Post on 22-Feb-2019
PRINCIPIS DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULARObjectiu: unificar conceptes.
PROGRAMA:
1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.
2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).
3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.
4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressiófuncional...).
5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.
6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.
7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.
BIBLIOGRAFIA
Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.Griffiths, Anthony J.F.; Miller, Jeffrey H.; Suzuki, David T.; Lewontin, Richard C.; Gelbart, WilliamM. New York: WH Freeman and Co; c1999.
Molecular Cell Biology. 4th ed.Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. New York: WH Freeman and Co; c1999.
Genomes. 2nd ed.Brown, T. A. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers, Ltd 2002.
Human Molecular Genetics 2. 2nd ed.Strachan, Tom and Read, Andrew P. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 1999.
Ingeniería Genética y transferencia Génica.Marta Izquierdo Rojo; Editorial PirámideMadrid, 2001
PROGRAMA:
1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.
2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).
3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.
4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).
5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.
6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.
7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.
PROGRAMA:
1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.
2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).
3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.
4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).
5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.
6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.
7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.
PROGRAMA:
1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.
2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).
3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmidsi YACS.
4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressiófuncional...).
5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.
6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.
7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.
CRE-RECOMBINASE
ataacttcgtata gcatacat tatacgaagttat
loxP
Cre recombinase
loxP loxP
loxP
A
B
Excision of a loxP flanked region
0.2 - 2.0 MbYAC (yeast artificial chromosome)
up to 300 kbBAC (bacterial artificial chromosome)
130 - 150 kbPAC (P1 artificial chromosome)
30 - 44 kbCosmid
9 - 23 kbBacteriophage λ replacement
0 - 10 kbBacteriophage λ insertion
0 - 10 kbStandard high copy number plasmid
Size of insertCloning vector
PROGRAMA:
1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.
2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).
3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.
4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiquesi de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).
5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.
6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.
7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.
Tejido
mRNA
H2O mRNA
OvocitosXenopus
Ensayo
Selecciónpor tamaño
ABCD H2O A B C D
SintesiscDNA
1
2
3
45
6
H2O 1 2 3 4 5 6
Aislamiento de clones únicos
PROGRAMA:
1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.
2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).
3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.
4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).
5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciacióautomàtica.
6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.
7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.
PROGRAMA:
1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.
2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).
3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.
4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).
5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.
6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.
7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.
gene of interest
selection marker
targeting construct
X X
homology homology
double homologousrecombination
selection marker
inactivated gene
HOMOLOGOUS RECOMBINATION
egg
sperm
fertilized egg
ZYGOTE
32-64-cellstage
BLASTOCYST
inner cell mass (ICM)
Embryonic Stem cells:culture
genetic manipulation
reintroduce in host-embryo
CRE-LOXP:
TISSUE-SPECIFIC GENE INACTIVATION
(only one floxed allele indicated, should be homozygous or other allele otherwise inactivated)
PROGRAMA:
1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.
2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulaciód’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).
3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.
4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...).
5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.
6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.
7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lulesde mamífer. Teràpia gènica.
cDNAAffinity tagT7 promoter
Insert in an expression plasmid
TAAATG
NH4
Purify fusion protein via affinity tag
• Common affinty tags are be 6X-His & GST –both protein will bind reversibly with high affinty and specificty to a particular chromatography resin
Needs to be in frame
Vectors amb promotors induïbles
Tet-inducible, two component system.
+ Tet Ras
-CMV Promoter Tet r VP16 activation domain