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XXIV Jornadas Técnicas de laAETC | Octubre2012 |
Análisis de Micotoxinasen cerealesPaul Aguiar.
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XXIV Jornadas Técnicas de laAETC | Octubre2012 |
Análisis de Micotoxinas en cereales
Int roducción
Legislación
Técnicas analíticas
Conclusiones
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Micotoxinas
Toxinas producidas por mohos, de modo natural,
presentes en productos agrícolas: cereales.
Son metabolitos secundarios.
La mayoría de las micotoxinas de interés son
producidas por tres géneros de mohos:
ê Aspergillus
ê Penicillium
ê Fusarium
Int ro ducció n
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Int ro ducció n
Micotoxinas
Se conocen miles de metabolitos tóxicos producidos por mohos.
Han sido detectadas más de 200 micotoxinas en cereales.
AFLATOXINAS
Af latoxinas B1 G1 B2 G2.
Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus.
Cereales, frutos secos, higos y especias.
Aflatoxina M 1.
OCRATOXINA
Ocratoxina A.
Penicillium verrucosum, Aspegillus ochraceous.
Maíz, cebada, trigo, avena, café, uvas, cacao y especias.
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Int ro ducció n
FUM ONISINAS
Fumonisinas B1 B2.
Fusarium verticilloides.
Cereales, principalmente maíz.
TRICOTECENOS
DON (Vomitoxina), Toxina T-2 & HT-2.
Fusarium spp.
Trigo, cebada y maíz, en Europa y USA.
ZEARALENONA
Fusarium grammineum.
Trigo, cebada avena y maíz.
ALCALOIDES DEL CORNEZUELO
Claviceps spp.
Centeno, trigo y cebada.
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Factores que influyen en la producción de micotoxinas
Biológicos
•V ariedades
•M ohos toxigénicos
Ambient ales
•T emperatu ra
•Hu medad
•Plagas
Cosecha
•M adu rez
•Secado
•Daño mecáni co
Almacenamient o
•Hu medad
•T emperatu ra
•A ireación
•Plagas
Mohos MicotoxinasTemperatura
Humedad (aw)
Prevención Variedades resistentes Prácticas agronómicas (GAP)
Tecnología post-cosecha Transporte / Almacenamiento
Int ro ducció n
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Exposición a las micotoxinas
Prevenir la presencia de micotoxinas en alimentos:
Evit ar la formación de micotoxinas en materias primas.
Análisis de micotoxinas materias primas.
Prevenir la aparición durante transporte y almacenamiento.
Control de alimentos para consumo humano y piensos.
Int ro ducció n
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Micotoxicosis: enfermedad provocada por la exposición a micotoxinas.
Efectos de las micotoxinas
Efectos tóxicos agudos observables en situaciones excepcionales.
Efectos crónicos por exposición prolongada.
Factores que influyen en la toxicidad:
Tipo de micotoxina y su toxicidad.
S inergia ent re micotoxinas.
Ingest a y exposición.
Individuales.
Int ro ducció n
Edad Media: En Europa: Ergotismo.
Producida por ingest a de Claviceps purpúrea.
Años ‘60: En Reino Unido: Enfermedad “X” de los pavos.
Producida por harina de cacahuetes con Aspergillus Flavus.
Los lis i ados . Piet er Brueghel, el v iej o. 1568.M useo del Louv re ( París)
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Efectos de las micotoxinas en animales
Estudios experimentales han permitido determinar diversos efectos:
Inmunológicos Aflatoxinas, Tricotecenos, Ocratoxina A.
Hemorrágicos Aflatoxinas, Tricotecenos.
Hepatotóxicos Aflatoxinas, Ocratoxina A, Fumonisinas.
Nefrotóxicos Ocratoxina, Tricotecenos, Fumonisinas.
Reproductivos Fumonisinas, ciertos Alcaloides del cornezuelo.
Teratógenos Aflatoxina B1, Ocratoxina A, Toxina T-2, Zearalenona.
Neurotóxicos Deoxinivalenol, Fumonisinas, Alcaloides del cornezuelo.
Cancerígenos Aflatoxinas, Ocratoxina A, Fumonisinas.
Dermatológicos varios Tricotecenos.
Int ro ducció n
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Efectos de las micotoxinas en humanos
Grupo 4: probablement e no cance rígeno
Grupo 3: no clasificado como cance rígeno
Grupo 2B: posiblement e cance rígeno
Grupo 2A: probablement e cance rígeno
Grupo 1: cancerígeno
Clasificación de IARC
Grupo 3Toxinas T-2 & HT-2
Grupo 3Zearalenona
Grupo 2BOcrat oxina A
Grupo 2BFumo nisinas B1 B2
Grupo 3Deoxinivalenol
Grupo 2BAflat oxinaM 1
Grupo 1Aflat oxinas B1 B2 G1 G2
Clasificación de las micotoxinas
Agencia Internac ional para la Investigac ión del Cáncer (IARC)
Int ro ducció n
Existen evidencias de los efectos en humanos pero en muchos casos los
posibles efectos son consecuencia de extrapolar los efectos en animales.
