MÉTODOS DE ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA

QRT-PCR(real time PCR, quantitative pcr)

Real Time PCRTécnica de laboratorio usada para reproducir

segmentos ácidos nucleídos

mediante un proceso cíclico,

que genera gran cantidad de copias

que pueden ser usadas en

estudios o análisis posteriores

PCR

Cuantificación extremadamente

difícil, ya que la PCR da origen a la

misma cantidad de producto

independientemente de la cantidad

inicial de moléculas de DNA presente en

las muestras

Limitaciones

- Higuchi et al- Producto es monitoreado durante el curso de la reacción y no en el punto final (end point)- Sondas fluorescentesQRT-PCR

PCR En Tiempo Real

Técnica de amplificación y cuantificación de ADN y ARNm que utiliza tecnologías fluorescentes para evidenciar la amplificación de una secuencia corta

sistemas fluorescentes

agentes intercalantes

sondas de hidrolisis y de hibridación

sondas Taqman

Sondas molecular Beacons

Sondas FRET

Agentes Intercalantes

Fluorocormos que aumentan su fluorescencia cuando se unen a una

doble cadena de DNA

SYBR Green

Ventajas Desventajas

Facilita las condiciones de

optimización y es mas barato que las sondas especificas

Unión inespecífica a cualquier doble cadena de DNA y

también a los dímeros de cebadores

(fluorescencia inespecífica)

Soluciones

Fundamento: Curva De Fusión

(melting curve)

Diferentes moléculas de DNA de doble cadena

se abren a diferente

temperaturas

Factores

Concentración de guanina y citosina

La longitud de fragmento de amplificación

Estructura secundaria y terciaria

Factores químicos que

hacen parte de los componentes

de reacción

Buen diseño de los cebadores y condiciones optimas de

reacción

Desventajas

SONDAS DE HIDRÓLISIS Y DE HIBRIDACIÓN

1. Las sondas Taqman2. Sondas Molecular Beacons3. Sondas FRET

Sondas TaqMan

Oligonucleótidos lineales que son etiquetados con un fluorocromo donador (reporter) en la porción 5’ como FAM (6-carboxifluoresceína) y un aceptor (quenber) en la porción 3’ como TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).

Dependen de la actividad 5’ nucleasa de la Taq ADN polimerasa para su ruptura durante la síntesis de una nueva hebra.

El lugar en el que anilla la sonda

fragmento de amplificación o secuencia blanco

Antes que los cebadores

Señal emitida se genera

Cada amplicon nuevo sintetizado

Sonda Molecular Beacons Oligonucleótidos de cadena simple  zona de apareamiento de bases interna No dependen de su hidrólisis para generar la señal fluorescente

Forman una horquilla (harpin)

La emisión de

fluorescencia se da

durante la etapa de

anillamiento

la sonda se linealisa lo

que permite que los

fluorocromos se separen

el donador emita su señal la cual es

detectada por el

equipo.

La sonda FRET

Se compone de dos sondas que se

unen específicamente a

secuencias del ADN blanco.

Una de la sonda lleva una molécula

donadora en su porción 3’ y la otra

lleva un aceptor en su porción 5’

La fluorescencia

emitida es directamente proporcional al aumento de ADN en cada ciclo

Cuando la sondas se

anillan al ADN blanco, estas

se unen

se excitar a la molécula

donadora en una longitud

de onda determinada

se da la trasferencia de energía

hacia el aceptor que absorbe la

energía emitida por el donador y la emite en otra longitud de

onda

Definiciones sobre análisis de Datos

En PCR en tiempo real se deben manejar una serie de conceptos relacionados con el análisis e interpretación de graficas generadas por el software luego de un proceso de amplificación.La curva de amplificación

Componentes

Fase inicial o background

Fase exponencial

Fase de meseta o plateau

Línea base (baseline)

• Nivel basal de la fluorescencia emitida

• Definido durante los primeros ciclos de la PCR

• Programada en cada software de PCR en tiempo real

Umbral (threshold)

• Es el punto de corte de la fluorescencia por encima de la línea base

• A partir de esta línea de corte se calcula los valores de Ct

Ct o CP (threshold cycle)

• Refleja el punto en el cual un numero suficiente de amplicones se ha acumulado dentro de la reacción y se presenta un crecimiento exponencial

Eficiencia de la PCR en tiempo real

Parámetro que permite establecer la confiabilidad de la estimación del numero de copias y se debe calcular para cada reacción.

