Juan Carlos Rodríguez DíazS. Microbiología

Hospital General Universitario de Elcherodriguez_juadia@gva.es

PRUEBAS PARA EL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS EMPLEADAS

EN LA PRACTICA CLINICA II

Métodos diagnósticos

SerologíaSe basa en al detección de anticuerpos del paciente mediante ensayos in vitro

Métodos:Aglutinación

IFI: Inmunofluorescencia indirecta

EIA: Enzimoinmunoensayo

Western Blot

Tipos de inmunoglobulinasIg G: Se mantiene positiva toda la vida del paciente (puede cuantificarse)

IgM. Sólo se mantiene positiva en la fase aguda de la enfermedad (semanas o meses)

Métodos diagnósticos

Métodos diagnósticos

Detección por reacción en cadena de la polimerasaSirve para detectar la presencia de los virus

1.- Separación de las cadenas

2.- Unión de los cebadores y la diana

3.- La Taq polimerasa genera de una nueva cadena

HerpesvirusVirus herpes 1, 2, 6 y 8– Detección del virus por PCRVirus Epstein Barr– Mononucleosis infecciosa:

• Paul Bunnell: Antígenos no específicos• Detección de IgM frente al VCA (Virus capside antigen)

– Reactivaciones en inmunodeprimidos• Detección del virus por PCR

Varicella-zoster– Varicella: IgM– Zoster: PCR de las lesiones

HerpesvirusCitomegalovirus

– Infección en inmunodeprimidos: • Cuantificación del los virus en sangre• Detección de antígenos en leucocitos del paciente: Técnica en desuso; sustituida por PCR en sangre

– Enfermedad en inmunodeprimidos: • Detección de virus por PCR en diferentes muestras

– Mononucleosis infecciosa en inmunocompetentes: Ig M

Papilomavirus

Genotipos

– Hay más de 100 diferentes. Se asocian a:• Genotipos de bajo riesgo: Patologías benignas: verrugas genitales o no genitales

• Genotipos de alto riesgo: Contribuyen a la generación de procesos cancerígenos: cuello de útero, faringe, etc.

Clasificación• Alto riesgo: 16, 18, 31, etc• Bajo riesgo: 6, 8, etc

Diagnóstico– Detección y genotipado del virus por PCR

Hepatitis AMarcadores serológicos

�Ig M: Aparece en la infección aguda y se mantiene 3-6 meses, por lo que es el que se emplea en el diagnóstico. Se detecta mediante ELISA

�Ig G: Indica contacto previo con el virus. Sólo útil en estudios de prevacunación y seroprevalencia. Se detecta mediante ELISA

Marcadores serológicos. Hepatitis A

Hepatitis B. Marcadores serológicos

HBsAg HBeAg AntiHBc (IgM)

AntiHBc AntiHBs AntiHBe

H. Aguda

+ + + + - -

H. Curada

- - - + + +

H. Crónica

+ + -/+ + - -

Portador + - - + - +

Pre-core + - - + - +

Hepatitis B. Marcadores serológicos

Hepatitis B. Marcadores serológicos

Hepatitis C. Diagnóstico

� Técnica de cribado: Detección de anticuerpos totales mediante ELISA

� Los anticuerpos aparecen 4-6 semanas postinfección, pero en algunos casos pueden retrasarse meses.

� Todos los resultados positivos deben ser confirmados

� Pruebas confirmatorias: Inmunoblot o PCR

Hepatitis C. Genotipado

� El genotipo del virus influye en la respuesta al tratamiento (1b es el que peor responde)

� Se realiza mediante una amplificación por PCR del fragmento variable y por hibridación posterior con sondas fijadas en un papel de celulosa (LIPA)

Hepatitis C. Genotipado

Hepatitis D. Marcadores serológicos

�Solo se debe buscar este agente si existe presencia de HBsAg en suero del paciente (hepatitis B aguda, portador o hepatitis crónica)

