Post on 23-Jan-2016
description
(
Ariadna Berenice Trejo Raya A01163207 María Alejandra García Alcaraz A01167481
María Elena Mendoza Acosta A01163564 Mario Alfonso Arenas García A01162581
Natalia Martínez Balderas A01163759
Dr. César García Díaz
2014
Tecnológico de Monterrey
Campus Estado de México
Laboratorio de
Bioprocesos
Práctica V
Cultivo por Lote
1. Resultados
El microorganismo empleado para la realización del cultivo en lote fue E. coli transformado con un plásmido que contiene GFP (Green Fluorescent Protein). Se dejó crecer la bacteria por 19 horas con la finalidad de poder obtener su cinética de crecimiento.
1.1 Crecimiento de la Biomasa Se registró la densidad óptica (O.D, por sus siglas en inglés) tomando muestras cada
dos horas (aproximadamente); cumpliendo con 9 tomas en total. La tabla 1.1 muestra
los datos del logaritmo natural de O.D con relación al tiempo.
Tabla 1.1 Datos de Ln [O.D] con relación al cambio en el tiempo.
Tiempo (min) Ln [Absorbancia]
0 -3.270169119
210 -2.103734234
330 -1.814005078
435 -1.127011763
555 -0.182721637
705 0.455524308
855 0.455524308
1005 0.393392527
1140 -3.270169119
De estos datos, se realizó la gráfica I; la cual establecida como el Ln [O.D] en el
eje y con respecto al tiempo (eje x). La tasa de crecimiento es el cambio en el número
de células por minuto, estimado como el cambio de O.D por minuto en este caso.
El cambio instantáneo es dado en función del número de células que están
presentes en cualquier momento, el cual es representado por la siguiente ecuación
(Ec. 1):
𝑑𝑁
𝑁= 𝜇𝑡
Donde N es la cantidad de células en el tiempo t, y μ es la constante de la tasa de
crecimiento (unidades en este caso de min-1). (Hall et al, 2013)
-3.5
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
0 200 400 600 800 1000 1200
Ln [
O.D
]
Tiempo (min)
Ln[O.D] vs Tiempo
Gráfica I. Comportamiento de Ln [O.D] en relación al
tiempo (min).
Al integrar la previa ecuación mencionada, evaluando desde t =0 y t =T, la relación
es (Ec. 2):
ln [𝑁𝑇
𝑁0⁄ ] = 𝜇(𝑡 − 𝑡0)
De esto, la pendiente de la gráfica de Ln [N] en función de t es μ. En base a ello, se
utiliza la pendiente de Ln [O.D] en función de t para poder obtener μ, pero solo
empleando la parte lineal de la gráfica que corresponde a la fase exponencial del
crecimiento. (Ver gráfica II.)
De la regresión lineal realizada en la gráfica II, se obtiene la siguiente ecuación (Ec. 3):
𝑦 = 0.0053𝑥 − 3.3268
De ello, se calcula que 0.0053 min-1 corresponde a μ. Para la obtención del tiempo de duplicación (tD), se emplea (Ec. 4):
𝑡𝐷 = ln2𝜇⁄
Esto da un tiempo de duplicación de 130.78 minutos.
1.2 Efecto de la Concentración de Sustrato
El análisis de la concentración de sustrato (glucosa) se realizó mediante el uso de una
curva de fenol-ácido sulfúrico (gráfica III). En base a dicha curva, se obtuvo una
regresión lineal (Ec. 5) para la determinación de la concentración de glucosa a través
del tiempo para las muestras obtenidas durante el intervalo de 19 horas.
y = 0.0053x - 3.3268R² = 0.9766
-3.5
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0 100 200 300 400 500 600
Ln [
O.D
]
Tiempo [min]
Fase Exponencial del Crecimiento
Gráfica II. Regresión lineal del crecimiento en la fase
exponencial.
La ecuación obtenida a partir de la gráfica III es la siguiente (Ec. 5):
𝑦 = 0.0065𝑥 − 0.0238
Mediante el uso de la ecuación 5, se obtuvieron las concentraciones de glucosa
(ver tabla 2) y con ello se realizó una gráfica (IV) en la cual se puede observar la
relación de la concentración de sustrato con el paso del tiempo.
