Post on 13-Jan-2016
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Práctica Enzimas de Restricción
Enzimas de restricción Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propioSistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio
ADN bacteriano protegido por metilación. La enzima de restricción corta el ADN no metilado: no propio
Enzimas de restricción
Se han identificado cientos La mayoría reconocen y cortan
secuencias palindrómicas Muchas dejan “puntas
pegajosas” Se pueden hacer cortes muy
precisos del ADN al escoger la enzima
Importante en biología molecular: puntas pegajosas se unen con secuencia complementaria
Palíndrome
• oso• radar • reconocer• rotor • salas• seres • somos • sometemos • oro• ala • ojo
Secuencia palindrómica en biología
5'- G A A T T C -3'
3'- C T T A A G -5'
• Locus de ADN en el que la secuencia 5'-a-3' es idéntica en ambas hebras
Algunas enzimas usadas comúnmente
Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTTSac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG
Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI 5'-G | GATCC Pst I 5'-CTGCA | G
Uso de enzimas de restricción
• La actividad depende de condiciones precisas:
pHTemperaturaConcentración de salesIones
• Unidad enzimática (u) es la cantidad de enzima requerida para digerir 1 ug de ADN bajo condiciones óptimas:
3-5 u/ug de ADN genómico1 u/ug ADN de plásmido Stocks típicamente 10 u/ul
Tipos corte
Utilidad para ADN recombinante
Marcador de peso molecular
• Permite identificar tamaño (peso) aproximado de moléculas en un gel
• A menudo es ácido nucleico digerido con enzima de restricción
• Común: fago lambda digerido con HindIII: da 5 bandas
• O la escalera de 1kb
Plásmidos en gel
Electroforesis de plásmidos
• Plásmido sin cortar puede tomar 5 conformaciones
• No se puede determinar el tamaño de un plásmido no cortado.
• Si se corta con ER que corte en un sitio: se lineariza
Digestión plásmidos
Número bandas= número de sitios de restricción
pG
EM
-T
pG
EM
-T/E
co
RI
pU
WL
201
pU
WL
201
/Ec
oR
I
Digestión ADN genómico
Diagnóstico deleciones/inserciones por electroforesis
Deleción en FQ
Fibrosis quística
Recesiva
Deleción 3pb en gen CFTR, 70% de casos
Degradada en RE, no llega a membrana celular
Diagnóstico por sitios de restricción
Mutación: Cys282Tyr
Mutación Hemocromatosis
Mutación: His63Asp
Mutación Hemocromatosis
• http://www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Restriction_Digestion/index.html
Lambda cortado con EcoRI
5 cortes
Lambda cortado con Eco RI
6 fragmentos
Práctica
• Digestión del fago Lambda con tres enzimas de restricción