Post on 18-Oct-2018
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
“Respuesta inmune y expresión de genes en el
camarón blanco (Litopenaeus vannamei) inducida por inmunoestimulantes microbianos”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
JESÚS TOMÁS MORENO HERRERA
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE 2012
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Acuacultura del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR), Unidad Sinaloa, del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue apoyado económicamente a través del proyecto SIP multidiciplinario_(Con número de registro_20120575_).El alumno/a_Jesús Tomás Moreno Herrera___fue apoyado con una beca CONACYT con clave 369358. El autor agradece el apoyo económico brindado por el Instituto Politécnico Nacional como becario del Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) y por el apoyo económico brindado atraves de la beca tesis del programa de becas institucionales de posgrado. Un agradecimiento al Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología por el apoyo otorgado para la terminación de la presente tesis.
I
DEDICATORIA
A mis padres Emelia y Antonio, por haberme educado y soportado mis errores, por
apoyarme en todo momento, por sus consejos, por su ejemplo de perseverancia y
constancia, por sus valores, por la motivación constante que me ha permitido ser una
persona de bien, y me han enseñado a ser quien soy, pero más que nada, por su
amor incondicional.
A mis hermanos, Magda, Marta, Claudia, Emelia, Toño, Mony y Cami, gracias por
haber fomentado en mí el deseo de superación y el anhelo de triunfo en la vida, y
porque siempre me han apoyado incondicionalmente.
A todos, espero no defraudarlos y contar siempre con su valioso apoyo, sincero e
incondicional.
II
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por acompañarme todos los días. A mi familia, que me dio todo el apoyo para seguir adelante con este nuevo reto que decidí tomar. Al Dr. Antonio Luna González yal Dr. Ángel Isidro Campa Córdova gracias por darme la oportunidad y la confianza de trabajar con ellos, y por compartirme su conocimiento para la realizar este trabajo. A mis tutores, Dra. Norma Elena Leyva López, Dr. Héctor Abelardo González Ocampo, Dr. Javier Orduña Rojas † yal M.C. Jesús Arturo Fierro Coronado por sus comentarios, observaciones que ayudaron a mejorar este trabajo, y por el tiempo invertido en ello. Al equipo de trabajo que colaboró de alguna forma en el trabajo de laboratorio y campo: Arturo Fierro “el sho”, gracias compa; Ely Sara, Polanco, Dani. Al Biol. Adolfo Ramírez por el aporte de organismos. A mis compañeros y amigos de generación, John, Chelis, Pedro, Joaco, Lalo, Styl, Miguel, Alfredo, José, Samuel, Jorge, Porfi †, Magnolia, Sheila, Rocio, Liz, Fátima, Eli, Irene; y mis otros amigos, Abraham, Viri, Carmen, Judith, Dámaris, Jaz, Sara, Ana y Violeta; por hacer que el viaje fuera más corto y placentero y este plagado de buenos momentos. A todos los investigadores y profesores que participaron en mi formación académica. Gracias por su conocimiento impartido. A Dorín, Don Roberto, Ricardo y Celestino por su amistad y apoyo en la parte administrativa. A todas aquellas personas que de momento se me escapa mencionar, pero que de alguna manera colaboraron en la realización del presente trabajo. ¡Muchas gracias a todos!
III
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL ................................................................................................................. III
ABREVIATURAS .................................................................................................................... V
GLOSARIO ............................................................................................................................ VII
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... X
LISTA DE TABLAS ............................................................................................................... XI
RESUMEN ............................................................................................................................. XII
ABSTRACT ........................................................................................................................... XIII
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 1
2. ANTECEDENTES .............................................................................................................. 16
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 19
4. HIPÓTESIS ......................................................................................................................... 20
5. OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 20
5.1. Objetivos específicos ........................................................................................... 20
6. METODOLOGIA ................................................................................................................ 21
6.1. Adición de las BAL y levaduras al alimento ................................................... 21
6.2. Obtención de animales y su aclimatación ......................................................... 21
6.3. Extracción de ADN para la determinación de WSSV ...................................... 21
6.4. PCR para WSSV ........................................................................................................ 22
6.5. Bioensayo ................................................................................................................... 23
6.5.1. Obtención de hemolinfa ................................................................................ 23
6.5.2. Extracción de ARN y RT-PCR semicuantitativa ..................................... 24
6.5.3. Secuenciación de genes del sistema inmune ........................................ 26
6.5.4. Determinación de la concentración de proteína ....................................... 26
6.5.5. Conteo y separación de hemocitos ........................................................... 26
6.5.6. Medición de fenoloxidasa (plasma) y profenoloxidasa (SLH) ............ 27
6.5.7. Cuantificación del anión superóxido intracelular .................................... 27
6.5.8. Actividad de la peroxidasa .............................................................................. 28
6.5.9. Tasa de crecimiento específico ..................................................................... 28
6.5.10. Análisis estadístico de los resultados ..................................................... 28
7. RESULTADOS ................................................................................................................ 29
7.1. Supervivencia y tasa de crecimiento específico .............................................. 29
7.2. Conteo total de hemocitos (CTH) ......................................................................... 29
IV
7.3. Determinación de proteína .................................................................................. 30
7.4. Peroxidasa total de plasma y SLH .................................................................... 31
7.5. Anión superóxido en SLH .................................................................................... 32
7.6. proFO, FO, FO total ............................................................................................... 32
7.7. Análisis de la expresión de genes del sistema inmune ................................. 33
7.8. Parámetros fisicoquímicos (temperatura, oxígeno disuelto, pH, salinidad) ............................................................................................................................................... 35
7.9. Calidad de agua (nitritos, nitratos y amonio) .................................................... 35
8. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 36
9. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 41
10. REFERENCIAS ................................................................................................................ 42
V
ABREVIATURAS
ADN Ácido desoxirribonucleico
ARN Ácido ribonucleico
ANDEVA Análisis de varianza
BAL Bacterias ácido lácticas
°C Grado centígrado
CTH Conteo total de hemocitos
d Día
DE Desviación estándar
DNTPs Desoxinucleótidos trifosfato
EE Error estándar
EDTA Etilendiaminotetraacetato
FO Fenoloxidasa
FO tot Fenoloxidasa total
GADPH Glicerladehído-3-fosfato deshidrogenasa
g/kg Gramo por kilogramo
H2O Agua
h Hora
Kb Kilobase
L Litro
L-Dopa L-dihidroxifenilalanina
M Marcador de peso molecular
min Minutos
mm Milímetro
mM Milimolar
mL Mililitro
mg/L Miligramo por litro
µL Microlitros
NH4 Amonio
NO2 Nitrito
NO3 Nitrato
VI
OD Oxígeno disuelto
pb Pares de bases
PCR Polymerase chain reaction (reacción en cadena de
polimerasa)
pH Potencial de iones de hidrogeno
proFO Profenoloxidasa
‰ Partes por mil (salinidad)
% Porcentaje
spp Especies
SLH Sobrenadante lisado de hemocitos
TCE Tasa de crecimiento especifica
U Unidades
UFC Unidades formadoras de colonias
UFC/mL Unidades formadoras de colonias por mililitro
VII
GLOSARIO
Acuicultura: Conjunto de técnicas y actividades cuyo objetivo es la cría en cautiverio
de organismos acuáticos (peces, moluscos, crustáceos, reptiles o algas) en agua
cuyo mayor o menor carácter intensivo depende del grado de intervención del
hombre en los ciclos biológicos de los organismos en cuestión.
Antibiótico: [Gr. anti, contra + bios, vida]: un compuesto orgánico, inhibidor o tóxico
para otras especies, por lo general bacterias, que es formado y secretado
naturalmente por un organismo.
Bacteria: Organismo unicelular procariota, que se presenta en varias formas
(esférica, bastón o espiral). Algunas bacterias provocan enfermedades, pero muchas
son benéficas.
Bacteria ácido láctica: Grupo de bacterias que fermentan carbohidratos dando
ácido láctico como producto principal. Se les emplea en la fabricación de yogur,
quesos, leche fermentada y embutidos.
Camaronicultura: Es el cultivo de las diferentes especies de camarones que se
lleva a cabo en aéreas costeras.
Electroforesis: Técnica de separación de sustancias, basada en su desplazamiento
en un campo eléctrico debido a su carga neta. Se utiliza con frecuencia para separar
mezclas de iones, proteínas o ácidos nucleicos.
Enfermedad: Término amplio que se utiliza para designar el daño de células
suficiente para causar disfunción en el organismo. Una enfermedad pude ser
causada por (1) defectos genéticos reflejados en una normal estructura y función
celular, (2) desbalance nutricional que priva a las células de nutrientes esenciales, (3)
agentes químicos o físicos que lesionan las células o (4) agentes infecciosos que
dañan las células por su acción fisiológica o presencia física.
Enzima: Biomolécula que cataliza una reacción química específica,
fundamentalmente una proteína.
Fagocitosis: Capacidad de algunas células de destruir las bacterias o agentes
nocivos para el organismo.
VIII
Gen: En biología molecular, segmento de DNA o RNA que normalmente contiene
una región promotora, una región que se transcribe y una región con una señal de
terminación de lectura.
Hemocito: Célula de la hemolinfa de los invertebrados.
Hemolinfa: Liquido circulatorio de los artrópodos, moluscos, etc. Análogo de a
sangre de invertebrados. Su composición varía mucho de una especie a otra. Puede
ser de diferentes colores o incluso incolora; los pigmentos pueden proceder de la
alimentación o de los procesos metabólicos y no tienen ninguna función biológica, ya
que en el transporte de gases es independiente del aparato circulatorio.
Levadura: Son hongos unicelulares, usualmente de forma ovalada, con estados
vegetativos que se reproducen predominantemente por gemación o fisión, dando por
resultado un crecimiento unicelular, aunque algunas pueden ser dimórficas o
bifásicas y crecer como micelio bajo condiciones ambientales apropiadas.
Patógeno: Cualquier organismo que puede causar enfermedades o iniciar un
proceso patológico.
PCR (Siglas del Inglés Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la
Polimerasa): Metodología utilizada para producir múltiples copias de fragmento d
DNA molde, anillamiento con oligonucleótidos específicos y extensión de los mismos
por medio de una DNA polimerasa termotolerante.
Prebiótico: Ingredientes alimentarios no digeribles que promueven la salud del
huésped al estimular selectivamente el crecimiento y la actividad de una bacteria
benéfica o un grupo de ellas en el tracto digestivo.
Primer: Cadena pequeña de polinucleótidos que sirve de indicadora en la síntesis
química de una molécula de ácidos nucleicos (iniciador o cebador).
Probiótico: Se considera alimento probiótico aquel que contiene microorganismos
vivos presentes en un alimento que permanecen activos en el intestino y ejercen
importantes efectos fisiológicos, se define como un suplemento microbiano formado
por un cultivo simple o mixto de microorganismos seleccionados que son adicionados
con el propósito de manipular las poblaciones bacterianas presentes en los sistemas
de producción.
IX
Síndrome: Combinación de síntomas que dan como resultado un solo efecto que
constituye una entidad clínica diferente.
Virus: Agente infeccioso acelular, con una organización muy simple, formada por un
complejo de proteína, la cápside y un solo tipo de ácido nucleico (DNA o RNA),
carece de metabolismo independiente y sólo se puede replicar en una célula
hospedera.
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Tasa de crecimiento específico del camarón blanco durante el bioensayo. ................................................................................................................. 29
Figura 2. Conteo total de hemocitos del bioensayo. ................................................. 30
Figura 3. Actividad peroxidasa total del plasma y SLH del bioensayo. ..................... 31
Figura 4. Resultados del análisis de anión superóxido ............................................. 32
Figura 5. Expresión de los genes del sistema inmune de L. vannamei. ................... 34
XI
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Genes del sistema inmune estudiados(Wang et al., 2007) ......................... 25
Tabla 2. Determinación de la proteína de plasma y de SLH del bioensayo .............. 31
Tabla 3. Profenoloxidasa (ProFO), Fenoloxidasa (FO) y Fenoloxidasa Total (FOtotal) ...................................................................................................... 33
Tabla 4. Parámetros fisicoquímicos del bioensayo. .................................................. 35
Tabla 5. Calidad del agua del bioensayo .................................................................. 35
XII
RESUMEN
En este trabajo se evaluó el efecto inmunoestimulante de bacterias ácido
lácticas y levaduras muertas por calor en Litopenaeus vannamei, cultivado en el
laboratorio. La mezcla inmunoestimulante (MI) en polvo se adicionó en el alimento.
Se realizó un bioensayo de 26 días en tinas de plástico con 80 L de agua de mar
filtrada, aireación constante y 10 organismos por tina. La alimentación se realizó dos
veces al día, la limpieza diariamente y la determinación de parámetros fisicoquímicos
cada 3 días. La calidad del agua y el registro del peso de los organismos se
realizaron al inicio y al final del bioensayo. Se determinó la tasa de crecimiento
específico y los tratamientos se realizaron por triplicado: I) dieta control
(Camaronina); II) MI en alimento, diario; III) MI en alimento, cada 3 días; IV) MI en
alimento, cada 6 días. Los camarones estaban libres de WSSV, la supervivencia se
determinó diariamente. Para el estudio del sistema inmune se extrajo la hemolinfa, se
hizo un conteo total de hemocitos, se determinó bioquímicamente la concentración
de anión superóxido,la actividad de la fenoloxidasa (FO) y peroxidasa. Los resultados
se analizaron con un ANDEVA y una prueba Tukey, se estudió la expresión
semicuantitativa de 6 genes del sistema inmune, utilizando la técnica de RT-PCR.
Los resultados se analizaron con la prueba de Kruskal-Wallis, no hubo aumento
significativo en el crecimiento y la supervivencia, el conteo total de hemocitos, la
concentración de la proteína, la concentración del anión superóxido y en la actividad
de la enzima peroxidasa. La actividad de la FO (plasma) en el tratamiento IV fue
significativamente mayor que en los tratamientos I, II y III. La FO del SLH (proFO) en
el tratamiento IV fue significativamente mayor que en los tratamientos I y III. La FO
total se comportó de la misma manera que en la FO del SLH. La secuencia de los
productos amplificados coincidió con la reportada en el banco de genes. La MI
provocó una sobreexpresión significativa de los genes que codifican para la
profenoloxidasa (tratamiento IV), la lisozima (tratamiento III) y la transglutaminasa
(tratamiento II) con respecto a los animales no tratados (control).
XIII
ABSTRACT
This study evaluated the immunostimulant effect of lactic acid bacteria and yeasts
(dead by heat) in L. vannamei, cultured in the laboratory. The immunostimulant
powder (MI) was added in the feed. Bioassay (26 d) was performed in plastic tanks
with 80 L of filtered sea water, constant aeration and 10 organisms per tank. Feeding
was performed twice daily. Daily cleaning and determination of physicochemical
parameters were done every 3 days. The quality of water and the recording of the
weight of the organisms were performed at the beginning and at the end of the
bioassay. The specific growth rate was determined. Triplicate treatments: I) control
diet (Camaronina) II) MI in feed, daily; III) MI in feed every three days; IV) MI in feed
every 6 days. The shrimp were WSSV free. Survival was determined daily. For the
study of the immune system, hemolymph was extracted total hemocyte count was
done, andthe superoxide anion concentration, phenoloxidase (FO) and peroxidase
activity were determined. The results were analyzed with ANOVA and Tukey test. The
expression six immune system genes, using the technique of RT-PCRwas studied.
The results of gene expression were analyzed with the Kruskal-Wallis test. There
were no significant diferences in the growth and survival, the total hemocyte count,
the protein concentration, the concentration of superoxide anion, and the activity of
the enzyme peroxidase. The FO activity (plasma) in the treatment IV was significantly
higher than in treatments I, II and III. The FO activity in HLS in treatment IV was
significantly higher than in treatments I and III. The total FO activity was as in HLS.
