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UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA
La Universidad Católica de Loja
ÁREA BIOLÓGICA
TITULACIÓN DE BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO
“Establecimiento y validación de metodologías para el análisis de
nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos vegetales foliares”
AUTOR: Silva Silva, Romina de los Ángeles
DIRECTOR: Capa Mora, Edwin Daniel
LOJA – ECUADOR
2014
iv
APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN
Ingeniero.
Edwin Daniel Capa Mora
DOCENTE DE LA TITULACIÓN
De mi consideración:
El presente trabajo de fin de titulación: “Establecimiento y validación de metodologías para
el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos vegetales foliares”, realizado por Silva
Silva Romina de los Ángeles, ha sido orientado y revisado durante su ejecución, por
cuanto se aprueba la presentación del mismo
Loja, 28 de febrero de 2014
f)…………………………………….
v
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS
Yo, Silva Silva, Romina de los Ángeles declaro ser autora del presente trabajo de fin de
titulación “Establecimiento y validación de metodologías para el análisis de nitrógeno,
fósforo y potasio en tejidos vegetales foliares”, de la Titulación de Bioquímico
Farmacéutico siendo Edwin Daniel Capa Mora director del presente trabajo; y eximo
expresamente a la Universidad Técnica Particular de Loja, y a sus representantes legales
de posibles reclamos o acciones legales. Además certifico que las ideas, conceptos,
procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo investigativo, son de mi
exclusiva responsabilidad.
Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 67 del Estatuto Orgánico
de la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente que textualmente
dice: “Forman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de
investigaciones, trabajos científicos o técnicos de tesis de grado que se realicen a través,
o con el apoyo financiero, académico o institucional (operativo) de la Universidad”.
f) ------------------------------------
Silva Silva Romina de los Ángeles
1105001943
vi
DEDICATORIA
Esta tesis se la dedico a Dios y a la Virgen del Cisne, quiénes supieron guiarme por el
buen camino, darme fuerzas para seguir adelante y no desmayar en los problemas que se
presentaron, enseñándome a enfrentar las adversidades para no desfallecer en el intento.
A mi mamá Marcia, que hace todo en la vida para que pueda conseguir mis sueños y
objetivos planteados, y que hoy gracias a ella puedo ver alcanzada esta meta.
A mis hermanos, tíos y primos, ya que de una u otra manera contribuyeron para el logro
de mi meta y han fomentado en mí el deseo de superación.
vii
AGRADECIMIENTOS
Hago llegar mi profundo agradecimiento a la Universidad Técnica Particular de Loja,
especialmente a la Titulación de Bioquímica y Farmacia, por haberme brindado una sólida
formación universitaria.
Al Departamento de Ciencias Agropecuarias y de Alimentos, en especial al laboratorio de
Suelos Agrícolas; también al laboratorio de Química Analítica e Industrias de la UTPL, por
su apoyo en proporcionarme todo lo necesario para la ejecución del presente trabajo.
De manera especial, mi sincero agradecimiento a Daniel Capa M., por haberme guiado y
orientado en el cumplimiento de este trabajo investigativo, además por haberme brindado
su confianza, tiempo, y por compartir sus conocimientos profesionales para mi formación.
Así mismo al Dr. Juan Ignacio Burneo e Ing. Nataly Solano por haber formado parte de
este trabajo, guiándome y enseñándome en el periodo de becaria y tesista.
viii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
CARATULA iii
CERTIFICACIÓN iv
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS v
DEDICATORIA vi
AGRADECIMIENTOS vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS viii
ÍNDICE DE FIGURAS x
ÍNDICE DE TABLAS xi
ABREVIATURAS xii
RESUMEN xiv
ABSTACT xv
INTRODUCCIÓN xvi
CAPÍTULO 1. MARCO TEÓRICO 1
1.1. Análisis foliar 2
1.1.1. Importancia de los análisis foliares 2
1.1.2. Utilidad de los análisis foliares 2
1.2. Nutrientes en las planta 3
1.2.1. Nitrógeno 3
1.2.2. Fósforo 4
1.2.3.Potasio 5
1.3.Métodos usados para la determinación de análisis foliares 5
1.3.1.Digestión y determinación de nitrógeno por destilación y titulación manual
5
1.3.2.Calcinación y determinación de potasio por Espectrofotometría de absorción y emisión atómica