Los efectos dependen de la toxicidad y la exposición.
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Legislació n
Legislación sobre micotoxinas
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Legislació n
Legislación europea sobre micotoxinas
Af latoxinas Todos loscereales y todos losproductos abasedecereles.
Maízy arroz.
Aliment os abasedecereales t ransformadosy aliment os para lactant es.
Semillas oleaginosas, frutos secos,frut as pasas, especias
Leche cruda, leche para la fabricación de productos lácteos.
REGLAMENTO (EU) Nº 165/2010 de la COMISIÓN de 26 de febrero.
Ocratoxina A Cereales no elaborados.
Todos losproductosderivadosdecereales no elaborados, incluidos losproductost ransformados a basedecereales y los cereales dest inados alconsumo humano direct o.
Glut en det rigo no dest inado a la vent a directa al consumidor.
Aliment os elaborados abasedecereales y alimentos infant iles para lactant es.
Uv as pasas,vinos y bebidas a base dev ino, mosto deuv a,zumo deuv a.
Especias, café tost ado y soluble, regaliz.
REGLAMENTO (EU) Nº 594/2012 de la COMISIÓN de 5 de julio.
REGLAMENTO (EU) Nº 1881/2006 de la COMISIÓN de 19 de diciembre.
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Legislació n
Legislación europea sobre micotoxinasDeoxinivalenol (DON) Cereales no elaborados queno seant rigo duro, avena y maíz.
Trigo duro y avena no elaborados.
Maíz no elaborado, excepto el dest inado a moliendaporvía húmeda.
Cereales dest inados al consumo humano directo, harina decereales, salvado y germen comoproducto final comercializado para el consumo humano directo.
Past a seca.
Pan, past eles, gallet as, aperit ivosdecereales y cereales para desayuno.
Aliment os elaborados abasedecereales y alimentos infant iles para lactant es.
Fracciones demolienda del maíz.
Zearalenona Cereales no elaborados dist intosdel maíz.
Maíz no elaborado excepto el dest inado a molienda porvía húmeda.
Cereales dest inados al consumo humano directo, harina decereales, salvado y germen comoproducto final comercializado para el consumo humano directo.
Aceit edemaíz refinado.
Pan, past eles, gallet as, aperit ivosdecereales y cereales para desayuno.
Maízdest inado alconsumo humano direct o, aperit ivosdemaíz y cereales para desayuno a basedemaíz.
Aliment os elaborados abasedecereales y alimentos infant iles para lactant es.
Fracciones demolienda del maíz.
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Legislació n
Legislación europea sobre micotoxinas
REGLAMENTO (EU) Nº 1126/2007 de la COMISIÓN de 28 de sept iembre.
Fumonisinas Maíz no elaborado excepto el dest inado a molienda porvía húmeda.
Maízy aliment os a basedemaíz dest inados al consumo humano directo.
Cereales para el desayuno abasedemaíz y aperit ivosdemaíz.
Aliment os elaborados abasedecereales y alimentos infant iles para lactant es.
Fracciones demolienda del maíz.
Legislación de micotoxinas en alimentación animalAf latoxina B1
Materias primas para piensos.
Piensos complement arios y completos.
Piensos compuestos para v acas lecheras y terneros,ovejas lecheras y corderos, cabras lecheras ycabritos, lechones y aves de corral jóv enes.
Piensos compuestos para bov inos,ovinos, caprinos, porcinos y av es de corral.
Cornezuelo del centeno Materias primas para piensos y piensos compuestos que contienen cereales no molidos.
REGLAMENTO (EU) Nº 574/2011 de la COMISIÓN de 16 de junio.
Co nt enido m áxim o en mg/kg en pienso s calculadosobre la base de un co nt enido de hum edad del 12%.
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Legislació n
Legislación europea sobre toma de muest rasREGLAMENTO (EU) Nº 401/2006 de COMISIÓN de 23 de febrero
Control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios.
El muestreo tiene un papel fundamental en la precisión de la determinacióndel contenido de micotoxinas.
Definiciones:
• Lote
• Sublote
• Muestra elemental
• Muestra global
• Muestra de laboratorio
Método de muestreo para los cereales y productos a base de cereales.
Método de muestreo para alimentos infantiles y alimentos elaborados a basede cereales para lactantes y niños de corta edad.
“Guidance document for the sampling of cereals for mycotoxins” (EC, 2010).