The sequence of the amplified products coincided with those reported in the Gene
Bank. The MI caused a significant overexpression of the genes coding for the
prophenoloxidase (IV treatment), lysozyme (treatment III) and transglutaminase
(Treatment II) with respect to the untreated animals (control).
1
1. INTRODUCCIÓN
La salud de las especies acuáticas está influenciada por la llamada triada
epidemiológica, la cual se refiere a interacciones entre el medio ambiente, los
patógenos y el huésped. En los sistemas de producción del camarón blanco
(Litopenaeus vannamei), muchos patógenos potenciales, tales como las bacterias,
hongos y virus, co-existen con el camarón sin causar un impacto negativo en la
producción, debido a un equilibrio en los factores de la triada. Sin embargo, cualquier
alteración en alguno de ellos, como estrés en el organismo, deterioro del ambiente o
mutaciones de las cepas patógenas, pueden desencadenar enfermedades agudas,
que provocan pérdidas significativas en la industria(Flegel y Pasharawipas, 1998;
Moriarty, 1999; Capy et al., 2000; Spann et al., 2000; Vidal et al., 2001).Los
probióticos, suplementos microbianos formados por un cultivo simple o mixto de
microorganismos seleccionados, han demostrado en la acuacultura, que son
capaces de mejorar el crecimiento, supervivencia, capacidad inmune y tasa de
conversión alimenticia de los organismos, así como también, mejorar la calidad de
agua de cultivo. Por ello, actualmente representan una estrategia ampliamente
aceptada para la mejora de los sistemas de cultivo (Balcázar, 2002).
Probióticos
La palabra probiótico fue propuesta en 1974 por Parker, deriva del griego que
significa "para la vida" y contrasta con la palabra antibiótico, la cual significa "contra
la vida" (Aguirre, 1992).
En los 70´s un probiótico se definía como “un microorganismo que se utiliza
como suplemento en la alimentación animal, para aumentar el crecimiento y reducir
el estrés”. Hoy en día, en acuacultura, el término probiótico se define como un
suplemento microbiano formado por un cultivo simple o mixto de microorganismos
seleccionados que son adicionados con el propósito de manipular las poblaciones
bacterianas presentes en los sistemas de producción (Balcázar, 2002). Esta
definición incluye cultivos microbianos, células y metabolitos microbianos (productos
directos del cultivo microbiano) (Aguirre, 1992).
2
Hoy en día el término probiótico, está más asociado al género Lactobacillus en
la salud humana y sus mecanismos generales de acción son los siguientes
(Balcázar, 2002; Amores et al., 2004):
Competencia por sitios de fijación con bacterias patógenas (exclusión
competitiva);
Mejoramiento de la nutrición por el suministro de nutrientes esenciales;
Incremento de la digestión por el suministro de enzimas esenciales;
Eliminación directa de materia orgánica disuelta mediada por la bacteria;
Producción de sustancias que inhiben el crecimiento de patógenos
oportunistas;
Producción de sustancias inmunoestimulantes.
Entre los microorganismos comúnmente empleados como probióticos en
acuacultura se encuentran las bacterias ácido lácticas, los bacilos, los vibrios y las
levaduras (Kumar et al., 2006).
Bacterias ácido lácticas
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son el grupo bacteriano de mayor
importancia. Estos microorganismos, especialmente el género Lactobacillus, son los
responsables de la producción de ácido láctico durante la fermentación, provocando
así una disminución del pH. Las BAL se desarrollan rápidamente durante el proceso
fermentativo y se replican desde 103-104 UFC/g hasta 108-109 UFC/g al final de la
fermentación, manteniéndose en estos niveles al final de la maduración (Hugas et al.,
1993).
Con respecto a su taxonomía, las BAL forman un grupo natural de bacterias
Gram positivas, anaerobias aerotolerantes, normalmente no móviles, que no forman
esporas, ni producen catalasa, aunque algunas cepas presentan una pseudo-
catalasa, con morfología de coco, coco-bacilo ó bacilo, que fermentan carbohidratos
para formar principalmente ácido láctico, con un contenido de G+C inferior a 55
mol%, por lo cual pertenecen a la subdivisión Clostridrium de las eubacterias Gram
positivas.
3
Taxonómicamente forman un grupo bastante heterogéneo, los géneros
incluidos son Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Streptococcus,
Enterococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Pediococcus y
Tetragenococcus (Vandamme et al., 1996).
Las BAL se encuentran normalmente en alimentos fermentados tales como
carne, vegetales, frutas, bebidas y productos lácticos, y también en los tractos
respiratorio, intestinal y genital de humanos y animales, en aguas fecales y en
materia vegetal. Las BAL tienen una gran importancia en alimentación y tecnología
alimentaria, sobretodo por su capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos
patógenos por lo cual han mostrado un impacto positivo en la salud humana y
animal.
Además del ácido láctico y acético, las BAL son capaces de producir y
excretar otras sustancias, aunque en cantidades muy inferiores. Entre éstas
destacan el ácido fórmico, ácidos grasos libres, amonio, etanol, peróxido de
hidrógeno, diacetilo, acetoína, 2,3-butanodiol, acetaldehído, benzoato, enzimas
bacteriolíticas, bacteriocinas y antibióticos, además de diversas sustancias
inhibidoras que no están completamente identificadas (Gilliland, 1986; Klaenhammer,
1988; Daeschel, 1989; Lindgren y Dobrogosz, 1990; Piard y Desmazeud, 1991,1992;
Vandenbergh, 1993). Algunas de estas sustancias tienen actividad antagonista
contra diversos microorganismos patógenos y deteriorantes de alimentos. La
inhibición del crecimiento de microorganismos indeseables se produce por
eliminación competitiva de los sustratos esenciales, acumulación de D-aminoácidos,
disminución del potencial redox, congregación, etc. No obstante la antibiosis podría
inhibir a otras cepas de BAL deseables (Houle et al., 1989).
Los mecanismos de acción de las BAL, son los siguientes:
Cambio en la flora bacteriana y reducción de poblaciones de organismos
patógenos.
Producción de ácido láctico, con lo que se reduce el pH en el sistema
digestivo del animal.
Adhesión o colonización por los microorganismos seleccionados a nivel de
sistema digestivo del animal.
4
Prevención por los microorganismos de la síntesis de toxinas.
En algunos casos producción de antibióticos.
Levaduras
Las levaduras, son hongos unicelulares, usualmente de forma ovalada, con
estados vegetativos que se reproducen predominantemente por gemación o fisión,
dando por resultado un crecimiento unicelular, aunque algunas pueden ser
dimórficas o bifásicas y crecer como micelio bajo condiciones ambientales
apropiadas. Este grupo de microorganismos está incluido taxonómicamente en la
División Eumycota y dadas sus características de reproducción sexual, se pueden
ubicar en tres subdivisiones: Ascomycotina, que comprende a levaduras que pueden
formar esporas contenidas dentro de una asca; Basidiomycotina, en donde los
representantes forman esporas externas localizadas sobre basidios o esterigmas y;
Deuteromicotina en donde se incluyen todas aquellas levaduras para las que no ha
sido posible demostrar que presentan una fase sexual en su ciclo de vida (Ochoa y
Vázquez-Juárez, 2004). Las levaduras registran una amplia distribución en un
variado tipo de hábitats tanto terrestres como acuáticos, ya que pueden encontrarse
asociadas a la flora y fauna acuática de los océanos, siendo parte constitutiva de la
población microbiana marina. Por lo anterior se les consideran “Levaduras Marinas”,
cuya reproducción y crecimiento ocurren preferentemente en el mar, o en
condiciones óptimas a las concentraciones normales de sales en el mar, entre 2.4-
4% de NaCl. También hay algunas levaduras que son capaces de distribuirse en
ambientes salinos no marinos y son altamente halofílicas o halotolerantes (Ochoa y
Vázquez-Juárez, 2004).
Se ha demostrado que algunas especies de levaduras poseen mecanismos
que les permite colonizar el intestino de peces y eventualmente incrementar su
población (Andlid, 1995). Otros estudios más detallados han definido el mecanismo
de colonización de la levadura al animal hospedante, el cual parece estar mediado
por la participación de adhesinas específicas y la hidrofobicidad típica de este tipo de
células. Actualmente, hay un modelo que propone que las células tienen capacidad
para cambiar rápidamente la hidrofobicidad de superficie celular de hidrofóbico a
5
hidrofílico, en respuesta a la disponibilidad de nutrientes, lo que les confiere
capacidad de crecer con componentes de la mucosa como única fuente de energía y
establecer una relación estrecha a través del reconocimiento específico de ciertos
componentes de la mucosa. Así, es posible explicar el hecho de que una nueva
especie del género Rhodotorula haya sido aislada del gusano Lamellibrachia sp., el
cual fue recolectado a una profundidad de 1,156 m en la Bahía de Sagami, Japón
(Nakayama et al., 2001).
Dos aspectos han motivado la consideración del uso de levaduras como
probióticos en acuacultura: primero, es el difundido y probado efecto benéfico de
levaduras en diversos modelos que incluyen al hombre. Segundo, es la demostración
de la presencia de levaduras con una alta capacidad de colonización, en el tracto
digestivo de peces. La levadura Saccharomyces boulardii es ampliamente utilizada
en varios países de Europa en el tratamiento de enteritis infecciosa aguda, en
desórdenes producidos por el uso de antibióticos y colitis asociadas a infecciones por
Clostridium difficile. El género Candida sp. se utiliza en el cultivo a gran escala de
rotíferos. Diversos mecanismos del efecto benéfico han sido descritos y se sugiere
que la expresión de enzimas intestinales es favorecida por poliaminas secretadas por
el organismo (Ochoa y Vázquez-Juárez, 2004).
Sistema inmune del camarón
Teniendo en cuenta que el reto más grande que enfrenta la camaronicultura
son los problemas virales, es importante el estudio del sistema inmune del camarón
(Arala-Chávez y Sequeira, 2000).
En los camarones, los mecanismos celulares y humorales (inmunidad innata o
no específica) contribuyen a la defensa del organismo, limitando invasiones
microbianas y virales que son eliminadas de la hemolinfa y tejidos (Söderhäll y
Cerenius, 1992; Vázquez et al., 1998; Bachère, 2000).
La función del sistema inmune es mantener la individualidad biológica del
organismo, por ello, su principal actividad es diferenciar y eliminar todo material
extraño de sus tejidos (Vargas et al., 1996).
6
Según Bachère (2002), la respuesta inmune de los crustáceos puede ser
divida en varias fases:
1) Etapa inmediata e inducible, correspondiente al reconocimiento de lo “no
propio”, gracias a factores presentes en la hemolinfa que poseen una alta
especificidad de reconocimiento (Destoumieux et al. 1997; Vázquez et al.,
1998).
2) Etapa de defensa celular y síntesis de efectores.
3) Etapa humoral y de recuperación celular.
En particular, los crustáceos decápodos poseen un sistema circulatorio abierto
mediante el cual son distribuidos los nutrientes, oxígeno, hormonas y células que
viajan a través de la hemolinfa. La hemolinfa es un análogo de la sangre y la linfa de
los vertebrados. La hemolinfa baña los tejidos, denominándose hemocele a los sitios
donde circula. La hemolinfa presenta un color azul verdoso a causa de la
hemocianina, la cual es una proteína involucrada en la respiración abundante en la
hemolinfa de todos los crustáceos.
La respuesta celular del sistema inmune del camarón
Varios tipos de células están involucradas en la eliminación de partículas
extrañas que llegan al hemocele de los crustáceos (Johnson, 1987):
a) Los podocitos o nefrocitos, los cuales están localizados en branquias y en el
celosoma de la glándula antenal, y están especializados en la pinocitosis de
proteínas y posiblemente virus.
b) Las células fagocíticas de reserva se presentan en el corazón de los peneidos,
estas células son derivadas del tejido hematopoyético y están involucradas en
filtrar otras sustancias, sin embargo, no existe evidencia de que estén
relacionadas con la fagocitosis de bacterias o virus.
c) Los fagocitos fijos, también derivados del tejido hematopoyético están ubicados
en los espacios hemales del hepatopáncreas donde secuestran gran cantidad
de partículas.
d) El órgano linfoide es considerado una parte integral del sistema circulatorio de
los camarones peneidos, se asume que funciona como filtro de la hemolinfa,
7
por lo que tendría gran importancia en la eliminación y captura de partículas
virales (Van de Braak et al., 2002).
En el órgano linfoide de los camarones se forman los esferoides, los cuales se
observan como una masa multicelular que origina una desorganización de los
túbulos normales, carecen de un lumen central y presentan vacuolas
citoplasmáticas o algún tipo de inclusiones (Anggraeni y Owens, 2000); se ha
sugerido que estos esferoides son originados por los hemocitos y también
constituyen un mecanismo para secuestrar virus (Anggraeni y Owens, 2000;
Van de Braak et al., 2002).
e) Existen evidencias de esferoides ectópicos en algunas especies de peneidos.
Los esferoides del órgano linfoide y los esferoides ectópicos están compuestos
del mismo tipo de células fagocíticas las cuales pueden proliferar in situ o
migrar a los sitios en respuesta a una infección viral (Hasson et al.,1999).
Esferoides ectópicos fueron reportados en algunos apéndices que
normalmente contienen glándulas tegumentales (Hasson et al.,1999).
f) Las glándulas tegumentales han sido encontradas en asociación con la
superficie cuticular, su distribución y número varía de una especie a otra,
además estarían implicadas en muchas funciones que incluyen el
endurecimiento de la cutícula, formación de epicutículas, apareamiento,
osmorregulación, defensa contra predadores y ayudan en la alimentación
mediante la formación del mucus (Talbot y Demers, 1993).
g) Los hemocitos, células circulantes en la hemolinfa, son las células fagocíticas
más abundantes, se han considerado análogos a los leucocitos de mamíferos
debido a las funciones que realizan en el mecanismo de defensa como parte
de la respuesta inmune innata, participando en el reconocimiento, destrucción
de partículas extrañas y agentes infecciosos (Raa, 1996). Estas células llevan
a cabo reacciones inmunes como fagocitosis, encapsulación, nodulación,
citotoxicidad (Söderhäll y Cerenius, 1992). Además, los hemocitos participan
en la coagulación de la hemolinfa ya que constituyen la fracción celular de la
misma.
8
Se han descrito tres tipos de hemocitos, utilizado criterios morfológicos,
antigénicos y funcionales (Rodríguez, 1996; Johansson et al., 2000):
Hemocitos hialinos, los cuales no poseen gránulos, tienen capacidad
fagocítica e intervienen en la coagulación (Raa, 1996).
Hemocitos semigranulosos, los cuales poseen abundantes gránulos,
intervienen en la fagocitosis, encapsulación y en la liberación del sistema
profenoloxidasa (proFO)encargado y responsable de la melanización.
Además, sintetizan y liberan las peneidinas, que son péptidos antimicrobianos
(Dextoumieux et al., 2000).
Hemocitos granulosos, los cuales están cargados de gránulos. Estos
hemocitos almacenan las enzimas que constituyen el sistema proFO en los
crustáceos a un nivel más elevado que el de los hemocitos semigranulosos
(Smith y Söderhäll, 1983). Al igual que los hemocitos semigranulosos
sintetizan y almacenan las peneidinas (Destoumieux et al., 2000) e intervienen
en el mecanismo de encapsulación.
Respecto a las infecciones virales de peneidos, se han reportado las
siguientes respuestas celulares:
Fagocitosis de virus (Söderhall et al., 1996), la cual es considerada la primera
línea de defensa en invertebrados (Bayne, 1990).
