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TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS DE RESIDUOS INHIBIDORES
Mª Teresa Fernández Fernández
Laboratorio de Salud Pública de Lugo
Conselleria de Sanidade
Xornada técnica do leite
12 de Noviembre de 2007
Residuos y
Salud pública
Xornada técnica do leite
12 de Noviembre de 2007
¿Cuál es la justificación del control de residuos en leche?
EFECTOS
TOXICOLÓGICOS
v Resistencias microbianas
v Alergias
v Toxicidad
v Efectos sobre la flora intestinal
Residuos y
Industria Láctea
EFECTOS TECNOLÓGICO ECONÓMICOS
qInhibición bacteriana:Efectos sobre las características organolépticas del productoqEnmascaramiento de los controles microbiológicos: fallan los controlesqTermorresistencia:superan las barreras térmicas (pasteurización,UHT,etc.)
Residuos y
Productor
EFECTOS
ECONÓMICOS
Ø Sanciones
Ø Pago por calidad
Ø Descarte de leche
§ Contaminación cisterna-silo
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¿Cuáles son los posibles residuos y contaminantes en la leche?
vResiduos de medicamentos veterinarios
vSustancias anabolizantes
vDetergentes y desinfectantes.
vPesticidas
vMicotoxinas
vPCBs, Dioxinas, metales pesados,etc.
DEFINICIONES
(Codex Alimentarius)
Define los residuos de medicamentos veterinarioscomo los productos originales y sus metabolitos en cualquier porción comestible del producto animal
(P.N.I.R.)Residuo de:
•Sustancias de acción farmacológica
•Sus productos de transformación
•Otras sustancias
que se transmitan a los productos animales y que
puedan resultar nocivos para la salud humana
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Residuo
DEFINICIONES
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Promotor de crecimiento
Sustancia que en sí misma proporciona el crecimiento del animal
(Clembuterol,Hormonas)
Precursor de crecimiento
Sustancia que favorece las condiciones del entorno del animal para favorecer su
crecimiento
(antibióticos , vitaminas,tranquilizantes,etc.)
LMR = Limite Máximo de Residuo(µg/kg = ppb)
Es el contenido de un determinado producto veterinario que se considera
admisible en un producto alimenticio; este límite se basará en el tipo y en la
cantidad de residuos que se consideren no constituyen ningún riesgo
toxicológico para la salud humana
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DEFINICIONES
• Antibiótico: (1942) compuestos químicos de origen microbiano ,con actividadantimicrobiana.
• Quimioterápico:compuestos de síntesis (distinción con los de origen natural)
• Antibacteriano: Para distinguir losantimicrobianos activos frente a bacterias de los activos frente a hongos (Antifúngicos).
• Inhibidor: Se denominan así a los residuos de antibióticos detectados mediante técnicas microbiológicas
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12 de Noviembre de 2007
DEFINICIONES
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Normativa sobre residuos de medicamentos veterinarios
(Reglamento UE 2377/90)
ØAnexo I: Lista de sustancias farmacológicas activas, cuyos LMR se han fijado definitivamente (medicamentos con limitación de uso)
ØAnexo II: Lista de sustancias que no están sujetas a LMR (medicamentos de libre uso)
ØAnexo III: Lista de sustancias para las que se han fijado LMR provisionales (medicamentos con limitación de uso provisional)
ØAnexo IV: Lista de sustancias para las que no se pueden establecer LMR (medicamentos prohibidos)
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Grupos antibióticos
Macrólidos y LincosaminasEpiramicina
Kitasamicina
Lincomicinsa
Tilosina
etc.
TetraciclinasClortetraciclina
Oxitetraciclina
Tetraciclina
Doxiciclina
Rolitetraciclina
:
PenicilinasAmoxicilina
Ampicilina
Bencilpenicilina
Cloxacilina
Oxacilina,etc.
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Grupos antibióticos
CefalosporinasCefalotina
Cefaloxina
Cefoperazona
Cefuroxima
Cefazolina
etc.
NitrofuranosFuraltadona
Furazolidona
AminoglucósidosEspectinomicina
Estreptomicina
Kanamicina
Gentamicina
etc.
:
QuinolonasCirofloxacinoEnrofloxainoAc Nalidíxico
AnfenicolesCloranfenicol
Tianfenicol
Fluorfenicol.
