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Tema 2. TOMA, MANIPULACIN Y PREPARACIN DE MUESTRASPARA SU ANLISIS
Tipos de muestras
Recipientes de recoleccin
Variables que afectan a la toma de muestra
Transporte de muestras
Criterios para el rechazo de muestras
Estabilidad y conservacin
Preparacin de muestras para el anlisis
Mtodos de separacin: centrifugacin, precipitacin, extraccin, cromatografa y electroforesis
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
TIPOS DE MUESTRAS
SANGRE
ORINA
OTROS LIQUIDOS ORGNICOS: Lquido cefalorraqudeo y amnitico
HECES
ASPIRADOS GSTRICOS
CLCULOS RENALES Y BILIARES
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
COAGULACIN SANGUINEA
Sangre entera : suspensin de clulas en una matriz de protenas y sales denominada plasma
SANGRE ENTERA
COGULO
SUERO(parte lquida)
1. coagulacin2. centrifugacin
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
COAGULACIN SANGUINEA
Los cogulos de sangre se forman por interaccin de aproximadamente una docena de protenas denominadas FACTORES DE COAGULACIN que funcionan simultneamente
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
COAGULACIN SANGUINEA
PROTROMBINA TROMBINA
Factores de coagulacin
FIBRINGENO FIBRINA
REDES DE FIBRINA
Polimerizacin
Cogulo: Redes de fibrina + plaqueta + glbulos rojos
Hemostasia: Propiedad de autosellado del sistema circulatorio
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
RECIPIENTES DE RECOLECCIN
1. JERINGAS2. TUBOS DE VACO:
3. OTROS RECIPIENTES DE RECOLECCIN
*Stat (del latn statim=inmediatamente)
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
VARIABLES QUE AFECTAN A LA TOMA DE MUESTRA
Variables diurnas
Postura del paciente
Estasis (acumulacin de sangre sobre una constriccin)
Hemlisis (prdida de hemoglobina por parte de los eritrocitos)
Conservacin
Transporte
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
Criterio para el rechazo de muestras
1. Inadecuada identificacin
2. Recogida de volumen de sangre inadecuado
3. Utilizacin de tubos inadecuados
4. Presencia de hemlisis
5. Transporte inapropiado
6. Presencia de interferentes
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
ESTABILIDAD Y CONSERVACIN DE MUESTRAS
La alteracin de muestras puede ser debida a:
1. Adsorcin sobre las paredes del vidrio del recipiente
2. Evaporacin de sustancias voltiles
3. Paso de agua de los hemates al plasma (adicin de anticoagulantes)
4. Alteraciones en la permeabilidad de los eritrocitos
5. Actividades metablicas de hemates y leucocitos (consumo de O2 yproduccin de CO2
6. Hidrlisis
7. Gluclisis
8. Fenmenos de autodegradacin
9. Contaminacin por bacterias u hongos.
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
ESTABILIDAD Y CONSERVACIN DE MUESTRAS
1. Alteracin de la temperatura
2. Alteracin del pH
3. Liofilizacin de muestras
4. Conservantes qumicos
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
Conservantes qumicos
1. SANGRE
1.1. Los que evitan transformaciones qumicas: KF y yodoacetato
1.2. Los que tienen acciones antibacterianas: timol / KF + monoclorobenceno / KF + monobromobenceno / Antibiticos
2. ORINA
Suelen aadirse agentes antibacterianos: formaldehdo / timol / ac. brico / tolueno / cloroformo.
