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UNAJMA - EPIA
UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ MARÍA ARGUEDAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
PROYECTO DE TESIS
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE LACTOBACILLUS SP PRODUCTOR DE BACTERIOCINAS A PARTIR DE QUESO ELABORADO ARTESANALMENTE PARA USO PROBIÓTICO.
AUTOR:
Córdova Ramírez Alex
Talaverano Rojas Abel
Guzman Poma Yori Yoon
Uchupe Ramírez Dennis
ASESOR: Blga. Luz Azucena Torres García.
ANDAHUAYLAS – PERÚ
2013
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1. PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
I. GENERALIDADES :1. TÍTULO:
Aislamiento y selección de Lactobacillus sp Productor de Bacteriocinas
a partir de queso elaborado artesanalmente para uso probiótico.
2. AUTOR :2.1Nombre:
Córdova Ramírez Alex
Talaverano Rojas Abel
Guzman Poma Yori Yoon
Uchupe Ramirez Dennis
2.2 Carrera Profesional:Ingeniería agroindustrial.
3. ASESORA:3.1Nombre: Blga. Luz Azucena Torres García.
4. TIPO DE INVESTIGACIÓN4.2.De acuerdo al fin que persigue:
Básica
4.1De acuerdo a la técnica de contrastación:
Descriptiva.
5. RÉGIMEN DE INVESTIGACIÓN: Libre.
6. LOCALIDAD E INSTITUCIÓN DONDE SE DESARROLLA EL PROYECTO:6.1Localidad:
Santa Rosa – Talavera – Andahuaylas – Apurímac – Perú.
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6.2Institución:
Universidad Nacional “José María Arguedas”
7. CRONOGRAMA DE TRABAJO:
8. RECURSOS8.1Recursos disponibles:
8.1.1 Personal:
3.2Profesional: Blga. Luz Azucena Torres García.
8.1.2 Bienes:
Materiales para el aislamiento de Lactobacillus sp (materiales de vidrio, plástico, equipos, materia prima,
reactivos)
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ETAPAS Fecha InicioFecha
Término
Dedicación
Horas semanales
Recolección de datos 01/04/2014 08/08/2014 3hrs
Análisis de resultados 05/04/2014 08/08/2014 2hrs
Elaboración de informe 05/04/2014 08/08/2014 2hrs
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Materia prima cantidad descripciónQueso 2 unidades Queso artesanal
Materiales de vidrio cantidad descripciónPlaca petri 5 unidades De marca SCHOT
DURAN
Mechero 2 unidades De ron de quemar
Vaso de licuadora. 1 unidades De 1 litro
Vasos precipitados 2 unidades De 100 ml
Materiales de metal cantidad descripciónCuchillo 2 Marca facusa
Azas bacteriológicas. 2 Con terminal de aro y en
escuadra
Materiales de plástico cantidad descripciónLavatorios. 2 De tamaño mediano
Equipos cantidad descripciónCentrifugadora. 1 Separación de la muestra
Incubadora. 1 Para Incubación de la
muestra
Reactivos y otros. cantidad descripciónCaldo MRS. 125g del envase Medio de cultivo
especifico.
Alcohol 25ml Alcohol de 96º
Algodón. 100g Industrial
8.1.3 Local:
Laboratorio de la escuela profesional de ingeniera
agroindustrial.
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8.2Recursos no disponibles:
Caldo MRS.
Quesos artesanales.
Otros (tipeo, internet, etc.)
II. PLAN DE INVESTIGACION :1. REALIDAD PROBLEMÁTICA:
Las bacterias ácido lácticas se utilizan desde hace aproximadamente 4 mil
años en la elaboración de alimentos. Comprenden un grupo de bacterias
benignas que como producto final de su fermentación tienen al ácido
láctico. Se han identificado diversas tipos de bacterias en las
fermentaciones acido lácticas, en las que destaca el género
Lactobacillus. Se caracterizan por ser bacilos Gram positivos, no
esporulados, sin motilidad (no tienen movimiento), de metabolismo
fermentativo, anaerobio facultativo. (Fuente: Zamorano - 2002)
Existen diversos péptidos antimicrobianos denominados bacteriocinas
los cuales en su mayoría son producidos por bacterias ácido
lácticas.