Encapsulación (Momoyama et al., 1994).
Melanización (Hasson et al., 1999a; Wang et al., 1999).
Nodulación (Söderhall y Cerenius, 1992; Durand et al., 1997).
Formación de esferoides del órgano linfoide (EOL) (Anggraeni y Owens,
2000).
Fagocitosis
Es el mecanismo de defensa celular más común entre todos los animales
incluyendo a los invertebrados (Söderhäll y Cerenius, 1992; Vargas-Albores, 1995;
Le Moullac et al., 1997). La eliminación de material particulado en los crustáceos la
9
realizan dos tipos de células: los hemocitos libres y los fagocitos fijos, los cuales se
localizan en los senos hemales del hepatopáncreas en la mayoría de los decápodos.
Johnson (1987) menciona que la fagocitosis es la eliminación de materiales extraños
del hemocele de crustáceos decápodos, donde se ven involucradas varias clases de
células. Las proteínas y pequeños virus son eliminados por los podocitos, los cuales
son células especializadas en llevar a cabo picnocitosis, y que están ubicadas en las
branquias y en la glándula antenal (Rodríguez, 1996). La fagocitosis junto con otros
mecanismos humorales constituye la primera línea de defensa inmunológica cuando
una partícula atraviesa la primera barrera de defensa que constituye la cutícula
(Söderhäll y Cerenius, 1992).
La fagocitosis consiste de los siguientes pasos: quimiotaxis, adherencia,
ingestión, destrucción del patógeno y expulsión del material de desecho por
exocitosis. Las células fagocíticas destruyen a los organismos englobados mediante
dos mecanismos de defensa, el aerobio y el anaerobio. El mecanismo aerobio está
ligado al estallido respiratorio, empleando NADPH o NADH como donador de
electrones, durante este mecanismo se reduce un electrón del oxígeno para formarse
el radical superóxido (O2-), el cual es convertido a peróxido de hidrógeno
espontáneamente o por acción de la superóxido dismutasa (SOD), produciéndose
una nueva molécula de oxígeno. El mecanismo anaerobio es atribuido a la acción de
enzimas microbicidas, como lisozimas y moléculas como péptidos antimicrobianos
(Nappi y Ottaviani, 2000).
Encapsulación
Es un tipo de respuesta multicelular para eliminar partículas extrañas que no
pueden ser destruidas por los mecanismos humorales (Vázquez et al., 1998). Este
mecanismo actúa cuando una partícula es demasiado grande para ser fagocitada.
Muchos hemocitos cubren a la partícula grande formando capas alrededor de ella, y
las cápsulas son fuertemente melanizadas (Söderhäll y Cerenius, 1992).
En crustáceos, se ha observado que los hemocitos semigranulares son los
responsables de reconocer las moléculas o partículas extrañas encapsulándolas
mediante una proteína que funciona como opsonina, y que actúa en conjunto con la
10
activación del sistema profenoloxidasa. Esta proteína es multifuncional debido a que
además de ser un promotor de encapsulación puede actuar como un factor de
adhesión y un factor de degranulación para células semigranulares y granulares
(Söderhäll y Cerenius, 1992).
Melanización
Es una manifestación común en los invertebrados, cuyo proceso comprende
una serie de reacciones enzimáticas en cascada conocido como sistema
profenoloxidasa (proFO) (Vázquez et al., 1998; Perdomo-Morales et al., 2007).El
sistema proFO de los camarones se encuentra en el interior de los gránulos de los
hemocitos granulosos y semigranulosos. Este sistema puede ser activado en forma
natural por estimulación de componentes microbianos, como los β-glucanos de
hongos, los peptidoglucanos (PG) y los lipopolisacáridos (LPS) bacterianos (Vargas-
Albores, 1995). Una vez liberado el contenido granular por degranulación, la proFO
es activada a fenoloxidasa (FO).
La enzima activadora es una serina-proteasa de tipo tripsina llamada enzima
activadora de la profenoloxidasa (EaproFO) ó proteína activadora de la
profenoloxidasa (ppA) (Vargas y Yepiz, 1998). La fenoloxidasa es la enzima
responsable de la melanización observada en crustáceos e insectos (Söderhäll y
Cerenius, 1992). La FO promueve la oxidación de fenoles en quinonas las cuales se
polimerizan de manera no enzimática formando depósitos insolubles de melanina.
La melanina es un pigmento pardo-negro, con propiedades biológicas capaces
de inhibir la actividad de enzimas bacterianas y fúngicas (Smith y Söderhäll, 1983).
Puede ser observada como manchas obscuras en el caparazón de los camarones
(Homblad y Söderhäll, 1999). A la melanina se le han atribuido propiedades
microbicidas, durante la generación de quinonas se producen otros agentes
microbicidas importantes, como el anión superóxido y los radicales hidroxilo (Nappi et
al., 1995; Vargas-Albores et al., 1998).
Además de su participación en la melanización, el sistema proFO también está
involucrado en algunas reacciones celulares de defensa como fagocitosis,
11
nodulación, encapsulación, adhesión y locomoción de hemocitos (Vargas-Albores,
1995).
La activación del sistema proFO, medido como actividad de la fenoloxidasa
(FO), ha sido usada para medir la inmunoestimulación en camarones (Sung et al.,
1994; Sung et al., 1996). Cabe mencionar que en el camarón, tanto la enzima proPO
y la EaproPO se encuentran en forma inactiva en los gránulos de los hemocitos
(Vargas-Albores, 1995).
Nodulación
Cuando el huésped es invadido por un gran número de microorganismos, en
exceso y no pueden ser removidos por fagocitosis, se lleva a cabo la formación de
nódulos. Este es un mecanismo muy eficiente para la eliminación de partículas
extrañas en invertebrados, incluyendo a los crustáceos (Söderhäll y Cerenius, 1992).
En los nódulos las partículas extrañas son aprisionadas por varias capas de
hemocitos, formando pequeñas cápsulas desde las cuales ciertos hemocitos se
desprenden y se infiltran en la masa bacteriana e intentan fagocitarla. Estos forman
nódulos en el que las partículas extrañas son atrapadas por varias capas de
hemocitos con la consiguiente activación del sistema profenoloxidasa cuando el
nódulo es melanizado. Durante este proceso, las partículas extrañas son removidas
rápidamente de la circulación hemolinfática, alojándose en branquias y entre los
túbulos hepatopancreáticos (Söderhäll y Cerenius, 1992).
Coagulación
La coagulación de la hemolinfa es una respuesta de defensa muy importante
en los crustáceos, ya que es un proceso en el cual los crustáceos rápidamente sellan
sus heridas del exoesqueleto previniendo la pérdida de la hemolinfa y evitando el
ingreso de partículas extrañas al organismo (Söderhäll y Cerenius, 1992; Song y
Huang, 1999; Montaño-Pérez et al., 1999).
La hemolinfa coagula mediante una cascada enzimática en la que intervienen
enzimas proteolíticas que finalmente hidrolizan una proteína llamada coagulógeno. El
coagulógeno es transformado a coagulina y posteriormente se polimeriza para
12
conformar el coágulo (Montaño-Pérez et al., 1999). La proteína de la coagulación es
un dímero plasmático cuyo monómero tiene aproximadamente 200 kDa, en peneidos
se llama proteína coaguladora (PC) y se encuentra en el plasma. La polimerización
de PC se lleva a cabo mediante la acción de la enzima transglutaminasa (TGasa) en
presencia de calcio. La TGasa se encuentra en el interior de las células hialinas y se
libera al plasma por daño tisular o como una repuesta inmediata de los hemocitos
ante la presencia de lipopolisacáridos LPS y β-1,3-glucanos (Martín et al., 1991; Yeh
et al., 1998; Montaño-Pérez et al., 1999).
La respuesta humoral del sistema inmune del camarón
La respuesta humoral es un mecanismo capaz de inhibir el crecimiento
bacteriano en plasma, de inhibir la actividad enzimática y de liberar sustancias
causantes de lisis celular, aglutininas y precipitinas (Bachére et al., 2000). Tales
sustancias son:
Péptidos antimicrobianos
Los péptidos antimicrobianos son proteínas que actúan como antibióticos
endógenos y son considerados como unos de los principales elementos de la
inmunidad innata (Destoumieux et al.,2000). En particular, en muchos estudios se
han caracterizado péptidos antimicrobianos que matan o inhiben el crecimiento de
microorganismos (Destoumieux et al., 2000). Hasta la fecha, se han descrito una
amplia variedad de péptidos antimicrobianos, los cuales se han clasificado
basándose en sus secuencias de aminoácidos, en sus estructuras secundarias y sus
similitudes funcionales (Bulet et al., 1999).
Los péptidos antimicrobianos son producidos en células fagocíticas de
vertebrados, invertebrados y tunicados. El modo de acción de los péptidos
antimicrobianos en la mayoría de los casos es perforar las membranas microbianas,
mientras que otros péptidos interrumpen la biosíntesis de membrana, finalizando en
una muerte celular (Destoumieux et al. 2000).
En camarón blanco (L. vannamei), se han caracterizado tres péptidos
antimicrobianos clasificados como peneidinas (Destoumieux et al., 1997). Se ha
13
comprobado que las células hialinas pueden secretar penaeidinas al plasma tal y
como lo hacen las células del cuerpo graso en insectos (Meister et al., 1997). Al
demostrar que los hemocitos son el origen de producción y almacenamiento de estos
péptidos, se sugiere que su presencia en el plasma de camarón es el resultado de su
secreción o liberación al degranular los hemocitos. Esto sucede como respuesta al
estrés o resultado de una estimulación (Bachére et al., 2000).
Las peneidinas son activas contra hongos y bacterias Gram positivas
(Destoumieux et al., 1997; Wang et al., 1999) y además actúan como opsoninas
contra bacterias Gram negativas (Muñoz et al., 2002). Las peneidinas son
mayormente sintetizadas en los hemocitos, donde ellas son continuamente
procesadas y almacenadas; y en tal caso almacenadas dentro de los gránulos
citoplasmáticos (Destoumieux et al., 2000).
Enzimas hidrolíticas
Dentro de los hemocitos, existen diversas enzimas hidrolíticas con actividad
de proteasas, glucosidasas, fosfatasas, lipasas y esterasas indicativas de la
presencia de lisosomas (López et al., 1997; Peraza-Gómez et al., 2011; Flores-
Miranda et al., 2011).
Las enzimas lisosomales participan en la muerte y degradación de
microorganismos y partículas dentro y fuera de los hemocitos (Carajaraville et al.,
1995) ya que en algunos casos son liberadas de la célula al plasma u otros tejidos
donde modifican la conformación molecular de la superficie celular de
microorganismos patógenos, favoreciendo el reconocimiento y fagocitosis (Cheng,
1983). A su vez las enzimas lisosomales participan en la fagocitosis matando y
degradando partículas fagocitadas y en algunos casos degradan partículas invasoras
(Cheng, 1992).
Lisozima
Es una enzima lisosomal presente en todos los organismos vivos, asociada
con el sistema de defensa y con el sistema digestivo, donde tiene como principal
función la degradación de bacterias (Viana y Raa, 1992). Ya que actúa contra los
agentes infecciosos, principalmente atacando a los mucopolisacáridos presentes en
14
la pared celular de bacterias Gram negativas (Lie et al., 1989), algunas otras
lisozimas presentan actividad esterasa o quitinasa (Viana y Raa, 1992).
Lectinas
Son proteínas no enzimáticas o glicoproteínas de amplia distribución, con la
capacidad de reconocer en forma específica una gran variedad de carbohidratos. Las
lectinas de invertebrados son consideradas como moléculas de reconocimiento
primitivas (Nappi y Ottaviani, 2000). Ya que pueden reconocer a algunos
microorganismos, como bacterias Gram negativas , debido a que poseen en su
pared celular carbohidratos; también las lectinas pueden inducir la aglutinación de
estos microorganismos e igualmente pueden dirigir otros procesos celulares como la
fagocitosis (Bayne, 1990).
Las lectinas también presentan propiedades de opsonisación lo que permite a
los hemocitos fagocitar algunos microorganismos que son reconocidos (Vasta, 1999).
Se ha observado que algunas lectinas endógenas de invertebrados promueven la
activación del sistema proFO (Ratcliffe et al., 1991)
Se ha identificado la presencia de lectinas en la hemolinfa de varios
crustáceos tanto en la membrana de los hemocitos como en las de gránulos
citoplasmáticos, con características estructurales y especificidad idéntica a la de las
lectinas séricas, por lo que se cree que las lectinas son sintetizadas por los
hemocitos y posteriormente liberadas al hemocele (Sierra et al., 1999).
Peroxidasa
La actividad de la peroxidasa, presente en crustáceos (Sritunyalucksana et al.,
2001) se asocia con una molécula de adhesión llamada peroxinectina. La
peroxinectina actúa como una opsonina, como un factor que promueve la
desgranulación y la encapsulación, asi como actividad de peroxidasa y de adhesión
celular. El aislamiento a partir de hemocitos de una superóxido dismutasa intracelular
(SOD) en asociación con peroxinectina sugiere que la peroxinectina puede producir
ácido hipohálico a partir del peróxido de hidrógeno (producido por la SOD) y, como
15
consecuencia,puede funcionar como un sistema eficiente de ataque microbicida
contra microorganismos patógenos invasores (Sritunyalucksana et al., 2001).
Radical anión superóxido
Cuando una partícula extraña logra pasar al interior de un organismo y es
reconocida por sus células de defensa, esta partícula es fagocitada. El anión
superóxido se produce durante el proceso de fagocitosis en los hemocitos teniendo
efectos oxidantes bactericidas (Muñóz et al., 2000).
Genes relacionados con la respuesta inmune
La expresión de genes relacionados con el sistema inmune en el camarón
blanco como profenoloxidasa (proFe), transglutaminasa (TG), crustina (CR),
peneidina 3a (PEN), lisozima (LIZ) y superóxido dismutasa (SD)] en L. vannamei,
proporciona información importante sobre la activación del sistema inmune y su
modulación siendo una guía para la toma de muestras en tejidos u órganos (Wang et
al., 2007).
16
2. ANTECEDENTES
En los camarones peneidos, se han realizado importantes estudios sobre el uso
de probióticos en los cultivos larvarios, de juveniles y adultos.
En el año 2005, Ramírez-Toro realizó uno de los estudios más completos sobre
la actividad probiótica de BAL en larvas y juveniles de L. vannamei. En su ensayo de
crecimiento de larvas, demostró que el alimento adicionado con BAL posee una
ligera ventaja con respecto al alimento solo. Realizó también un ensayo de inhibición
de 14 patógenos, con BAL y diferentes antibióticos, demostrando que las BAL
pueden competir fácilmente con el uso de antibióticos en la acuacultura. Observó
también que las BAL pueden colonizar el tracto digestivo y el hepatopáncreas de los
organismos tratados, a partir del 5to día de tratamiento. Al igual que los ejemplos
anteriores, demostró que la sobrevivencia de larvas alimentadas con BAL, después
de un desafío con Vibrio harveyi, es mucho más alta (80%) que en el control (40%).
Finalmente, realizó un desafío de juveniles positivos para WSSV, con Vibrio
alginolyticus, para medir algunos parámetros del sistema inmune, y encontró que en
los organismos alimentados con BAL, no se presentaba sintomatología de vibriosis ni
mancha blanca, mientras que en los organismos del control se presentaron los
signos gruesos de ambas enfermedades (expansión de cromatóforos en branquias,
urópodos, telson, anténulas, necrosis localizada y puntos blancos en el cefalotórax).