6
1.3.3.Calcinación y determinación por calorimetría del fosfo-vanadomolibdato
6
1.4. Validación de métodos analíticos 6
1.4.1. Validación 6
1.4.2. Clasificación de métodos de validación 6
1.4.3. Linealidad 7
1.4.4. Límite de cuantificación 7
1.4.5. Límite de detección 8
1.4.6. Exactitud 8 1.4.7. Precisión 8
1.4.8. Repetibilidad 8
1.4.9. Reproducibilidad 8
1.4.10. Incertidumbre 9
1.4.11. Sensibilidad 9
ix
1.4.12. Coeficiente de variación 9
1.5. Especie considerada para la validación de los métodos 10
1.5.1. Tomate de árbol 10 CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS 11
2.1. Ubicación y descripción de la zona de estudio 12
2.2. Recolección de muestras foliares y de suelos 12
2.3. Análisis de tejidos vegetales foliares 13
2.3.1. Preparación de la muestra 13
2.3.2. Análisis de nitrógeno por método de micro-Kjeldhal. Espectrofotometría de UV. V.
15
2.3.3. Análisis de fósforo por el método de molibdato vanadato de amonio por Espectrofotometría de UV. V.
19
2.3.4. Análisis de potasio por el método de Espectrofotometría de Absorción Atómica
24
2.4. Análisis de suelos 28
2.5. Análisis estadísticos y de validación 31
CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 33
3.1. Resultados validación de nitrógeno 34
3.2. Resultados validación de fósforo 41
3.3. Resultados validación de potasio 47
3.4. Resultados de análisis de suelos y foliares 54
3.5. Resultados de análisis foliares 55
3.6. Correlaciones entre nitrógeno, fósforo y potasio de la planta y suelo
58
CAPÍTULO 4. CONCLUSIONES 62
CAPÍTULO 5. RECOMENDACIONES 64
CAPÍTULO 6. BIBLIOGRAFÍA 66
CAPÍTULO 7. ANEXOS 73
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Deficiencia de nitrógeno en solanáceas 4 Figura 2. Deficiencia de fósforo en solanáceas 4 Figura 3. Deficiencia de potasio en solanáceas 5 Figura 4. Mapa de la Estación Agroecológica de la UTPL 12 Figura 5. Muestreo de hojas en el cultivo de tomate de árbol (muestreo
al azar) 13
Figura 6. Diseño experimental de bloques completos 31 Figura 7. Curva de calibración de nitrógeno 35 Figura 8. Gráfico control para nitrógeno 39 Figura 9. Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de
nitrógeno 39
Figura 10. Curva de calibración de fósforo 42 Figura 11. Gráfico control para fósforo 45 Figura 12. Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de
fósforo 46
Figura 13. Curva de calibración de potasio 48 Figura 14. Gráfico control para potasio 52 Figura 15. Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de
potasio 53
Figura 16. Resultados de las absorbancias de nitrógeno en análisis foliares
56
Figura 17. Resultados de las absorbancias de fósforo en análisis foliares 57 Figura 18. Resultados de las absorbancias de potasio en análisis foliares 57 Figura 19 Suelo desprovisto de materia orgánica en la plantación de
tomate de árbol. Estación Agroecológica UTPL 59
Figura 20 Deficiencias de macronutrientes en el cultivo de tomate de árbol.
60
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Reactivos utilizados para la determinación de nitrógeno 15 Tabla 2. Reactivos utilizados para la determinación de fósforo 20 Tabla 3. Reactivos utilizados para la determinación de potasio 25 Tabla 4. Valores de nitrógeno para la curva de calibración (linealidad) 34 Tabla 5. LDD Y LDQ para nitrógeno 35 Tabla 6. Repetibilidad para nitrógeno 36 Tabla 7. Reproducibilidad de nitrógeno. Prueba F para varianza 37 Tabla 8. Reproducibilidad de nitrógeno. Prueba T para 3 variables 37 Tabla 9. Recuperación de nitrógeno 38 Tabla 10. Incertidumbre nitrógeno 40 Tabla 11. Valores de fósforo para la curva de calibración (linealidad) 41 Tabla 12. LDD y LDQ para fósforo 42 Tabla 13. Repetibilidad para fósforo 43 Tabla 14. Reproducibilidad de fósforo. Prueba F para varianza 43 Tabla 15. Reproducibilidad de fósforo. Prueba T para variables 44 Tabla 16. Recuperación para fósforo 44 Tabla 17. Incertidumbre fósforo 46 Tabla 18. Valores de potasio para la curva de calibración (linealidad) 48 Tabla 19. LDD y LDQ para potasio 49 Tabla 20. Repetibilidad de potasio 50 Tabla 21. Reproducibilidad de potasio. Prueba F para varianza 50 Tabla 22. Reproducibilidad de potasio. Prueba T para variables 51 Tabla 23. Recuperación para potasio 51 Tabla 24. Incertidumbre potasio 53 Tabla 25. Porcentajes de nutrientes en el suelo del cultivo de tomate de
árbol 54
Tabla 26. Interpretaciones de los resultados obtenidos en suelos 55 Tabla 27 Porcentajes de nutrientes en la planta del cultivo de tomate de
árbol. 55
Tabla 28 Interpretaciones de los resultados obtenidos en foliares 55 Tabla 29 Correlaciones de Pearson para nitrógeno, fósforo y potasio
entre planta y suelo 58
xii
ABREBIATURAS
°C = Grados centígrados
% CV = Porcentaje de coeficiente de variación
% K = Porcentaje de potasio
% N = Porcentaje de nitrógeno
% P = Porcentaje de fósforo
Abs = Absorbancia
Ca = Calcio
Cf = Concentración final obtenida de la curva de calibración
cmol/Kg = Centimol por kilogramo
Cu = Cobre
cm = Centímetro
EAA = Espectrofotómetro de absorción atómica
exp = Exponente
Fe = Hierro
Fd = Factor de dilución
g = Gramo
g/l = Gramo por litro
ha = hectáreas
K = Potasio
Kg = Kilogramo
LDD = Límite de detección
LDQ = Límite de cuantificación
Mg = Magnesio
mg/Kg = miligramo por kilogramo
mg/l = Miligramo por litro
ml = Milímetros
Mn = Manganeso
Mol/l = Mol por litro
N = Nitrógeno
Na = Sodio
xiii
nm = Nanómetro
P = Fósforo
ppm = Partes por millón
r2 = Coeficiente de correlación
S = Desviación estándar
U = Incertidumbre
Wm = Peso de la muestra
V = Volumen
Zn = Zinc
xiv
RESUMEN
El trabajo se desarrolló en los laboratorios de suelos agrícolas de la UTPL. Se estableció
y validó metodologías para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos foliares
(cultivo de tomate de árbol), además se realizó una correlación entre contenido de
nutrientes suelo - planta. Se hizo un muestreo inicial de hojas y suelo. Para validar las
metodologías de análisis foliares se usó: Nitrógeno por micro-Kjeldahl y
Espectrofotometría de Ultra Violeta Visible (UV-V.), Fósforo por Espectrofotometría de
UV-V. y potasio por Espectrofotometría de Absorción Atómica (AA). Los análisis de suelos
fueron: Nitrógeno, fósforo y potasio. El diseño experimental fue de bloques completos, y
los estadísticos usando Tukey (p<0,05) con SPSS Statistics 17.0; además se evaluó los
parámetros de validación: límite de detección, repetitibilidad, reproducibilidad
recuperación e incertidumbre. Los resultados indican que la validación para nitrógeno,
fósforo se han cumplido, no mostrando diferencia significativa en los análisis realizados;
mientras que para el potasio pese a que se cumplió la validación, se han presentado
inconvenientes a la hora de realizar los análisis, sin embargo no existió diferencia
significativa entre las repeticiones.
