Post on 15-Apr-2017
Approccio analitico multi-integrato nella di ti d ll i f i d HPVdiagnostica della infezione da HPV
EVENTI RESIDENZIALI 2015INCONTRI CON IL TERRITORIO. GESTIONE DEL PAZIENTE DAL MEDICO DI
BASE AL RICOVERO IN STRUTTURA SANITARIA
INFEZIONE INFEZIONE DA VIRUS DA VIRUS HPVHPVGraziella Graziella CalugiCalugi
INFEZIONE DA PAPILLOMAVIRUS UMANO (HPV)
L’infezione da HPV è una delle più frequenti infezioni sessualmente trasmesse.
Il virus è causa per lo sviluppo del cancro della cervice uterina.
Il cancro del collo dell’utero è ancora oggi la seconda neoplasia per incidenza e mortalità femminile al mondo.
Lo studio dell’infezione e ruolo patogenetico di HPV è stato importante ai fi i d ll il di fini dello sviluppo di metodi diagnostici e di vaccini necessari per la prevenzione per la prevenzione della neoplasia.
FILOGENESI HPV
Famiglia: Famiglia: Papillomaviridae;
Supergruppi o “generi”: indicati con una lettera indicati con una lettera greca
Gruppi o “specie”: raggruppano tipi distinti raggruppano tipi distinti a livello genomico, ma simili nelle proprietà biologichebiologiche.
Alpha-papillomavirus: tropismo anogenitale, si di ti g i b l distinguono in base al loro potere oncogeno in High Risk (HR) e Low Risk (LR)
De Villier et al. Virology 2004
Risk (LR)
PAPILLOMAVIRUS UMANO (HPV)PAPILLOMAVIRUS UMANO (HPV)
Virus nudi a simmetria icosaedrica di piccole dimensioni (55nm);
2 proteine strutturali:
L1 proteina capsidica maggiore, peso molecolare di 55 kDa; rappresenta l’80% delle proteine capsidichekDa; rappresenta l 80% delle proteine capsidiche
L2 proteina capsidica minore, peso molecolare di 70 kDa; rappresenta il restante 20% delle proteine capsidichecapsidiche
Genoma:
DNA circolare doppio filamento di circa 8000 bp;
8 sequenze geniche: Early (E1, E2, E4, E5, E6, E7) e Late (L1, L2)( , )
LCR (regione non codificante)
Storia Naturale dell’ Infezione da HPV
Ciclo di replicazione e della progressione dell’HPV all’interno dell’epitelio
EZIOPATOGENESI VIRALE
7Woodman et al., Nature Review 7;11‐22, 2007
REPLICAZIONE VIRALE
Inibizione trascrizione di E6/E7 Integrazione
URR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2
Trasformazione eimmortalizzazione
Replicazione DNAFattori cellulari
Infezione
Strato corneo
Caduta delle cellule epiteliali che contengono il virus
DNA viralenel nucleo della cellula infetta come
episoma
Strato corneo
Assemblaggio virale
Cheratinocita basale
Replicazione accelerata di DNA virale in cellule più differenziate
normale
Strato basale
Episoma
Replicazione Cellulare Apoptosi e Riparazione del danno cellulare
E2F
E2FDanno
E2F
E2FE2F
E2Fgenico
E2F
PRB
E7 E6
PRB P53
9
ONCOGENESI VIRALE
persistent HPV Cell cycle progressionpersistent HPV infection
Cell cycle progression
Promoter p16 IN4aPromoter p16 IN4a
HSIL P16 +
TERMINI CITOLOGICI ED ISTOLOGICI
ASCUS, atypical squamous cells of undetermined significance;ASC H t i l ll f d t i d i ifi t l d H SILASC-H: atypical squamous cells of undetermined significance, cannot esclude H-SILLSIL or HSIL, low- or high-grade squamous intraepithelial lesion.
Schledermann D et al. D. Cyt.2008; 36: 453–459 .
