PCR en tiempo realComo seleccionar pruebas Moleculares de VPV y ETS

Dr. José de J. Curiel ValdésAnatomopatólogo

ColposcopistaPatólogo Clínico

Evolución en la detección del Cáncer de Cérvix

ThinPrep® SurePath®

1996 19991949

LBC: Citología líquida

2003

Revisión de las pautas de screening

1990s LBC 2000sTest de Papanicolau

VHP– 99,7% Cánceres de Cérvix1

1Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado )

PCR

1980

P16 CINTecCervatec p16 ELISA

L1Ag CytoactivONCOTEC mRNA E6/E7Screening 1º basado en

DNA HPV

HC-2 / H VentanaAmplicor* RocheDNA Invader* WD

2008PREVENCION PRIMARIA

ESCENARIO POSTVACUNAL

Prevención SecundariaProg. Base PoblacionalFinlandia 1963-2008

Meisels and Fortin 1976Purola and Savia 1977Coilocito / Efecto citopatico HPV

Dürst et al. 1983

¿Cómo se si lo tengo?¿Cómo se diagnostica?

• 1.- Estudio de “Papanicolaou” citología cervical.

• 2.- Colposcopía

• 3.- Biopsia “Estándar de

• 4.- Pruebas moleculares

FORMA TRADICIONAL

FORMA MODERNAMAS SEGURA

“BASE LIQUIDA”

¿Cómo se si lo tengo?¿Cómo se diagnostica?

• 1.- Estudio de “Papanicolaou” citología cervical.

• 2.- Colposcopía

• 3.- Biopsia “Estándar de Oro” (?)

• 4.- Pruebas moleculares NORMAL

VIRUS

Citología

• Es el método de detección recomendado• Se considera en NIC 1 poco sensible y específica.• Solo es positiva por definición si existe una fase

productiva.• NIC 2 y 3 es mas sensible y específica.• En base líquida sube la sensibilidad y especificidad.• Es estándar para medir esta sensibilidad y

especificidad ha sido la biopsia.

Colposcopía• Indicada cuando existe una citología anormal

• Usada de rutina y en personas de 20 a 30 años es causa de sobre diagnóstico

• Imágenes en mosaico de diversos tipos, relieves, patrón de vasos etc.

• Algunos muy característicos.

• Siempre requiere de biopsia que lo corrobore.

ALGUNAS IMÁGENES COLPOSCÓPICAS Y SU CORRELACIÓN HISTOLÓGICA

FinoMetaplasia Madura

Metaplasia InmaduraRara vez NIC

DensoNIC Alto Grado

Liso

FinoMetaplasia Maduracon paraqueratosis

GruesoNIC Alto Grado

a Carcinoma Invasor

Mosaico

FinoNIC I

GruesoNIC II y III

Punteado

Metaplasia queratinizante

Siempre ver quehay por debajo

Leucoplasia

Aceto Blanco

¿Cómo se si lo tengo?¿Cómo se diagnostica?

• 1.- Estudio de “

• 2.- Colposcopía

• 3.- Biopsia “Estándar de Oro” (?)

• 4.- Pruebas mol

NORMAL

VIRUS

Espectros molecular y visiblepara diagnóstico de VPH

UNIVERSO POSIBLE A ESTUDIAR

80-90% < 25 años~20 % > 30 años

40-50% < 25 años~20 % 30 años

<10 % > 30 años

A quienes seleccionar

UNIVERSO CON ENFERMEDAD GRAVENUESTRO OBJETIVO A ENCONTRAR

P16

PCR Y CH II

A quienes seleccionar

J.J.C.V.

PORTADOR

Debemos situar de manera segura a nuestra paciente en este esquema

antes de cualquier tratamiento

METAPLASIAS

HS

META

• DETECTAR LAS INFECCIONES PERSISTENTES PREDOMINATEMENTE POR VIRUS DE ALTO RIESGO

• DEFINICIÓN DE ALTO RIESGO– POR BIOLOGÍA MOLECULAR Y DATOS EPIDEMIOLÓGICOS.– CASOS CON Dx HISTOLÓGICO DE CÁNCER Y NIC

METODOS MOLECULARES

• PCR• CH2• OTROS

• Inmunohistoquímica: P16• L 1 DE Cápsula• otros

DEFINICION DE RIESGO

• Bajo: Pocas posibilidades, pero existentes de producir cáncer

• Alto: Mayores posibilidades de producir cáncer

• No es una definición absoluta.