Palabras clave: macronutrientes, análisis químicos, fertilización.
xv
ABSTRACT
This research work was developed in the agricultural soils laboratories from UTPL. In
order to do this investigation were established the most suitable methodologies for the
analysis of nitrogen, phosphorus and potassium in plant leaf tissues (crop tree tomato);
furthermore, a correlation between nutrient content was performed soil – plant. An initial
sampling of leaves and soil was done. To support the analysis foliar methodologies was
used: Nitrogen by micro-kjeldahl and UV-V. Spectrophotometry, phosphorus by UV-V.
Spectrophotometry and potassium AA Spectrophotometry. Also, analysis to soils:
Nitrogen, phosphorus and potassium was accomplished. An experimental design of
complete block was raised, and statisticians with Tukey test (p <0.05) using the SPSS
Statistics 17.0; furthermore, the validation parameter were fulfilled: detection limit,
repeatability, reproducibility uncertainty recovery among others. The results point out the
validation for nitrogen, phosphorus were accomplished with total normality, there is not
significance difference among the process done; meanwhile for potassium despite that it
met necessary for validation, there have been drawbacks when taking readings in the AA
spectrophotometer, although there has been no significant difference between the
repetitions performed.
Key words: macronutrients, chemical analysis, fertilization.
xvi
INTRODUCCIÓN
El análisis de tejidos vegetales, consiste en la determinación de la composición química
de la planta. Actualmente se considera como una referencia indispensable para saber los
requerimientos nutricionales de plantaciones así como los estados carenciales de
elementos nutritivos (Legaz et al., 2005).
El análisis foliar da una indicación precisa de la absorción de los diferentes nutrientes por
la planta, debido a que las hojas son muy sensibles a los cambios de la composición del
medio nutritivo (Valenzuela et al., 2000). De los resultados obtenidos dependerán las
medidas a tomar para controlar los factores que limitan la absorción de macro y micro
nutrientes en el cultivo y así optimizar su nutrición (Gadahía, 2008).
Las dosificaciones acertadas de fertilización mineral u orgánica permitirán el adecuado
desarrollo de los cultivos agrícolas, lo cual se logra mediante un análisis físico - químico
de suelos y de tejidos vegetales (Legaz et al., 2005).
El laboratorios de suelos agrícolas de la UTPL tiene desarrollado las metodologías para
análisis físico químicos de los suelos, sin embargo se cree conveniente la implementación
de los análisis foliares, para brindar un mejor servicio de recomendaciones de fertilización,
ya sea en las investigaciones del Departamento, trabajos de consultorías o asesoramiento
a pequeños y grandes productores agrícolas.
Para asegurar la calidad de la implementación de un análisis foliar, es preciso la
validación de los métodos analíticos, siendo requisito indispensable en la práctica de los
análisis químicos; en estos procesos se evaluará si el método o métodos aplicados
cumplen con los requisitos necesarios; después de todo este proceso se verificará si el
método (s) serán idóneos y fiables para su aplicación (Duffau et al., 2010).
Para validar el proceso químico analítico es necesaria la asignación de responsabilidad a
un analista o laboratorista, este proceso debe ser efectuado de forma metódica,
ordenada, trazable y confiable. El método únicamente será validado cuando cumpla con
los parámetros de linealidad, precisión, exactitud y sensibilidad; lo que va a ayudar a
concluir que el método o métodos seleccionados son los correctos (Mínguez et al., 1991 y
Duffau et al., 2010).
Por todo lo comentado antes se ve la necesidad de implementar y validar una
metodología de análisis de tejidos vegetales foliares.
xvii
Para poder cumplir con el desarrollo de este trabajo se ha planteado los siguientes
objetivos.
Objetivo general
Establecer y validar los métodos para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos
vegetales (cultivo de tomate de árbol Solanum betaceum Cav.).
Objetivos específicos
1. Establecer metodologías adecuadas para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio
en tejidos foliares.
2. Validar los procesos metodológicos establecidos para los análisis foliares.
3. Realizar correlaciones entre los resultados de análisis de tejidos foliares frente a
los resultados de suelos.
1
CAPÍTULO 1
MARCO TEÓRICO
2
1.1. Análisis foliar
El análisis foliar es un método de diagnóstico que hace uso del análisis químico aplicado a
partes representativas de la planta, para cuantificar las cantidades de nutrientes que ha
absorbido; y supone es una de las mejores formas de conocer las características de los
cultivos (Carvajal, 1978). Las partes a muestrear pueden ser secciones específicas de la
planta, como los peciolos, las raíces y las hojas siendo éstas las que mejor reflejan el
estado nutricional de la planta ya que ahí se efectúa la elaboración de las sustancias para
el crecimiento (Laboratorio A-L de México, 2011).
La composición mineral de las plantas dependerá de muchos factores como: de la
especie que se trate, de la edad, de la parte de la planta analizada, del clima, estación en
que se realice el muestreo y del suministro de nutrientes del suelo (Rodríguez, 1990).
1.1.1. Importancia de los análisis foliares
Son una referencia indispensable para determinar tanto las necesidades de abonado de
las plantaciones como los estados carenciales de macro y micro elementos. Esto se debe
a que los análisis foliares dan una indicación precisa de la absorción de los diferentes
elementos por la planta, ya que las hojas son muy sensibles a los cambios de
composición del medio nutritivo (Legaz et al., 1995).
Un análisis completo del tejido puede detectar una deficiencia nutricional antes de que los
síntomas aparezcan en la planta. El diagnóstico de "hambre oculta" a menudo le
proporciona al productor la oportunidad de corregir el problema durante la etapa de
crecimiento (Laboratorio A-L de México, 2011).
1.1.2. Utilidad de los análisis foliares
Las deficiencias nutricionales en la planta puede ser detectada a tiempo; en primera
instancia se lo realiza por la sintomatología observada, sin embargo es necesario la
confirmación de la deficiencia mediante análisis de planta (Barbazán, 1998).
Los análisis foliares son usados para revelar el estado nutricional de cultivos en un
sistema de producción determinado. Por otra parte siempre deben de ir acompañados con
análisis de los suelos representativos del área del sistema de producción, así como
también de la averiguación de otros factores de manejo que afectan el rendimiento
(Barbazán, 1998).