Las bacteriocinas son sustancias de origen proteico, que se define
como un grupo de sustancias antimicrobianas de origen bacteriano,
caracterizadas por la adsorción a receptores de membrana
específicos, la actividad intraespecífica y, la biosíntesis letal.
Las propiedades que principalmente que tienen las bacteriocinas en
cuenta son las siguientes: naturaleza, tamaño molecular,
composición aminoacídica y estructura química, termo resistencia y
estabilidad frente a pH, se han descrito algunas que presentan en su
molécula componentes glucocídicos y/o lipídicos, además de una
fracción proteica.
Las bacteriocinas se pueden utilizar como pro-bióticos en diferentes
alimentos procesados. Al ingerir productos con contenido de pro-bióticos
logra alcanzar un buen estado de salud del individuo, es a través de la
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resistencia otorgada contra la invasión de microorganismos patógenos,
que se logra mediante la generación de sustancias antimicrobianas como
ácido láctico. (Fuente: biblioteca.universia.net - bacteriocinas)
El uso de bacteriocinas producidas por bacterias ácido lácticas junto con
otras tecnologías, mejora la seguridad en alimentos, ha sido comprobado
mediante la combinación con calor, agentes antimicrobianos, sistema
lactoperoxidasa, presión hidrostática y campo eléctrico pulsado, las cuales
van a gen erar que se alargue la vida útil y comercial de los productos.
Los beneficios que brindan las bacteriocinas, están relacionados con la
salud humana y animal, por tal motivo estas bacterias pueden ser usadas
en la conservación de ciertos alimentos usando las bacteriocinas como
antimicrobianos, los cuales ayudan a una mejor digestión. Presentan
varias características y ventajas que las hacen particularmente
atractivas: un espectro de inhibición específico, un sistema de
autorregulación de PH, estabilidad y procesos de producción, costo
efectivo y el consumo en forma segura para los humanos por un
periodo prolongado. (Fuente: Sedano – 2006)
Actualmente, la bio-conservación en la industria alimentaria se basa en
las bacteriocinas producidas especialmente por el género Lactobacillus.
1.1.Antecedentes:
En el año 2002, en Francia y Colombia, realizaron un trabajo acerca
de bacterias ácido lácticas productoras de bacteriocinas
aisladas de quesos frescos artesanales. Las cepas
productoras de bacteriocinas se reconocieron mediante la inhibición
del crecimiento de Listeria sp utilizada como cepa indicadora
(Gonzales,1994).
El Sedano en el año 2006, aisló 81 cepas de Lactobacillus de 11
muestras de masato procedentes de Pucallpa – Ucayali, de estas 81
cepas, 8 cepas presentaron actividad inhibitoria, y solamente una
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demostró que la sustancia inhibitoria no era un ácido orgánico ni
peróxido de hidrógeno, pudiendo corresponder a una bacteriocina.
En el Perú ya se han realizado diversos estudios sobre las bacteriocinas
presentes en el queso, como es el caso de la Universidad Mayor de San
Marcos, donde aislaron bacteriocinas a partir de bacterias del género
Lactobacillus sp. Presentes en fermentaciones ácido láctico como es el
caso de yogurt. Fue un trabajo de investigación realizado por Ruth
Liliana Cristóbal Delgado de la facultada de farmacia y bioquímica en el
año 2008, en sus estudios de postgrado
1.2.Justificación:
Las bacteriocinas, por ser sustancias antagónicas (antimicrobianos que
inhiben el daños de las bacterias) ayudan en las dietas no digeribles y
brindan un buen estado de salud. Se pueden utilizar también como
conservadores biológicos puros que en un momento dado podrían
reemplazar a los conservadores químicos ya que tienen la ventaja de ser
proteínas que al biodegradarse no forman compuestos secundarios,
debido a esto se debería dar un valor agregado en producciones
industriales de derivados lácteos como el queso para ser usados como
pro bióticos.
2. PROBLEMA:¿Cómo aíslar y se seleccionar Lactobacillus sp. Productor de
bacteriocinas a partir de queso elaborado artesanalmente para uso
probiótico?