Así mismo, observó que el número de hemocitos después de la infección, era mayor
en las larvas alimentadas con BAL, y el tiempo de coagulación de la hemolinfa en los
organismos del control, fue de 274 s, casi el triple que en los organismos del
tratamiento con BAL (88 s). Midió también las UFC/mL de V. alginolyticus en la
hemolinfa, registrando un mayor número en el control que en el tratamiento con BAL.
Wang et al., (2006) estudiaron la expresión del gen que codifica para la
profenoloxidasa en los tejidos de L. vannamei por qPCR e hibridación in situ. Su
análisis reveló que la profenoloxidasa es constitutiva principalmente en hemocitos del
camarón. Sus transcripciones se encontraron en los hemocitos, las branquias, el
corazón, órgano linfoide, estómago, intestino medio, el ciego del intestino medio
anterior y ganglionares. La expresión más baja fue encontrada en hepatopáncreas,
17
músculo y epidermis cuticular. Los resultados de las hibridaciones in situ mostraron
que las branquias, el corazón, el músculo, el tejido hematopoyético y hepatopáncreas
infiltrados por hemocitos presentaron signos positivos.
Wang et al., (2007) analizaron por RT-PCR convencional y PCR en tiempo real
(qPCR) e hibridación in situ las expresiones en tejidos de nueve genes relacionados
con el sistema inmune, en L. vannamei: la proteína de unión a β-glucanos (HDL-
BGBP), proteína de unión a lipopolisacáridos (LGBP), hemocianina, profenoloxidasa
(pFO), transglutaminasa (TGasa), crustina, penaeidinas (PEN), superóxido
dismutasa (cMnSOD) y la lisozima. Las transcripciones de los nueve genes fueron
detectados en todos los tejidos con los niveles de expresión diferencial al ser
examinados por RT-PCR y qPCR.
Rodríguez et al., (2007) probaron combinaciones de una cepa probiótica de V.
alginolyticus, y β-1,3/1,6-glucanos en Penaeus vannamei, retado con el virus de la
mancha blanca. En su investigación encontraron que la aplicación del probiótico en el
agua, durante la larvicultura (antes del estadio zoea II), y la posterior adición de los β-
1,3/1,6-glucanos, en el alimento, desde el estadio zoea II en adelante, aumentaba la
sobrevivencia de los organismos retados con WSSV. Así mismo, observaron que
después de la infección con el virus, los organismos sobrevivientes mostraban una
resistencia al mismo, una fuerte actividad antibacteriana, un aumento en el número
de hemocitos totales, y la carencia de lesiones típicas de la enfermedad de la
mancha blanca. También observaron que si se adicionan β-1,3/1,6-glucanos en la
dieta, por lo menos 15 d antes de la infección con el virus, los organismos aumentan
el nivel de proteína en plasma, la generación de O2 y el número total de hemocitos.
Burge et al., (2007) cuantificaron la expresión del gen de la lisozima, una
proteína antibacteriana producida por hemocitos de camarón, dentro de los tejidos de
L. vannamei en respuesta a un desafío con un patógeno. Los resultados sugirieron
que la lisozima se expresa en la mayoría de los hemocitos en circulación y en los
tejidos periféricos.
Partida-Arangure (2009) observó que la adición de la mezcla probada por
Peraza-Gómez (2008) en el alimento (vivos y muertos por calor), en L. vannamei,
18
causa inmunoestimulación por incremento significativo en el número total de
hemocitos.
Shockey et al., (2009) hicieron demostraron que los antimicrobianos como la
crustina en camaron blanco in vivo presentan una respuesta a la exposición a las
bacterias y hongos.
Wang et al., (2010) utilizaron PCR en tiempo real para monitorear
simultáneamente las respuestas de 12 genes de sistema inmune innato en L.
vannamei después del desafío con Vibrio harveyi, observando una regulación de la
mayoría de los genes analizados.
Flores-Miranda et al., (2011) observaron que la adición de la mezcla probada
por Peraza-Gómez et al., (2008) en el alimento, en L. vannamei, causa
inmunoestimulación en L. vannamei retado con Vibrio sinaloensis. Observaron un
incremento significativo en el número total de hemocitos cuando se alimentaron
diariamente, pero no así cuando se alimenta cada tres y seis días. Sin embargo, la
supervivencia fue significativamente mayor respecto al control cuando se alimentaron
cada 3 días. Además, demostraron la actividad de 9 enzimas hidrolíticas en el
plasma y 6 en el sobrenadante de lisado de hemocitos.
Peraza-Gómez et al., (2011) evaluaron el efecto de una mezcla de tres plantas
medicinales, dos de ellas comerciales (VPH® y HSV®), junto con albahaca morada
silvestre, y una mezcla probiótica (BAL y una levadura) contra el virus de la mancha
blanca, en L. vannamei. Los autores observaron que la adición de la mezcla
probiótica en el alimento, aumentaba la sobrevivencia de los organismos ante el
virus, y disminuía la prevalencia de organismos infectados con WSSVV. En los
camarones sobrevivientes, tratados con bacterias, aumentó el número total de
hemocitos y dos enzimas lisosomales.
19
3. JUSTIFICACIÓN
Las enfermedades en acuicultura provocan anualmente pérdidas millonarias,
por lo que la prevención y control acaparan la mayor atención. Gran parte de las
enfermedades son causadas por virus y bacterias. Por ejemplo, el virus de la mancha
blanca (WSSV) ha registrado graves pérdidas en casi todas las áreas de cultivo de
camarón en América. Por lo anterior, se han tratado de desarrollar técnicas
amigables con el ambiente, que le permitan al camarón convivir con los patógenos
sin ser afectados, o bien, técnicas que minimicen las pérdidas, una vez detectado el
virus en un cultivo.
Una buena opción, son los probióticos, que ya han mostrado buenos
resultados contra estos virus, especialmente contra el virus de la mancha blanca
(WSSV) cuando se usan como inmunoestimulantes. La inmunoestimulación se
proyecta como una alternativa de prevención a los agentes virales, ya que existen
evidencias publicadas que señalan el efecto protector de los β-glucanos y
péptidoglicanos contra este virus.
20
4. HIPÓTESIS
Las bacterias ácido lácticas y levaduras, adicionadas al alimento, provocan
una inmunoestimulación y un cambio en la expresión de genes en camarón blanco
(L. vannamei).
5. OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de bacterias ácido lácticas y levaduras en el sistema inmune
y la expresión de genes de L. vannamei.
5.1. Objetivos específicos
Determinar el efecto del alimento adicionado con microorganismos, y
administrado con diferente frecuencia, en cuatro parámetros bioquímicos del
sistema inmune de L. vannamei.
Determinar el efecto del alimento adicionado con microorganismos, y
administrado con diferente frecuencia, en la expresión de genes del sistema
inmune de L. vannamei.
21
6. METODOLOGIA
6.1. Adición de las BAL y levaduras al alimento
Se usó una mezcla inmunoestimulante (MI) compuesta por 4 bacterias
ácido lácticas (Lta2, Lta6, Lta8 y Lta10) y 1 levadura (Lt6), previamente utilizada
por Partida-Aranguré (2009) y Peraza-Gómez et al. (2011), la concentración de la
mezcla utilizada fue de 8.5 mg/kg de alimento. Los aislados (Apún-Molina et al.,
2009) se conservan en el Departamento de Acuacultura CIIDIR-IPN (Unidad
Sinaloa).Los microorganismos se cultivaron en MRS, se obtuvo el pellet por
centrifugación, se secaron a 74 °C, por 4 h, y se trituraron en un mortero. La
mezcla bacteriana en polvo se adicionó al alimento balanceado (Camaronina®,
Purina, 35%) molido previamente en una licuadora. La mezcla se rehidrató, se hizo
el pellet de nuevo en un molino de carne y se secó con un ventilador. Se preparó
alimento sin microorganismos para el tratamiento control. El alimento se preparó
para 27 d y se guardó a -20 °C.
6.2. Obtención de animales y su aclimatación
Se trajeron camarones de la granja Acuícola Cuate Machado (Guasave,
Sinaloa) a las instalaciones del Departamento de Acuacultura del CIIDIR-IPN, Unidad
Sinaloa. Para la aclimatación y posterior cultivo, se utilizaron tinas ovaladas de
plástico con una capacidad de 120 L, llenadas con 80 L de agua de mar filtrada (20
µm). En cada una de las tinas se colocaron 10 organismos. Se aclimataron los
organismos durante 5 d en el sistema de cultivo, y se alimentaron dos veces al día
(09:00 y 17:00) con Camaronina® (Purina), a razón del 5% de la masa corporal. Se
hizo un análisis de mancha blanca a 12 camarones para saber si estaban libres de
WSSV.
6.3.Extracción de ADN para la determinación de WSSV
Para la extracción de ADN se utilizó una lamela branquial por organismo, la
cual se colocó en 400 L del reactivo DNAzol MRC® (Invitrogen), se maceró con un
pistilo y se dejó incubar por 30 min. Posteriormente, se centrifugó a 13,000 x g
22
durante 10 min. Se recuperaron 300 L del sobrenadante, al cual se añadieron 400
L de etanol absoluto frío. La mezcla se dejó reposar por 15 min, agitando
periódicamente. A continuación se centrifugó a 9,000 x g durante 5 min y se desechó
el sobrenadante. La pastilla se resuspendió en 1 mL de etanol al 70% frío y se
centrifugó a 9,000 x g durante 5 min. Se decantó el sobrenadante y se extrajo con
una pipeta el líquido restante. Se colocó la muestra en un termoblock a 55 °C hasta
secar y se agregaron 30 L de agua ultrapura a 55 °C. Finalmente, se agitó la
muestra en un agitador vortex, se centrifugó a 9,000 x g durante 30 s y se almacenó
a -20 °C.
6.4. PCR para WSSV
La detección final de WSSV en los organismos se realizó mediante una
PCR sencilla y una PCR anidada. Los oligonucleótidos utilizados en la PCR sencilla
fueron: WSSV1:5’-ATC ATG GCT GCT TCA CAG AC-3’ y WSSV2:5’-GGC TGG AGA
GGA CAA GAC AT-3’. Los oligonucleótidos utilizados en la PCR anidada fueron:
WSSV1 in (sentido) 5’-TCT TCA TCA GAT GCT ACT GC 3’ y WSSV2 in
(contrasentido) 5’-TAA CGC TAT CCA GTA TCA CG 3’. (Kimura et al., 1996). Los
dos pares de oligonucleótidos amplifican un fragmento de 982 pb y 570 pb,
respectivamente. La mezcla de reacción se realizó en tubos Eppendorf de 0.2 mL e
incluyó18.75 µL de H2O; 2.5 µL de búfer de reacción 10X (Bioline); 1.0 µL de
MgCl2(50 mM; Bioline); 0.5 µL de dNTPs (100 µM; Bioline); 0.5 µL de cada oligo (10
mM cada uno; Sigma-Genosys); 0.25 µL de Taq polimerasa (5 U/µL; Bioline) y 1 µL
de DNA total para un volumen total de 25 µL. La amplificación se realizó en un
termociclador Biometra (Tpersonal) usando el siguiente programa: desnaturalización
inicial a 95 °C por 4 min, 35 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C 2 min a 72 °C y una
extensión final a 72 °C, por 4 min. Los fragmentos amplificados se visualizaron
(incluido un marcador de peso molecular de 1 kb) en un gel de agarosa al 1%, teñido
con bromuro de etidio, bajo luz UV. En la PCR anidada se redujo a 45 s el tiempo de
polimerización a 72 °C.
23
6.5. Bioensayo
El bioensayo duró 25 días, se utilizaron diez camarones por tina con peso
promedio de 9.96±3.18g.Se utilizaron cuatro tratamientos por triplicado: I) Control
negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5mg/kg de alimento),diario; III)
Camaronina® + MI (8.5mg/kg de alimento), cada tres días;IV) Camaronina® + MI
(8.5mg/kg de alimento),cada seis días. La limpieza del sistema de cultivo se realizó
cada 3 días, eliminando la materia particulada del fondo por sifoneo. El volumen de
agua perdido en la limpieza, se recuperó inmediatamente. Los parámetros
fisicoquímicos: temperatura, oxígeno, salinidad y pH se midieron cada 3 días en cada
una de las tinas. Al inicio y final del bioensayo, se determinó la cantidad de nitritos,
nitratos y amonio presentes en el agua de las tinas experimentales, y en el reservorio
utilizado para los recambios de agua(Strickland y Parsons, 1972). Al final del
bioensayo, se registró la supervivencia y la prevalencia de camarones infectados
(vivos y muertos) con WSSV, mediante PCR.
6.5.1. Obtención de hemolinfa
Para determinar la expresión de los genes del sistema inmune, la actividad de
la fenoloxidasa y la peroxidasa y la concentración del anión superóxido intracelular,
se extrajo la hemolinfa de los camarones cultivados con jeringas para insulina (27G x
13 mm) de la parte ventral del camarón, justo en la zona del segundo par de
pleópodos. La jeringa se cargó con una solución isotónica para camarón y EDTA
como anticoagulante (SIC- EDTA, Na2) (NaCl 450 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM +
EDTA, Na2 10 mM, pH 7.3, 850 mOsm/kg), previamente enfriada a 4 °C (Vargas-
Albores et al., 1993), en una proporción 2:1 (2 volúmenes de SIC-EDTA por cada
volumen extraído de hemolinfa). Inmediatamente después de ser extraída la muestra
de hemolinfa, ésta se colocó en tubos Eppendorf® de 1.5 mL. Para el conteo de
hemocitos se extrajo la hemolinfa de dos camarones por tina (6 por tratamiento) en
SIC-EDTA enfriada. Cincuenta µL de hemolinfa se mezclaron con 150 µL (1:3) de
una solución de formol al 6%. El conteo se hizo individualmente en una cámara
Neubauer.
24
Para el estudio bioquímico (FO y peroxidasa) del sistema inmune se utilizó la
hemolinfa de dos camarones por tina (seis por tratamiento). Se separaron los
hemocitos del plasma centrifugando a 800 x g, por 6 min, a 4 °C. El plasma se
almacenó a -80 °C y el paquete celular se lavó con 1 mL de SIC frío. La muestra
lavada se centrifugó a 800 x g, por 6 min, a 4 °C y el sobrenadante se desechó. Al
paquete celular se adicionaron 300 µL de búfer de cacodilatos 10 mM (pH 7) y se
centrifugó a 14 000 x g, por 10 min, a 4 °C, recuperándose el sobrenadante del lisado
de hemocitos (SLH), el cual se guardó a -80 °C. Para la determinación bioquímica del
anión superóxido intracelular se utilizaron dos camarones por tina (seis por
tratamiento). Las células se separaron del plasma y se lavaron (como arriba) y se
resuspendieron en un búfer especial como se explica más adelante.
Para determinar la expresión de los genes del sistema inmune, se extrajo la
hemolinfa de tres camarones por tina (réplica) y se hizo un pool. La hemolinfa se
centrifugó a 800 x g, por 6 min, a 4 °C. El plasma se eliminó y el paquete celular
(pool de los tres camarones) se lavó con 1 mL de SIC frío. Al paquete celular se
adicionaron 1.5 mL de Trizol enfriado en hielo y se almacenó a -80 °C.
6.5.2. Extracción de ARN y RT-PCR semicuantitativa
Se utilizaron los hemocitos guardados a -80 °Cen TrizolMRC®. El ARN total
fue extraído de acuerdo al protocolo del fabricante (Invitrogen®) y guardado a -80 °C
hasta su uso en la RT-PCR. La concentración y pureza del ARN se determinó
midiendo la absorbancia a 260/280 nm en un Nanofotómetro (Nanodrop 8000,
Thermo Scientific®).
