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PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
(CURSO 2012–2013)
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013) Martes
PRÁCTICAS A REALIZAR
ANÁLISIS CUANTITATIVO
DE ORINAM-1 Lectura
de la placa de Agar CLED
ANÁLISIS CUALITATIVO
DE ORINA
M-2Identificación presuntiva
de las colonias crecidas en las placas de Agar Cromogénico y Agar MacConkey
M-3Tinción de Gram
de colonias aisladas en las placas deAgar Cromogénico y Agar MacConkey
M-4 Prueba de la citocromo-oxidasaa la presunta enterobacteria
M-5 Siembra de la colonia seleccionadaen Agar MacConkey
LECTURA Y CONCLUSIONES DEL ANÁLISIS CUANTITATIVODE LA MUESTRA DE ORINA
FUNDAMENTO
Tratamos de conocer el número de microorganismos presentes por cada mililitro de orina.
Independientemente del número, la presencia de ciertos microorganismos, por ejemplo, levaduras o estafilococos en cultivo puro, es suficiente para considerar que existe un proceso infeccioso.
METODOLOGÍA
Como hemos sembrado 1μL de muestra, si multiplicamos el número de UFC (unidades formadoras de colonias) que aparezcan en la placa por 1.000, obtendremos el número de microorganismos presentes por cada mL de orina.
La OMS recomienda utilizar el índice de Kass (105 UFC/mL de orina) como umbral para considerar o no la existencia de una posible infección (> 105 UFC, bacteriuria significativa).
De todas formas, este valor es sólo indicativo, ya que hay personas que presentando valores superiores al índice de Kass, están perfectamente sanas y otras, en cambio, tienen infección en el tracto urinario (ITU) aun cuando no presentan más de 102 ó 103 UFC/mL de orina.
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ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ORINALectura de la placa de Agar CLED
Inoculada con un volumen de 1 μl de orina
Contar el número de UFC en la placa
Ejemplo:
Nº UFC/µL = 35
Nº UFC/mL = 35 x 103 = 3,5 x 104
Nº UFC/mL = 0,35 x 105
Nº BACTERIAS EN ORINA
Nº > 105 / mL Bacteriuria significativaProbable infección
105 /mL > Nº > 104 /mL Diagnóstico dudosoDebe repetirse el análisis
Nº < 104 / mL Bacteriuria no significativaProbable contaminación
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ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINAIdentificación presuntiva de colonias
Utilizaremos las placas:
Agar de MacConkey Moderadamente selectivo
Agar Cromogénico No selectivo
Observaremos la pigmentación de las colonias y consultaremos la tabla.
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INDIVIDUO SIN FACTORES
PREDISPONENTES
INDIVIDUO CON FACTORES
PREDISPONENTES
FRECUENTES
Escherichia coliProteus mirabilisKlebsiella pneumoniae
Escherichia coliPseudomonas aeruginosaOtras enterobacteriasEnterococosStaphylococcus epidermidisCandida albicans
POCO FRECUENTES
EnterococosStaphylococcus saprophyticus
Corynebacterium urealyticum
AGENTES MICROBIANOS AISLADOS FRECUENTEMENTEEN INFECCIONES URINARIAS
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Agar de MacConkey
No fermentala lactosa
Fermentala lactosa
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Agar de MacConkey
Zona oscurecida alrededor de las colonias debida al precipitado de las
sales biliares cuando el medio se hace fuertemente ácido
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Microorganismo Fermentadorde lactosa
Tipo de fermentación de
la glucosa
Liberación de ácidos
Liberaciónde CO2
Escherichia coli Fuerte Ácido mixta Muchos Poco
Enterobacter aerogenes
Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho
Klebsiella pneumoniae Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho
Citrobacter Lento Ácido mixta Muchos Poco
Serratia Lento Ácido mixta Butilén-glicólica
Muchos Pocos
PocoMucho
FERMENTACIÓN DE LA LACTOSA POR ENTEROBACTERIAS
Salmonella, Shigella, Proteus, Edwarsiella y Providencia: no fermentan la lactosa
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PIGMENTACIÓN DE COLONIAS
BACTERIA CLED MACCONKEY CROMOGÉNICO
Escherichia coli Amarillo (grandes)Rojo-rosa
(precipitado)Rosa
Klebsiella Amarillo-azul-blanquecino
Rosa (mucosa)
Azul oscuroPúrpura
Proteus Azul translúcido Incolora Halo marrón
Salmonella Azul Incolora -
Pseudomonasaeruginosa Verde -
VerdeMarrón
Staphylococcusaureus Amarillo dorado No crece
BlancoCrema
S. epidermidis Amarillo pálido No creceRosa
Blanco pálido
Enterococcusfaecalis Amarillo No crece
AzulTurquesa
Estreptococcus - No crece Blanco
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Se seleccionará una de estas colonias y se le realizará la prueba de la oxidasa
La prueba de la oxidasa debe salir negativa
(todas las enterobacterias sonoxidasa negativas)
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Se realizarán tinciones de Gram a colonias aisladas y se observarán al microscopio
Interesan únicamente las colonias que se correspondan con bacilos Gram negativos
Tinción de Gram
1. Extensión.2. Desecación.3. Fijación.4. Colorante: Cristal violeta, 2 minutos.5. Lavar con agua.6. Mordiente: Lugol, 2 minutos.7. Lavar abundantemente con agua.8. Decoloración: Alcohol etílico 96%, 20 segundos.9. Lavar abundantemente con agua.10. Colorante de contraste: Safranina, 3-4 minutos.11. Lavar abundantemente con agua.12. Dejar secar a temperatura ambiente.13. Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100X).
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Gram positiva Gram negativa
Extender y fijarla preparación
Etanol
Lugol
Cristal violeta
Safranina
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Gram positivas
Gramnegativas
Tinciónde Gram
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Prueba positiva
Aparición de color azul-violeta intenso en 10-15 segundos, debido a la formación de azul de indofenol.
Control positivo
Pseudomonas aeruginosa.
Procedimiento
Depositar unas gotas dereactivo (tetrametil-p-feniléndiamina) sobre un papel de filtro. Inmediatamente, con la ayuda de un palillo estéril extender un inóculo de la bacteria sobre el papel de filtro impregnado de reactivo.
Prueba de la citocromo oxidasa
Fundamento
Determinar la presencia delenzima citocromo c oxidasa.
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SIEMBRA DE LA COLONIA SELECCIONADACOMO PRESUNTA ENTEROBACTERIA EN PLACA DE AGAR DE MACCONKEY
La colonia seleccionada debe cumplir:
Haber sido aislada en Agar Cromogénico o en Agar de MacConkey
Se corresponde con bacilos cortos Gram negativos
Dar negativa la prueba de la oxidasa
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Siembra por estrías en sectoresde la placa de Agar de MacConkey
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