3
Los análisis pueden ser útiles para aclarar o interpretar una situación dada en los
sistemas productivos, o para ajustar las dosis de fertilizante a usar en las diferentes
etapas fenológicas del cultivo (Barbazán, 1998 y Legaz et al., 2005).
En la actualidad el análisis foliar es básico, de manera especial en los casos que se
trabaja con fertirrigación, ya que permite actuar de inmediato para corregir los
desequilibrios nutritivos que la planta pueda presentar, incorporando los nutrientes a
través del agua de riego, ya que de esta forma son rápidamente absorbidos por los
cultivos (INEA, s/f).
1.2. Nutrientes en las plantas
Son los elementos esenciales para el crecimiento de la planta, la cual los toma del suelo o
del agua. Los nutrientes primarios (nitrógeno, fósforo y potasio) son consumidos en
cantidades relativamente grandes; otros tres nutrientes secundarios (calcio, magnesio y
azufre) son tomados en menores cantidades, sin embargo pese a ser requeridos en
menores cantidades son esenciales para su crecimiento. Los micronutrientes o elementos
trazas son requeridos en cantidades muy pequeñas, pero igual que los anteriores son
importantes para el metabolismo vegetal (Dirección de Fomento de Tierras y Aguas,
1999).
1.2.1. Nitrógeno (N)
Este nutriente juega un rol esencial en el crecimiento del vegetal, ya que es constituyente
de moléculas como clorofila, aminoácidos esenciales, proteínas, enzimas,
nucleoproteínas, hormonas, y trifosfato de adenosina (ATP). Además, el N es esencial en
muchos procesos metabólicos (Reali, 2000).
El síntoma característico de la deficiencia de N se visualiza temprano en las hojas por
disminución en la formación de clorofila y dificultad en las actividades enzimáticas. La
deficiencia se la observa en el amarillamiento, que ocurre primero en las hojas maduras,
pero los síntomas se extienden rápidamente por tratarse de un nutriente muy móvil, hacia
las hojas jóvenes (Reali, 2000).
4
Figura 1. Deficiencia de nitrógeno en solanáceas. Fuente. http://blog.agrologica.es, consultado en noviembre del 2013
1.2.2. Fósforo (P)
Esencial para el crecimiento de las plantas, ya que desempeña un papel importante en la
fotosíntesis, la respiración, el almacenamiento, transferencia de energía y crecimiento
celular. Además ayuda a la rápida formación y crecimiento de raíces, y mejora la calidad
de la fruta, hortalizas y granos (Cevallos, 2008).
La primera señal de falta de P es una planta pequeña con hojas distorsionadas, cuando la
deficiencia es severa se desarrollan áreas muertas en la hoja, el fruto y el tallo. Las hojas
viejas se afectan antes que las jóvenes y retarda la madurez del cultivo. Los síntomas
visuales de la deficiencia de P no son tan claros como los de N y K. En muchos cultivos,
la deficiencia de P es difícil de detectar en el campo y en ciertas etapas de crecimiento la
carencia de P causa que el cultivo presente un color verde oscuro (Cevallos, 2008).
Figura 2. Deficiencia de fósforo en solanáceas. Fuente. http://blog.agrologica.es, consultado en noviembre del 2013.
5
1.2.3. Potasio (K)
El K es un nutriente esencial en la planta, es vital para la fotosíntesis, la síntesis de
proteínas, ayuda a controlar el balance iónico, es importante en la translocación de
metales pesados como el hierro (Fe), permite a la planta resistir los ataques de
enfermedades, es esencial en la formación de la fruta y mejora la resistencia de la planta
a las heladas (Cevallos, 2008).
Cuando existe deficiencia de K, la fotosíntesis se reduce y la respiración de la planta se
incrementa. Estas dos condiciones reducen la acumulación de carbohidratos, con
consecuencias adversas en el crecimiento y producción de la planta. La sintomatología de
la deficiencia de K se manifiesta porque las hojas se enrollan y se arrugan, apareciendo
unas zonas amarillas difusas en el limbo de las bandas transversales. La aparición de
nuevos brotes hace que esta sintomatología aparezca más en las hojas viejas, ya que el
K emigra de ellas hacia los nuevos órganos. Los brotes son débiles con hojas de tamaño
inferior al normal que caen con facilidad, los frutos son pequeños con corteza suave que
tienden a colorar prematuramente (Legaz et al., 2005).
Figura 3. Deficiencia de Potasio en solanáceas. Fuente. http://blog.agrologica.es, consultado en noviembre del 2013.
1.3. Métodos usados para la determinación de análisis foliares
1.3.1. Digestión y determinación de nitrógeno por destilación y titulación
manual
El principio de este método consiste que del filtrado resultante del “Método de Digestión
en tubo con H2SO4 - ácido salicílico–catalizador”, se determina la concentración de N-NH4
por destilación de NH3 y titulación manual (Sadzawka, 2004).
6
1.3.2. Calcinación y determinación de potasio por Espectrofotometría de
absorción y emisión atómica
Este método consiste en la determinación por calcinación en mufla a un temperatura de
500 ºC, el filtrado proveniente de la calcinación es el que se va a utilizar para determinar
la concentración de K por Espectrofotometría de absorción y emisión atómica (EAA) con
llama de aire - acetileno y agregando solución de lantano para minimizar las interferencias
(Sadzawka, 2004).
1.3.3. Calcinación y determinación por calorimetría del fosfo-vanadomolibdato
Del filtrado proveniente de la calcinación según el método de calcinación en mufla a 500
°C, se determina la concentración de P por colorimetría del complejo fosfo-
vanadomolibdato (Sadzawka, 2004).
1.4. Validación de métodos analíticos
1.4.1. Validación
Es la evaluación estadística de los resultados obtenidos en la aplicación de técnicas
analíticas, mediante pruebas convenientemente documentadas y demostrativas de que un
método es lo suficientemente fiable a fin de producir el resultado previo bajo condiciones
definidas (Pérez et al., 2007). Para la validación de los métodos se requiere que los
parámetros de desempeño se realicen usando equipos que cuenten con las
especificaciones técnicas correctas, y que estén calibrados adecuadamente. Así mismo,
el operador que realiza los estudios debe ser técnicamente competente en el campo de
estudio y debe poseer suficientes conocimientos sobre el trabajo a realizar, con el fin de
que sea capaz de tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones hechas
mientras avanza el estudio (Centro Nacional de Metrología, 1998).