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Legislació n
Toma de muestras
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30.000 t >>> 300 g
Legislació n
Toma de muestras
Muestra: 300 g
30.000 t
300 g
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Legislació n
Toma de muestras: dist ribución heterogénea
500 ppm
Dist ribución real en el lote
Co rt esía de K. Esbensen (AAUE)
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Legislació n
Toma de muestras: dist ribución heterogénea
Dist ribución real en el lote
1000 ppm
Co rt esía de K. Esbensen (AAUE)
XXIV Jornadas Técnicas de laAETC | Octubre2012 |
Legislació n
Toma de muestras: dist ribución heterogénea
5000 ppm
Dist ribución real en el lote
Co rt esía de K. Esbensen (AAUE)
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Legislació n
Toma de muestras: dist ribución heterogénea
10000 ppm (1%)
Dist ribución real en el lote
Af latoxina B1 en cereales y productos a base de cereales: 2 ppb (0,002 ppm).Co rt esía de K. Esbensen (AAUE)
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Toma de muestras
Procedimiento para el control de micotoxinas en un lote
LotePreparac iónde muest ra
Toma demuest ra
Análisis
Error TM Error PM Error A
La variabilidad asociada al control de productos en grano, para determinar micoto-xinas, no permite determinar la verdadera concentración de un lote con un 100% decerteza.
La reducción de la variación asociada a cada etapa permite realizar una estimaciónmás precisa de la concentración verdadera de micotoxinas en un lote.
Error Tot al
El error asociado a la toma de muestra es notablemente mayor que los errores aso-ciados a la preparación de la muestra y el análisis de la misma.
Legislació n
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Recuento de mohos
Recuento Micotoxinas
Recuento Micotoxinas
Recuento Micotoxinas
Recuento Micotoxinas
Detección bajo luz UV
Detección de fluorescencia verde-amarillenta, producidapor un metabolito co-sintetizado con las Aflatoxinas.
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Cromatograf ía en capa f ina
(TLC)
Cromatograf ía de líquidos
(HPLC-FLD, HPLC-UV, LC-MSMS)
Enzimoinmunoensayos
(LFD, ELISA)
Fluorimetría
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Enzimoinmunoensayos (formato tarjet a)
Ant icuerpos
monoclonales
Ant icuerpos
monoclonales
Ant icuerpos
monoclonales
Ocrat oxina AAflatoxinas
B1, B2, G1, G2
Aflatoxina B1
OCHRACARD®AFLACARD® TotalAFLACARD® B1
Rápido: result ados en 15 minutos.
Sencillo: prueba cualitativa de interpretación visual de resu ltados.
Flex ible: diferentes límites en diversas matrices ( 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20 y 30 ppb)
Fiable: buena correlación de result ados con HPLC.
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Rida® QUICK Af latoxin
Rida® QUICK DON
Rida® QUICK Fumonisin
Rida® QUICK Zearalenone
Enzimoinmunoensayos (LFD: dispositivo de flujo lateral)
Rida® QUICKDON Quant
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Rápido: result ados en 15 minutos.
Sencillo: ensayo cuantitat ivo empleando lector.
Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
75 ~ 500 ppb5 min.10 min.Zearalenona
0,8 ~ 10 ppm5 min.10 min.Fumonisin
0,25 ~ 5,50 ppm5 min.10 min.DON
4 ~ 75 ppb5 min.10 min.Af latoxin
Rango de medidaIncubaciónExtracciónRida® QUICK
Enzimoinmunoensayos (LFD: dispositivo de flujo lateral)
Flex ible: amplio rango de medida.
Fiable: buena correlación con ELISA y HPLC.
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Enzimoinmunoensayos (ELISA)
RIDASCREEN® FAST (48 pocillos/5 patrones): piensosy cereales (materias primas)
RIDASCREEN® (96 pocillos/6 patrones): alimentosy alimentación infant il.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
RIDASCREEN® Aflatoxinas Totales
Aflatoxina B1
Aflatoxina M1
Ocratoxina A
Citrinina
Zearalenona
DON (Vomitoxina)
Toxina T2 & HT-2
Fumonisinas
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Enzimoinmunoensayos (ELISA Sandwich)
Detecta y cuantifica la concentración de micotoxinas.
Anticuerpo de captura y un anticuepo conjugado con un enzima.
Sustrato cromogénico para detectar el anticuerpo conjugado.
Medida espectrofotométrica mediante lector de placas (450 nm).
Cuantifica resultados respecto a curva de calibración.
