UNIVERSIDAD DE SONORA

POSGRADO EN BIOCIENCIAS

MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)

Material Didáctico

Elaboró: Dra. Kadiya Calderón Alvarado

kadiya.calderon@unison.mx

MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)

Unidad: CentroDivisión: Ciencias Biológicas y de la SaludDepartamento: Investigaciones Científicas y Tecnológicas (DICTUS)Eje Temático: Optativa / especializaciónCréditos: 8

Teoría: 3 horas a la semana por semestre

Dra. Kadiya del Carmen Calderón Alvarado

kadiya.calderon@unison.mx

TEMARIO DEL CURSO

CALENDARIO DE ACTIVIDADESSesión 1. Intro y conceptos básicos (Unidad 1)Sesión 2. Extracción y manipulación de AN (Unidad 2) Sesión 3. Reacción en cadena de la polimerasa (Unidad 5)Sesión 4. Examen 1 (unidades 1,2 y 5)Sesión 5. Sesión especial Investigador invitado externoSesión 6. Endonucleasas y enzimas de restricción (Unidad 3)Sesión 7. Técnicas de hibridación (Unidad 4)Sesión 8. Bibliotecas genómicas (unidad 6)Sesión 9 Examen 2 (unidades 1-6)Sesión 10. Secuenciación de ADN (Unidad 7) Sesión 11. Citogenética molecular (Unidad 8)Sesión 12. Microarrays (Unidad 9)Sesión 13. Exámen 3 (unidades 7-9)Sesión 14. Calificaciones finales

UNIDAD 1. Introducción y conceptos básicos

Elaboró: Dra. Kadiya del C. Calderón Alvarado

UNIVERSIDAD DE SONORA

POSGRADO EN BIOCIENCIAS

MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)

1. Dogma central de la biología molecular

BiologíaMolecular:Conjuntodeprocesosbásicosquellevanalmantenimientodelainformacióngenética(replicación)yasuexpresión(transcripciónytraducción).

ADN

ARNm

Proteína

TRANSCRIPCIÓN

TRADUCCIÓN

aminoácidos

Genes X, Lewin B, 2009.

ADN

Bases moleculares de la genética

Genes (ADN)

Transcripción (ARNm)

Traducción (ARNt)

Proteína

Replicación

Células hijas

Célula parentalMantenimiento de la información genéticaLa replicación del ADNposibilita el flujo de la información genética de una generación a la siguiente.Cada célula fruto de una división celular recibe una copia del cromosoma idéntica a la de la célula progenitora.

Genes X, Lewin B, 2009.

HERRAMIENTAS MOLECULARESSon las técnicas de laboratorio que se usan para aislar o extraer ácidos nucleicos en alta pureza para su posterior manipulación.

a) Amplificar una región de interés

b) Clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus

c)Utilizar enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción.

d) Perfiles de biodiversidad

e) Análisis de metagenómica, transcriptómica o proteómica.

Viables pero no cultivables

*Métodos tradicionales:

*Siembra en medios de cultivo selectivos ó diferenciales.

* Pruebas bioquímicas.* Tinciones, etc.

*Métodos moleculares

¿Qué es la microbiología?

Woese, C., & Fox, G. (1977)

¿Porqué estudiar microbiología?

Enfoquesenelestudiodelosmicroorganismos:Microbiologíatradicional:Sefundamentaenelestudiodelosmicroorganismosaisladosencultivopuro.

Estudiodesuscaracterísticasindividuales

SecuenciacióndeADN:• Filogenia• Identificacióndefunciones

Genómica(1970):Análisisdelmaterialgenético delosorganismos.Apartirdelassecuenciadegenesesposible:• Comprenderlasrelacionesevolutivas (filogenia)• Conocerlascapacidades metabólicas delosmicroorganismos

Muchosmicroorganismoshanevolucionadocreciendojuntosencomunidades,altamenteestructuradasycondivisiónderoles.

Susactividadescolectivas sonvitalesparaelfuncionamientodelabiosfera,einfluencianlavidaysaludhumanas.

Microbiologíatradicionalygenómica:

Limitacionesenmicrobiologíaambiental:• Losmicroorganismos no funcionanindividualmente

• Losmicroorganismos interaccionan:

• Entresí• Asociándoseconotrosseresvivos• Conelentornofísicoenelquehabitan

Porlotanto,esimportanteestudiarlaestructura delascomunidadesmicrobianasparaentendersudinámica yasídescubrirlafunción delosmicroorganismosenlossistemas

ambientalesàMETAGENÓMICA.Philip

pote

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201

3; C

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l., 2

018

Meta(griego) =quetrasciende

• Ramadelascienciasbiológicas, quetratadecomprenderlabiologíaanivelde comunidadensuentornonatural,trascendiendoalosorganismosindividuales.

• Ramadelametodologíacientífica, quedesarrollaherramientas quepermitencomprenderlacomposicióngenéticaysufunciónencomunidadesmicrobianascomplejas.

LascomunidadescomplejasNO puedensertotalmentecaracterizadas

Metagenómica(J.Handelsman,1998)Handelsman, J. et al. 1998. Chemistry & Biology 5 (10): R245–R249

Aplicacióndetécnicasparaelestudiodirectodelascomunidadesmicrobianasensusentornos

naturales,sinnecesidaddeaislarycultivarindividualmentelasespeciesenellaboratorio

Basadasenlarecuperacióndelosácidosnucleicos (ADN/ARN)apartirde

muestraambientales

Conjuntodelosgenomasdeunentorno=METAGENOMA

entorno

comunidad

metagenoma

Metagenómicaenlaecologíamicrobiana

Zou et al., 2018.