1.4.2. Clasificación de métodos de validación
Los métodos se pueden clasificar de distinta forma, pero se debe establecer una
diferencia clara entre los métodos cualitativos y los cuantitativos.
Los métodos cualitativos exigen la definición de una serie de parámetros cuyo
cumplimiento es necesario para la validación:
Especificidad/selectividad
Límite de detección
7
Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio)
Estabilidad.
Cuando se trate de métodos cualitativos en los que sea necesario establecer un nivel de
concentración definido (un umbral) para reflejar resultados, deben determinarse los tres
parámetros adicionales siguientes:
Linealidad
Exactitud (sesgo) (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en
laboratorio) en el umbral de concentración
Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) en el
umbral de concentración.
Los métodos cuantitativos exigen, para su validación, que se determine las siguientes
series de parámetros que han de cumplirse:
Especificidad/selectividad
Límite de detección
Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio)
Linealidad y rango de trabajo
Exactitud (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio)
Recuperación
Incertidumbre de la medición
Estabilidad.
1.4.3. Linealidad
Es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente proporcionales
a la concentración o cantidad del analito en un rango definido. Se determina mediante el
tratamiento matemático de los resultados obtenidos en el análisis del analito a diferentes
cantidades o concentraciones. La selección del rango y del número de puntos
experimentales están estrictamente relacionados con la aplicación del método
(Velasteguí, 2011).
1.4.4. Límite de cuantificación
Es la cantidad más pequeña del analito en una muestra que puede ser cuantitativamente
determinada con exactitud aceptable. Es un parámetro del análisis cuantitativo para
8
niveles bajos de compuestos en matrices de muestra y se usa particularmente para
impurezas y productos de degradación. Se expresa como concentración del analito (Guía
de Validación de Métodos Analíticos, 2009).
1.4.5. Límite de detección
Cantidad más pequeña de analito en una muestra que puede ser detectada por una única
medición, con un nivel de confianza determinado, pero no necesariamente cuantificada
con un valor exacto. Es comúnmente expresado como concentración del analito (Guía de
Validación de Métodos Analíticos, 2009).
1.4.6. Exactitud (sesgo)
Medición de la diferencia entre los resultados previstos del análisis y el valor de referencia
aceptado, debido a un error sistemático del método y del laboratorio. Normalmente se
expresa en porcentaje. La exactitud y la precisión determinan el error total del análisis
(Centro Nacional de Metrología, 1998).
1.4.7. Precisión
Es una medida de cuán cerca están los resultados unos de otros, y generalmente se
expresa por medidas como la desviación estándar, que describe la dispersión de los
resultados (Velasteguí, 2011).
1.4.8. Repetibilidad
Precisión en condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones según las cuales los
resultados independientes de una prueba se obtienen con el mismo método, sobre
objetos de prueba idénticos, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el
mismo equipo y dentro de intervalos de tiempo cortos (Centro Nacional de Metrología,
1998).
1.4.9. Reproducibilidad
Precisión bajo condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones según las cuales los
resultados de prueba se obtienen con el mismo método, sobre objetos de prueba
idénticos, en diferentes laboratorios, por diferentes operadores, usando diferentes equipos
(Centro Nacional de Metrología, 1998).
9
1.4.10. Incertidumbre
La incertidumbre de una medición es el parámetro asociado al resultado, es decir,
caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente pueden ser atribuidos al
mesurando (Instituto de Salud Pública, 2010).
Las fuentes asociadas a la incertidumbre puede deberse a los siguientes factores:
La naturaleza de la magnitud que se mide.
El instrumento de medición.
El observador.
Condiciones externas.
Cada factor constituye una fuente de incertidumbre, la que contribuirá en mayor o menor
grado a la incertidumbre total o universal.
Detectar y evaluar las incertidumbres no es simple e implica conocer diversos aspectos de
la medición como:
Errores accidentales o aleatorios que aparecen cuando las mediciones
repetidas de la misma variable dan valores diferentes, con igual probabilidad de
estar por arriba o por abajo del valor real. Cuando la dispersión de las medidas es
pequeña se dice que la medida es precisa.
Errores sistemáticos que son una desviación constante de todas las medidas ya
sea siempre hacia arriba o hacia abajo del valor real y son producidas, por
ejemplo, por la falta de calibración del instrumento de medición.
Con todas las incertidumbres de los diferentes factores ya mencionados antes se calcula
la incertidumbre expandida, la cual contribuye a dar una incertidumbre total.
1.4.11. Sensibilidad
La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de medición
y el cambio correspondiente en el valor de la cantidad objeto de la medición (Instituto de
Salud Pública, 2010).
1.4.12. Coeficiente de Variación
Es la desviación estándar dividida por la media. También en conocida como desviación
estándar relativa (RSD). El coeficiente de variación puede ser expresado en porcentaje:
10
Siendo:
S= desviación estándar de las lecturas
X= promedio de la totalidad de la muestra
1.5. Especie considerada para la validación de los métodos
1.5.1. Tomate de Árbol
El tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) es originario de la región andina,
posiblemente de Bolivia (Bohs y Nelson, 1997). Los frutos de esta especie son
comestibles, de sabor agradable, ligeramente ácidos y con un alto contenido de
provitamina A, vitaminas C y B6 y minerales como el hierro y potasio (Chalampunte et al.,
2005 y Vasco et al., 2009). Es además una importante alternativa en la producción,
diversificación y mercadeo de productos no tradicionales, los cuales son una opción
importante en la comercialización (Hallam et al., 2004).
