Post on 19-Sep-2018
LIPASASDrs. Alcántara y Sinisterra
Biotransformations GroupFaculty of Pharmacy
Universidad Complutensewww.biotransformaciones.com
Enzimas aisladasCélulas aisladas
Liasas, transferasase isomerasas
K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 4th ed, 2000
Lipasas (acilglicerolhidrolasas E.C.3.1.1.3): actúan como catalizadores en reacciones lipolíticas (catabolismo de grasas y aceites) a través de la hidrólisis de los enlaces éster de acilgliceroles.
LIPASAS
Son activas únicamente adsorbidas sobre una interfase oleo-acuosa, “activación interfacial.”
1. Centro activo: tríada catalítica (Ser-His-Asp ó Glu)
Características comunes de las lipasas con otras serinhidrolasas:
2. Hueco oxianiónico: estabiliza el intermedio tetraédrico formado durante la catálisis enzimática a través de la formación de puentes de hidrógeno.
LIPASAS E.C. 3.1.1.1
Lipasas no especíicas.- hidrolizan todas las posiciones del triglicérido: Staphilococcus aureus, Candida rugosa
Lipasa 1,3-específicas .- conducen a 2- acil – monoglicéridos : Rhizopus arrhizus
Lipasa 2-específicas.- conducen a 1,3-diacilgliceridos : Geotrichum candidum
Catalizan la hidrólisis de esteres insolubles en agua, mediante una activación interfacial
Modelo de Verger de activación
Interfacial de las lipasas
TIPO DE LIPASA
K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 4th ed, 2000
ENANTIÓMERO RECONOCIDO
K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 4th ed, 2000
Residuos de aminoácidos en 11 lipasas mostrando la tríada catalítica, en el Hueco Oxianiónico (en cursiva) y el sitio de unión propuesto (cursiva).
Lipasa
Secuencia de consenso cercana de la Ser
nucleofila Gly-X-Ser-X-Gly
His catalítica Asp/Glu Catalítico
Hueco Oxianiónico
CVL, PCL -Gly85-His86-Ser87-Gln88-Gly89- -His285-Leu286- -Asp263- -Gly16-Leu17-
RML -Gly142-His143-Ser144-Leu145-Gly146- -His257-Leu258- -Asp203- -Gly81-Ser82-
HLL -Gly144-His145-Ser146-Leu147-Gly148- -His258-Leu259- -Asp201- -Gly82-Ser83-
PcamL -Gly143-His144-Ser145-Leu146-Gly147- -His259-Ile260- -Asp199- -Gly83-Ser84-
ROL -Gly143-His144-Ser145-Leu146-Gly147- -His257-Leu258- -Asp204- -Gly82-Thr83-
PPL -Gly150-His151-Ser152-Leu153-Gly154- -His263-Leu264- -Asp176- -Gly76-Phe77-
CAL-B Thr103-Trp104-Ser105-Gln106-Gly107- -His224-Ala225- -Asp187- -Gly39-Thr40-
CRL (lip1) -Gly207-Glu208-Ser209-Ala210-Gly211- -His449-Ser450-c -Glu341- -Gly123-Gly124-
GCL (lip II) -Gly215-Glu216-Ser217-Ala218-Gly219- -His463-Gly464- -Glu354- -Gly131-Ala132-
Asp
His
SerON NH H
O
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
SerO
C
R1
N N
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
OO
O
O H
H
R2O O-
Asp
His
SerO
C OR1
N NH
O
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
SerO
C
R1
N N
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
O H
H
HO O-
C O
R1
R2O INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1
ENZIMA ACILADA
C O
R1
R2OC O
R1
HO
R2OH
OH
H
H2O
INTERMEDIOTETRAÉDRICO #2
MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS LIPASAS
Reconocimiento de alcoholes quirales
Regla de Kazlauskas(J. Org. Chem., 1991, 56, 2656)
HO OHOH
sn-glicerol
12
3
R1
O
O O
O
R3
O
R2
O
sn-Triglicérido
12
3
Alcoholes secundarios
m LHO H
3. Tapadera:Elemento estructural diferenciador de las lipasas.Formada por una porción helicoidal anfipática.Se coloca sobre el centro activo de la enzima cuando está inactiva. Existen dos conformaciones:
Conformación cerrada o inactiva (medio acuoso)
Conformación abierta (en interfase o medio orgánico)Estructura 3D de la RML
Excepciones:Lipasas de Pseudomonas glumae, Pseudomonasaeruginosa y Candida antarctica B, fosfolipasaspancreáticas A2, y la cutinasa de Fusarium solanicarecen de tapadera. Lipasas pancreáticas de nutria y de cobaya: tapadera sin activación interfacial.Lipasa de Staphylococcus hycius: activación interfacial sólo con algunos sustratos.