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Grupos antibióticos
PeptídicosBacitracina
Colistina
Polimixina B
Avoparcina
Virgiamicina
Gramicidina
IonóforosMonensina
Salinomicina Lasalocid
OtrosNovoviocina
A.Fusidico
Trimetroprima
Dimetridazol
Griseofulvina
Nistatina
Carbadox
Ronidazol
Metronidazol
Dapsona
etc.
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Propiedades de los métodos de detección
ØSelectividadØLímites de detecciónØSensibilidad para los LMRsØReproducibilidad, Precisión, Exactitud
Falsos Positivos
Falsos Negativos
OBJETIVO DEL MÉTODO DE CONTROL
ELEGIREMOS EL MÉTODO DE DETECCIÓN
¿Cuál sería el método ideal?ü Detecta todos los residuos posibles
üCon sensibilidad alrededor de los LMRs
üPocos resultados falsos negativos(protección del consumidor)
üPocos resultados falsos positivos (protección del productor y del comercio nacional e internacional)
üEconómico y de fácil usoXornada técnica do leite
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ESTRATEGÍA ANALÍTICA
Técnicas de
Cribado
o de
Screening
Técnicas
de
Post-Cribado
Técnicas
de
Confirmación
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Propiedades de los métodos de detección: Fundamento
Técnicas de
Cribado
o de
Screening
Microbiológicas
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Propiedades de los métodos de detección: Fundamento
Técnicas
de
Post-Cribado
Ø Inhibición microbiana: Post-Cribado
Ø HPTLC(Cromatografía de capa fina)
Ø Inmuno-enzimáticos:*Inmunológicos (ELISA, RIA,etc.).*Enzymáticos (Pezym)
Ø De Unión a Receptores:*Receptores microbiológicos(Charm).
*Receptores proteicos (Beta-star,Snap)
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Propiedades de los métodos de detección: Fundamento Cromatografía
Técnicas
de
Confirmación
Ø HPLC/UVØ HPLC/DADØ HPLC/FLUOØ HPLC/MS-MSØ GSØ GS/MSØ etc.
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TÉCNICAS MICROBIOLÓGICASDE
Screening o Cribado
Todas se basan en el cultivo de un microorganismo enagar que tiene resistencia o sensibilidad frente a un antibiótico o grupos antibióticos determinados que seecuentran como residuos en los tejidos de origen animal o en sus productos .
Para conseguir un amplio espectro de identificación , se juega con la siembra en agares de distinta composición ypH.
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TÉCNICAS MICROBIOLÓGICASde Screening o Cribado
qTécnica de Cribado de residuos antibacterianos con 5 placas
qTécnica Stop (“Swab test on premises”)
qTécnica STAR (“screening test for antibiotic residues”)
qTécnica de cribado de residuos antibacterianos en leche por inhibiciónde B. stearotermóphilus:
* En placa.
* Delvotest.
* Eclipse 50
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Técnica de Cribado de residuos antibacterianos con 5 placas
Disco control Estreptomicina
0,5 µg/disco
Disco control Estreptomicina
0,5 µg/disco
Disco controlSulfadimidina0,5 µg/disco
Disco controlBencilpenicilina
0,01 UI /disco
Disco controlCiprofloxacino0,003 µg/disco
Ph 830ml de
agar
+
Kocuria rhizophila
37ºC
Ph 6
30ml deagar
+
B. subtilis
30ºC
DST(pH7,4)
30ml de agar+
solución deTrimetoprima
+
B. subtilis
30ºC
Ph 8
30ml deagar
+
B. subtilis
30ºC
DST ó PH 8
30ml deagar
+
E. coli
30ºC
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Leche cruda
En baño a 80ºC
durante 10 mit
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Medida con calibre de los halos de inhibición
Positivas las muestras conhalos
mayores ó iguales 2mm
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Técnica Stop (“Swab test on premises”)
Johnston et al. 1981
Utilizada por su sencillez en mataderos sin necesidad de remitir muestras al laboratorio en EEUU y países de
influencia
Agar nº 5
+
B. subtilis
Disco control de Neomicina
(V. Calderón)
Técnica STAR (“screening test for antibiotic residues”)
Fué una de las propuestas del laboratorio Comunitario de Referencia en atención a las necesidades de los planes de
residuos
Tilosina37ºCM. LuteusMedio pH 8
Ciprofloxacino37ºCE. coli Medio pH 8
Estreptomicina30ºCB. subtilisMedio pH 7,2
Sulfadimidina55ºCB. stearotermóphilus
Medio DSTpH 7,4
+Trimetoprima
Clortetraciclina30ºCB. cereusMedio pH 6
DISCO CONTROL
TªMICROORGANISMOMEDIO
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Técnica de Post-cribadode residuos de antibióticos por
bioensayo múltiple
Es una técnica con la que se pretende identificar el grupo de antibióticosal que podría pertenecer el residuo
Se utiliza desde hace tiempo en EEUU y su puesta a punto para el PNIR fué a cargo del Centro Nacional de Referencia de Majadahonda (V. Calderón)
40 mg/ ml200 UI/ml E. coli CECT 4201Nº 7,4K
NO200 UI/ml E. coli CECT 4201Nº 7,4Q
40 mg/ ml200 UI/ml S. epidermidis CECT 231Nº 11?