El tomate de árbol durante los cinco a siete primeros meses tiene un importante desarrollo
vegetativo, por lo que en esta etapa son importantes los aportes de N, P, K, Ca y micro-
elementos (León et al., 2004). Luego la planta entra en un estado de equilibrio productivo-
vegetativo debido a que se inicia la floración: las hojas son más abundantes pero de
menor tamaño y las ramas mantienen una alta producción de inflorescencias y frutos; en
este periodo se deben aplicar cantidades crecientes de N, K y Mg (Santillán, 2001 y León
et al., 2004). Durante el segundo año la planta presenta un estado más productivo, en
este periodo se deben estabilizar las cantidades de nutrientes aportando fórmulas
completas en que predominen principalmente el K y el N. Además, es importante
considerar que la aplicación combinada de agua y nutrientes (fertirrigación) es
satisfactoria para la productividad del cultivo y permite un adecuado manejo del suelo y
agua, por lo que su implementación es conveniente para el control de dichas condiciones.
En el Ecuador las provincias donde se cultivan estas frutas son; Carchi, Imbabura,
Pichincha, Tungurahua, Chimborazo, Cañar, Azuay y Loja. En total en el país se cultivan
14748 hectáreas y en la provincia de Imbabura 883 hectáreas, la provincia que más
produce tomate de árbol en el país es la provincia de Tungurahua son 8300 hectáreas
(Uquillas et al., 2010).
11
CAPÍTULO 2
MATERIALES Y MÉTODOS
12
2.1. Ubicación y descripción de la zona de estudio
Para el establecimiento y validación del proyecto de “Metodologías de análisis de tejidos
vegetales foliares” se utilizó como referencia el cultivo de tomate de árbol, dicha
plantación está situada en la Estación Agroecológica de la UTPL (Figura 4), la que se
encuentra ubicada en el sector sur oriental de la hoya de Loja, y cuenta con una superficie
de 17,2 ha. Y dentro de las siguiente coordenadas UTM (Municipio de Loja, 2006).
E: 702050 – 702700
N: 9527600 – 9558400
Figura 4. Mapa de la Estación Agroecológica de la UTPL. Fuente. Servicios Agropecuarios, 2006.
La clasificación climática de esta zona según Koppen, 2005 corresponde: templado
lluvioso, mesotérmico frío e isotermal, con temperatura media de 15,4 °C, precipitación
media de 780 mm por año y una altura de 2160 m s.n.m.
2.2. Recolección de muestras foliares y de suelos
El muestreo se lo realizó en una parcela de cultivo de tomate de árbol, la que tenía una
edad de dos años. La recolección de las muestras foliares se la hizo al azar y siguiendo
las recomendaciones dadas por Holland, et al. (1967), el que indica que un muestreo
óptimo y práctico para árboles frutales es el de establecer una muestra compuesta de 100
hojas (cuatro hojas por árbol para un total de 25 árboles por unidad de muestreo) (Figura
5).
13
Figura 5. Muestreo de hojas en el cultivo de tomate de árbol (muestreo al azar). Fuente. La Autora.
Las cuatro hojas de las plantas que conformaron la muestra, también fueron tomadas al
azar (Apéndice 1), pero asegurándonos que éstas pertenezcan a las que se han
desarrollado por completo y que no presenten algún tipo de daño causado por ataque de
plagas o enfermedades. Para el muestreo se utilizó una podadora manual y luego de cada
corte se realizó la respectiva desinfección.
Así mismo se recogió tres muestras de suelo de la parcela tomate de árbol, cada una de 1
Kg de peso, el muestreo se lo hizo una sola vez al inicio del proyecto. La recolección de la
muestra se la hizo con una barrena (20 cm de profundidad por 5 cm de ancho) a una
profundidad de 20 cm (horizonte mineral) que es donde se encuentra la mayor parte del
sistema radicular.
Las muestras tanto foliares como de suelos fueron trasladadas al Departamento de
Ciencias Agropecuarias y Alimentos (Laboratorios de Suelos Agrícolas), para sus
respectivos análisis.
2.3. Análisis de tejidos vegetales foliares
2.3.1. Preparación de la muestra
Las muestras foliares colectadas se sometieron al siguiente proceso de preparación
(Apéndice 1):
Limpieza de la muestra: La muestra fresca se lavó con abundante agua destilada
para eliminar polvo o rastros de contaminación.
Secado de la muestra: una vez realizada la limpieza de las muestras, se eliminó
el peciolo de las hojas, esto debido a que esta parte de la hoja contiene gran
cantidad de savia lo cual podría afectar al análisis foliar; posteriormente se sometió
a un secado en estufa durante 24 horas y a una temperatura de 80 o C.
14
Molienda: Una vez que la muestra estuvo seca, se trituró con un mortero
homogenizando en su totalidad, seguido se pasó por un tamiz de 2 mm.
Almacenamiento: Las muestras se almacenaron en bolsas plásticas libres de
humedad, para sus respectivos análisis de N, P y K (Calderón y Pavlona, 2001).
Apéndice 1. Procedimiento de recolección limpieza, secado, triturado y almacenado de la muestra
foliar.
Fuente. La Autora.
15
2.3.2. Análisis de nitrógeno por método de micro-Kjeldhal. Espectrofotometría
de UV-V.
Campo de aplicación
Este método tiene como objeto determinar el contenido de nitrógeno total en tejidos
vegetales. Por micro Kejldhal. Espectrofotometría de UV-V.
Principio
La determinación de N en foliares se basa en la digestión de la muestra foliar para destruir
compuestos no nitrogenados en un medio ácido (H2SO4) y en presencia de selenio y
sulfato de potasio como catalizadores a 350 ºC en el equipo micro-Kjeldhal. El producto
de esta reacción se lo llevó a un aforo de 50 ml, y se tomó una alícuota la cual se mezcla
con reactivo de color que está compuesta por fenol e hidróxido de sodio hasta que genere
color azul, posteriormente se leyó en el Espectrofotómetro UV-V. a una longitud de onda
de 660 nm (Bremmer, 1982).
Condiciones ambientales
Las condiciones ambientales en las que normalmente se trabajó son:
Temperatura media: 20 °C con mínimas de 17 °C y máximas de 24 o C
Humedad relativa: 45 – 75 %
Reactivos
Tabla 1. Reactivos utilizados para la determinación de nitrógeno.
