Real Time qPCR en la mesada

Problemas, más y más problemas….

Feliz día a todas las mujeres!

Extracción de RNA

Material de partida

Tubos AXYGEN

Buffer TAE nuevo,

Más tiempo NaOH

H2O nueva (prep muestras)

Loading buffer

EtBr

Consideraciones para chequear integridad del ARN en gel de agarosa

Tratar cuba electroforética con NaOH 0.5 M por ½ - 1 hora

Usar agua estéril para preparación de buffer

NO reutilizar el buffer

Separar reactivos exclusivamente para RNA (agarosa, EtBr, Loading Buffer)

Correr poco tiempo (ej: 15 min a 100 V)

Siempre usar agua miliQ para preparar muestras

Hígado:

- centrifugación luego del TriZol

- doble extracción con cloroformo

Sangre:

- menor volumen de resuspensión (10 – 20 ul)

- GlycoBlue

Particularidades…

qPCR

¿¿ Cq > 32/33 ??

- Gen de baja expresión?

- Problema en la RT

- RNA realmente íntegro?

- Problema en la qPCR Control + !!

Pre-amplificación

Cambiar de gen !!

Degradación post-extracción?

SD

Enzimas?

Nueva tanda de cDNA

CHEQUEAR !

Con 1, 2 o 3 cDNAs

Pool de cDNAs

Lámpara de excitación? SYBR??

SYBR

Estabilidad

Inhibición

AMPLIFICA EL NTC !!!

- Dímeros de primer ??

- Contaminación ??

Dímeros de primer

- Diseñar nuevos

- T annealing

- Cc usada

Contaminación

• Juego de pipetas exclusivo

• NEVER IN THE LIFE sembrar los productos de PCR con esas pipetas

• Gel agarosa en sala aparte

• No mezclar por pipeteo

• Alicuotar reactivos

• Stock de primers: tips con filtro, alicuotar!!

• Hacer SIEMPRE blanco de reacción (NTC) para cada gen

Lidiando con las contaminaciones…

Construyendo una Curva Standard…

Curva Standard

Ef = 10 ^ - (1/Pend)

Puntos a tener en cuenta…

- cDNA a utilizar

- Temperatura de annealing (1,6 1,9)

- Puntos de la curva!!!

- muy concentrados: se va de la linealidad

NO incluir diluciones 1/10 – 1/20

- muy diluidos: dispersión de los datos / problemas con blancos!!

Persevera…..

….. Y triunfarás!!