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Perspectiva del uso de la secuenciación masiva en el mundo vitivinícolaCarmen Portillo Dept. Bioquimica i Biotecnologia, URV
15 Abril 2016XXVIIè CONGRÉS I LA NIT DE L’ENOLOGIA 2016
Indice
Introducción de la microbiología del vino
Secuenciación masiva (HTS)
Aplicaciones de HTS en enología
Perspectivas futuras de HTS en enología
Carácter del vino
Uva
• Variedad, cepa, prácticas cultivo• Clima, microclima, enfermedades
Microorganismos
• Microbiota de la uva• Inóculo• Microbiota de la bodega
Procesado
• Recogida, macerado, aditivos, condiciones de fermentación, lias• Clarificación, filtración
Envejecimiento
• Composición, tiempo, Tª, pH, higiene, evaporación,O2
Introducción
Decisión de la bodega
Grape
Introducción
MicroorganismoEnvejecimientoProcesadoUva
MicroorganismoEnvejecimientoProcesadoUva
Microorganismo
Procesado
Procesado
Crianza
Crianza
Uva
Microorganismo
Uva
Microbiología del vinoLevaduras: Fermentación alcohólicaAzucares EtOH + CO2
LAB: Fermentación MalolácticaAc. málico Ac. Láctico
Deseables
Introducción
Sugars
Problema de contaminación
Levaduras o bacterias: • Desestabilizan la fermentación• Producen malos olores o sabores• Refermentan en el producto embotellado
Indeseables
BACTERIASAcetobacter
GluconobacterBacillus
PediococcusLactobacillus
…
LEVADURASBrettanomyces
CandidaPichia
Zygosaccha.Schizosacch.
….
Introducción
Métodos de detección alteraciones microbiológicas• Análisis sensoriales o de cromatografía gaseosa
Confirmativos
• Cultivo en placas de medios selectivosIncubación larga, VPNC, medios inadecuados
• Técnicas moleculares basadas en ADN/ARNrestricción del ADN mitocondrialPCR-RFLPPCR-RAPDPCR con cebadores específicos Pre-enriquecimiento PCR anidada LimitacionesqPCR
Introducción
Métodos de detección alteraciones microbiológicas• Análisis sensoriales o de cromatografía gaseosa
Confirmativos
• Cultivo en placas de medios selectivosIncubación larga, VPNC, medios inadecuados
• Técnicas moleculares basadas en ADN/ARNrestricción del ADN mitocondrialPCR-RFLPPCR-RAPDPCR con cebadores específicos Pre-eriquecimiento PCR anidada LimitacionesqPCR
Introducción
Secuenciación Masiva HTS
Secuenciación masiva (HTS)Secuenciación m
asiva (HTS)
ADN genómico
Fragmentación
Identificación(Tag)
Amplificación
SecuenciaciónAnálisis
Secuenciación masiva (HTS)Secuenciación m
asiva (HTS)
Aplicaciones de secuenciación masiva (HTS)
Secuenciación masiva (HTS)
• Metagenómica (mezcla de ADN dentro de un ecosistema)
• ADN de muestras prehistóricas• Secuenciación de genomas procariotas y eucariotas• Identificación de mutaciones (enfermedades)• Estudios comparativos (Metatranscriptómica)• Detección de alelos específicos del cancer• Epigenómica• Detectar ncRNA• …..