Reactivo Fórmula Marca
Hidróxido de sodio NaOH MERCK
Selenio Se ALDRICH
Fenol C6H5OH MERCK
Hipoclorito de sodio. NaClO MERCK
Ácido sulfúrico concentrado
H2SO4 MERCK
Sulfato de amonio (NH4)2SO4 MERCK
Sulfato de potasio K2SO4 MERCK
Fuente. La Autora.
16
Preparación de Reactivos
a. Mezcla catalizadora.- se pesó 100 g de sulfato de potasio y 2 g de selenio en
polvo, se agitó hasta que haya una homogenización total.
b. Solución de fenol.- se pesó 10 g de hidróxido de sodio, luego 13 g de fenol (se
usó las cámaras extracción y equipo de protección ya que desprende olores fuertes y
tóxicos), los dos reactivos se los disolvió en aproximadamente 80 ml de agua destilada,
y se aforó a 100 ml.
c. Solución de hipoclorito de sodio.- se tomó 10 ml de hipoclorito de sodio (5,25
%) y se aforó a 100 ml con agua destilada.
d. Estándar de calibración de nitrógeno.- se pesó 4,714 de sulfato de amonio
(NH4)2SO4, y se aforó a 1000 ml con agua destilada.
De la solución estándar madre que contiene 1000 ppm de nitrógeno, se preparó un
estándar de 100 ppm en un balón de 50 ml, a partir del cual se realizó los estándares
de 25, 50, 75 y 100 ppm tomando alícuotas de 12,5; 25; 37,5 y 50 ml respectivamente
,y se aforó en balones de 50 ml.
Materiales y Equipos
Balanza analítica
Balones de aforo
Celdas plásticas para lectura en el Espectrofotómetro
Embudos
Espátula
Espectrofotómetro UV-V. con longitud de onda 660 nm.
Estufa con circulación de aire
Lunas de reloj
Digestor TECATOR
Papel filtro
Pera de succión
Pipetas
Tubos de ensayo
Tubos de vidrio pared gruesa
Vasos de precipitado
17
Varillas de agitación
Preparación del Material
Todo el material que se utilizó para la determinación fue lavado con jabón líquido, para
evitar posibles adherencias de residuos al material.
Determinación
La metodología utilizada fue en base a Cadahia (2008).
Digestión
Se pesó 0,10 g de muestra seca y triturada dentro de un tubo de ensayo de 100
ml de aforo.
NOTA: Se debe pesar tanto las muestras con y sin recuperación y también se
hace un blanco.
A las muestras y al blanco, se adicionó 0,50 g de mezcla catalizadora y 5 ml de
ácido sulfúrico concentrado (H2SO4).
Se encendió y precalentó el micro-Kjeldahl a una temperatura de 100 o C.
En el micro-Kjeldahl se colocó los tubos de ensayo con la muestra para realizar
la digestión. Los primeros 10 minutos se colocó a 100º C, luego se fue subiendo
la temperatura paulatinamente hasta llegar a los 350 °C. Aproximadamente
luego de haber transcurrido alrededor de cinco horas la muestra quedó
transparente e incolora (sin presencia de humos blancos).
Se dejó enfriar los tubos por aproximadamente 30 minutos.
Una vez fríos se añadió aproximadamente 25 ml de agua destilada.
Se dejó enfriar nuevamente y se aforó a 50 ml, se tapó con parafina y se agitó
para que se homogenicen los compuestos presentes, posterior a esto se colocó
los tubos verticalmente para que se precipiten todos los sólidos existentes.
Generación de color
De la digestión se tomó aproximadamente 10 ml y se filtró en tubos de ensayo.
Del filtrado se extrajo una alícuota de 2 ml y se los depositó en un tubo de
ensayo, se adicionó 8 ml de la solución de fenol y 10 ml de la solución de
hipoclorito de sodio (en este orden), se agitó y dejó reposar por una hora,
preferiblemente en oscuridad.
18
Se encendió el Espectrofotómetro y se calibró a una longitud de onda de 660
nm.
Una vez generado el color y pasado el tiempo de reposo de las muestras, se
procedió a leer la absorbancia de las muestras en el Espectrofotómetro UV-V.
(Las celdas no deberán presentar mal estado, ya que las lecturas posiblemente
varían y los resultados serán incorrectos).
Los resultados obtenidos se registraron en la hoja de cálculo para la realizar las
regresiones lineales (Bremmer, 1982) (Ver Apéndice 2)
Cálculos de los resultados
Siendo:
Cf: Concentración final obtenida de la curva de calibración
FD: Factor de dilución
Wm: Peso de la muestra
Expresión de los resultados
Los resultados se expresaron con tres cifras significativas.
En el informe del análisis, se indica el método usado y el resultado obtenido.
Además de mencionar cualquier condición no especificada en esta norma o
considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber
influido sobre el resultado.
Por otra parte se debe incluir todos los detalles para la completa identificación
de la muestra.
Eliminación de residuos
Todos los residuos que resultaron de los análisis fueron almacenados en recipientes
adecuados, para luego ser enviados al Centro de Remediación Ambiental (CRA), en
cartones identificados y con hoja técnica adjunta.
19
Apéndice 2. Esquema del proceso de determinación de nitrógeno por el método de micro-Kjeldhal.
Espectrofotometría de UV-V. (Ver anexo I).
Fuente. La Autora.
2.3.3. Análisis de fósforo por el método de molibdato vanadato de amonio por
Espectrofotometría de UV-V.
Campo de Aplicación
Este método tiene como objeto determinar el contenido de fósforo disponible en tejidos
vegetales mediante Espectrofotometría de UV-V.
Principio
El método para determinación de fósforo disponible en tejidos vegetales fue mediante
Espectrofotometría UV-V., este se basa en la extracción de K mediante la digestión con
mezcla ácida (HNO3 concentrado 65 % y HCLO4 concentrado 70 %) donde se produce la
liberación de los elementos minerales, el producto de esta mezcla ácida se filtra, del cual
se toma una alícuota que en presencia del reactivo molibdato-vanadato de amonio da
lugar a la formación de un complejo de color amarillo, siendo el siguiente paso dar lectura
20
en el Espectrofotómetro UV-V. a una longitud de onda de 430 nm (Calderón y Pavlona,
2001).