3. HIPÓTESIS:Implícita.
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4. OBJETIVOS:4.1.Generales:
Aislar y seleccionar Lactobacillus sp. Productor de bacteriosinas a
partir de queso elaborado artesanalmente para uso probiótico.
5. DISEÑO DE CONTRASTACIÓN5.1Material de estudio:
Queso:
Se recolectaron quince muestras de quesos artesanales elaborados
en Sanmiguel de Llimpe perteneciente a la provincia de Chincheros ,
los cuales lo compramos en la feria dominical de Chincheros.
Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio de química de la
EPIA. De cada queso se tomará una porción de aproximadamente
300g, la cual se colocará en una bolsa estéril o de primer uso y se
transportará a temperatura ambiente.
5.2Técnicas:
5.2.1. Técnica para el aislamiento de Lactobacillus sp. productores de
bacteriocinas para uso probiótico.
A. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:
De cada porción de queso, realizar dos cortes radiales desde
el centro del queso usando un cuchillo estéril.
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Tomar de cada muestra, 25 g de queso y se
homogenizarla con 225 ml de caldo MRS (Merck, pH 6.5)
por 1 minuto usando como homogeneizador una licuadora.
Realizar diluciones decimales hasta 10-4 en frascos con 90 ml
de caldo MRS, de la dilución 10-4, tomar 0.1 ml y se sembrar
en superficie por diseminación con espátula por duplicado en
placas Petri con agar MRS (Merck, pH 6.5).
Incubar las placas a 37 °C por 72 horas.
B. OBTENCIÓN DE BACTERIOCINAS:
Después del tiempo de incubación, se seleccionara 5
colonias al azar de cada placa.
Anotar las características morfológicas de las colonias
como: color, tamaño (mm), aspecto y forma.
C. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS BACTERIOCINAS:
Cultivar cada aislado identificado en caldo MRS pH 6.5
a 37°C por 18 horas en ausencia de oxígeno.
Centrifugar a 3500 rpm por 15 minutos usando una
centrífuga
Filtrar el sobrenadante obtenido con discos de filtro.
colectar en un tubo de ensayo estéril para determinar la
actividad bacteriocinas las pruebas de caracterización
fisicoquímica.
Neutralizar el sobrenadante con NaOH 2.5N hasta llegar
a un pH de 6.5 para descartar que la acción inhibitoria se
deba a ácidos orgánicos.
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En placas petri estériles colocar 1 ml de inóculo de la
cepa indicadora y agregar 20 ml de agar Müeller Hinton,
licuado a menos de 50°C y luego homogenizó el inóculo
con el agar.
D. EFECTO DE TEMPERATURA DE CONSERVACIÓN:
Los sobrenadantes con actividad antibacteriana se deben
incubar a 4 °C, 15 °C y 32 °C por 30 días.
Después del periodo de incubación, se determinará la
actividad antibacteriana de los sobrenadantes tratados
Para la temperatura de 4 °C usar una refrigeradora y para
las temperaturas de 15 °C y 32 °C usar estufas graduadas
a las temperaturas indicadas.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Ratto M. Control
microbiológico de leches y productos lácteos: Métodos
recomendados. Lima, Cleiba – Universidad Nacional Mayor
de San Marcos; 1983González B, Arca P, Mayo B,
Suárez J. Detection, purification and partial characterization
of Plantaricin C, a bacteriocin produced by a
Lactobacillus plantarum strain of dairy origin. Applied and
Environmental Microbiology 1994.Sedano J. Selección de
cepas nativas de Lactobacillus con actividad inhibitoria y
tolerantes al etanol aisladas de masato (Tesis
Licenciatura). Lima, Universidad Nacional Mayor de San
Marcos;
2006.http://www.ugr.es/~anpenet/metodologia.html.X"Queso."
Microsoft® Encarta® 2009.Zamorano – 2002, extrído de :zamo-
oti-02.zamorano.edu/.../getFicha.asp?...
biblioteca.universia, extraído de:
net/ficha.do?id=44756650
6. ANEXOS:
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Colonias de bacillus sp.
Colonias obtenidas del aislamiento de bacteriocinas a partir del queso
artesanal.
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