Aplicaciones de secuenciación masiva (HTS)
Secuenciación masiva (HTS)
• Metagenómica (mezcla de ADN dentro de un ecosistema)
Aplicaciones de secuenciación masiva (HTS)
Secuenciación masiva (HTS)
• Metagenómica (mezcla de ADN dentro de un ecosistema)
Investigar comunidades microbianas
16S procariotas18S/ ITS eucariotas
Alimentos
Genes/funciones
Estructura de la comunidad
-Bebidas fermentadas-Carne-Leche-Queso…
Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones
Bokulich et al., 2012. PLoS ONE 7(5): e36357. doi:10.1371/journal.pone.0036357
• Estudio pionero de HTS en enología realizado sobre vino Botritizado• Diversidad bacteriana mucho mayor a la descrita anteriormente• Influencia del uso de inoculo de S.cerevisiae sobre diversidad bacteriana
Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones
Bokulich et al., 2013. PNAS. E139–E148, doi: 10.1073/pnas.1317377110
Las comunidades microbianas (bacterias y hongos) están influenciadas por la variedad de uva, región, clima y cosecha
Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones
Pinto et al., 2014. PLoS ONE 9(1): e85622. doi:10.1371/journal.pone.0085622
• Procariotas y Eucariotas en las hojas de la vid a lo largo del ciclo vegetativo
• Microbiología estructurada y dinámica (Enterobacteriaceae yAureobasidium)
• Microbiota afectada por el tratamiento químico
Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones
Zarraonaindia et al., 2014. mBio 6(2):e02527-14.doi:10.1128/mBio.02527-14
• El suelo es una fuente importante de bacterias asociadas a la vid• Los factores edáficos y las propiedades específicas del viñedo influyen la microbiología de la planta antes de la vendimia
Mantel test r ppH 0.611 0.001C:N 0.442 0.001Carbon 0.158 0.001Soil Temp 0.155 0.001Moisture 0.125 0.005Nitrogen 0.104 0.031
Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones
Portillo et al., 2016. International Journal of Food Microbiology 219 (2016) 56–63
• Los más abundantes en uva: Bacillales y Lactobacillaes• Diferentes grupos taxonómicos y proporción de los mismos (viñedo y variedad)
Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones
Portillo et al., 2016. International Journal of Food Microbiology 219 (2016) 56–63
• La variedad de uva y el viñedo influyen en la microbiota residente en los racimos• Factores como la orientación geográfica del viñedo marcan las diferencias en la composición bacteriana de las uvas dentro de una DO (Priorat)
Aplicaciones HTS en enologíaAplicaciones
Portillo et al., 2016. International Journal of Food Microbiology 219 (2016) 56–63
• Grupos taxonómicos compartidos por los distintos viñedos
Persperctivas de HTS en enología• Hasta ahora, uso principalmente ecológico• En el área de alimentos, monitorización de grupos• Recientemente, búsqueda de contaminantes
Perspectivas
Uso de HTS para la detección de contaminantes microbiológicos durante fermentación, envejecimiento o tras el
embotellado del vino
Persperctivas de HTS en enología• Hasta ahora, uso principalmente ecológico• En el área de alimentos, monitorización de
especies• Recientemente, búsqueda de contaminantes
Perspectivas
Uso de HTS para la detección de contaminaciones microbiológicas durante
fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino
Ventajas
-Descripción detallada de los microorganismos-Monitorización procesos normales/alterados-Identificación de nuevos alterantes-Posible efecto predictivo
Perperctivas de HTS en enología• Hasta ahora, uso principalmente ecológico• En el área de alimentos, monitorización de grupos• Recientemente, búsqueda de contaminantes
Perspectivas
Uso de HTS para la detección de contaminaciones microbiológicas durante
fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino
Desventajas -Coste aún elevado para bodegas-Requiere conocimientos bioinformáticos
Perperctivas de HTS en enología• Hasta ahora, uso principalmente ecológico• En el área de alimentos, monitorización de grupos• Recientemente, búsqueda de contaminantes
Perspectivas
Uso de HTS para la detección de contaminaciones microbiológicas durante
fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino
Desventajas -Coste aún elevado para bodegas-Requiere conocimientos bioinformáticos
Solución: Realizar análisis mediante servicios externosEjemplo: Biome Makers
Gracias!
Carmen Portillo Dept. Bioquimica i Biotecnologia, URV
15 Abril 2016XXVIIè CONGRÉS I LA NIT DE L’ENOLOGIA 2016