Directamente en el software.

Debe estar entre el 90 y el 100%

Doble de moléculas de DNA que en el ciclo anterior

Estrategias de Cuantificación

Establecer un numero relativo

de copias cuando se utiliza un gen

de referencia.

cuantificación relativa (expresión de un gen determinado en un momento estableció

del ciclo celular)

cuantificación absoluta (numero exacto de copias

de un gen)

Cuantificación RelativaMétodo mas sensible para la detección y cuantificación de

niveles de expresión de genes a partir de muestras pequeñas

de tejido

Depende de una RT-PCR en tiempo real (retro transcripción o kinetic RT-PCR)

mide el cambio relativo en los niveles de expresión de

ARNm y se basa en comparar los niveles de

expresión de una muestra problema frente a un gen

constructivo

Cuantificación Absoluta

Son altamente reproducibles y permiten generar datos específicos y sensibles.

Controles y Contaminación

Control Negativo de Extracción

•Muestra negativa a la que se realiza todo el proceso de extracción.•No debe generar curva de amplificación.

Control Positivo de Reacción

•Muestra positiva a la que se realiza todo el proceso de extracción.•Debe generar curva de amplificación.

Control sin DNA (NTC) con solo

mezcla de reacción.

•Es muy importante incluir los NTCs siempre en cada reacción para asegurar que lo que se esta midiendo no corresponde a algún tipo de contaminación.

Instrumentación

El equipo necesario:1. Termociclador2. Lector de fluorescencia3. Filtros 4. Fuente lumínica (lámpara halógena, LED

o un laser)

TERMOCICLADOR• Permite el análisis de los datos

para reportar la cuantificación, análisis de curvas de fusión y la discriminación alélicas

LECTOR DE FLUORESCENCIA• Es una seria de componentes que

colectan la luz a través de varios dispositivos ópticos que permiten el paso y la salida de la luz visible sobre el tubo de reacción gracias a un grupo de filtros que detectan todo el rango de la luz visible.

FUENTE LUMINICA • Genera las longitudes de onda

requeridas para excitar los fluorocromos utilizados en la PCR

Aplicaciones• Identificar pequeñas

mutaciones o polimorfismos en genes

causantes de enfermedades heredadas.

1.

•La utilización de las curvas de fusión para el genotipaje, ya

que cada fragmento generado tendría diferente tamaño y

por ende, diferente Tm.

2.

•En la detención de patógenos de importancia medica, con gran

énfasis en ensayos cuantitativos para virus, bacterias, levaduras

y parásitos protozoos.

3.

• En oncología ya que se requiere de pequeñas

cantidades de tejido y es útil en ensayos de amplificación y

expresión de genes, duplicación y delección

genética

4.

• en la detección de mutaciones puntuales,

diagnostico, seguimiento y respuesta

al tratamiento.

5.

• Monitorización para la seguridad de alimentos, bioterrorismo, en la área de biotecnología, etc.

6.VIDEO

Conclusiones

Permite obtener resultados reproducibles, confiables, rápidos y ofrece gran cantidad de aplicaciones.

Facilita la cuantificación de ADN y ARN sea mas precisa ya que se utilizan curvas estándar y los resultados se basan en la obtención de los valores de Ct

Algunas complicaciones se pueden solucionar si se tiene un experimento diseñado y realizado rigurosamente y con lo controles adecuados.

Articulo de Aplicacion

Detección cuantitativa del virus psorosis de cítricos mediante RT–PCR tiempo real

Quantitative diagnosis of citrus psorosis virus by real time RT–PCR

Implementar un protocolo de RT–PCR tiempo real para la detección del CPsV y determinar concentración viral en hojas de árboles de naranja Mars afectados por psorosis en el Estado de Nuevo León (NL), México.

¡Gracias!