Alcoholes primarios
MH
O
L
.............His His.............O
M
H
L
His .............
LM
HO His .............
LH
OM
b. Permutación H/O c. Permutación M/L d. Permutación M/Ha. Esquema general
m LHHO
m
L
H OH
Reconocimiento de ácidos quirales
1. en forma de cueva (lipasas de Rhizomucor y Rhizopus).
Clasificación de las lipasas según la geometría del centro activo (Pleiss, Chem. Phys. Lipids, 1998, 93, 67):
A B C
Representación del centro activo de las lipasas de Rhizomucor miehei y Candida rugosa. (A) Orientación lateral donde los residuos se encuentran perpendiculares a la figura y se indican por una linea continua; (B) Forma del centro activo desde una visión frontal; (C) Forma del centro activo visto desde arriba.
RML: 18 Å de longitud, 4,5 Å de anchura en la base, y 6 Å en la superficie de la proteina. La parte donde se localiza la tapadera tiene una altura de 12 Å, y al
otro lado tiene una altura de 8 Å
CRL: 22 Å de largo con un diámetro
de aproximadamente 4 Å.
2. en forma de embudo (lipasas de Candida antarctica, Pseudomonas y páncreas de mamífero y cutinasa).
3. en forma de tunel (la lipasa de Candida rugosa).
Ser 144 (catalítica)Zona de reconocimiento del ácido de la RML
Zona de reconocimiento del ácido de la CRL Ser 209 (catalítica)
Phe296
Phe296
Botta, Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1337, 302. Manetti, Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1543, 146.
Superposición de los centros de reconocimiento de los ácidos arilpropiónicos de las lipasas de RML y CRL
Phe296
Modelo cinético de resolución de una mezcla racémica
Relación de velocidades. Medida de la enantioseletividad
= E
Reacciones catalizadas por lipasas
INTERESTERIFICACIÓN
ACIDOLISIS
TRANSESTERIFICACIÓN (ALCOHOLISIS)
ESTERIFICACIÓN
R1
O
OR2+ R3 OR4
Olipasa
+O
OR4R1 R3
O
OR2
R1
O
OR2+ R3 OH
Olipasa
+O
OR2R3 R1
O
OH
R1
O
OR2HOR3+
lipasaR1
O
OR3HOR2+
R1
O
OHHOR2+
lipasaR1
O
OR2
R1
O
OR2
lipasa, H2OR1
O
OHHOR2+
HIDRÓLISIS DE ESTERES
SÍNTESIS DE PEROXIESTERES
SÍNTESIS DE AMIDAS
SÍNTESIS DE TIOESTERES
R1
O
OR2HOOR3+
lipasaR1
O
OOR3HOR2+
R1
O
OR2HSR3+
lipasaR1
O
SR3HOR2+
R1
O
OR2H2NR3+
lipasaR1
O
NHR3HOR2+
Resolución cinética de compuestos quirales a través de una estrategía hidrolítica:
Hidrólisis de ésteres racémicos con el estereocentro en la zona del alcohol (sustratos tipo I).
Resolución cinética de compuestos quirales a través de transferencia de acilo.
Resolución Cinética de racematos con lipasas
R1
CH
R2 O R3
Olipasa, H2O R1
CH
R2 OHR2CH
R3 O R3
O
+
Hidrólisis de ésteres racémicos con el estereocentro en el grupo ácido (sustratos tipo II).
R1
CH
R2 COR3 lipasa, H2O
O
R1CH
R2 COH
O
R2CH
R1 COR3
O+
R2
CH
R1 OH
lipasa G R3
O
R2CH
R1 O R3
O R2CH
R1 OHdisolv.orgánico
R2
CH
R1 COH
O
lipasa R3
disolv.orgánico
HO R2CH
R1 COH
O
R1CH
R1 COR3
O+
+
APLICACIONES
R1 R2
OH
lipasa deRh. miehei
Lipozyme IM20
disolvente orgánico+
R3
O
O
R4 R1 R2
OH
R1 R2
O+
R3
O
+HO
R4
O
R4
(R,S)
R1= Ph-, Bn-, 1-naftil, 2-naftil.R2= Me-, Et-, Pr-.