Tabla 1.2 Datos de concentración de glucosa con respecto al tiempo
Tiempo (min)
Concentración (μg/ml)
Concentración Real (ug/ml)
0 239.9692308 10000
210 388.2769231 9706.923077
330 302.8923077 7572.307692
435 218.2769231 2182.769231
555 217.5076923 2175.076923
705 230.5846154 2305.846154
855 194.7384615 1947.384615
1005 131.3538462 1313.538462
1140 101.4307692 1014.307692
y = 0.0065x - 0.0238R² = 0.9975
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 100 200 300 400 500
Ab
sorb
anci
a
Concentración (μg/ml)
Curva Tipo Fenol-Ácido Sulfúrico
Gráfica III. Curva fenol-ácido sulfúrico con regresión
lineal.
La pendiente de la gráfica de concentración la cual está en función de t es la
velocidad de consumo de sustrato. En este caso, se usa solamente la parte lineal de la
gráfica IV para poder calcular la velocidad de consumo de sustrato; asimismo, este
segmento corresponde a la fase exponencial del microorganismo. (Ver gráfica V.)
En la Gráfica V, se realizó una regresión lineal donde se obtuvo que la velocidad de consumo es de 1984.2 μg·ml-1·h-1 (1.984 mg·ml-1·h-1); y la ecuación que explica dicho comportamiento corresponde a la ecuación 6 (Ec. 6):
𝑦 = −1984.2𝑥 + 17235
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 200 400 600 800 1000 1200
Co
nce
ntr
ació
n [μ
g/m
l]
Tiempo [min]
Concentración vs Tiempo
Gráfica IV. Relación de concentración de glucosa al
paso del tiempo.
y = -1984.2x + 17235R² = 0.9219
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Co
nce
ntr
ació
n [μ
g/m
l]
Tiempo [h]
Velocidad de consumo
Gráfica V. Velocidad de consumo de glucosa de E.
coli con GFP.
Aunque la velocidad de consumo tiene un signo negativo, esto corresponde a que
denota que la concentración va disminuyendo.
2. Discusión
El cultivo en lote (o batch) se caracteriza por el crecimiento de microorganismos en un
volumen fijo de nutrientes inicial. Dicha cantidad es alterada conforme es usado por el
microorganismo hasta que es agotado. Por otro lado, dicho método de cultivo no
presenta intercambio de materia con su alrededor. (Quiroga, 2010)
Cabe mencionar que en este tipo de cultivo las condiciones irán cambiando a
medida que proceda la reacción; normalmente a medida que las condiciones
nutricionales cambian, la velocidad de crecimiento disminuye.
Las ventajas del uso de un cultivo batch es que se tiene un mejor control sobre el
riesgo de contaminación al igual que sobre el crecimiento del microorganismo. Sin
embargo, puede existir una inhibición por altas concentraciones de sustrato y puede
haber improductividad en la operación del fermentador. Por otro lado, el crecimiento no
restringido puede desencadenar una serie de cambios en el medio de cultivo como la
limitación de oxígeno y cambios de pH, al igual de que las vías metabólicas se saturan
generando acumulación de productos inhibitorios en el medio. (Menzella, 2013)
Considerando el microorganismo utilizado (E. coli que genera GFP), se estipula
que el tiempo de duplicación para la gran mayoría de las cepas de E. coli es de entre
20 y 30 minutos. (Expression Technologies, 2003) Sin embargo, de acuerdo a un
estudio realizado por Siak-Wei, Morin y colaboradores (2005); reportan que las tasas
de crecimiento (entre ellas el tiempo de duplicación) es mayor en microorganismos
que tienen plásmidos que aquellos que no los tienen (se usó E. coli cepa DH5α, con y
sin el plásmido NS3).
El tiempo de duplicación se estimó en 130 minutos, el cual está por encima del
rango de 20-30 minutos que ocurre a una temperatura de 37°C (Srivastava, 2003).
Esto puede ser debido a que, como previamente mencionado, se deba a que este
modificado para poder generar GFP; ya que su tasa de crecimiento es menor. Otras
consideraciones a tomar son (Microbial Physiology, s.f.):
Concentraciones de nutrientes
Temperatura y pH del sistema
Efecto de O2 en el sistema
En todos los casos, el biorreactor no pasaba de los parámetros óptimos de
operación para poder tener un crecimiento óptimo de la bacteria; los cuales fueron de
500 RPM, 1 vvm de aireación, temperatura a 37°C a un pH de 7. Puede ser que el
elevado tiempo de duplicación se deba a que se trate de un microorganismo
modificado; como explica Siak-Wei y colaboradores (2005).
