en división Lenta en tumores sólidos (2 semanas),

aunque en neos hematológicas, se puede en 24-72h

Precisa personal experimentado Baja sensibilidad Poco poder de resolución en alteraciones

cromosómicas complejas, microdelecciones, …

Muestras

Médula Ósea extraída mediante punción esternal o de cresta ilíaca, en un tubo estéril de heparina sódica

Sangre Periférica extraída en un tubo de 10ml de heparina sódica

Biopsia ganglionar guardada en un tubo con medio de cultivo

¡INTENTAR MÁXIMAS CONDICIONES DE ASEPSIA!

Siembra En primer lugar, se realiza la siembra de

los cultivos en condiciones estériles en la cámara de flujo laminar

Se siembran 0.5 ml en dos Falcons de cultivo estéril (preparados con 10ml de caldo de cultivo a -20ºC)

Según dx de la muestra, se cultiva 24-72h, con o sin TPA

Orientación Diagnóstica

Tipo de Muestra

Tipo de Cultivo

Mitógenos [ ] y tiempo de Colcemid

SMD MÓ o SP 24/48h24h + MTX

____________ (0,1g/ml)30’

SMPC MÓ o SP 24/48h24h + MTX

____________ (0,1g/ml)30’

LAM MÓ o SP 24/48h24h + MTX

____________ (0,1g/ml)30’

LAL MÓ o SP Directo/24h ____________ (0,1g/ml)2 h

SLPC/LNH SP o MÓ 72h TPA (estimulación de línea B)PHA (estimulación de línea T)

(0,15g/ml) 2h

SLPC/LNH Ganglio/bazo/ exudado/masa tumoral

24h: Sin estimulación celular48/72h: Con mitógeno

TPA/PHA (0,1g/ml)20’ (sin estimular)(0,15g/ml) 2h (estimulado)

MM MÓ 48/72h: Sin estimulación120h: Con

IL-4 (0,1g/ml)20’

Sacrificio de los cultivos Añadir 0.1 ml del antimitótico Colcemid y se

deja en estufa de CO2 a 37ºC durante○ 30’ las mieloblásticas (LAM, LMC, SMD, SMPC)○ 2º las linfoblásticas (SLPC, LNH)

Pasamos el contenido a un tubo de centrífuga, y lo centrifugamos 10’ a 1200 rpm

Posteriormente, decantamos el sobrenadante, dejando el botón (pellet) y resuspendemos

Choque Osmótico: 8 ml de ClK 0.075M gota a gota, agitando, y lo dejamos 30’ al baño maría (37ºC)

Sacrificio de los cultivos Centrifugamos, decantamos, y se

añaden 5ml del fijador Carnoy (metanol:ácido acético 3:1) agitando. 10’ a temperatura ambiente

Repetimos el paso anterior, dejando 30’ en nevera

Centrifugamos, decantamos, y añadimos 1ml de Carnoy

Resuspendemos y pasamos a un tubo NUP

Portaobjetos Porta previamente guardado a 4ºC con metanol. Secamos, cubrimos con fijador (Carnoy) y mientras decantamos se tiran 1 ó 2 gotas de la

preparación. Se flamea y se deja secar Miramos en microscopio invertido para ver la

densidad celular y la extensión de los cromosomas

Se hacen 4 extensiones de cada cultivo 24h en estufa de desecación a 60ºC, para

envejecer

Portaobjetos

Para la tinción○ Solución de tripsina 12 segundos○ Lavamos con PBS 2 segundos○ Giemsa al 5% 5 minutos○ Lavar y mirar al microscopio

Se cubren Metafer® para seleccionar metafases

Leucemias agudas

Momento Cultivo Cariotipo FISH

LAM Dx 2x24h + ADN + ARN + Criopreserv.

Sí CYTOCELL

Evolución 2x24h Sí Consultar

Pre/Post Tx 2x24h Sí Consultar

LAM INFANTIL Dx 2x24h Sí 7, 8, MLL

LAM (día sig.) Dx 24h + 48h Sí CYTOCELL

LAP Dx 1x24h + 1x48h Sí PML/RARα

Recaída 1x24h + 1x48h Sí PML/RARα

Evolución 1x24h + 1x48h Consultar Consultar

LAL Dx - Adultos 2x24h Sí BCR/ABL + MLL

Dx - Niños 2x24h Sí BCR/ABL + MLL + TEL/AML1 + E2A

Evolución 2x24h Sí Consultar

Pre/Post Tx 2x24h Consultar Consultar

Del(5q)

PML/RARα

Delección p53

AML1/ETO

MLL

Del(7q)

MYH11/CBFβ

Del(20q)

SMD y SMPC Momento Cultivo Cariotipo FISH

SMD * Dx 2x24h Sí 5q-

Evolución 2x24h Sí Consultar

Pre/Post Tx 2x24h Sí Consultar

SMPC Dx 2x24h Sí BCR-ABL (SP)

Evolución 2x24h Sí Consultar

LMC Dx 2x24h Sí BCR-ABL (SP)

Evolución 2x24h Sí BCR-ABL (SP)