Se usó la transcriptasa reversa M-ML(Invitrogen®) para sintetizar la primera
hebra (ADNc) con el primer oligo dT20 a partir de 1µg de ARN total a 37 °C, por 50
min. El ADNc resultante en búfer TE 1x se almacenó a -20 °C para su uso en las
reacciones de PCR.La concentración del ARN y el ADNc se determinó midiendo la
absorbancia a 260/280 nm en un Nanofotómetro (Nanodrop® 8000).
Los genes(Tabla 1) profenoloxidasa (proFO), transglutaminasa (TG), crustina
(CR), peneidina 3a (PEN), lisozima (LIZ) y superóxido dismutasa (SOD) fueron
amplificados del ADNc de hemocitos (Wang et al.,2007). El gen de la -actina fue
25
usado como control en todas las reacciones de amplificación. Como el gen de la beta
actina es constitutivo se usó para normalizar la expresión de los genes de estudio. La
tabla que se inserta muestra los primers que se utilizaron en este trabajo. Se
utilizaron 100 ng de ADNc para la PCR en una reacción con volumen de 25 µL. La
amplificación se realizó en un termociclador Biometra (Whatmann®), con las
siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C por 5 min, seguido por 40
ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 s, 60°C por 1min,anillado (temperatura
variable para cada gen) y extensión a 72 °C por 1 min 30 s y una elongación final a
72 °C, por 5 min. Los productos de la PCR (25 µL) fueron visualizados en un gel de
agarosa al 1.0%, teñido con bromuro de etidio, usando un sistema de
fotodocumentación (BioRad). La cuantificación del ARNm se realizó empleando el
programa de análisis de imágenes IMAGE J® (http://rsb. info.nih.gov/ij/) que nos
permitió comparar la intensidad de la banda correspondiente al producto amplificado
de los genes de estudio con el testigo -actina, calculando la razón gen de estudio/-
actina (por triplicado).
Tabla1. Genes del sistema inmune estudiados(Wang et al., 2007).
Efectores del sistema
inmune
Secuencia del oligo (5’-3’)
Producto
(pb) -actina Sentido Contrasentido
GTGTGACGACGAAGTAGCC TGGTCGTGAAGGTGTAACCA
605
Profenoloxidasa Sentido Contrasentido
GGAATTGTTTTACTACATGCATCAGC GGAACAAGTCATCCACGAGCTT
563
Transglutaminasa Sentido Contrasentido
CAACCTGGAGGTTCACAAGC CAAAGCTCTYGGKAAATACG
535
Crustina Sentido Contrasentido
ATTCTGTGCGGCCTCTTTAC ATCGGTCGTTCTTCAGATGG
539
Peneidina 3a Sentido Contrasentido
AGCCTCACCTGCAGAGACCA AATCAGGATCRCAGKCTCTTCAC
378
Lisozima Sentido Contrasentido
TTCGGGAAGTGCGAATTCG AATGGAAACCCTTGGTGAC
475
Superóxido dismutasa Sentido Contrasentido
GAGAAGAAGTTGGCTGAGCT ATGTTGGGTCCAGAAGATGG
467
26
6.5.3. Secuenciación de genes del sistema inmune
Los productos amplificados de los genes[crustina (CR), peneidina 3a (PEN),
lisozima (LIZ), transglutaminasa (TGasa), profenoloxidasa (proFO) y superóxido
dismutasa (SOD)] fueron limpiados con el kit Wizard® SV Geland PCR Clean-Up
System(Invitrogen®). La cuantificación se realizó con el kit Quant-iT™ dsDNA HS Kit
(Invitrogen®). Los productos ya limpios se mandaron a secuenciar al CINVESTAV
Irapuato.
6.5.4. Determinación de la concentración de proteína
La concentración de proteína se determinó de acuerdo al método descrito por
Bradford (1976), utilizando albúmina de suero bovino para construir una curva
estándar. Como muestra se utilizó sobrenadante lisado de hemocitos y plasma.
6.5.5. Conteo y separación de hemocitos
El conteo de los hemocitos se realizó utilizando una cámara de Neubauer con
una retícula de 0.01 mm. Para el conteo se tomaron 50 µL de hemolinfa y se
diluyeron (1:5, v/v) en una solución de formol al 4%. A partir de esta dilución se
realizaron 2 conteos en el microscopio. Para separar los hemocitos del plasma y
medir la fenoloxidasa, la hemolinfa se centrifugó a 3,000 x g, por 3 min a 4C. El
plasma se guardó a 4C y el paquete celular se lavó con 1 mL de SIC frío. La
muestra lavada se centrifugó a 3,000 x g, por 3 min, a 4C y el sobrenadante se
desechó. Al paquete celular se adicionaron 600 µL de cacodilato de sodio (10 mM,
pH 7) enfriado en hielo y se centrifugó a 15,000 x g durante 5 min a 4C, para
romper las células y obtener el contenido celular, es decir, el sobrenadante del lisado
de hemocitos ó SLH. El SLH y el plasma se mantuvieron en hielo (4C) para los
análisis de profenoloxidasa (proFO) y fenoloxidasa (FO) y posteriormente se
congelaron a -70C para la determinación de enzimas hidrolíticas y proteína.
27
6.5.6. Medición de fenoloxidasa (plasma) y profenoloxidasa (SLH)
La medición de la proFO y la FO se realizó con la técnica descrita por
Hernández-López et al. (1996). La actividad de la FO presente en el plasma se midió
espectrofotométricamente por la formación de dopacromo a partir de L-
dihidroxifenilalanina (L-Dopa). A 50 µL de muestra, se le adicionaron 50 µL de búfer
de cacodilato 10 mM, pH 7 y 50 µL de L-Dopa(3 mg/mL en agua destilada). Se
incubó durante 10 min a temperatura ambiente (aprox. 25°C), posteriormente se le
adicionaron 800 µL de búfer de cacodilato y se determinó la absorbancia a 492 nm
en un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys 2 (Thermo Scientific®). En
todos los ensayos se utilizó cacodilato como control negativo. La proFO se determinó
activándola previamente con tripsina(0.1 mg/mL) en agua destilada) para convertirla
en FO. La actividad de la FO se midió como se describió previamente. La actividad
enzimática se expresó como unidades, donde una unidad representa el cambio en la
absorbancia por minuto por miligramo de proteína (U/min/mg de proteína). La
cantidad de proFO disponible en la muestra se calculó de la siguiente forma:
La actividad total se expresó como el cambio en la absorbancia a 492nm. La
cantidad de proFO disponible en la muestra se calculó de la siguiente forma:
FO + FO activada con tripsina = FO total
FO total - FO = proFO
6.5.7. Cuantificación del anión superóxido intracelular
El anión superóxido se cuantificó mediante la metodología de Song y Hsieh
(1994). Se tomaron 100 µL de hemolinfa de cada grupo y se centrifugaron a 800 x g,
por 5 min. Posteriormente, se descartó el sobrenadante y los hemocitos se lavaron
tres veces con Búfer SIC-EDTA y se tiñeron con 100 µL de una solución NBT (0.3%)
durante 30 min a 37 °C. La reacción de tinción se finalizó mediante la eliminación de
la solución NBT por centrifugación y la adición de 100 µL de metanol absoluto.
Después de tres lavados con metanol al 70% los hemocitos se secaron al aire
durante 30 min y luego se añadieron 120 µL de KOH más 140 µL de DMSO para
disolver el formazán citoplasmático. La densidad óptica del formazán disuelto se leyó
28
a 630 nm en un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys® 2 para comparar los
efectos de los diferentes tratamientos en la generación del anión.
6.5.8. Actividad de la peroxidasa
Se realizó la extracción de hemolinfa en búfer SIC-EDTA. Se centrifugó la
hemolinfa a 800 x g por 5 minutos (4 °C). Se guardó el plasma en tubos en hielo. Se
lavaron los hemocitos 2 veces con SIC-EDTA (300 µL) y se centrifugaron a 800 x g,
por 5 minutos, a 4 °C. Se tiró el búfer después de cada lavado. Se resuspendieron
los hemocitos en 200 µL del búfer SIC-EDTA y congelaron a -80 °C, por 30 min; se
descongelaron en hielo para hacer el análisis. Se centrifugó la muestra a 17,000 x g,
por 10 min, a 4 °C. Se obtuvo el sobrenadante del lisado de hemocitos (SLH) y se
tiraron los restos celulares. En una celda de sílice se mezclaron64µL de búfer fosfato
de potasio (H2KO4P, 0.1 M, pH 6.0); 64 µL de H2O2 (0.147 M); 128 µL de Pirogallol al
5 % (w/v) y 840 µL de agua destilada. A la mezcla se agregaron 40 µL de plasma o
SLH y se agitó vigorosamente con la misma pipeta. La absorbancia se leyó a 420 nm
después de 20 s en espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys® 2. La actividad
se expresó como las variaciones en absorbancia después de 20 s de reacción.
6.5.9. Tasa de crecimiento específico
La tasa de crecimiento específico (TCE) se calculará de la siguiente manera:
TCE = 100 (LN W2 – LN W1)/T
Donde: W2 es el peso final, W1 el peso inicial y T es el número de días de cultivo.
6.5.10. Análisis estadístico de los resultados
Los datos de crecimiento, conteo de hemocitos, FO, peroxidasa y anión
superóxido se analizaron para determinar si existen diferencias entre tratamientos
(p<0.05). Si existían diferencias entre tratamientos, se realizó una prueba de Tukey
(HSD) para identificar la naturaleza de estas diferencias (p<0.05)(Zar, 1996).Para
analizar la expresión de los genes del sistema inmune se realizó una prueba no
paramétrica de Kruskal-Wallis. Los valores de p<0.05 fueron considerados
significativamente diferentes.
29
7. RESULTADOS
7.1. Supervivencia y tasa de crecimiento específico
La supervivencia en el bioensayo fue del 100% en todos los tratamientos. No
se encontraron diferencias significativas (p>0.05). Respecto a la TCE los resultados
fueron: I) 0.96±0.09 (%/d); II) 1.06±0.10(%/d); III) 1.25±0.35(%/d); IV)
1.21±0.02(%/d).En el tratamiento III donde se alimentaron los camarones con
inmunoestimulantes cada tres días se obtuvo un mejor crecimiento (Fig. 1).
Figura 1.Tasa de crecimiento específico de camarón blanco durante el bioensayo. I)
Control negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento),
diario; III) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV)
Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican
como promedio ± DE.
7.2. Conteo total de hemocitos(CTH)
Los resultados del CTH (Fig. 2) muestran que en el tratamiento I (Control) el
número de células fue de 28.49 x 106±17.54 x 106 hemocitos/mL, en el tratamiento II
fue de 34 x 106±16.22 x 106 hemocitos/mL, en el tratamiento III fue de 40.65 x
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
I II III IV
TCE
(%/d
)
TRATAMIENTOS
30
106±19.26 x 106 hemocitos/mL, en el tratamiento IV fue de 39.12 x 106±10.55 x 106
hemocitos/mL. No hubo diferencias significativas pero se observó un mayor número
de hemocitos en los tratamientos con aditivos, especialmente en el tratamiento III
(Fig. 2).
Figura 2. Conteo total de hemocitos del bioensayo.I) Control negativo
(Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), diario; III)
Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV) Camaronina® + MI
(8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican como promedio ± DE.
7.3. Determinación de proteína
La determinación de la proteína se hizo tanto en plasma como en el SLH. El
tratamiento I (Control) presentó concentraciones promedio de 88.642±15.6y
0.527±0.1µg/µL en plasma y SLH, respectivamente. En el Tratamiento II (MI diaria)
fueron de 91.766±9.1 y 0.382±0.05µg/µL en el plasma y SLH, respectivamente. El
tratamiento III (MI c/3dias) presentó concentraciones de 102.013±6.1y
0.431±0.1µg/µL en plasma y SLH, respectivamente. En el tratamiento IV (MI
c/6días)las concentraciones fueron de 87.111±10.5 y 0.359±0.02µg/µL en plasma y
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
I II III IV
He
mo
cito
s (x
10
6)
Tratamientos
31
SLH, respectivamente. No se existieron diferencias significativas entre los
tratamientos, tanto en plasma como en el SLH (Tabla 2).
Tabla 2. Determinación de la proteína de plasma y de SLH del bioensayo. Los
valores se indican como promedio ± E.E.
TRATAMIENTOS PLASMA mg/mL SLH mg/mL
I 88.6 ± 15.6 0.52 ± 0.1
II 91.7 ± 9.1 0.38 ± 0.05
III 102 ± 6.1 0.43 ± 0.1
IV 87.1 ± 10.5 0.35 ± 0.02
7.4. Peroxidasa total de plasma y SLH
Los resultados de la actividad de la peroxidasa (Absorbancia a 420 nm) entre
los diferentes tratamientos se muestran en la figura 3:I)0.040±0.01; II) 0.06±0.02; III)
0.05±0.02; IV) 0.05±0.02.No hubo diferencias significativas entre tratamientos, sin
embargo, los tratamientos con aditivos presentaron una mayor absorbancia (Fig. 3).
Figura 3.Actividad peroxidasa total del plasma y SLH del bioensayo.I) Control
negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), diario; III)
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
I II III IV
Ab
sorb
anci
a (4
20
nm
)
Tratamientos
32
Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV4) Camaronina® + MI
(8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican como promedio ± DE.
7.5. Anión superóxido en SLH
Para evaluar la respuesta oxidativa generada en L. vannamei, se determinó la
generación de anión superóxido (Absorbancia a 630 nm).Los resultados de los 4
tratamientos fueron los siguientes: I) 1.10±0.55; II) 1.47±0.63; III) 1.74±0.61; IV)
1.45±0.29. No hubo diferencias significativas entre los tratamientos (Fig. 4).
Figura 4.Resultados del análisis de anión superóxido de SLH en el
bioensayo.I) Control negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de
alimento), diario; III) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV)
Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican
como promedio ± DE.
7.6. proFO, FO, FO total
Los resultados de la actividad de la fenoloxidasa [FO, (U/min/mg de proteína)
× 103] en el plasma mostraron que en el tratamiento IV ésta fue significativamente
mayor en comparación con los tratamientos I, II y III (p=0.0001, p=0.0001, p=0.0001,
respectivamente). Los resultados en el SLH mostraron que en el tratamiento IV la
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
I II III IVEsta
llid
o r
esp
irat
ori
o (
Ab
s. a
63
0)
nm
)
Tratamientos
33
proFO (FO) fue significativamente mayor que en el tratamiento I (p=0.001) y III
(p=0.003). La actividad total de la FO en la hemolinfa de los camarones
experimentales presentó el mismo comportamiento en el SLH (Tabla 3).
Tabla 3.Profenoloxidasa (ProFO), Fenoloxidasa (FO) y Fenoloxidasa Total
(FOtotal) en L. vannamei alimentado con inmunoestimulantes con diferente
frecuencia. Actividad expresada en U/min/mg de proteína. Los valores se indican
como promedio ± DE.
Tratamientos Profenoloxidasa
(SLH)
Fenoloxidasa
(Plasma)
Fenoloxidasa
(Total)
I 37.3±22.0b 0.119±0.03b 37.4±22.03b
II 51.3±26.0ab 0.113±0.02b 51.4±26.01ab
III 38.9±13.2b 0.138±0.03b 39.1±13.22b
IV 63.7±19.9a 0.189±0.03a 63.8±19.90a
Tratamientos: I) Control negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5
mg/kg de alimento), diario; III) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres
días; IV) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada seis días.
7.7. Análisis de la expresión de genes del sistema inmune
Los resultados muestran que los genes crustina, peneidina y superoxido
dismutasa no presentaron diferencias significativas (p>0.05) entre los tratamientos de
acuerdo a la prueba de Kruskal-Wallis. Por otro lado,en el gen de la lisozima se
observó una sobreexpresión significativadel tratamiento III respecto al control
(p=0.02). La expresión del gen de la transglutaminasa fue significativamente mayoren
el tratamiento II respecto al control (p=0.03). Por último,la expresión del gen de la
profenoloxidasa fue significativamente mayoren el tratamiento IV respecto al control
(p=0.01) (Fig. 5).