R3= Me-, Et-, Pr-, Ph-, R4= H-, Me-
(S) (R)
I. E. De FuentesTesis Doctoral, UCM, 2002
Ph Me
OH
lipasa deRh. miehei
Lipozyme IM20iPr2O
+Me
O
O
H Ph Me
OH
Ph Me
O+
Me
O
(R,S) (S) (R)REACCIÓN TEST
A. R. Alcántara y colsChem. Phys. Lipids, 1998, 93, 169
FACTORES QUE DEBEN CONTROLARSE
R1 ∗
R2
OH
O
R3 Nu
AW
1. VARIABLES CONTÍNUAS
DISOLVENTE(logP)
TEMPERATURA
AGITACIÓN
RELACIÓNMOLAR
2. VARIABLES DISCRETAS
ESTRUCTURA DEL ALCOHOL, DEL DONADOR DE ACILO, PUREZA DE LA PREPARACIÓN ENZIMÁTICA, NATURALEZA DEL SOPORTE
con un centro estereogénico, de forma que la actividad biológica en los tratamientos mencionados reside fundamentalmente en el enantiómero S presentando el isómero R efectos secundarios indeseables en algunas ocasiones.
Dentro de este grupo de fármacos, el propranolol (1-isopropilamino-3(1-naftoxi)-2-propanol) se considera el compuesto de referencia. Se ha comprobado que la actividad beta-bloqueante de su isómero S es 100 veces superior a la del isómero R. Es más, el isómero R presenta un efecto secundario como contraceptivo masculino.
ArO ∗
HN
OH
Los beta-bloqueantes constituyen el grupo más importante dentro de los fármacos adrenérgicos.Utilizados en el tratamiento de: hipertensión
arritmiasangina de pechociertos tipos de ansiedad.
Una familia de estos compuestos, muy vendidos, presentan estructura de ariloxiaminopropanol, v.g.:Sumial, atenolol etc.
APLICACIÓN PRÁCTICA
ArO ∗
HN
OH
Ar nombre
propranolol
atenolol
NH
pindolol
O
oxprenolol
Ar-OH
OCl N
,1)
2) HCl (1h, 0-5ºC)Ar
O ClOH
2.- Resolución cinética de los racematos empleando una lipasa
1.- Síntesis de los intermedios racémicos de estructura de halohidrina.
METODOLOGÍA:
I. Borreguero.Tesis Doctoral, UCM, 1999.
ArO Cl
OH O R1
OR2
lipasadisolvente orgánico
ArO (R) Cl
OH
+
Ar = 1-naftilo,1a2-naftilo,1bo-tolilo, 1cp-tolilo, 1d
1
R-1
R1 = Me, Et, Pr, -CH2Cl, -(CH2)10CH3R2 = H, Me
ArO (S) Cl
O
O
R1
S-2
OBJETIVO:
Optimizar un proceso quimioenzimático de obtención de sintones quirales para obtener estos compuestos enantioméricamente puros.
1.- Síntesis de los intermedios racémicos de estructura de halohidrina
Ar-OHO
Cl+Ar
O ClOH
ArO
O+N
ab
HCl (0-5ºC)
Ar = 1-naftilo, t = 46 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = 2-naftilo, t = 26 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = o-tolilo, t = 72 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = p-tolilo, t = 120 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%
2.- Resolución cinética de los racematos de 1 empleando una lipasa
O ClOH O
O
lipasadisolv. orgánico
O(R)
ClOH
+
1
O(S)
ClO
O
R1
S-2R-1
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900Tiempo (h)
0
10
20
30
40
50
60Conversion (%)
Lipozyme IM20
HLL
PPL
CAT. mg t (h) X (%)
Pto.13
ee1(%) Pto.1 ee3
(%) Eb EFc
HLL 106 547 30 S-(+) >99 R-(-) 32 >100 0.73
PPL 106 817 8 S-(+) 65 R-(-) 3 5 0.36
IM20 15 340 53 S-(+) >99 R-(-) 78 >100 0.71
CONDICIONES ESTANDAR: SUSTRATO 1a, AGENTE ACILANTE = ACETATO DE VINILO (R1 = Me, R2 = H), RELACIÓN MOLAR 1/3, DISOLVENTE = iso-OCTANO, T = 30ºC
2.1.- Influencia de la temperatura
0 100 200 300 400 500 600Time (h)
0
10
20
30
40
50
60
Yield (%)
4ºC
25ºC
37ºC
50ºC
60ºC
0 100 200 300 400 500 600Time (h)
0
20
40
60
80
100
Substrate´s e.e. (%)
4ºC
25ºC
37ºC
50ºC
60ºC
T (ºC) c (%)
e.e of R-2a (%) E EF
4 17
42
48
34
Tiem
po d
e reacció
n=
24 h
ora
s
39
18 18 0.88
25 59 18 0.81
37 74 20 0.80
50 43 17 0.83
60 56 27 0.88
2.2.- Influencia de logP
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Time (h)
0
10
20
30
40
50
60
Yield (%)