LMMC Dx 2x24h + ADN + ARN

Sí PDGFR α y β* + BCR-ABL

Evolución 2x24h Sí No

SLPC Momento Cultivo Cariotipo FISH

SLPC-B Dx 2x72h + TPA No FISH LLC + IgH

LLC Dx 2x72h + TPA No FISH LLC + IgH

SLPC-T Dx 2x72h + PHA No FISH LLC + IgH

LINFOMAS Momento Cultivo Cariotipo FISH

Manto Dx 2x72h + TPA No BCL-1

Folicular Dx 2x72h + TPA No BCL-2

No definido Dx 2x72h + PHA No IgH

Hodking No No No

OTROSMoment

oCultivo Cariotipo FISH

Anemia Aplásica Dx 2x24h Sí 7q-

Fragilidad Cromósomica

Dx 2x72h + PHA2x72h + DPB2x72h + 10 MTC2x72h + 40 MTC

Sí No

FISH Complemento de la técnica de

citogenética Hibridación in situ: Marcar o identificar

una secuencia de ADN con una sonda específica que reconoce dicha secuencia

Sonda: Secuencia de ADN marcadas con un fluorocromo, específicas, que reconocen una determinada secuencia del genoma

FISH Alteraciones cromosómicas numéricas y

estructurales tanto en células que no entran en división (interfase) como en células en división (metafase)

La mayoría de los dx hematológicos se asocian a una alteración citogenética determinada

Confirmación de dx clínicos, caracterizar grupos pronósticos y realizar monitorización de EMR

Valoración del quimerismo hematopoyético tras el trasplante de médula ósea alogénico cuando existe discrepancia de sexo entre donante y receptor

FISH Menor S que otras técnicas moleculares Identificación de anomalías cromosómicas

crípticas o difíciles de detectar para la citogenética convencional

Por el hecho de permitir identificar mutaciones en interfase, simplifica el procesamiento de la muestra al no requerirse cultivo

○ Técnica sencilla y rápida○ En determinados casos, en 4-5h se puede tener

un dx

FISH Puede aplicarse en células depositadas en

un portaobjetos de microscopia (frotis convencional, impronta de tejido, citocentrifugación…) hasta cortes de tejido incluidos en parafina

Se ha usado esta técnica para muestras en parafina almacenadas durante años (hasta 12) a tª ambiente

Técnica de elección (por delante de la PCR) para búsqueda de translocaciones que involucran a genes “promiscuos”, y para delecciones en MM, LLC…

Variantes

Variantes tecnológicas○ Hibridación genómica comparada (CGH)○ Cariotipo espectral (SKY-FISH)○ Multiplex FISH (M-FISH)

Aplicaciones crecientes

Variantes (M-FISH y SKY-FISH) Consisten en marcar el ADN de cada

cromosoma con un fluorocromo con espectro de emisión único y diferenciable de lo demás

“Se pinta a cada cromosoma de un color” Los cromosomas anómalos aparecerán no

uniformes Útil en neos hematológicas Caracteriza correctamente translocaciones

complejas y crípticas

Ventajas (M-FISH y SKY-FISH) Permiten analizar todo el genoma Enorme poder de resolución Identificación de segmentos

cromosómicos no identificados (gran avance en el conocimiento de los genes implicados en ≠ patologías)

Inconvenientes (M-FISH y SKY-FISH) Requieren cultivo de tejido fresco Analizan sólo células en división Personal experimentado tanto en la

realización como en la interpretación Sensibilidad similar al cariotipo, aunque la

información sea más concluyente No detectan delecciones, inversiones o

duplicaciones dentro de un cromosoma Elevado coste económico Equipo informático sofisticado

Muestras

Preparaciones de citogenética convencional tras cultivo de médula ósea, sangre periférica, ganglio u otros tejidos

La muestra obtenida de estos cultivos se conserva en solución Carnoy

También es aplicable a extensiones en fresco de muestras biológicas

Preparación – Día 1 Extensiones: Eppendorf (donde se ha

guardado el material de citogenética convencional) del congelador a -20ºC, se centrifuga, se decanta, y se resuspende con fijador nuevo

Una gota en un porta previamente tratado con metanol y secar a la llama o con plancha a 40-50ºC

Observar extensiones en microscopio invertido a x10 aumentos para ver la distribución de núcleos y el secado

Guardar a Tª ambiente 24h○ Si la muestra es urgente, se puede hibridar en el

mismo día, dejando al menos 1h en temperatura ambiente

Hibridación - Día 2 En oscuridad 7 µl de tampón 1 µl de sonda 2 µl de agua destilada

Se colocan en el porta, tapar con un cubre y colocar en el Hybrite e incubar según cada sonda (24h

normalmente)

Tª ambienteEppendorf estéril

Lavado y contratinción - Día 3 En oscuridad Lavado post-hibridación

○ Retiramos cubre, lavamos 2’ en un baño a 74ºC con una solución de lavado

○ Posteriomente, lavamos 1’ en una solución de lavado a distinta concentración y a temperatura ambiente

Contratinción○ Poner 10 µl de DAPI II y cubrir○ Poner a -20ºC en una caja oscura, envueltas

en papel de aluminio, como mínimo 30’-1º

Microscopio de Fluorescencia Sondas centroméricas: Mínimo de 200

núcleos, con los núcleos con 1, 2, 3 ó 4 señales de hibridación

○ Trisomía: Si >5% de células con 3 señales○ Monosomía: Si >15% con 1 señal

Sondas de locus específicos: Valorar mínimo de 100 núcleos o de 20 metafases

○ Valorable si >5% de células alteradas