34
Figura 5. Expresión de los genes del sistema inmune de L. vannamei. I)
Control negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento),
diario; III) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV)
Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican
como promedio ± DE.
Las secuencias obtenidas de los seis genes se compararon con las
secuencias nucleotídicas reportadas en el banco genómico (GeneBank) coincidiendo
con las reportadas por Wang et al., (2007).
35
7.8. Parámetros fisicoquímicos (temperatura, oxígeno disuelto, pH, salinidad)
Los parámetros fisicoquímicos del aguase mantuvieron dentro de los
intervalos óptimos (Brock y Main, 1994)para el cultivo del camarón blanco durante los
26 días que duró el experimento(Tabla 4).
Tabla 4.Parámetros fisicoquímicos del bioensayo. Los valores se indican
como promedio ± DE.
Tratamientos
Salinidad
(‰)
O.D
(mg/L)
Temperatura
(°C) pH
I 33.5±1.1 5.6±0.4 26.1±2.4 8.4±0.3
II 34.6±1.8 5.4±0.4 25.9±2.2 8.3±0.3
III 36.3±2.1 6.1±0.3 26.0±2.4 8.4±0.3
IV
Intervalo óptimo*
36.5±1.7
15 - 35
5.8±0.5
4.0 – 10.0
26.2±2.4
23 - 30
8.4±0.2
8.1 – 9.0
* (Brock y Main, 1994).
7.9. Calidad de agua (nitritos, nitratos y amonio)
Durante el cultivo, la concentración promedio de nitritos (0.003-0.04 mg/L) fue
óptima. Los nitratosy amonio estuvieron dentro del intervalo óptimo(Tabla 5).
Tabla 5.Calidad del agua del bioensayo. Los valores se indican como
promedio ± DE.
Tratamientos Nitritos Nitratos Amonio
I 0.04±0.01 0.74±0.14 0.55±0.62
II 0.02±0.01 0.73±0.04 0.73±0.88
III 0.01±0.01 0.63±0.24 0.95±0.25 IV
Intervalo óptimo* 0.02±0.003
<0.5 0.70±0.08 0.4 – 0.8
0.87±0.16 0.1 – 1.0
* (Brock y Main, 1994)
36
8. DISCUSIÓN
Las enfermedades microbianas causan graves problemas en la acuacultura al
nivel mundial (Lo et al., 1997). En el mercado existen varios inmunoestimulantes que
pretenden fortalecer el sistema inmune de L. vannamei para que sea más resistente a
las enfermedades pero existe poco soporte científico sobre su función y la
dosis/frecuencia de aplicación (Sajeevan et al., 2009). Por lo tanto, en este trabajo se
evaluó el efecto inmunoestimulante de una mezcla microbiana compuesta por
bacterias acido lácticas y una levadura adicionadas en el alimento en juveniles de
camarón blanco, L.vannamei, alimentado con diferente frecuencia.
En el bioensayo realizado, la supervivencia fue del 100% en los cuatro
tratamientos sin encontrarse diferencias significativas en la tasa de crecimiento
específico entre éstos. Durante el experimento se mantuvieron los parámetros
fisicoquímicos y de calidad del agua dentro de los intervalos propuestos por Brock y
Main (1994) para el cultivo de camarón blanco, por lo que se puede afirmar que el
sistema de cultivo presentó las condiciones adecuadas.
Los hemocitos son responsables de la coagulación, el endurecimiento del
exoesqueleto y la eliminación de materiales extraños (Johansson y Soderhall, 1989;
Song y Hsieh, 1994).Un incremento en el número de hemocitos aumenta la respuesta
inmune de los crustáceos durante los periodos de estrés y los hace más resistentes a
las enfermedades (Truskott y White, 1990; Le Moullac et al., 1998). En este trabajo,
aunque se observó un aumento en el número de hemocitos en los tratamientos con
inmunoestimulantes, especialmente en el tratamiento III (alimentados cada 3 días con
la MI), respecto al control, no hubo diferencias significativas. Por el contrario, Peraza-
Gómez et al. (2011), en L. vannamei, obtuvieron un aumento significativo en el
número total de hemocitos (40.9 x 106 hemocitos/mL) respecto al control (25.0 x 106
hemocitos/mL) cuando administró la misma mezcla de BAL y una levadura pero
adicionadas vivas en el alimento en una concentración de 1 x 106 UFC/g de alimento.
Los autores mencionan que el aumento en el número de hemocitos pudo ser inducido
por componentes de la pared celular de la mezcla inmunoestimulante
(peptidoglucanos de las BAL y β−glucanos de la levadura). Del mismo modo, Bai et
37
al., (2010) encontraron que administrando β-glucanos con diferente frecuencia (2000
mg/kg de alimento) a L. vannamei en cultivo aumentó significativamente el número de
hemocitos respecto al control.
La actividad de la peroxidasa, presente en crustáceos se asocia con una
molécula de adhesión llamada peroxinectina (Sritunyalucksana et al., 2001). La
peroxinectina actúa como una opsonina y como un factor que promueve la
degranulación y encapsulamiento, además de tener actividad de peroxidasa y
adhesión celular. La enzima superóxido dismutasa (SOD) de hemocitos produce
peróxido de hidrógeno el cual puede ser transformado a ácido hipohálico por la
peroxinectina. Este ácido puede funcionar como microbicida contra microorganismos
invasores (Sritunyalucksana et al., 2001). En este estudio, aunque se obtuvo un
aumento en la actividad de la peroxidasa en los tratamientos con inmunoestimulantes,
especialmente en el tratamiento II (alimentados diariamente con la MI), respecto al
control, no hubo diferencias significativas. En Litopenaeus schmitti, la peroxidasa
presente en la hemolinfa es mayor dentro de los hemocitos que en el plasma (Laria et
al., 2003).
El anión superóxido se produce durante el proceso de fagocitosis en los
hemocitos y tiene actividad bactericida (Muñóz et al., 2000). La molécula es uno de
los parámetros del sistema inmune más utilizados para determinar el estado de salud
de los camarones cultivados. En este trabajo, no se encontraron diferencias
significativas entre tratamientos respecto a la concentración del radical anión
superóxido. Sin embargo, la concentración fue mayor en los tratamientos con la MI,
especialmente en el tratamiento III (alimentados cada tres días). Contrariamente,
Campa-Córdova et al. (2002) inmunoestimularon camarones (L. vannamei) con β-
glucanos y polisacáridos sulfatados. Encontraron que la generación del anión
superóxido aumentó significativamente en los camarones tratados con respecto al
control. Sin embargo, es importante recordar que en este trabajo se utilizaron los
microorganismos completos (BAL y levadura) para inmunoestimular los animales a
diferencia del trabajo mencionado donde utilizaron moléculas aisladas. De la misma
manera, Guertler et al., (2010) encontraron un aumento significativo del anión
superóxido en los hemocitos de los camarones (L. vannamei, L. schmitti y
38
Farfantepenaeus paulensis) tratados con 2 mg/mL de laminarina (β-glucano) respecto
al grupo control.
La enzima SOD cataliza el anión superóxido a peróxido de hidrógeno (Wang et
al., 2010); sin embargo, a nivel de transcripción del ARNm del gen de la SOD no hubo
un aumento significativo entre los organismos alimentados con la MI y el grupo
control. Como el anión superóxido se produce durante el proceso de fagocitosis, los
resultados a nivel bioquímico (concentración del anión superóxido en hemocitos) y
genético indican que no hubo un aumento significativo en la actividad fagocítica de los
hemocitos de L. vannamei alimentado con la MI.
El sistema profenoloxidasa es uno de los mecanismos defensivos más
importantes en crustáceos (Söderhäll y Cerenius, 1992; Sung et al., 1996). En este
trabajo, la actividad de la fenoloxidasa (SLH y Plasma) fue significativamente más alta
en el tratamiento IV (alimentados cada 6 días con la MI) respecto al grupo control. De
manera similar, Suphantharika et al., (2003) reportaron un aumento de la actividad de
la FO en camarones tigre (Penaeus monodon) cuando administraron oralmente β-
glucanos (0.2%, peso/peso). Felix et al., (2004) encontraron que la adición de la
macroalga (Sargassum wightii) en polvo en el alimento funcionó como
inmunoestimulante ya que la actividad de la FO en los animales alimentados con 10
g/kg de alimento fue significativamente mayor que en los animales del grupo control.
En el mismo tenor, la actividad de la FO en camarones blancos (L. vannamei)
alimentados con dietas conteniendo Lactobacillus plantarum vivas (107 y 1010 UFC/kg
de alimento) fue significativamente más alta a las 168 h respecto a los camarones del
grupo control (Chiu et al., 2007). En contraste, Peraza-Gómez et al., (2011), en L.
vannamei, no obtuvieron un aumento significativo en la actividad de la FO en los
organismos tratados respecto al grupo control cuando administraron la misma mezcla
de BAL y una levadura utilizadas en este trabajo pero adicionadas vivas en el
alimento en una concentración de 1 x 106 UFC/g de alimento.
La respuesta inmune innata en invertebrados se dispara cuando los
receptores que reconocen patrones moleculares (RRPM), en el hemocito o solubles
en el plasma, reconocen y se unen específicamente a los patrones moleculares
asociados a patógenos (lipopolisacáridos, β-glucanos, peptidoglucanos, ADN y ARN)
39
(Dalmo y Bøgwald, 2008; Wang et al., 2010). Cuando los hemocitos de los
camarones (L. vannamei) reconocen las moléculas en los microorganismos se
dispara una cascada de proteasas serinas lo que da como resultado la activación del
sistema profenoloxidasa (Wang et al., 2010). En este trabajo se encontró un aumento
significativo en la transcripción del ARNm dela profenoloxidasa en el tratamiento IV
(alimentados con la MI cada 6 días) respecto al grupo control. El aumento en la
expresión del gen significa que los camarones son más resistentes ante el ataque de
un posible patógeno. Es importante recalcar que los resultados a nivel genético
coinciden con los del análisis bioquímico.
Cuando los hemocitos de los camarones (L. vannamei) reconocen las
moléculas en los microorganismos se liberan varias proteínas, incluyendo la
profenoloxidasa, proteinasa serina, peroxinectina, inhibidor de proteinasas y lisozima
(Lin et al., 2010). La lisozima es una enzima hidrolítica lisosomal que pertenece al
sistema de péptidos antimicrobianos y es un componente importante del sistema de
defensa del camarón contra bacterias Gram negativas (Wang et al., 2010). En este
trabajo se hizo el análisis de la actividad de la lisozima en hemocitos dando como
resultado una sobreexpresión significativa del gen en el tratamiento III (alimentados
diariamente con la MI) respecto al control. Burge et al. (2007) hicieron un estudio
para cuantificar la expresión del gen de la lisozima en respuesta a un desafío con
Vibrio campbelli. La lisozima se expresó en la mayoría de los hemocitos en
circulación y en los tejidos.
En este trabajo, el gen de la transglutaminasa presentó una expresión
significativamente mayor en el tratamiento II (alimentados diario con la MI) en
comparación con los camarones del grupo control. La proteína de la coagulación es
un dímero plasmático que se llama proteína coaguladora (CP) y se encuentra en el
plasma en crustáceos decápodos. La polimerización de CP se lleva a cabo mediante
la acción de la enzima transglutaminasa en presencia de calcio. La transglutaminasa
se encuentra en el interior de las células hialinas del camarón y se libera al plasma
por daño tisular o como una repuesta inmediata de los hemocitos ante la presencia
de lipopolisacáridos LPS y β-1,3-glucanos (Martín et al., 1991; Yeh et al., 1998;
Montaño-Pérez et al., 1999). La transglutaminasa está implicada en la coagulación
40
de la sangre y es un mecanismo de defensa entre los invertebrados. Según Fagutao
et al., (2012), el silenciamiento génico de la transglutaminasa hace al camarón más
susceptible a infecciones bacterianas y virales; por tanto, esta enzima es un
componente esencial del sistema inmune del camarón y está implicada en la
regulación de algunos otros genes (crustina y lisozima).
En este estudio, la expresión del gen de la crustina fue igual en todos los
tratamientos, por lo que la MI no tuvo un efecto positivo en los camarones
alimentados. La crustina es un péptido antimicrobiano muy importante en los
crustáceos decápodos. Antony et al., (2010) caracterizaron la crustina en los
hemocitos del camarón tigre gigante (Penaeus monodon) a nivel molecular. Los
autores observaron una expresión diferencial del gen de la crustina en respuesta a la
administración de diversos inmunoestimulantes (levaduras y bacterias). Los
inmunoestimulantes mejoraron la producción de crustina y confieren una protección
significativa del camarón contra la infección de WSSV.
En este estudio, la expresión del gen de la peneidina 3a fue igual en todos los
tratamientos, por lo que la MI no tuvo un efecto positivo en los camarones
alimentados. Las peneidinas son una familia única de péptidos antimicrobianos que
se han encontrado solamente en camarones peneidos. Existen tres subfamilias de
peneidinas (PEN2, PEN3 y PEN4) que son muy efectivas contra bacterias Gram
positivas, pero no contra bacterias Gram negativas (Destoumieux et al., 1999;
Bachere et al., 2004; Gueguen et al., 2006; de Lorgeril et al., 2008).
41
9. CONCLUSIONES
La mezcla inmunoestimulante compuesta por bacterias acido lácticas y una
levadura incrementó significativamente la actividad de la fenoloxidasa en el
camarón blanco (L. vannamei en el estudio realizado a nivel bioquímico y
molecular.
En el análisis bioquímico de la peroxidasa y anión superoxido no se observaron
diferencias significativas entre los organismos tratados con la MI y el control.
Se observó un aumento significativo en la expresión del gen de la lisozima en
el tratamiento donde se alimentó a los camarones cada tres días con la MI
respecto al tratamiento control.
El aumento significativo de la expresión del gen de la transglutaminasa indica
que a nivel bioquímico la coagulación de hemolinfa de los animales
alimentados diariamente con la MI es más rápida que en el control; lo anterior
se debe a que en el tratamiento 2 los camarones fueron inmunoestimulados
continuamente.
La expresión delos genes crustina, peneidina y superoxido dismutasa fue igual
en todos los tratamientos.
Las secuencias obtenidas de los seis genes estudiados coinciden con las
reportadas por Wang et al.(2007) en el GeneBank.
42
10. REFERENCIAS
Aguirre, G.l. 1992. Aplicación de Probióticos en la Acuacultura. Centro de
Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR). Memorias de Primer
Simposium Internacional de Nutrición Acuícola.
Ajitha, S.; M. Sridhar; N. Sridhar; I.S.B. Singh y V. Varghese. 2004. Probiotic
effects of lactic acid bacteria against Vibrio alginolyticus in Penaeus
(Fenneropenaeus indicus(H. Milne Edwards). Asian Fisheries Science17: 71-
80.
Álvarez-Ruiz, P. 2006. Detección molecular del complejo viral WSSV, TSV e
IHHNV y análisis de su coinfección en camarón blanco (L. vannamei) de
granja en Guasave, Sinaloa. Tesis de maestría. CIIDIR-IPN, Unidad Sinaloa.
103 pp.
Amores, R.; A. Calvo; D. Martínez-Hernández y J.R. Maestre-Vera. 2004.
Probióticos. Revista Española de Quimioterapia 17: 131-139.
Andlid, T. 1995. Ecological physiology of yeasts colonizing the intestine of fish.
PhD thesis. University of Goteborg, Sweden.