NO200 UI/ml S. epidermidis CECT 231Nº 11G
NO200 UI/ml Kocuria rhizophila CECT4093Nº11F
NO200 UI/mlKocuria rhizophila CECT 4070Nº 11E
40 mg/ ml200 UI/mlB. subtilis CECT 356Nº 5d
NO200 UI/ml B. subtilis CECT 356Nº 5D
NO200 UI/mlKocuria rhizophila CECT 4070Nº 2C
NONOKocuria rhizophila CECT 4070Nº 2B
NO200 UI/mlB. cereus CECT 5314Nº 8a
NO200 UI/ml B. cereus CECT 193Nº 8A
PLACA MEDIO MICROORGANISMO PENICILASA HEPARINA
PREPARACIÓN DE PLACAS
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cilindros de 8 mm de Ø externo y 10
mm de altura
Leche cruda
A 80º C durante 10 mit
para inactivar los posibles inhibidores naturales
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Técnica de Post-cribado de residuos de antibióticos por bioensayo múltiple
Lectura de resultadosØPlacas A y a: Detección de Tetraciclinas
ØPlaca B y C: Detección de ß-lactámicos
ØPlaca D: Detección de aminoglucósidos(estreptomicina)
ØPlacas E y F : Detección de macrólidos (eritromicina)
ØPlaca G: Detección de aminoglucósidos (Neomicinay Gentamicina)
ØPlaca Q: Detección de Quinolonas
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Técnica de Post-cribado de residuos de antibióticos por bioensayo múltiple
Informe de resultados
Si no se puede interpretar el resultado Inhibidor no identificable
Si no se detecta el halo Negativo
Se detecta una inhibición Actividad antibacteriana concordante con el grupo....
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Agar Nº 2 adicionado con 1 g de D(+) Glucosa+Púrpura de Bromocresol
+suspensión de esporas B. stearothermophilus
+solución de Trimetoprima
Técnica de cribado de residuos antibacterianos en leche porinhibiciónde B. stearotermóphilus en placa
( método de Kundrat)
En ausencia de sustancias inhibidorasel germen se desarrolla en el curso de la incubación, fermentando la glucosapresente en el medio, formando ácido, el cual hará virar a amarillo el Púrpura de bromocresol (violeta) de todo el agarde la placa o del tubo.
disco control de 0,01 UI de penicilina GTª de incubación 64ºC durante 3h - 4h
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Delvotest y test Eclipse 50Añadir una tableta nutritiva (solo en
el Delvotest)
Añadir 100 µl de muestra en Delvotesty 50 µl en el Eclipse 50
Tapar los viales e incubar a 64ºC± 2ºC
Leer los resultados
aproximadamente
3 h
Eclipse 50 Delvotest
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ØSon tests que vienen preparados para su utilización en tubo. Se basa igualmente que el anterior en la inhibición o no del desarrollo de Bacillus stearothermophilus(var.calidolactis) a 64ºC, en un agar compuesto de nutrientes seleccionados y con un indicador de color que hará virar el medio a amarillo en caso de ausencia de sustancias inhibidoras debido a la formación de ácido por parte del germen que se ha desarrollado en el medio, y permanecerácon el color violeta original del medio, en el caso de la presencia de sustancias inhibidoras, que no permitirán el desarrollo del germen.ØNegativo cuando en todo el agar del tubo hay un cambio de color manifiesto de violeta a amarillo.ØPositivo cuando veamos con claridad que se mantienen el color violeta original del medio
Fundamento de la técnica del Delvotest y Test Eclipse 50
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ØLa favorable evolución del proceso patológico a curar
ØUn buen diagnóstico:ØNos lleva a la elección del mejor tratamiento
ØLa mejor dosificaciónØElección del mejor producto
ØLa adecuada duración del tratamiento
ØY en consecuencia