• Estudiosdeladiversidadfilogenéticadelascomunidadesdemicroorganismos,usandofundamentalmenteel16SrRNAcomomarcadorà estructura

• Monitorizarypredecircambiosenlospatronesdediversidaddelascomunidadesdemicroorganismos,enfuncióndelascondicionesambientalesà dinámica.

Aplicacionesdelamicrobiologíamolecularenlaecologíamicrobiana

• Examinargenes/operonesenbuscadeenzimasdeinterés,conaplicacionesmédicas,industriales,etc.

• Examinarmecanismosdesecreción,regulación,ytransduccióndeseñales,asociadosagenesdeinterés.

Spor et al., 2016; Calderón et al., 2017

Metagenómicaaplicadaalaevaluacióndeladiversidadmicrobiana

Técnicasquenorequierenextraccióndeácidosnucleicos:

- Hibridacióninsituconfluorescencia(FISH)

Técnicasbasadasenlaextraccióndeácidosnucleicos(ADN/ARN):

- Construccióndebibliotecasmetagenómicas.

- Fingerprinting:• Electroforesisengelcongradientedesnaturalizanteodetemperatura

(DGGE/TGGE)• Polimorfismoconformacionaldecadenasencilla(SSCP)• Polimorfismodelalongituddefragmentosderestricciónterminales

(T-RFLP)

- PCRyRT-PCRentiemporeal(RealTimePCR)(cuantitativas).

- Microarrays(ChipsdeADN)

- Secuenciaciónmasiva(High-throughputsequencing,Deepsequencing,NextGenerationSequencing).

ARNribosómicobacteriano.

§ ARNr23S§ ARNr5S§ proteínas

§ ARNr16S§ proteínas

Ribosomabacteriano

• LasecuenciadebasesdelgendelARNr 16Stieneinterésfilogenético(cronómetromolecular).

• SepuedendiferenciareidentificarbacteriasapartirdelasecuenciadesugendelARNr 16S.

50S

30S

Subunidadgrande

Subunidadpequeña

Genes X, Lewin B, 2009.

Estructura secundariadel ARNr 16S deEscherichia coli

5’

3’

Zonas conservadas

Zonas hipervariables

Regionesespecíficas de grupo:

• división• reino• familia• género• especie

Diseño de cebadores (primers) y sondas (probes)

EstructurasecundariadelARNr16SdeEscherichiacoli

V1 66-99nt

V2137-242nt

V3433-497nt

V4576-682nt

V81243-1294nt

V91435-1465nt

V71117-1173nt

V6986-1043nt

V5 822-879nt

Hay9regionesconsideradashipervariablesenlasecuenciadel16SrRNAdebacterias(V1aV9)

Yarza et al., (2014).

Estructura secundaria del ARNr 18S eucariota (Saccharomyces cerevisiae)

V7

V8

V5

V4

V3

V9

V1

V2

V6

http://nar.oxfordjournals.org/content/suppl/2001/12/18/30.1.183.DC1/varmaps.htmldoi:10.1093/nar/30.1.183Nucleic AcidsResJanuary1,2002vol.30no.1183-185

750 μm de diámetroThiomargarita namibiensis

500 μm de longitudEpulopiscium fishelsoni

100 μm

protozoo

Wolffia globosa

Planta con flores,400μm diametro

200 µm

Tamaño, forma y asociaciones.

Tamaño de los procariotas: muy variable

Industria farmacéutica y cosmética, industria alimentaria: • Expansores del plasma (dextrano)• Espesantes y emulgentes de alimentos, cosméticos,

fármacos, pinturas, agroquímicos (xantano, alginato, otros)• Aditivos de la industria de extracción del petróleo (xantano)

Importancia industrial de los productos microbiológicos

Recordatorio….... La envuelta celularPared celular

Bacterias Gram positivas y Gram negativas

Gram negativas

Membrana plasmática

Capa de mureína

Porina

Espacio periplásmico

Membranaexterna

LPS

Gram positivas

Capa de mureína

Membrana plasmática

Ácidosteicoicos

Ácidoslipoteicoicos

Piliofimbrias.

Importanciayfuncionesdelospiliadhesivos•Fijaciónsobresuperficiessólidas(vivasoinertes)

•Formacióndebiopelículas•Evasióndelas defensasinmunes

Adhesinasà

Importantesfactoresdevirulenciadelosmicroorganismospatógenos

5µm

•Todos los pili adhesivos en Gram positivas y Gram negativas son responsables de la adhesión específica de los patógenos a los tejidos de su hospedador, facilitando la colonización e invasión.

Aplicaciones:

Industria de lácteos y quesos, embutidos

Fabricación de pan y bebidas alcohólicas

F. láctica

F. butírica F. propiónica

F. alcohólica

Disolventes y explosivos

F. butanólica

queso suizo

Fermentaciones

Viables pero no cultivables (VBNC)Artículo para discusión

¿Cómo distinguir entre Resucitación, sobrevivencia y recrecimiento?

Pintó et al., 2013