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
1. En ausencia de agentes qumicos
2. En presencia de agentes qumicos:
HeparinaSales de AEDTOxalatosNaFCitrato sdicoPolietanol-sulfonato sdico
1. OBTENCIN DE SANGRE ENTERA Y PLASMA
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
1. Separadores de suero
2. Filtro tipo mbolo
1. OBTENCIN DE SUERO. SEPARACIN POR CENTRIFUGACIN
2. PRECIPITACIN PARA LA ELIMINACIN DE PROTENAS
UltracentrifugacinAbsorcin sobre sustancias como el caolnCombinacin de las protenas con los correspondientes anticuerposPrecipitacin por desnaturalizacin por calor, pH adecuadoPrecipitacin mediante procedimientos qumicos
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
PRECIPITACIN DE PROTEINAS POR PROCEDIMIENTOS QUMICOS
Precipitaciones que dependen de la deshidratacin de protenas
- Por adicin de disolventes miscibles- Por fraccionamiento salino (salting out)
Precipitaciones que dependen de la formacin de sales insolubles
- Precipitantes aninicos: cidos tungstico, tricloroactico, metafosfrico, perclrico,etc
- Precipitantes catinicos: Hg2+, Fe3+, Cu2+, combinaciones deHg2+- Ba2+ y de Ba2+ - Zn2+
Precipitacin mediante adicin de cloroformo
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
3. EXTRACCIN
3.1. Extraccin lquido-liquido
- Extraccin simple
- Extracciones mltiples
- Condiciones ptimas de extraccin:
* Eleccin del disolvente
* Control del pH
* Control de la fuerza inica
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
3.1. Extraccin lquido-liquido de forma continua3. EXTRACCIN
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
3.2. Extraccin slido-lquido de forma continua
3. EXTRACCIN
Muestra slida
disolvente
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
3.3. Extraccin a contracorriente
3.4. Procesado de extractos
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Clasificacin segn la fase mvil y los aparatos fsicos:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Clasificacin segn el mecanismo de separacin de la fase estacionaria:
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Diagrama de un sistema de cromatografa lquida:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Componentes bsicos de un equipo de cromatrografa gaseosa:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Cromatograma tpico de un sistema de cromatografa lquida en columna:
tR2
tR1
tM
1 2 3 4V (mLt (min)
Res
pues
ta d
el d
etec
tor
0
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Parmetros de retencin:
Tiempo de retencin (tr)
Tiempo muerto (tm)
Factor de retencin o capacidad: k= tr tm tm
Selectividad o retencin relativa: = (tr)B - tm(tr)A tm
Platos tericos : N = 16 tr2 N = 5.55 tr2w2 w2
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Parmetros de retencin:
Factor de retencin o capacidad: k= tr tm tm
tr
tm
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Parmetros de retencin:
Selectividad o retencin relativa: = (tr)B - tm(tr)A tm
(tr)B
(tr)A
tm
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Parmetros de retencin:
Platos tericos : N = 16 tr2 N = 5.55 tr2w2 w2
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Parmetros de retencin:
Resolucin: R = t2 t1 (w1 +w2)
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Parmetros de retencin:
Resolucin: R = t2 t1 (w1 +w2)
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Cuantificacin usando un patrn externo:
Concentracin del patrn externo
Altu
ra
re
a de
pic
o
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Cuantificacin usando un patrn interno: determinacin de teofilina utilizando betahidroxietilteofilina como patrn interno
Seleccin del patrn interno:
Debe estar completamente separado de otros picos Debe ser eludo cerca de la sustancia analizada Debe comportarse de forma similar a la sustancia analizado durante el pretratamiento de muestra Debe tener una altura o rea del orden de un patrn en el intervalo de concentracin deseada No debe estar presente en la muestra Debe poder obtenerse comercialmente Debe ser agregado en forma lquida
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Cuantificacin utilizando la adicin estndar:
y = 0,0411x + 0,0101R2 = 0,9995
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
-0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Cromo (mg/l)A
bsor
banc
ia (u
. A.)
Concentracin de patrn aadidaA
ltura
o
rea
de p
ico
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Derivatizacin
muestra Agente derivatizanteNuevo producto+
Derivatizacin de barbitricos por tetrametilacin
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA Muestras para HPLC:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS
0. Definicin1. Fuerzas ejercidas sobre la partcula2. Movilidad de una partcula3. Efecto del pH sobre la movilidad4. Electrolitos5. Movimiento y conductividad de los iones6. Otros factores que afectan a la movilidad:
carga y conformacinAtmsfera inica y potencial Zenerga trmica: efecto de relajacinefecto electrofortico
7. Medios de soporte8. Tcnicas de aumento de la resolucin9. Mtodos de separacin en base al tamao molecular10. Mtodos de separacin en base al tamao y la carga11. Localizacin del compuesto de inters12. Aplicaciones clnicas13. Electroforesis capilar
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS
Aplicacin de un campo elctrico a una disolucin inica:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS
PERSONA SANA
PRESENCIA DE CIRROSISHEPTICA
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS
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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS CAPILAR
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS CAPILAR
Dimetro capilar 5mCampo elctrico 25 KVDetector electroqumico
Neurona
Capilar
Serotonina 3M
Res
pues
ta d
etec
tor
Tiempo (min)