Approccio analitico multi-integrato nella diagnostica della infezione da HPV
Scopo del lavoro Messa a punto di un protocollo analiticomulti-integrato per la caratterizzazione delle infezioni HPV a rischio di progressione
Protocollo analitico multi-integrato
Screening citologico “LBC”
Test immuno-citochimico per P16INK4a
Test molecolare HPV DNA con genotipizzazione
1 campione
Test molecolare HPV DNA con genotipizzazione
Test molecolare HPV RNA
Approccio analitico multi-integrato nella diagnostica della infezione da HPVdella infezione da HPV
• Popolazione studiata= 161 casi
43%
9%
29%
18%
Il sistema ThinPrepIl sistema ThinPrep
Il campione viene processato tramite lo strumento ThinPrep 3000p p pIl sistema separa le cellule da sangue, muco e detriti non diagnosticiRandomizza e risospende le cellule creando un campione rappresentativo
Immuno-citochimica p16INK4aImmuno-citochimica p16INK4a
Dal ThinPrep viene preparato un secondo vetrino.
Il dosaggio della proteina p16 è stato effettuato Il dosaggio della proteina p16 è stato effettuato mediante l’uso del KIT CINtec attraverso l’uso di
anticorpo murino anti-umano, rivelazione cromogena dell’ immuno-complesso e successiva colorazione con dell immuno complesso e successiva colorazione con
ematossilina-eosina
Carcinoma squamoso P16 +
HPV DNAHPV DNA
Estrazione del DNA (1ml)Estrazione del DNA (1ml)
Estrazione su colonne di silice
Amplifica ione End Point o Realtime regione L1Amplificazione End Point o Realtime regione L1
“Primer set” MY09-11, GP5-6+, Beta Globina
HPV DNA
Amplificazione dell’ appropriato target molecolare
T l l DNA i “L ”Target molecolare DNA: geni “Late”in particolare il gene L1
Detection dell’ appropriato target molecolare
Corsa elettroforetica su gel di Agarosio al 2%Corsa elettroforetica su gel di Agarosio al 2%Detection della presenza o assenza del target
+ Polo elettrico -+ Polo elettrico -
Real Time Fluorescent PCR
Corsa elettroforetica capillare della PCR di sequenzaCorsa elettroforetica capillare della PCR di sequenza
Il prodotto di PCR di sequenza migra per elettroforesi capillare su sequenziatore automatico.
Confronto delle Sequenze ottenute con Sequenze Consensus Genotipo Specifiche in NCBI D t b NCBI Database
HPV RNA
• Estrazione RNA (1ml)
Biglie di silice magnetica estrattore semi-automatico mini-Mag, Biomerieux
Amplificazione NucliSENS EasyQ HPV 1.1
Real-time con metodica NASBA, e sonde “scorpions” per trascritti E6-E7 dei virotipi HR 16, 18, 31, 33, 45.
E’ presente anche un controllo interno “Gene U1A”
HPV RNAHPV U1A‐16 HPV 18-31 HPV 45‐33
C‐C‐ C‐
C+ C+ C+
Risultati HPV-DNARisultati HPV-DNA
Risultati p16Risultati p16
Risultati: HPV DNA RNA P16Risultati: HPV DNA-RNA-P16
Necessità del clinicoNecessità del clinico
Di i ‘ i b li i ’ i l i i•Distinguere tra ‘minor abnormalities’ e stati patologici
ASC‐US
LSIL
CIN 2‐3Rischio progressione
25
Uso del test HPV nel follow‐up della paziente trattata per neoplasia
i l
Uso del test HPV nella gestione del
cervicale
Uso del test HPV nella gestione del Paziente con Pap test anormale
Uso del test HPV come test di screening del cervico‐carcinoma
Colposcopia
P16 HPV DNAPositivoPositivoH-SIL
ASC-HNegativo Negativo
ASC H
Ripetizione Prelievo
HPV RNA
Negativo Positivo
ASCUSL-SIL
HPV DNAPositivo
L SIL
GenotipoGenotipo
Negativo
Ripetere a 1 annoRipetere a 1 anno ColposcopiaColposcopia
HPV 16, 18, 31, 33, 45
Ripetere a sei mesiRipetere a sei mesi
PositivoNegativo
HPV RNAHPV RNA
Uso del test HPV nella gestione del Paziente con Pap test anormale
PositivoCitologia negativa HPV DNA HPV RNACitologia negativa HPV DNA HPV RNA
Positivo
P i iPositivo
Ripetere a 6 mesiRipetere a 6 mesiRipetere a 1 annoRipetere a 1 anno
Uso del test HPV come test di screening del cervico‐carcinoma
RingraziamentiRingraziamentiggI Calugi’sCalugi’s
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