Post on 11-Jan-2016
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P C R
ANA PATRICIA FIGUEROA
SUSANA JARQUÍN
ALONZO MEJÍA
NATHALIE MORALES
ALBA VARGAS
WENDY MAYORGA
Reacción en Cadena de la Polimerasa
PCR
Fundamentada en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN.
Obtiene un gran número de copias de un fragmento de ADN particular.
Técnica de Biología Molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis.
Se utiliza para obtener suficiente ADN que permita detectar el número de repeticiones en varios loci.
S T R
Tipos de PCR
PCR anidada
PCR múltiple PCR in situ
PCR con transcriptasa inversa
PCR en tiempo
real
Componentes
dNTPS Tampón de reacción Cebadores
ADN Polimerasa
sMolde
TermocicladorAparato usado en Biología Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para la amplificación de diversas hebras de ADN.
Modelo más común es un bloque de resistencia eléctrica que distribuye una temperatura homogénea a través de una placa durante tiempos programables, durante los cuales ocurre la desnaturalización, hibridación y extensión de una molécula de ADN.
Etapas
Desnaturalización• Separación de
las dos cadenas de ADN
Hibridación• Unión del
cebador a la secuencia complementaria en el ADN molde
Extensión• Síntesis de la
cadena complementaria por medio de la ADN polimerasa
Cebadores
Oligonucleótidos complementarios a la secuencia que se desea amplificar.
Se requieren para iniciar la replicación
Se utilizan dos en cada reacción.
Mayor longitud y temperatura
= más específica
Temperatura de Anillado
4(G+C) + 2(A+T)
Diseño de Cebadores
Contenido de C y G debe ser aproximadamente 50%.
Evitar zonas con largas secuencias de una sola
base.
Evitar complementariedad entre los cebadores.
Temperatura de hibridación de los cebadores debe ser
similar.
Secuencia debe ser única.
Formación de dímeros
ADN Polimerasa
Enzimas que intervienen en la replicación del ADN.
Capaces de adicionar dNTPS a partir de la región 3’ de un
cebador y copiar una secuencia molde.
Utilización de diferentes polimerasas en la técnica de PCR.
Método para copiar trozos de ADN.
Ciclos y temperaturas
Desnaturalización (95°C)
Extensión (72°C)
Anillado (55°C-60°C)
Principio Caliente
Métodos que permiten comenzar un PCR sólo cuando la temperatura de
annealing padeció.
Contaminación• Mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar
contaminados con preparados anteriores de DNA, o con fragmentos de restricción purificados .
• Contaminación cruzada entre muestras �
• Productos de amplificaciones anteriores por PCR
¿Control negativo?Muestra que incluye los componentes de la reacción, excepto el ADN.
Se usa para comprobar que ninguno de los componentes de la reacción está contaminado con ADN de otra procedencia y que no se han producido errores de manejo que hayan provocado la contaminación cruzada entre muestras.
Método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
E l e c t r o f o r e s i s
Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta
Se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular
L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este termino se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas
Generalidades Método de separación de moléculas según la
movilidad de éstas en un campo eléctrico.
Puede ser:
• Sobre la superficie hidratada de un soporte sólido
• A través de una matriz prosa
• En disolución
Es frecuentemente utilizado para analizar fragmentos de ADN generados por enzimas de restricción PCR.
FACTORES
Campo Eléctrico•Es generado por la fuente de corriente
• se encarga de asimilar las proteínas cargadas negativamente gracias al SDC desde la parte superior a la inferior del gel, produciendo su separación por tamaño
Muestra
Se colocan en el lugar indicado gracias a la separación que realizan los pocillos
Deben ser preparadas en presencia del tampón de carga
Tampón
Mezcla en concentraciones relativamente elevadas de un ácido débil y su base conjugada.
Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolución frente a la adición de cantidades relativamente pequeñas de ácidos o bases fuertes.
Componentes habituales
Tris
EDTA
SDS
Glicerol
β-mercaptoetanol
Soporte En el se fijan los cristales superior
y separador para la preparación de la muestra.
Los cristales deben ser situados a una distancia considerable para que se pueda añadir la mezcla.
Gel Agarosa1. Preparación del molde
2. Preparación del gel de agarosa
a) Vaso de 100ml
b) Tampon de electroforesis y agarosa
c) Calentar
d) Enfriar
e) Dejar que se solidifique
Preparación del gel para electroforesis
1. Sacar los topes2. Colocar el gel en la cámara de
electroforesis3. Llenar la cámara4. Sacar el peine que ha formado los
pocillos5. Proceder la siempre del gel y llevar a
cabo la electroforesis
Proceso de Electroforesis
Colocar ADN en los
pocillos
Se aplica corriente eléctrica
DNA agrupado
Se añade Bromuro de Etidio
Características
Electrodo negativo
Electrodo positivo
Velocidad de migración inversamente proporcional al peso de la molécula
Si 2 componentes tienen la misma masa, las separaciones serán incompletas = bandas solapadas
Bandas en diferentes calles pero misma altura tienen similar peso molecular
¿Cómo se comparan las bandas de ADN?
Se investiga si la posición de una de las bandas de cada marcador genético del hijo coincide con una de las bandas del mismo marcador genético del supuesto padre.
Se asignan las bandas de DNA de origen materno del genotipo del
hijo.
Bandas deben coincidir con la mitas de las bandas del DNA del padre
Ventajas del PCR
A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.
El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.
Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc.
Desventajas del PCR
Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.
Se necesitan “ primers ” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN.
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro).
Avances en la cienciaGracias a esta técnica se han podido realizar estudios genéticos en cualquier campo de la ciencia.
• Se utiliza diariamente para la identificación de cadáveres.
• En el estudio de escenas del crimen para buscar rastros del culpable.
• También se emplea en la biología, para identificar cadenas genéticas de plantas, animales o, sobre todo, microorganismos.
¡Gracias por su atención!