Anggraeni, M.S. y L. Owens. 2000. The haemocytic origin of lymphoid organ
spheroids cells in the penaeid prawn Penaeus monodon. Diseases of Aquatic
Organisms 40: 85–92.
Antony, S.P.;I.S.B. Singh;N.S. Sudheer;S. Vrinda; P. Priyaja y R. Philip. 2010.
Molecular characterization of a crustin-like antimicrobial peptide in the giant
tiger shrimp, Penaeus monodon, and its expression profile in response to
various immunostimulants and challenge with WSSV. Immunobiology 216:
184–194.
Arala-Chávez, M. y T. Sequeira. 2000. Is there any kind of adaptive immunity
in invertebrates? Aquaculture 191: 247-258.
Bachère, E. 2000. Shrimp immunity y disease control. Aquaculture 191: 3-11.
Bachère, E.; D. Destoumieux y P. Bulet. 2000. Penaedins, antimicrobial
peptides of shrimp: A comparison whith other effectors of innate immunity.
Aquaculture 191: 71–88.
43
Bachère, E.; Y. Gueguen; M. Gonzalez; J. de Lorgeril; J. Garnier yB.
Romestand. 2004. Insights into the anti-microbial defense of marine
invertebrates: the penaeid shrimps and the oyster Crassostrea gigas. Immunol.
Rev.198:149–68.
Bai, N.; Z. Wenbing; M. Kangsen; X. Wang; W. Xu y H. Ma. 2010. Effects of
discontinuous administration of β-glucan and glycyrrhizin on the growth and
immunity of white shrimp Litopenaeus vannamei. Aquaculture 306: 218-224.
Balcázar, J.L. 2002. Uso de probióticos en acuicultura: Aspectos generales.
CIVA 2002. (http://www.civa2002.org), 877-881.
Bayne, C.J. 1990. Phagocytosis and non-self recognition in invertebrates.
BioScience 40 (10): 722- 731.
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding.
Anal. Biochem. 72: 248–54.
Brock, J. y K.L. Main. 1994. A guide to the common problems and diseases of
cultured Penaeus vannamei. World Aquaculture Society, Baton Rouge,
Louisiana, USA. 242 pp.
Bulet, P.; C. Hetru; J.L. Dimarcq y D. Hoffmann. 1999. Antimicrobial peptides
in insects; structure and function. Dev. Comp. Immunol. 23: 329-344.
Burge, E.J.; D.J. Madigan; L.E. Burnett y K.G. Burnett. 2007. Lysozyme gene
expression by hemocytes of Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei, after
injection with Vibrio. Fish Shellfish Immunol. 22: 327-339.
Campa-Córdova, A.I.;N.Y. Hernández-Saavedra; R. De Philippis yF. Ascencio.
2002. Generation of superoxide anion and SOD activity in haemocytes and
muscle of American white shrimp (Litopenaeus vannamei) as a response to
beta-glucan and sulphated polysaccharide. Fish Shellfish Immunol. 12(4): 353-
66.
Capy, P., G. Gasperi; C. Biemont y C. Bazin. 2000. Stress and transposable
elements: co-evolution or useful parasites? Heredity 85: 101– 106.
44
Carajaraville, M.P.; S.G. Pal y Y. Robledo. 1995. Light and electrón
microscopical localization of lysosomal acid hydrolases in bivalve haemocytes
by enzyme cytochemistry. Acta Histochemistry Cytochemistry 28: 409-416.
Chamberlain, G.W. 1994. Taura syndrome and China collapse caused by new
shrimp viruses. World Aquaculture 25: 22-25
Chang, C.F.; M.S. Su; H.Y. Chen; C.F. Lo; G.H. Kou y I.C. Liao. 1999. Effect of
dietary â-1,3 glucanos on resistence to white spot syndrome virus (WSSV) in
postlarval and juvenile Penaeus monodon. Dis. Aquat. Org.36: 163-168.
Chang, C.F; M.S. Su; H.Y. Chen; C.F. Lo y I.C. Liao. 1999. Effect of dietary β-
1,3-glucan on resistance to white spot syndrome virus (WSSV) in postlarval
and juvenil Penaeus monodon. Diseases of Aquatic Organisms 36: 163-168.
Cheng, T.C. 1983. The role of lysosomes in molluscan inflammation. American
Zoology 23: 129-144.
Cheng, T.C. 1992. Selective induction of release of hydrolases from
Crassostrea virginica hemocytes by certain bacteria. Journal of Invertebrate
Pathology 59: 197-200.
Chiu, C.C.; Y.K. Guu; C.H Liu; T.M. Pan y W. Cheng. 2007. Immune
responses and gene expression in white shrimp, Litopenaeus vannamei,
induced by Lactobacillus plantarum. Fish & Shellfish Immunology 23: 364-377.
Daeschel, M.A. (1989). Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for
use as food preservatives. Food Technology, 43, 164-167.
Dalmo, R.A. yJ. Bøgwald.2008.Beta-glucans as conductors of immune
symphonies. Fish Shellfish Immunol.25:384–96.
de Lorgeril, J.; Y. Gueguen; C. Goarant; E. Goyard; C. Mugnier; J. Fievet;D.
Piquemal yE. Bachère.2008. A relationship between antimicrobial peptide
gene expression and capacity of a selected shrimp line to survive a Vibrio
infection. Mol. Immnol. 5: 3438–45.
Destoumieux, D.; P. Bulet; D. Loew; A. Van Dorsselaer; J. Rodríguez y E.
Bachère. 1997. Penaeidins, a new family of antimicrobial peptides isolated
from the shrimp Penaeus vannamei (Decapoda). The Journal of Biological
Chemistry 272 (45): 28398-28406.
45
Destoumieux, D.; P. Bulet; J.M. Strub; A. Van Dorsselaer yE. Bachère. 1999.
Recombinant expression and range of activity of penaeidins, antimicrobial
peptides from penaeid shrimp. Eur. J. Biochem. 266:335–46.
Destomieux, D.; M. Muñoz, C. Cosseau, J. Rodriguez, P. Bulet, M. Comps y E.
Bachère. 2000. Penaeidins, antimicrobial peptides with chitin-binding activity,
are produced and stored in shrimp granulocytes and realesed after microbial
challenge. Journal of Cell Science 113:461-469.
Durand, S.; D.V. Lightner; J.R. Bonami y R.M. Redman. 1997. Ultrastructure y
morphogenesis of White Spot Syndrome Baculovirus (WSSV). Diseases of
Aquatic Organisms 29: 205-211.
Fagutao, F.F.; M.B.B. Maningas; H. Kondo; T. Aoki yI. Hirono.2012,
Transglutaminase regulates immune-related genes in shrimp.Fish & Shellfish
Immunology 32: 711-715.
FAO. 2002. Anuario. El estado mundial de la pesca y la acuacultura.
Felix, S.; P. Herald Robins y A. Rajeev. 2004. Inmune enhancement
assessment of dietary incorporated marine algae Sargassum wightii
(Phaeophyceae/Punctariales) in tiger shrimp Penaeus
monodon(Crustacea/Penaeidae) through prophenoloxidase (proPO)
systems.Indian Journal of Marine Sciences 33(4): 361-364.
Flegel, T.W. y T. Pasharawipas. 1998. Active viral accommodation: a new
concept for crustacean response to viral pathogens. In: Flegel, T.W. (Ed.),
Advances in Shrimp Biotechnology. National Center for Genetic Engineering
and Biotechnology, Bangkok, pp. 245– 250.
Flegel, T.W. y V. Alday-Sanz. 1998. The crisis in asian shrimp aquaculture:
current status and future needs. J. Appl. Ichthyol. 14: 269-273.
Flegel, T.W. 1997. Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus
monodon) in Thailand. World J. Microbiol. Biotechnol. 13: 433-442.
Flores-Miranda, Ma. Del C.; A. Luna-González;A.I. Campa‐Córdova; H.A.
González-Ocampo; J.A. Fierro-Coronado y B.O. Partida-Arangure. 2011.
Microbial immunostimulants reduce mortality in whiteleg shrimp (Litopenaeus
vannamei) challenged with Vibrio sinaloensis strains. Aquaculture 320: 51-55.
46
Gueguen, Y.;J. Garnier; L. Robert; M.P. Lefranc; I. Mougenot; J. de Lorgerilet
al. 2006. PenBase, the shrimp antimicrobial peptide penaeidin database:
sequencebased classification and recommended nomenclature. Dev. Comp.
Immunol. 30:283–8.
Guertler, C.; D. Dias Shleder; M.A. Barracco y L.M. Perazzolo. 2010.
Comparative study of the intracellular superoxide anion production in different
penaeid species through the NBT-reduction assay. Aquaculture Research
41(7): 1082-1088.
Guilliand, S.E. 1986. Bacterial Starter Cultures for Foods. In Bacteriocins of
Lactic Acid Bacteria. De Vuyst, L. y Vandamme, J. (eds.). CRC Press, Inc.
Boca Raton, Florida, EE.UU.
Hasson, K.; D.V. Lightner; L.L Mohney; R.M. Redman y B.M. White. 1999.
Role of lymphoid organ spheroids in chronic Taura syndrome virus (TSV)
infections in Penaeus vannamei. Diseases of Aquatic Organisms 38: 93-105.
Hernández-López, J.; T. Gollas-Galván y F. Vargas-Albores. Activation of the
prophenoloxidase system of the brown shrimp (Penaeus californiensis
Holmes). Comp. Biochem. Physiol. 113C: 61-66; 1996.
Homblad, T. y K. Söderhäll. 1999. Cell adhesion molecules and antioxidate
enzymes in a crustacean, possible role in immunity. Aquaculture 172: 111-123.
Houle, J.F.; M. Lafrance; J.O. Julien;E. Brochu y C.P.Champagne .1989.
Selection of mixed cultures for meat fermentation. J. Food Sci.54:839- 842.
Hugas, M.;M. Garriga;T. AymerichY J.M. Monfort. 1993. Biochemical
characterization of lactobacilli from dry fermented sausages. Int. J. Food
Microbiol. 18:107-113.
Jiménez, F. 1999. Programa de contingencia para la prevención de
enfermedades virales de camarones peneidos en México. Dirección General
de Acuacultura. SEMARNAP. México D.F..
Johansson, M.W. yK. Soderhall. 1989. Cellular immunity in crustaceans and
the proPO system. Parasitology Today 5: 171–176.
Johansson, M.; P. Keyser; K. Sritunyalucksana y K. Söderhäll. 2000.
Crustacean haemocytes and haematopoiesis. Aquaculture 191:45-52
47
Johnson, P.T. 1987. A review of fixed phagocytic y pinocytotic cells of
decapods crustaceans, whit remarks on hemocytes. Development
andComparative Immunology 11: 679-704.
Jory, D.E. y H.M. Dixon. 1999. Shrimp white spot virus in the hemisphere.
Aquaculture Magazine 25: 83-91.
Kimura, T.; K. Yamano; H. Nakano; K. Momoyama; M. Hiraoka y K. Inouye.
1996. Detection of penaeid rod-shaped DNAvirus (PRDV) by PCR. Fish
Pathology31: 93-98.
Klaenhammer, T.R. 1988. Bacteorocins of acid bacteria. Biochimie 70: 337-
349.
Kumar, R., S.C. Mukherjee, K.P. Prasad y A.K. Pal. 2006. Evaluationof
Bacillus subtilis as a probiotic to Indianmajor carp Labeo rohita (Ham.).
Aquaculture Research 37:1215-1221.
Laria R.; R. Silveira yM. Martínez. 2003. Actividad peroxidasa (POD) en
juveniles del camarónLitopenaeus schmitti. II Congreso Iberoamericano Virtual
de Acuicultura, CIVA 2003, pp.99-104, URL: http://www.civa2003.org
Lindgren, S. E., y W. J. Dobrogosz. 1990. Antagonist activities of lactic acid
bacteria in food and feet fermentations. FEMS Microbiology Reviews 87:149-
164.
Le Moullac,G.; M. Le Groumellec; D. Ansquer; S. Froissard; P. Levy y
Aquacop.1997. Haematological and phenoloxidase activity changes in the
shrimp Penaeus stylirostris in relation with the moult cycle; protection against
vibriosis. Fish & Shellfish Immunology 7: 227-234.
Le Moullac, G; C. Soyez; D. Saulnier; D. Ansquer;J.C. Avarre yP. Levy. 1998.
Effect of hypoxia stress on the immune response and the resistance to
vibriosis of the shrimp Penaeus stylirostris. Fish Shellfish Immunol. 8:621-9.
Lie, O.; O. Evensen; A. Sorensen y E. Froysadal. 1989. Study on lysozyme
ativity in some fish species. Diseases of Aquatic Organisms 6: 1-5.
Lightner, D.V. 1996. CD. A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic
Procedures for Diseases of Cultured Penaeid Shrimp. World Aquaculture
Society, Baton Rouge, LA, USA.
48
Lightner, D.V. y R.M. Redman. 1998. Shrimp diseases and current diagnostic
methods. Aquaculture 164: 201-220.
Lin, Y.C.; C.M. Tayag; C.L. Huang; W.C. Tsui y J.C. Chen. 2010. White shrimp
Litopenaeus vannamei that had received the hot-water extract of Spirulina
platensis showed earlier recovery in immunity and up-regulationof gene
expressions after pH stress. Fish & Shellfish Immunology 29: 1092-1098.
Lo, C.F.; J.H. Leu; C.H. Chen; S.E. Peng; Y.T. Chen; C.M. Chou; P.Y. Yeh;
C.J. Huang; H.Y. Chou; C.H. Wang y G.H. Kou. 1996. Detection of baculovirus
associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using
polymerase chain reaction. Dis. Aquat. Org. 25: 133-141.
Lo, C.F.; K.F. Lin; C.H. Ho; Y.L. Chu; C.H. Chen; P.Y. Yeh y S.E. Peng. 1997.
Detection and tissue tropism of white spot syndrome bacculo virus (WSBV) in
captured brooders of P. monodon with a special emphasis on reproductive
organs. Dis. Aquat. Org. 30: 53–72.
López, C.; M.J. Carballal; C. Azevedo y A. Villalba. 1997. Enzyme
characterization of the circulating haemocytes of the carpet shell clam,
Ruditapes decissatus (Mollusca: Bivalvia). Fish & Shellfish Immunology 7: 595-
608.
Maeda, M.; J. Kasornchandra; T. Itami; N. Suzuki; O. Henning; J.D. Albaladejo
y Y.Takashi. 1998.Effect of various treatments on white spot syndrome virus
(WSSV) from Penaeus japonicus (Japan) and P. monodon (Tahiland). Fish
Pathology 160: 19-30.
Martín, G.G.; J.E. Hose; S. Omori; C. Clong; T. Hoodbhoy y N. Mcbrell. 1991.
Localization and roles of coagulation and transglutaminase in hemolymph
coagulation in decapods crustaceans. Comparative Biochemistry and
Physiology 100B: 517-522.
Mayo, M.A. 2002a. Virus taxonomy - Houston 2002. Archives of Virology
147/5: 1071-1076.
Mayo, M.A. 2002b. A summary of taxonomic changes recently approved by
ICTV. Archives of Virology 147(8): 1655-1656.
49
Meister, M.; B. Lemaitre y J.A. Hoffman. 1997. Antimicrobial peptide defense in
Drosophila BioEssays 19: 1019-1026.
Momoyama, K.; H. Hiraoka; H. Nakano; K. Koube; Inouye y N. Oseko. 1994.
Mass mortalities of cultured kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus in Japan
in 1993: histopathological study. Fish Pathology 29: 141-148.
Montaño-Perez, K.; T. Reyes-Izquierdo y F. Vargas-Albores. 1999. El proceso
de coagulación en camarones penaeidos. Ciencia 50: 23-28.