�Se detecta mediante la busqueda de anticuerpos totales mediante ELISA

�Mediante PCR se detecta la presencia de virus en suero

Pruebas diagnósticas de cribado

� Detecta conjuntamente Ac y Ag frente al HIV-1, HIV-2 y subgrupo 0

� Generalmente mediante detección de anticuerpos en suero mediante ELISA

� Pruebas de EIA (enzimo-inmunoensayo) de membrana: Pruebas rápidas

Pruebas diagnósticas de confirmación

� Todos los sueros positivos deben ser confirmadas por Western Blot

� Las proteínas del virus se separan en una tira de nitrocelulosa (incluye proteinas del HIV_1 y HIV-2).

Se considera un suero positivo si hay anticuerpos frente a dos de las tres proteínas más importantes del virus (gp160, gp120, gp41)

� Si no cumplen los criterios, se llama WB indeterminado

Western Blot

Otros virus RNA�Rubéola

�Detección de IgM�PCR del virus en líquido amniotico en infecciones congénitas

�Sarampion:�Detección de IgM�PCR del virus en orina o exudado nasofaringeo

�Parotiditis�Detección de IgM�PCR del virus en saliva

Virus respiratorio sincitial (VRS) y metaneumovirus

�Clínica� Infección de vía respiratorias inferiores y superiores �Bronquiolitis en neonatos

�Diagnóstico�Detección de antígenos en muestras respiratorias�PCR en muestras respiratorias

Virus de la gripe�Caracteristicas principales

�Producida por los virus influenza A y B � Infección viral estacional� Las pandemias son producidas por influenza A

� Subtipos antigénicos�Pueden tener diferentes tipos de hemaglutinina (H1, H2, H3, …) y de neuraminidasa (N1, N2, N3, …)

�Se nombran indicando las dos proteinas: H1N1, H3N2.

�Diagnóstico�Detección de antígeno específico de A ó B (poco sensible)

�PCR múltiple en muestras respiratorias para detectar:� Gen común a todas las cepas de gripe� Gen común a todas las cepas de gripe A� Gen específico de cada subtipo

Enterovirus�Virus incluidos

�Coxsackie�Echovirus�Enterovirus

�Clínica�Manifestaciones neurológicas

� Meningitis (la mayor parte de las meningitis de la infancia)� Encefalitis y mielitis (poliomielitis like)� Manifestaciones cutáneas� Miopericarditis� Conjuntivitis aguda hemorrágica� Manifestaciones gastrointestinales

• DiagnósticoPCR y cultivo viral

Virus productores de gastroenteritis

�Virus�Rotavirus�Adenovirus�Calicivirus: norovirus y sapovirus�Astrovirus�Torovirus�Virus Aichi (kobuvirus)

�Diagnóstico�Detección de antígenos de rotavirus, adenovirus y astrovirus

�PCR y microscopia electrónica

JUAN CARLOS RODRÍGUEZS. MICROBIOLOGÍAHOSPITAL GENERAL

UNIVERSITARIO DE ELCHE

Diagnóstico microbiológico de las infecciones causadas por

micobacterias

Mycobacterium

Características de los microorganismos del género Mycobacterium

�Bacilos aerobios curvados�No se tiñen por la coloración de Gram�Tienen ácidos micólicos en la pared, por lo que son ácido-alcohol resistentes

�Crecimiento lento (tiempo de generación entre 2 y 20 horas) y medios especiales

�El género incluye más de 60 especies, algunas patógenas y otras saprófitas

�Necesitan tratamientos especiales y no responden a los antibióticos habituales

Características de los microorganismos del género Mycobacterium

�No crecen en los medios de cultivo habitualmente utilizados en los laboratorios de Microbiología. ¡¡Hay que solicitar expresamente su aislamiento!!

�Mediante la tinción de Gram no se visualizan, ¡hay que hacer tinciones especiales!

