1

PROTEASAS

Prof. Andrés R. Alcántara.Grupo de Biotransformaciones

Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. Fac. Farmacia

2Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Enzimas que catalizan procesos reversibles de hidrólisis de diferentes

sustratosNomenclatura según el Enzyme Commission (E.C.)

E.C.3.X.Y.Z

Tipo de enzimas: Hidrolasas

Tipo de sustratosobre el que actúan

3Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

3.1 Sobre ésteres3.2 Glicosidasas (rompen enlaces glicosídicos)3.3 Sobre éteres3.4 Peptidasas (rompen enlaces peptídicos)3.5 Sobre otros enlaces C-N no peptídicos3.6 Sobre anhidridos de ácido3.7 Sobre enlaces C-C3.8 Sobre enlaces C-X3.9 Sobre enlaces P-N3.10 Sobre enlaces S-N3.11 Sobre enlaces C-P3.12 Sobre enlaces S-S3.13 Sobre enlaces C-S

4Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

E.C.3.4.-.- Acting on peptide bonds (peptide hydrolases).There are 1582 PDB entries in enzyme class E.C.3.4.-.-

E.C.3.4.11.- Aminopeptidases. [ 46 PDB entries ] E.C.3.4.13.- Dipeptidases. [ 8 PDB entries ] E.C.3.4.14.- Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases. [ 4 PDB entries ] E.C.3.4.15.- Peptidyl-dipeptidases. [ 3 PDB entries ] E.C.3.4.16.- Serine-type carboxypeptidases. [ 27 PDB entries ] E.C.3.4.17.- Metallocarboxypeptidases. [ 35 PDB entries ] E.C.3.4.18.- Cysteine-type carboxypeptidases. [ 1 PDB entry ] E.C.3.4.19.- Omega peptidases. [ 6 PDB entries ] E.C.3.4.21.- Serine endopeptidases. [ 780 PDB entries ] E.C.3.4.22.- Cysteine endopeptidases. [ 122 PDB entries ] E.C.3.4.23.- Aspartic endopeptidases. [ 338 PDB entries ] E.C.3.4.24.- Metalloendopeptidases. [ 196 PDB entries ] E.C.3.4.25.- Threonine endopeptidases. [ 2 PDB entries ] E.C.3.4.99.- Endopeptidases of unknown catalytic mechanism. [ 14 PDB entries ]

5Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

LAS MÁS IMPORTANTES EN BIOCATÁLISIS

1. SERIN PROTEASAS2. ASPARTIL PROTESASA3. METALOPROTEASAS4. CISTEIN PROTEASAS

DENTRO DE ELLAS, LAS SERIN PROTEASAS SON LAS MÁS USADAS:SE SUBDIVIDEN EN:

GRUPO A:TripsinaQuimotripsinaElastasaTrombina

GRUPO B:Subtilisina

Los miembros de cada grupo tienen un ancestro común,Los grupos A y B se han hecho similares a través de un proceso de evolución

convergente

6Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Identidad de secuencia redspecto a la tripsina pancreática de mamíferos.

Fish trypsin 69%

Bacterial trypsin 43%

Mammalian chymotrypsin 50%

Mammalian elastase 48%

Fungal elastase 26%

Mammalian plasma thrombin 38%

Bacterial subtilisin 0%

7Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

LAS PROTEASAS DIFIEREN EN SU ESPECIFICIDAD

HN

NH

HN

NH

HN

R3

O

O

R2

R1

O R'1

O R'2

O

HIDROLISIS

SUBSITIO S3

S2

S1

S'1

S'2

8Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

S1-S’1

9Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Prsentan un centro de especificaidaddistinto del centro catalítico.Reconocen las cadenas laterales antes de la ruptura.Quimotripsina: aromáticos o voluminosos

Phe, Tyr, Trp, Leu, MetTripsina: grandes, y con carga positiva.

Lys, ArgElastasa: pequeños, hidrofóbicos

Ala

10Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Asp

His

SerON NH H

O

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

OO

O

O H

H

R2HN O-

Asp

His

SerO

C OR1

N NH

O

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

O H

H

HO O-

C O

R1

R2HN INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1

INTERMEDIOTETRAÉDRICO #2 ENZIMA ACILADA

C O

R1

R2HNC O

R1

HO

OH

H

H2O

R2NH2

11Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Mecanismo de acción de las hidrolasas dependientes de serina PASO 1

12Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

PASO 2

13Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

PASO 3

14Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

PASO 4

15Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

PASO 5

16Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

PASO 6

17Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

PASO 7

18Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Estructuras cristalográficas