Moriarty, D.J.W.1999. Microbial Biosystems: New Frontiers. Proceedings of
the 8th International Symposium on Microbial Ecology.
Muñoz M.; R. Cedeño;J. Rodriguez;WPW van der Knaap;E. Mialhe yE.
Bachére.2000.Measurement of reactive oxygen intermediate production in
haemocyte of thepenaeid shrimp (Penaeus vannamei). Aquaculture 191:89–
107.
Muñoz, M.; F. Vandenbulcke; D. Saulnier y E. Bachère. 2002. Expression y
distribution of penaeidin antimicrobial peptides are regulated by haemocyte
reactions in microbial challenge shrimp. European Journal of Biochemistry
269: 2678-2689.
Nakayama, T.; M. Hamamoto; T. Nakase y K. Horikoshi. 2001. Rhodotorula
lamellibrachii sp.nov., a new yeast species from a tubeworm collected at the
deep-sea floor in Sagami bay and its phylogenetic analysis. Antonie Van
Leeuwenhoek 80: 317-322.
Nappi, A.J. y E. Ottaviani. 2000. Cytotoxicity and cytotoxic molecules in
invertebrates. BioEssays 22: 469-480.
Nappi, A.J.; E.Vass; E. Frey y Y. Carton. 1995. Superoxide anion generation in
Drosophila during melanotic encapsulation of parasites. European Journal of
Cell Biology 68: 450-456.
Nunan, L.M.; B.T. Poulos y D.V. Lightner. 1998. The detection of white spot
syndrome virus (WSSV) and yellow head virus (YHV) in imported commodity
shrimp. Aquaculture 160: 19-30.
50
Ochoa, J.L. y R. Vázquez-Juárez. 2004. Las levaduras marinas como
herramienta científica y biotecnológica. Universidad y Ciencia. Número
especial I: 39-50.
OIE.2003.Enfermedadesanimales.(http://www.oie.int/esp/maladies/es
fiches.htm).
Partida-Arangure, B.O. 2009. Efecto de prebióticos y microorganismos con
potencial probiótico en el crecimiento, supervivencia y sistema inmune del
camarón blanco Litopenaeus vannamei, cultivado en condiciones
experimentales. Tesis de maestría. CIIDIR-IPN, Unidad Sinaloa. 75 pp.
Peraza-Gómez, V. 2008. Uso de plantas medicinales, bacterias ácido lácticas
y levaduras con potencial probiótico para combatir la enfermedad de la
mancha blanca en Litopenaeus vannamei, cultivado en el laboratorio. Tesis de
maestría. CIIDIR-IPN, Unidad Sinaloa. 67 pp.
Peraza-Gómez, V.; A. Luna-González, A.I. Campa-Córdova; J.A. Fierro-
Coronado; H.A. González-Ocampo y J.C. Sainz-Hernández. 2011. Dietary
microorganism and plant effects on the survival and immune response of
Litopenaeus vannamei challenged with the white spot syndrome virus.
Aquaculture Research 42: 559-570.
Perdomo-Morales, R.; V. Montero-Alejo; E. Perera; Z. Pardo-Ruiz yE. Alonso-
Jiménez. Phenoloxidase activity in the hemolymph of the spiny lobster
Panulirus argus. Fish & Shellfish Immunology23(6): 1187-1195.
Piard, J.C. y M. Desmazeud. 1991. Inhibition factors produced by lactic acid
bacteria 1. Oxigen methabolites and end products from catabolism. Lait 71:
525-541.
Piard, J.C. y M. Desmazeud. 1992. Inhibition factors produced by lactic acid
bacteria 2. Bacteriocines and other antibacterial subtances. Lait 72: 113-142
Raa, J. 1996. The use of immunostimulatory substances in fish and shellfish
farming. Reviews in Fisheries Science 4:229-288.
Ramírez-Toro, C. 2005. Uso de bacterias lácticas probióticas en la
alimentación de Litopenaeus vannamei, como inhibidoras de microorganismos
51
patógenos y estimulantes del sistema inmune. Tesis de Doctorado.
Universidad Federal de Paraná.
Ratcliffe, N.A.; J.L. Brookman y A.F. Rowley. 1991. Activation of the
prophenoloxidase cascade and initiation of nodule formation in locust by
bacterial lipopolysaccharides. Developmental and Comparative Immunology
15: 33-39.
Rodríguez, J., Y. Espinosa; F. Echeverría; G. Cárdenas; R. Román y S. Stern.
2007. Exposure to probiotics and β-1,3/1,6-glucans in larviculture modifies the
immune response of Penaeus vannamei juveniles and both the survival to
White Spot Syndrome Virus challenge and pond culture. Aquaculture 273:
405–415.
Rodríguez, J. 1996. Estado del arte de la investigación científica en
inmunología de Penaeidos”. En: Calderón J., F. Magallón, E. Andratta, R.
Sánchez (Eds). La investigación científica en Penaeidos de Iberoamérica. San
Pedro de Manglaralto-Ecuador. 37-45.
Rosa-Vélez, J. 2001. Virus de la Mancha Blanca (WSSV) y Cabeza Amarilla
(YHV), dos amenazas potenciales a los cultivos camaronicolas en México.
Panorama Acuícola6(2):18-19.
Sahul-Hameed, A.S.; M. Sarathi; R. Sudhakaran; G. Balasubramanian y S.
Syed-Musthaq. 2006. Quantitative assessment of apoptotic hemocytes in white
spot syndrome virus (WSSV)-infected penaeid shrimp, Penaeus monodon and
Penaeus indicus, by flow cytometric analysis. Aquaculture 256: 111–120.
Sajeevan, T.P.; P. Rosamma y I.S. Bright Singh. 2009. Dose/frequency: a
critical factor in the administration of glucan as immunostimulant to Indian
white shrimp, Fenneropenaeus indicus. Aquaculture 287: 248–252.
Santos-Audelo del Valle, J. 2004. Estudios Histopatológicos y Moleculares en
Camarones de las Costas del Norte de Sinaloa-Universidad de Occidente.
Tesis doctoral.
SEMARNAP (Secretaría del Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca).
Junio de 1999. Reporte de la presencia del Virus de la Mancha Blanca en
52
costas del Pacífico Mexicano. Programa Nacional de Sanidad Acuícola.
Dirección General de Acuacultura.
Shockey, J.E.; N.A. O’Leary; E. de la Vega; C.L. Browdy; P.S. Gross y J.E.
Baatz. 2009. The role of crustins in Litopenaeus vannamei in response to
infection with shrimp pathogens: an in vivo approach. Developmental and
Comparative Immunology 33: 668–673.
Sierra, C.; A. Pérez; C. Agundis; E. Zenteno y L. Vázquez. 1999. Subcellular
organization of the seric lectin in haemocytes from the freshwater prawn
Macrobrachium rosenberguii (Decapoda, Nanantia). In: Scram, F.R., von
Vaupel Klein, J.C. (Eds.), Crustaceans and the Biodiversity Crisis, Vol. I. Brill,
Leiden, pp. 961-970.
Smith, V.J. y K. Söderhäll.1983. Induction of degranulation and lysis of
hemocytes in the freswater crayfish Astacus astacus by components of the
prophenoloxidase activating system in vitro. Cell and tissue research 233: 295-
303.
Söderhäll, K. y L. Cerenius. 1992. Crustacean Inmunity. Annual Review of Fish
Diseases 1: 2-21.
Söderhäll, K.; L. Cerenius y M.W. Johansson. 1996. The Prophenoloxidase
Activating System in Invertebrates. En: K. Söderhäll, S. Iwanaga, y G. Vasta.
(editors) New directions in Invertebrate Immunology. SOS. Publications.
Massachussets, EE.UU 229- 253p.
Song, Y.L. y Y.T. Hsieh. 1994. Immunostimulation of tiger shrimp (Penaeus
monodon) hemocytes for generation of microbiocidal substances: analysis of
reactive oxygen species. Developmental and Comparative Immunology 18:
201–209.
Song, Y.L. y C.C. Huang. 1999. Application of Immunostimulants to Prevent
Diseases. Recent Advances in Marine Biotechnology 5: 173-187.
Spann, K.M.; R.A. Donaldson; J.A. Cowley y P.J. Walker. 2000. Differences in
the susceptibility of some penaeid prawn species to gill-associated virus (GAV)
infection. Dis. Aquat. Org. 42: 221– 225.
53
Sritunyalucksana K.; K. Wongsuebsantati;M.W. Johansson y K. S˛derhll.2001.
Peroxinectin, a cell adhesive protein associated with the propo system from
the black tiger shrimp, Penaeus monodon. Developmental and Comparative
Immunology 25: 353-363.
Strickland, J.D.H. y T.R. Parsons. 1972. A practical handbook of seawater
analysis. Bulletin 167 (2ª edición). Fish. Res. Bd. of Canada.
Sung, H.; Y. Yang y Y. Song. 1996. Enhancement of microbicid activity in the
tiger shrimp Penaeus monodon via immunostimulation. Journal of Crustacean
Biology 16: 278-284.
Sung, H; G. Kou y L. Song. 1994. Vibriosis resistance induced by glucan
treatment in tiger shrimp (Penaeus monodon). Fish Pathology 29:11-17.
Suphantharika, M.; P. Khunrae, P. Thanardkit y C. Verduyn. 2003. Preparation
of spent brewers yeast b-glucans with a potential application as an
immunostimulant for black tiger shrimp, Penaeus monodon. Bioresurces
Technology 88(1): 55-60.
Talbot, P. y D. Demers. 1993. Tegumental Gland of Crustacea. pp. 151-186.
En: M.N. Horst, y J.A. Freeman (editores). The Crustacean Integument.
Morphology y Biochemistry. CRC Press, Londres, Inglaterra.
Tang, K. y D. V. Lightner. 2001. Detection and quantification of infectious
hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp by real-time
PCR. Diseases of Aquatic Organisms 44: 79–85.
Truscott, R yK.N. White.1990. The influence of metal and temperature stress
on the immune system of crabs. Funct. Ecol.4:455-61.
Unzueta-Bustamante, M.L. 2000. Problemas patológicos en camarones
peneidos de importancia commercial en las ámericas. En: Memorias del III
Simposio Internacional de Acuacultura. AQUAMEXICO. Culiacán, Sinaloa,
México. 255-260 pp.
Van de Braak, C. B.; M.H. Botterblom; E.A. Huisman; J.H. Rombout y W.P.
Van der Knaap. 2002. Preliminary study on haemocyte response to white spot
syndrome virus infection in black tiger shrimp Penaeus monodon. Diseases of
Aquatic Organisms 51: 149-155.
54
Vandamme, P.; B. Pot; M. Guillis; P. De Vos; K. Kersters y J. Swings. 1996.
Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematic.
Microbiol. Rev. 60: 407-438.
Vandenbergh, P.A. 1993. Lactic acid bacteria, their metabolic products and
interference with microbial growth. FEMS Microbial. Rev.12:221-237.
Vargas, F. y G. Yepiz. 1998. Shrimp Immunity. Trends in Comparative
Biochem. Physiol. 5: 195-210.
Vargas, F.; I. Higueras; F. Jiménez; J. Hernández; T. Gollas y G. Yepiz. 1996.
Posibilidades de inmuestimulación del camarón a través del alimento. Avances
en Nutrición Acuícola III. Memorias del Tercer Simposium Internacional de
Nutrición Acuícola 433-439.
Vargas-Albores, F. 1995. Sistemas de defensa del camarón café (penaeus
californiensis). Science 46: 33-45.
Vargas-Albores, F.; P. Hinojosa-Baltazar; G. Portillo-Clark y F. Magallón-
Barajas. 1998. Influence of temperature y salinity on the yellowleg shrimp,
Penaeus californiensis (holmes), prophenoloxidase system. Aquaculture
Research 29: 549-553.
Vasta, G.R.; M. Quesenberry; H. Ahmed y N. O´Leary. 1999. C-type lectins
and galectins mediate innate and adaptive immune functions: their roles in the
complement activation pathway. Dev. Comp. Immunol. 23: 401-420.
Vaughan, E.E.; M.C. de Vries; E.G. Zoetendal; K. Ben-Amor; A.D. Akkermans
y W.M. de Vos. 2002. The intestinal LABs. Antoine Van Leeuwenhoek 82: 341-
352.
Vázquez, L.; C. Sierra; S. Juárez; C. Agundis; A. Zavala y E. Zenteno. 1998.
Mecanismos de inmunidad en crustáceos. Interciencia 23: 344-348.
Viana, M.T. y J. Raa. 1992. Lysozyme-like enzyme from the scallop Chlamys
islandica. Ciencias Marinas 18(1): 93-107.
Vidal, O.M.; C.B. Granja; F. Aranguren; J.A. Brock y M. Salazar. 2001. A
profound effect of hyperthermia on survival of Litopenaeus vannamei juveniles
infected with white spot syndrome virus. J. World Aquac. Soc. 32: 364–372.
55
Vieira, F.; F. Santiago-Pedrotti; C. Buglione-Neto; J.L. Pedreira-Mouriño; E.
Beltrame; M. Laterça-Martins; C. Ramirez y L.A. Vinatea-Arana. 2007. Lactic-
acid bacteria increase the survival of marine shrimp, Litopenaeus vannamei,
after infection with vibrio harveyi. Brazilian Journal of Oceanography
55(4):251-255.
Vlak, J. M.; J.R.Bonami; T.W. Flegel; G.H. Kou; D.V. Lightner; C.F. Lo; P.C.
Loh y P.J. Walker. 2002. Nimaviridae. A new virus family infecting aquatic
invertebrates. Poster. XII th International Congres of virology, París 2002.
Wang, D.;F. Li;S. Li;R. Wen yJ. Xiang. 2012. Expression profiles of
antimicrobial peptides (AMPs) and their regulation by Relish.Chinese Journal
of Oceanology and Limnology 30 (4): 611-619.
Wang, Y.C.;P.S. Chang;H.Y. Chen. 2007. Tissue expressions of nine genes
important to immune defence of the Pacific white shrimp Litopenaeus
vannamei. Fish & Shellfish Immunology 23: 1161-1177.
Wang, Y.C.;P.S. Chang yH.Y. Chen. 2006. Tissue distribution of
prophenoloxidase transcript in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei.
Fish &Shellfish Immunology 20: 414-418.
Wang, C.S.; K.F.J. Tang; G.H. Kou y S.N. Chen. 1997. Light and electron
microscopic evidence of white spot disease in the giant tiger shrimp, Penaeus
monodon (Fabricius), and the kuruma shrimp, Penaeus japonicus (Bate),
cultured in Taiwan. Journal of Fish Diseases 20: 323-331.
Wang, Q.; B.L.White; R.M. Redman y D.V. Lightner. 1999. Per os challenge of
Litopenaeus vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum juveniles
with six geographic isolates of white spot syndrome virus. Aquaculture 170:
179–194.
Wang, K.H.C.; C.W. Tseng; H.Y. Lin; I.T. Chen; Y.H. Chen;Y.M. Chen; T.Y.
Chen y H.L. Yang. 2010. RNAi knock-down of the Litopenaeus vannamei Toll
gene (LvToll) significantly increases mortality and reduces bacterial clearance
after challenge with Vibrio harveyi. Developmental and Comparative
Immunology 34: 49–58.
56
Yeh, M.S.; Y.L. Chen y I.H. Tsia. 1998. The Hemolymph clottable proteins of
tiger shrimp, penaeus monodon, and related species. Comparative
Biochemistry and Physiology 121B: 169-176.
Zar, J.H. 1996. Biostatistical analysis. (3a ed.). Prentice-Hall, Englewood Cliffs,
N.J. 662 pp.