� Los cultivos tardan semanas

Mycobacterium tuberculosis

�Hay que diferenciar entre:�Infección tuberculosa o tuberculosis latente: Nuestro sistema inmune ha estado en contacto con el microorganismo pero el paciente no ha sufrido ninguna alteración clínica

�Enfermedad tuberculosa: El paciente presenta signos y síntomas de tuberculosis

Infección tuberculosa

El Mantoux presenta reacciones cruzadas con:

�Vacunación�Otras micobacterias no tuberculosas

Alternativas al Mantoux

� IGRAs (Interferon gamma release assay): Quantiferon y T-spot.

�Se basa en que dos proteínas de M. tuberculosis (ESAT-6 y CFP-10) estimulan al sistema inmune e inducen una fuerte producción de IFN-gamma por las células CD4

�Estos antígenos están ausentes en la cepa vacunal y en la mauoria de las micobacterias no tuberculosas

�Excepto M. kansasii, M. marinum y M. szulgai

Muestras a procesar en función de la localización de la infección

� Pulmonar: 3 muestras de esputo de calidad o muestras invasivas

� Linfática: Punción del ganglio � Pleural: Líquido o biopsia pleural� Genitourinaria: 3 muestras de orina de tres días (más de 25 ml)

� Ósea: Material quirúrgico� TB Miliar: Muestras respiratorias, orina, sangre, LCR y otras muestras

� Meningea: LCR� Infección diseminada por M. avium: Muestras respiratorias, sangre, heces y médula ósea

� Muestras de piel y tejidos blandos:Biopsia o punción, con incubación de los cultivos a 30ºC (M. marinum)

� Sospecha de M. genavense: Incluir medios líquidos

Muestras pulmonares invasivas

� También pueden utilizarse muestras invasivas:�Aspirado bronquial (BAS)�Lavado broncoalveolar (BAL)�Cepillado bronquial�Biopsia transbronquial�Aspirado transtraqueal�Biopsia pulmonar, obtenida quirúrgicamente

� Los esputos obtenidos en los días siguientes a estos procedimientos son muy rentables

� Los aspirados gástricos deben procesarse o neutralizarse rápidamente con carbonato cálcico para neutralizar el ácido clorhídrido estomacal

Tinción

�Se basa en demostrar la existencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en la muestra

Tinción

� La tinción de Ziehl Neelsen utiliza fuschina y azul de metileno y se observa a 1000 aumentos en microscopio óptico

� La tinción de auramina se observa a 200 aumentos en microscopio de fluorescencia

Tinción

� La sensibilidad en muestras respiratorias es de 50-75% dependiendo de:�Calidad de la muestra�Tipo de lesión del paciente

� La sensibilidad en muestras extrarespiratorias es mucho más baja, dependiendo del tipo de muestra

� Las dos tinciones tienen rentabilidad semejante

�No diferencia las especies del género

Cultivo

� Puede hacerse en medios sólidos o líquidos� Se incuban 2 meses, aunque suelen ser positivos entre 2 y 4 semanas. El rango de crecimiento está entre 2 días y 8 semanas.

� Se incuban a 37ºC salvo algunas excepciones (biopsias cutáneas con sospecha de infección por M. marinum)

� Los medios sólidos se leen cada semana, mientras que los líquidos tienen lectura diaria automatizada

Siempre hay que hacer cultivo porque mejora� Sensibilidad: Detecta casos con tinción negativa� Especificidad: Permite identificar las micobacterias no tuberculosas� Permite estudiar la sensibilidad de la cepa mediante el antibiograma

Colonias de Mycobacterium

Nuevos métodos diagnósticos

� Basados en la reacción en la cadena de la polimerasa (PCR)

Más útiles en:�Muestras con pocas bacterias, como las extrapulmonares�Muestras pulmonares con tinción negativa �Aumentar la rapidez diagnóstica�Complemento de los medios líquidos�Permite detectar simultaneamente algunas resistencias antibióticas

� Un resultado negativo no descarta la infección aunque tienen buena sensibilidad

� No sustituye a los métodos tradicionales