Por otro lado; Soria, Flores y colaboradores (2009) reportan una velocidad de
consumo de glucosa (en este caso el sustrato) de 4.91 g·l-1·h-1 para E. coli MG1655 o
4.69 g·l-1·h-1 en la cepa JM101. Esto al reportarse en base a las unidades presentadas
en el segmento de resultados, sería de 4.91 mg·ml-1·h-1 y 4.69 mg·ml-1·h-1
respectivamente. Al contrastarlo con el valor obtenido, se observa que es
aproximadamente tres veces menor el valor de la práctica en contraste con el
reportado por la literatura. Esto en parte podría explicar el tiempo de duplicación
elevado en contraste con el que se reporta ampliamente (20-30 minutos), ya que
consume poca glucosa.
Es importante destacar que las velocidades de consumo de sustrato pueden variar
de acuerdo a la cepa empleada al igual que las operaciones del sistema; sin embargo,
los resultados de Soria y colaboradores (2009) fueron hechos en un proceso tipo lote y
en condiciones óptimas; por lo que se asemejan a las condiciones de la práctica.
3. Conclusión
Ariadna Berenice Trejo Raya
Durante la realización del presento ensayo de cultivo en lote utilizando E. coli cepa
DH5α, bajo las condiciones que establece el protocolo de la práctica presente, se
pudo observar la obtención de tiempos de duplicación mayores a los esperados;
resultado que probablemente sea gracias a la naturaleza de la cepa y condiciones de
operación propias del ensayo. Para determinar la relación entre el tipo de cepa y los
tiempos de duplicación elevados, es necesaria la realización de más estudios.
Para la determinación de la consumo de sustrato se realizó una curva de
calibración para Fenol-sulfúrico, la cual ayudó a la determinación de las
concentraciones; el uso y correcta realización de la misma determina en gran medida
la sensibilidad del ensayo realizado.
La correcta elección y uso de los método analíticos durante la caracterización de
un ensayo es de gran importancia, y determina la sensibilidad, reproductibilidad y
exactitud de los resultados obtenidos.
María Alejandra García Alcaraz
En esta práctica se obtuvieron valores lejanos a lo esperado, debido a que durante el
ensayo no se hizo uso de los parámetros adecuados y sobre todo las muestras se
estuvieron congelando y descongelando durante un largo periodo. Este factor también,
alteró la curva de crecimiento ya que el microorganismo de las diferentes muestras no
se eliminó por completo y siguió creciendo, cabe mencionar que las etapas o fases de
la curva de crecimiento dependen del tipo de microorganismo que sea utilizado.
Finalmente, este tipo de ensayo debe realizarse en un mismo día, pues el hecho
de estar congelando y descongelando las muestras altera los valores tanto de la curva
de calibración con fenol-sulfúrico y DNS, en otras palabras la sensibilidad del ensayo
se ve afectada. Además, el cultivo en batch al no poder controlar ciertos parámetros
del reactor se crea una inhibición en el proceso por acumulación de producto.
María Elena Mendoza Acosta
En un cultivo tipo lote el crecimiento celular se auto limita debido a la no adición de
nuevo medio de cultivo; lo cual permite un buen manejo de esterilidad y he ahí su
aplicación en diversas industrias.
Los valores encontrados indican que, en general, E. coli cepa DH5α, bajo las
condiciones ideales es más sensible que una cepa no transformada. Esto se definió a
partir de la obtención de un tiempo de duplicación más grande y por lo tanto una
velocidad de consumo de sustrato más lento que el de E.coli no transformada.
Tanto el buen manejo del ensayo, en cuanto a buenas prácticas de laboratorio
refiere, como la utilización correcta de los métodos analíticos es imprescindible; ya que
estos últimos permiten generar información que posteriormente será interpretada.
Se recomienda realizar una prueba de peso seco para la obtención de nuevos
valores de velocidad de crecimiento y así corroborar los datos obtenidos.
Mario Alfonso Arenas García
La significante diferencia entre los resultados obtenidos y los reportados por la
literatura puede ser debida en parte a que se trata de una cepa genéticamente
modificada (ya que genera GFP). Sin embargo, otra causa puede ser a la edad del
cultivo de E. coli, ya que si lleva mucho tiempo guardado esto también puede afectar el
desarrollo del mismo.