Varias enzimas nativas:Tripsina, quimotripsina, elastasa…Proteínas pequeñas (15-34 kD), alta resolución (1-2Å)

Varios complejos: Enzima-Producto (análogos), eg:

L-formamil-L-Trp embebido en la quimotripsinaEnzima-InhibidoresEnzima-Acilada

Condicionessustratos no naturales que deacilen lentamente:

Indolilacriloil-quimotripsina @ pH4Carbobenzoxi-Ala-elastasa @ -55°C

19Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Catalisis: Enlaces de H del bolsillo oxianionico

2 enlaces de H con NH193, NH195.El enlace NH195 es más largi en los complejos enzima-sustrato o enzimaproducto.(3.6Å)

Carbonilo trigonalSe acorta cuando el carbonilopiramidaliza

carbon tetrahedralC==O C—O¯

Favoreciendo el estado de transición.

20Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Evidencias que implican los enlaces de H en el oxianión

Thioester substrates less reactiveLonger / weaker H-bondsPerhaps other effects?

Zymogen (inactive) precursorsGly193 points away

Main chain H-bonds being usedDesign for rigidity?

21Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Otros enlaces de H del esqueleto peolipeptídico.

Los tres resíduos antes del enlace que se corta (S1, S2, S3) están unidos por enlaces de H a la enzimaSe forma un a modo de “complejo enzima sustrato tipolámina beta)

CO214 con NHR1NH216 con COR3.CO216 con NHR3.

Se mantiene una estructura rígida

cleaved bond

R1(in specificitypocket)

Non-specificH-bonding tobackbone

Residues importantfor specificity

215

216227

226

189

oxyanion hole

substrate peptide

Ser195His57Asp102Catalytic triad

R2

R3

HN

NH

HN

NH

HN

R3

O

O

R2

R1

O R'1

O R'2

O

HIDROLISIS

S3

S2

S1

S'1

S'2

22Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Triada catalítica

El Nε del resíduo His57 actúacomo una base

La protonación de la histidinaes vital

No – proton stabilized on Nδ by Asp102.

La atraccion del Hδ por el Asp102 aumenta su pKa.

Si se transfiere por completo, existe un relé de carga.

Cuando se devuelve el protónHε,, el Asp102 devuelve el Hδ:

Asp102/His57: buffer protónico

23

SINTESIS de AMIDAS

R1

O

O R2

R3 NH2

R3 NH NH2

HIDROLASEORGANIC SOLVENT

R1

O

HN R3

R1

O

HN NH R3

R2 OH+

R2 OH+

R

NH2

R

NH2

R

NH-Acyl

+LIPASE

Acyl Donor

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24

SÍNTESIS PEPTÍDICALa síntesis peptídica catalizada por enzimas se puede llevar a cabo de tres maneras: AMIDACÍON (reverso de la hidrólisis), TRANSPEPTIDACIÓN (menos frecuente) y AMINOLISIS DE ESTERES.

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25

SÍNTESIS PEPTÍDICACONTROL TERMODINÁMICO: en condiciones fisiológicas (entornos acuosos) el equilibrio está muy desplazado hacia la proteólisis. Por tanto, hemos de “tirar”del equilibrio en sentido de la síntesis:

Usar algún reactivo en exceso

Eliminar los productos:PÉPTIDO

formacion de un derivado insoluble por complejación.Extracción del producto con un cosolventeinmiscible.

AGUAEvaporación en contínuoDisminución de awusando un cosolvente miscible.

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26

CONTROL CINÉTICO: la aminólisis de ésteres supone un proceso irreveresible donde dos nucleófilos (agua y amina) compiten por el intermedio acil-enzima.

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SÍNTESIS PEPTÍDICA

27Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

28Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

29Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

30Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

SÍNTESIS PEPTÍDICA

31Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

SÍNTESIS PEPTÍDICA

32

EJEMPLO 1: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE UNA ENCEFALINA

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

33Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

EJEMPLO 2: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE Met- o Leu-ENCEFALINA

34Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

EJEMPLO 3: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE Met-ENCEFALINA

35Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

EJEMPLO 4: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE UN UNDECAPÉPTIDO

36Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

NH2

O OMe+ OH

O

O

HONH

Xtermolisina NH2

O OMe+

NH

O OMe

ONH O

OH

X

(D,L)-fenilalaninatode metilo

Ácido aspártico(N-protegido)

(D)-fenilalaninatode metilo

α-aspartamo(N-protegido)

EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS

SÍNTESIS PEPTÍDICA:ESTEREO y REGIOSELECTIVA

Azul: enantiómero convertido; Rojo: enantiómero no convertido

37Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

NH2

O OMe+ OH

O

O

HONH

Xtermolisina NH2

O OMe+

NH

O OMe

ONH O

OH

X

(D,L)-fenilalaninatode metilo

Ácido aspártico(N-protegido)

(D)-fenilalaninatode metilo

α-aspartamo(N-protegido)

38Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

NH2

O OMe+ OH

O

O

HONH

Xtermolisina NH2

O OMe+

NH

O OMe

ONH O

OH

X

(D,L)-fenilalaninatode metilo

Ácido aspártico(N-protegido)

(D)-fenilalaninatode metilo

α-aspartamo(N-protegido)

Principal problema en la síntesis química: formación del β−aspartamo (AMARGO), que habría que separar.

VENTAJAS DEL PROCESO ENZIMÁTICO:•No se produce nada del isómero beta (100 % REGIOSELECCIÓN)•La enzima es completamente enantioselectiva (se puede partir del ester racémico)•La reacción tiene lugar en medio acuoso, en condiciones suaves.•La termolisina se obtiene de Bacillus proteoliticus, un microorganismo termófilo aislado en una fuente termal (Rokko Hot Spring) en Japón, por lo que puede trabajar hasta 60ºC.

Al ser un equilibrio hay que eliminar los productos para desplazarlo. Se añade exceso de fenilaninato de metilo (inocuo para la enzima), por lo que se forma el carboxilato del alfa-aspartamo, que precipita en el medio de reacción, y se aisla facilmente.

39Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

The global market volume for this peptide sweetener, with a sweeteningpower about 200 times that of sucrose, has been estimated at 14,000–15,000 tons in 2003 (Ajinomoto 2003).

40Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

PROTEASAS PARA LA OBTENCIÓN DE INSULINA

Aislada por primera vez en 1921 a partir de páncreas de perro.Secuencia identificada por Sanger en 1955.Regula los niveles de azúcar en sangre, usada para el

tratamiento de la diabetes mellitus (aprox. 5% población occidental).

Es una proteína, no puede suministrarse oralmente (proteolisis)Hoy día existen 4 rutas de obtención de insulina:1. Extracción de páncreas humano2. Síntesis a partir de los aminoácidos individuales3. Conversión de insulina porcina en humana4. Fermentación a partir de microorganismos modificados

genéticamente

41Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

3. Conversión de insulina porcina en humana

Proteasa de Achromobacter lyticus

Cadena A

Cadena B

42Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente

4.1. Producción de pro-insulina, transformada en insulina por transpeptidación (Novo Nordisk)

Ester de la insulina humana

Obtenida a través de fermentaciónde células de S. cerevisiae modificadas

genéticamentePro-insulina

43Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente

4.2. Producción de mono/di-arg-insulina usando células de E. coli modificadas genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (ELI LILY)

44Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Conversión: sobre 70 %.Reactor tipo batch

Pro-Arg -insulina

Mono/di-Arg -insulina

45Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Mono/di-Arg -insulina

Insulina humana

46Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente

4.3. Producción de pre-pro-insulina usando células de E. coli modificadas genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (Hoechst MarionRoussel)

Pre-pro-Arginsulina

Mono/di-Arg -insulina

47Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Mono/di-Arg -insulina

Insulina humana

48Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

49Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS

OEtO

EtOO

subtilisina(R)

ONaO

EtOO

+(S)

OEtO

EtOO

Azul: enantiómero convertido; Rojo: enantiómero no convertido

ENANTIÓMERO BUSCADO

1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES

50Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

OEtO

EtOO

subtilisin(R)

ONaO

EtOO

+(S)

OEtO

EtOO

20% emulsion en 30 mM NaHCO3 acuoso en un sistema

bifásico con tolueno Separación &

Extracción

(S)OEt

O

EtOO

HCl

(R)OH

O

EtOO

Secado del tolueno&

NaOEt / Δ

OEtO

EtOO Rend. global: 87%

Sintón para la obtención de inhibidores de colagenasa

(osteoartritis)

51Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS

Azul: enantiómero convertidoRojo: enantiómero no convertido

ENANTIÓMERO BUSCADO

1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES

52Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

53Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Peptidomiméticos inhibidoresde renina

54Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS

Azul: enantiómero convertidoRojo: enantiómero no convertido

ENANTIÓMERO BUSCADO

1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES

55Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

56Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

57Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS

Azul: enantiómero convertidoRojo: enantiómero no convertido

ENANTIÓMERO BUSCADO

1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES

58Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASASCompañía: PGG Industries, USA

Utilidad: sintón para la obtención de LY333531, un inhibidor de la protein Kinasa C