tricloroetano
ciclohexano
dodecano
isooctano
metilciclohexano
nonano
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Time (h)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Substrate´s e.e. (%)
tricloroetano
ciclohexano
dodecano
isooctano
metilciclohexano
nonano
disolvente logP c (%) e.e of R-2a (%) E EF
1,1,1-tricloroetano
Ciclohexano
Metilciclohexano
isooctano
Nonano 5.1 45 64 16 0.78
Tiem
po d
e reacció
n=
24
h
ora
s
2.5
dodecano
42 15 0.81
3.2
34
43
48
49
60 16 0.80
3.7 73 19 0.79
4.5 71 14 0.74
436.6 59 15 0.78
2.2.- Influencia del agente acilante
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150Time (h)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Yield (%)
acetato de vinilo
butirato de vinilo
propionato de vinilo
laurato de vinilo
anhidrido acético
cloroacetato de vinilo
acetato de isopropenilo
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150Time (h)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Substrate´s e.e. (%)
Agente acilante T(h) CONV. (%) ees (%) E EF
24 12
----
12
14
>100
>100
>100
144
0.74
----
0.72
0.74
----
----
48
24
4
6
Laurato de vinilo 6 8 >99 ----
Anhidrido acético- 14 9
Acetato de isopropenilo ----- ----
Cloroacetato de vinilo 49 69
Acetato de vinilo 59 71
Propionato de vinilo 59 >99
Butirato de vinilo 62 >99
O ClOH O
O
Lipozyme IM20isooctano
O(R)
ClOH
+
1a
O(S)
ClO
O
S-2aR-1aT = 37ºC, t = 4 h
conversión = 55%, ee1 > 99%, E = 27
O(R)
ClOH
R-1a NH2
O(S)
HN
OH
PROPRANOLOL
2.3.- Condiciones optimizadas
Desymmetization on 1,3-propranodiols
Gracia-Urdiales et al. Chem rev. 2005,105, 313-354
Syntehsis of antitumor antibiotiv(+) FR900482. The synthesis of (S)-8 is the key step
Synthesis of pheromone from Dannau chrysippus
Desymmetrization of different 1,3-propanodiols- 2-substituted
Takabe et al. Tetrahedron: Asymmetry 2000, 13, 1967
The resolution was performed with Pseudomonas cepaciaLipase The yields were moderated and the presence ofDiacetates was noticeable in many cases.
The enantiopreference is related to the structure of theAmide group.
Contrarily, the nature of the alkyl group of the acetate (R3 ) wasnot very important
Desymmeetrization of different 1,3-propanodiols- 2-substituted
Takabe et al. Tetrahedron: Asymmetry 2000, 13, 1967
Pro-S recognitionThe interaction is controlled by the interaction of H-N with the amideGroup from the active site.
Pro-R recognitionThe N,N-disubstituted amides cannotInteract by H-bondingTherefore the R-recognition isFavored
In both cases the primary alcoholInteracts with the acylated serine
Desymmeetrization of of meso-compounds with quaternary center.It is a challenge for synthetic organic chemists.
Fukuyama et al. (JACS 2003, 125, 4048) reported the synthesis of Leutroducsin ( stimulant of growing cell colonies).The synthesis of the key intermediate (19) is performed with lipase from C. rugosa.
The monoester 21 (key intermediate in Vitamine-K analogous) is prepared using CALB.Chenevert et al. Tetrahedron Lett. 2002,43,7971
Synthesis of nuleoside prodrugs
NH
N
N
O
NH2N
O
OHOH
HHHH
HO
CH3
NH
N
N
O
NH2N
O
OHOH
HHHH
O
CH3
O
H3C
Vinyl acetateCandida antarct ica lipase
99% yield
Anti-leukaemic produg- Glxaxo-SmithKline
Raso & Voss Appl.Ctatal. A: Chemical 221,145-158(2001)
Enzymatic alcoxycarbonylation
Enzymatic synthesis of amides catalyzed by lipasesNon conventional synthesis
ALCÁNTARA et al. : Candida rugosa lipase-catalysed resolution of racemic acids, esters or amines in slightly hydrated organic media. Food Technol. Biotechnol. 2004 , 42, pp. 343-354