No obstante, no se le puede atribuir estas diferencias a un control indebido a las
condiciones de operación, ya que no se observó en ningún momento que hubiese
problemas significantes y se encontraban dentro de los rangos óptimos de crecimiento
para E. coli. Esto, sin embargo, no impidió observar el comportamiento generalizado
visto en un cultivo tipo lote; ya que de todas formas se podía observar la tendencia de
consumo de glucosa y el crecimiento de E. coli.
Finalmente, es importante destacar que hubo problemas para poder obtener los
pesos secos de las muestras; por lo que impide realizar un mayor análisis sobre los
datos. Cabe mencionar que se tiene que mejorar las prácticas de laboratorio para
poder evitar dichos problemas a futuro.
Natalia Martínez Balderas
La realización de esta práctica permitió conocer el procedimiento a seguir para lograr
una fermentación por lote, desde la preparación del equipo y del medio para su
esterilización como del inóculo. Así mismo, permitió observar los efectos de los
parámetros utilizados para el cultivo, en este caso E. coli, a trabajar.
Con respecto a los resultados obtenidos, donde el tiempo de duplicación de 130
minutos es mucho mayor que el reportado por la literatura de 20-30 minutos se puede
atribuir al hecho de que se trabajó con una cepa modificada (DH5α), lo cual ocasionó
que su comportamiento de crecimiento fura diferente al de una cepa no mutada.
La velocidad de consumo se vio afectada por el factor antes mencionado, pues al
crecer de una forma lenta, el sustrato se consume lentamente, esto se hace evidente
al comparar el tiempo de duplicación obtenido experimentalmente, en el orden de
microgramos, contra la información reportada en la literatura que se encuentra en el
gramos.
Por lo tanto, se puede concluir que a pesar de que las condiciones se mantengan
en un rango óptimo para la especie con la que se trabaja, el tiempo de crecimiento y la
velocidad de consumo de sustrato depende de que si la cepa está modificada o no,
pues el microorganismo se encuentra afectado por las características ajenas a sí
mismo.
4. Fuentes de Información
Expression Technologies Inc. (2003). “Bacterial E. coli Growth Media.” Obtenido el 17
de marzo de 2014 de:
http://www.exptec.com/Expression%20Technologies/Bacteria%20growth%20media.ht
m
Hall, B. G.; Acar, H.; Nandipati, A. y Barlow, M. (2013). “Growth Rates Made Easy.”
Molecular biology Evolution. DOI: 10.1093/molbev/mst187
Menzellas, H. (2013). “Tipos de cultivos Producción de proteínas recombinantes en E.
coli”. Obtenido el 18 de marzo de 2014 de:
http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/103635/mod_resource/content/1/Cla
se%2011.pdf
Microbial Physiology. (s.f.) “Bacterial Growth, Environmental Effects and Strategies.”
Obtenido el 18 de marzo de 2014 de:
http://trishul.sci.gu.edu.au/courses/bbs2710/Module2.pdf
Quiroga, A. (2010). “Optimización del Cultuvo de Escherichia coli para la Producción
de Cutinasas Recombinantes.” Obtenido el 19 de marzo de 2014 de:
http://tesis.uchile.cl/bitstream/handle/2250/111529/cf-quiroga_ac.pdf?sequence=1
Siak-Wei O., D.; Morin N., P.; Philp, R.; Kah-Weng Oh, S. y Gek-Sim Y., M. (2006).
“Global transcriptional analysis of metabolic burden due to plasmid maintenance
in Escherichia coli DH5α during batch fermentation.” Elsevier - Enzyme and Microbial
Technology. Obtenido el 18 de marzo de 2014 de:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022906001086
Soria, S.; Flores, N.; Castillo-España, P.; Gosset, G.; Bolivar, F. y Báez-Viveros, J. L.
(2009). “El Efecto de la Inactivación de la ATP Sintasa sobre las Velocidades
Esecíficas de Crecimiento y de Consumo de Glucosa en Escherichia coli.” XIII
Congreso Nacional de Biotecnolgía y Bioingeniería. Obtenido el 18 de marzo de 2014
de:
http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/acapulco09/TRABAJOS/AREA_VI/CVI-
66.pdf
Srivastava, S. (2003). “Chapter 5 Bacteria and Life Processes - I Growth and
Multiplication. 5.1 Population Growth.” Understanding Bacteria. (pp. 97-98). Paises
Bajos: Kluwer Academic Publishers. Obtenido el 17 de marzo de 2014 de:
http://books.google.com.mx/books?id=7bFdrHln8FwC&printsec=frontcover#v=onepage
&q&f=false