Positiv oNegativ o
Anticuerpos
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Enzimoinmunoensayos (ELISA Sandwich)
Anticuerpos
Micotoxina
Matriz
Positiv oNegativ o
EConjugado EE
EE E
EE
EE
EE
Sustrato
Muestra/Standard
Incubar
Lavado
Conjugado
Incubar
Lavado
Sustrato
IncubarEE
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Enzimoinmunoensayos (ELISA Sandwich)
Muestra/Standard
Incubar
Lavado
Conjugado
Incubar
Lavado
Sustrato
Incubar
Solución parada
Lectura
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
0/0,1/0,2/0,4/0,8/1,6 ppb3,50 ppbT-2 Toxin
0/3,7/11,1/33,3/100 ppb18,5 ppbDeox inivalenol
0/50/150/450/1350/4050 ppt1750 pptZearalenone
0/0,025/0,074/0,222/0,666/2 ppm25 ppb.Fumonisin
0/50/100/300/900/1800 ppt1,25 ppbOchratoxin A
0/0,5/1,5/4,5/13,5/40,5 ppb1,75 ppbAflatoxin Total
0 /1/5/10/20/50 ppb1,00 ppbAflatoxin B1
Valores de patronesL.O.D.RIDASCREEN® (96 p.)
RIDASCREEN®
Det erminación cuant it at iva de micotoxinas en aliment osy aliment ación infant il.
L.O.D para cer eales.
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Técnicas an alít icas
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
0/0,222/0,666/2/6 ppm222 ppbFumonisin
0/50/100/200/400 ppb50,0 ppbT-2 Toxin
0/0,222/0,666/2/6 ppm222 pppDeox inivalenol (DON)
0/50/100/200/400 ppb50,0 ppbZearalenone
0/5/10/20/40 ppb5,00 ppbOchratoxin A
0 /1,7/5/15/45 ppb1,70 ppbAflatoxin
Valores de patronesL.O.D.RIDASCREEN® FAST (48 p.)
RIDASCREEN® FASTDet erminación cuant it at iva de micotoxinas en piensos y cereales (mat erias p rimas)
L.O.D para cer eales.
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Columnas de inmunoaf inidad
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Solvente qu edesnatu raliza
los anticu erposy eluyen las
micotoxinas
Ant icu erposret ienen y
con centran lasmicotoxinas
Extracto demu estra sepasa por lacolu mna
Ant icu erpos
M atriz
M icotoxinas
Fiable: anticuerpos monoclonales.
Rápido: purifica el extracto de muestra en 20 minutos.
Flex ible: aplicaciones específicas para diferentes matrices.
Sensible: Bajo %CV, buenas recuperaciones y LOD < legislación EU.
Preparativa previa para determinar micotoxinas por HPLC-FLD, LC-MSMS.
Técnicas an alít icas
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Técnicas an alít icas
Columnas de inmunoaf inidad
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
Preparativa previa para determinar micotoxinas por HPLC-FLD, LC-MSMS.
HPLC-FLD LC-MSMS
AFLAPREP® DZT MS-PREP®
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Preparativa previa para determinar micotoxinas por HPLC-FLD, LC-MSMS.
Técnicas an alít icas
AFLAPREP® (Aflatoxinas B1 B2 G1 G2)
AFLAPREP® M (AflatoxinaM 1)
OCHRAPREP® (Ocrat oxina A)
AFLAOCHRA PREP® (Aflatoxinas y Ocrat oxina A)
EASI-EXTRACT® Zearalenone (Zearalenona)
DONPREP® (Deoxiniv alenol/Vomitoxina)
EASI-EXTRACT® T-2 & HT-2 (Toxinas T-2 & HT-2)
FUMONIPREP® (Fumonisinas)
AO ZON PREP® (Aflat oxinas, Ocrat oxina A y Zearalenona)
DZT MS-PREP® (Deoxiniv alenol, Zearalenona y Toxinas T-2 & HT-2)
TRILOGY Pat rones de micotoxinas
TRILOGY M at eriales de referencia
Columnas de inmunoaf inidad
Técnicas analíticas para determinar micotoxinas
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Los efectos en humanos son generalmente crónicos no agudos.
Co nclusio nes
Las micotoxinas pueden causar efectos adversos en la salud humana y animal.
Conclusiones
La presencia está condicionada por el tipo de moho, sustratoy factores externos.
La toma de muestra repercute de manera significativa en la determinación del con-tenido de micotoxinas en un lote. La muestra debe ser representativa del lote.
Consecuencias económicas en el comercio decereales y en la productividad de losanimales.
La contaminación puede ocurrir en el campo, durante la cosecha, el transporte y elalmacenamiento.
La reducción es posible aplicando buenas prácticas agrícolas (GAP) y buenas prác-ticas defabricación (GMP).
R-Biopharm dispone de diversas técnicas para el análisis de micotoxinas en cereales.
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Graciaspor su atención
p.aguiar@r-biopharm. es