INFECCION POR VPHDOS MODALIDADES

TRES ETAPAS

• PRODUCTIVA: L1 Y L2• TRANSFORMANTE: E6 (P53) Y E7 (gRb)

(ONCOGÉNICA)

• AMBAS EN TRES ETAPAS CLÍNICAS– PORTADOR SANO– INFECCIÓN SUBCLÍNICA– INFECCIÓN CLÍNICA

Donde está el Patólogo Clínico en el diagnóstico del VPH

Detección

Como riesgo

Enfermedad

Diagnóstico yCapacidad de progresión

Estudio citológico

Sensibilidad medianaEspecificidad alta

Colposcopía

Sensibilidad altaEspecificidad baja

Biopsia

Sensibilidad alta Especificidad mediana a alta

Clínico GinecólogoColposcopista

Colposcopía y Toma de muestras

AnatomopatólogoCitopatólogo

Interpretación y diagnóstico

Patólogo Clínico

¿ ?

Para que se usan las pruebas

DETECCION: Presencia de VPH como método primario de tamizaje antes de citología

CONFIRMACION DE DX

SEGUIMIENTO DESPUÉS DE TRATAMIENTO

CURIOSIDAD (POSITIVO EN LA PAREJA) USO EN HOMBRES (?) EN TEJIDOS FRESCO Y PARAFINA

Involucrados: Biólogos molecularesAnatomopatólogos Patólogos Clínicos, Químicos

Detección

• Estudio epidemiológico

• Factor de riesgo

• Seleccionar a quien realizar estudio citológico

• Preferentemente en mujeres de mas de 30 años

EVOLUCIÓN DE VIRUS PRESENTE A VIRUS TRANSFORMANTE

¿Quién fue primero mujer u hombre?

• La enfermedad es tan antigua como la humanidad

• PERO… se detectó apenas desde 1980 como infección

• En 1983 se le ligó como productor de Cáncer C.U.

• De ahí nació su importancia

HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by Age

15-19

20-24

25-29

30-34

35-39

40-44

45-49

50-54

55-59

60-65

Age (Years)

HPV

Pre

vale

nce

(%) HPV (HC2)

Cancer

1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.

0

5

10

15

20

25

30

0

5

10

15

20

25

30

Canc

er in

cide

nce

per 1

00,0

00

VIRUS FASE PRODUCTIVA (vegetativa o episomal)

• El virus es diagnosticable morfológicamente cuando tiene una fase proliferativa es decir un gran número de copias.

• Es cuando cambia la morfología celular , el núcleo crece y se lobula y es visible = Coilocitosis

• Existen estadios intermedios en donde hay virus con menos copias con cambios morfológicos inciertos ¡Coilocitosis Abortiva!.

Infección productiva HPV

¿Cómo se transforma una infección HPV en un carcinoma? Integración del ADN viral en el ADN

huésped

Adaptado de 1. Phelps y Alexander. Ann Intern Med. 1995;123:368–382. 2. Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.

LCRE7

E6

E1L1

L2

E2

E4E5

Punto de rotura e integración

+

–

LCR E7E6 E1L1L2E2 E4 E5

ADN del VPH integradoAND huéspedADN huésped

E2

ADN episomal del VPH

La integración aumenta el riesgo de cáncer - I

PA

p53E6

Después de laintegración

Episomal

Asociación de E6 con p53 y PA

Efecto

• Expresión del gen E6 controlada por E2

• La expresión de E6 deja de estar controlada

• Bloqueo de la actividad de p53

• Resistencia a la apoptosis

• Aumento de la inestabilidad cromosómica

Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.

Forma del VPH en la célula

E2F

pRBE7

Después de laintegración

Episomal

Libre

Forma del VPH en la célula Efecto

• Expresión del gen E7 controlada por E2

• La expresión de E7 deja de estar controlada

• Generación de múltiples cromosomas

• Inmortalización celular

• Oncogénesis

+

Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.

La integración aumenta el riesgo de cáncer - II

PCR de punto final

• Replicación, y electroforesis con comparación de un “codigo de barras” contra controles ya establecidos.

• No es absoluta la comparación, similitud de un % decreciente– 95 % virus de alto riesgo– 89 % virus de bajo riesgo– 70 Virus de alto riesgo.

PCR de punto final

• El patrón y traducción para catalogar los virus en alto y bajo riesgo fue por aislamiento de VPH en casos de carcinoma y displasias y así saber si fueron o no oncogénicos.

• De nuevo el estándar fue la biopsia.• Es decir PCR es una evidencia indirecta de

la capacidad oncogénica y por lo tanto no es absoluta por si sola.

PCR de punto finalIndicaciones de uso

• Como un método de Dx epidemiológico.• Detecta desde portadores y enfermedad

transitoria hasta enfermos • No distingue fase productiva o

transformante• Selecciona a quienes vigilar de los 30 años

en adelante.

Método de captura de híbridos (HC2)

• DESNATURALIZACIÓN

• HIBRIDACIÓN CON SONDAS ARN DE ALTO Y BAJO RIESGO

• CAPTURA DEL HÍBRIDO ADN/ARN MEDIANTE ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN

• FIJACIÓN AL HÍBRIDO DE ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN MARCADOS CON FOSFATASA ALCALINA

• DETECCIÓN DE LA ENZIMA FIJADA MEDIANTE SUSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE

• Hibridación ADN/ARN.• Cóctel de sondas:

- Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.

- Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44.• Sensibilidad adecuada a procesos de

tamizaje de VPH (1 pg/mL).• Aprobado por la FDA.• Posibilidad de semicuantificar.• Estandarizada y automatizable.

(Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)

Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbridos (HC2)

• LIMITACIONES:• Prueba dependiente del estado de conservación del DNA viral• La semicuantificación de la Carga Viral• No distingue los diferentes tipos virales• No detecta infecciones múltiples• Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos

virales de bajo riesgo. La mayoría de las muestras discordantes HCII+ están relacionadas con un valor bajo de RLU y reactividad cruzada con genotipos de bajo riesgo

Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbridos (HC2)

CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA

• Al ser menos sensible a través de estudio se ha comprobado que detecta a los mas capaces de inducir neoplasia.

• Factor pronóstico de progresión.

• Aprobado por FDA.

CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA

• Una prueba negativa de CH2 no significa que no se tenga virus

• El método ha sido estandarizado de manera que las unidades relativas de luz detectadas se compararon con la evolución a Ca Cu

• Se requiere un número relativamente elevado de copias para que sea oncogénico

• Por ello es que se requiere realizar la prueba cada 3 años

CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA

• Toda mujer debería después de los 30 años realizarse cuando menos una vez la prueba

• Una mujer de mas de 60 años sin vida sexual y con CH2 podría hacerse su estudio dos veces mas cada 3 años y suspender estudios.

• Si hay Actividad sexual debe continuar con Citología cada 2 o 3 años de acuerdo al grado de riesgo

PRC en tiempo real

• El mismo método para subir la temperatura y desdoblar la cadena de DNA

• Ciclos con temperatura controlada con sustratos que emiten luz

• Medida a diferentes temperatura y diferentes colores para los tipos específicos de virus

• El proceso dura unas horas y se realiza en una termociclador programado que lee “EN TIEMPO INMEDIATO (REAL)” la progresión de la replicación viral.

PRC en tiempo realVentajas sobre PCR de punto final

• Detección segura del tipo viral: la lectura de la electroforesis es dependiente de la calidad de la electroforesis, en PCR TR esta dada por la temperatura de unión y el color en cada ciclo

• Detección de enfermedades mixtas (varios tipos virales) La PCR de punto final el tipo que predomina inhibe a los otros y no se detectan.

• Tiempo de proceso: el mismo día (se requieren cuando menos 16 muestras por corrida) PCR tradicional mínimo 10 días

• Costo: es semejante

CH2 y PCR tiempo real FUTURO

• Método de tamizaje• Es mas senisble que el estudio citológico (pero

es mas caro)• Si se realiza de manera simultánea obliga a

revisar la citología de manera mas minuciosa, evita falsos negativos sobre todo el LAG

• Detecta mas mujeres en riesgo sin enfermedad (CCV detecta solo las que tienen enfermedad)

En ASC US o H en México

• Es preferible hacer colposcopía y tomar biopsia.

• La psoitividad de PCR, CH2 no indica necesariamente enfermedad, puede ser metaplasia atípica o inmadura.

• En EU la colposcopía y la biopsia son mucho mas caras que una prueba de PCR o CH2.

• Si sale positiva en EU ya se manda a Colposcopía y biopsia.

CH2: 3.28

CH2 7.19

Recomendaciones de la sociedad Española de ETS

Metodologías

• Cultivo celular• Cultivos con inmunoquímica• Frotis con anticuerpos monoclonales• PCR

• Cultivos: Falso positivos y negativos, depende del estado de conservación de la muestra y el tiempo de la toma a el inicio del proceso en el laboratorio.

• Publicación del Hospital Universitario de Monterrey NL

• Las muestras con sangrado fueron positivas en el 50 %, cuando el población fue solo el 29%,

• La mustra se toma de endocérvix y sangra fácilmente.

Uso en ETS

• La metodología tradicional de Chlamydia y las variedades de Mycoplasma- Ureaplasma (4 variedades) es muy errática, hay falsos negativos y positivos

• Depende de la toma y conservación de la muestra.

• Es método de crecimiento del germen. Es intracelular, por lo mismo está generalmente en el endocérvix

PCR en TR

• La muestra es fijada en el mismo medio de CBL

• La replicación de DNA es 100% específica de cada organismo

• Es mas sensible que los métodos microbiológicos convencionales.

• No da sensibilidad a antibióticos

Conclusión

• PCR RT es una metodología que se está usando en forma alterna y asm segura que CH2 y PCR de punto final

• 1.- Detecta infecciones múltiples• 2.- El tipo viral detectados en el mas real• 3.- Mismo costo• 4.- Menos tiempo de proceso• 5.- En ETS es mas segura y con un costo similar a

los dos cultivos.