Condiciones ambientales
Las condiciones ambientales en las que normalmente se trabaja son:
Temperatura media: 20 °C con mínimas de 17 °C y máximas de 24 o C
Humedad relativa: 45 – 75 %
Reactivos
Tabla 2. Reactivos utilizados para la determinación de fósforo.
Reactivo Fórmula Marca sugerida
Vanadato de amonio NH4VO3 Sigma-Aldrich
Molibdato de amonio heptahidratado
(NH4)6Mo7O24.4H2O MERCK
Ácido nítrico 65% HNO3 MERCK
Ácido perclórico HCLO4 MERCK
Potasio dihidrógeno fosfato
KH2PO4 MERCK
Ácido sulfúrico K2SO4 MERCK
Fuente. La Autora.
Preparación de reactivos
a. Mezcla ácida.- Se mezcló 250 ml de ácido nítrico (HNO3) concentrado al 65 % y
100 ml de ácido perclórico (HCLO4) concentrado al 70 %. Relación de mezcla
2,5:1.
b. Solución molibdato-vanadato de amonio
Molibdato de Amonio (NH4)6Mo7O24 4H2O al 5 % (Solución A).- Se pesó 12,5 g
de molibdato de amonio, seguidamente se agregó 150 ml de agua destilada, se
calentó suavemente hasta completar la disolución y se aforó a 250 ml.
Vanadato de Amonio NH4VO3 (Solución B).- Se pesó 0,625 g de vanadato de
amonio, se agregó 125 ml de agua destilada, se adicionó 62,5 ml de ácido nítrico
(NHO3) concentrado, se dejó enfriar y se aforó a 250 ml.
En un balón de 500 ml se disolvió la solución A (Molibdato de Amonio) sobre
solución B (Vanadato de Amonio) en una proporción 1:1.
21
c. Estándar de calibración de fósforo.- Se pesó 0,439 g de potasio dihidrógeno
fosfato, se agregó 300 ml de agua destilada y 10 ml de ácido sulfúrico a 10 N,
finalmente se aforó a 1000 ml con agua destilada.
De esta solución estándar que contiene 1000 ppm de fósforo se preparó
estándares de 3, 5, 8, 10 ppm tomando alícuotas de 1,5; 2,5; 4; y 5 ml
respectivamente, y se aforó en balones de 100 ml.
Materiales y equipos
Balanza analítica
Balones de aforo
Celdas para lectura en el Espectrofotómetro UV-V.
Embudos
Espátula
Espectrofotómetro UV-V. con longitud de onda 430 nm
Estufa con circulación de aire
Lunas de reloj
Papel filtro
Pera de succión
Pipetas
Tubos de ensayo
Varillas de agitación
Vasos de precipitación
Digestor TECATOR
Preparación del material
Todo el material que se utilizó para la determinación fue lavado con jabón líquido, para
evitar posibles adherencias de residuos de material.
Determinación
La metodología utilizada fue en base a Calderón (2001).
Digestión
Se pesó 0,5 g de muestra seca y molida y se llevó a un tubo de ensayo de 100
ml.
22
NOTA: Se debe pesar tanto las muestras con y sin recuperación y también se
hace un blanco.
Se agregó 3 ml de mezcla ácida y se colocó en la placa de digestión, donde la
temperatura no debe pasar de 200 o C (a mayor temperatura se puede
volatilizar algo de fósforo).
Se tomó como punto final de la digestión cuando aparecieron humos blancos y
el digerido se tornó amarillo transparente, en este punto hubo aproximadamente
0,5 mililitros de solución.
Se dejó enfriar los tubos por aproximadamente 30 minutos, se agregó agua
destilada y se aforó a 25 ml.
Una vez aforado se filtró la muestra en balones de 25 ml, la cual se encuentra
lista para la lectura de P, además de: S, K, Ca, Mg, Mn, Cu, Fe, Zn, Na.
Extracción de fósforo y generación de color.
Se tomó una alícuota de 0,5 ml del filtrado de la digestión y se coloca en un tubo
de ensayo.
A las muestras y al blanco, se les adicionó 2 ml de agua destilada y 1 ml de
solución molibdato-vanadato de amonio, desarrollándose inmediatamente el color
amarillo, y se dejó 5 minutos en reposo.
Se encendió el Espectrofotómetro y se calibró a una longitud de onda de 430 nm.
Una vez generado el color de las distintas muestras y pasado el tiempo de reposo,
se leyó las mismas en el Espectrofotómetro mediante las celdas y se registró los
resultados (las celdas no deberán presentar señales de ralladura o estar en mal
estado ya que las lecturas variarán y los resultados serán incorrectos).
Los datos obtenidos se registraron en la hoja de cálculo para la regresión lineal.
(Calderón y Pavlona, 2001) (Ver apéndice 3).
Cálculos y expresión de los resultados
Siendo:
% P = Porcentaje de fósforo
Abs = Absorbancia
23
V = Volumen
K = Constante
0,5g = Peso de la muestra
0,25 = Factor de dilución
Expresión de los resultados
El resultado se expresó con tres cifras significativas.
En el informe del análisis, deben indicarse el método usado y el resultado
obtenido. Debe mencionarse, además, cualquier condición no especificada en esta
norma o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda
haber influido sobre el resultado.
Se incluyen todos los detalles para la completa identificación de la muestra.
Eliminación de residuos
Todos los residuos que resulten del análisis deberán ser almacenados en recipientes
adecuados, para luego ser enviados al CRA (Centro de Remediación Ambiental), en
cartones identificados con hoja técnica adjunta.
24
Apéndice 3. Esquema del proceso de determinación de fósforo por Espectrofotometría de UV-V.
(Ver anexo II).
Fuente La Autora.
2.3.4. Análisis de potasio por el método de Espectrofotometría de Absorción
Atómica
Campo de aplicación
Este método tiene como objeto determinar el contenido de potasio disponible en tejidos
vegetales por el método de Absorción Atómica.
25
Principio
El método utilizado para la determinación de potasio disponible en tejidos vegetales fue
mediante Espectrofotometría AA, el cual se basa en la extracción de potasio mediante la
digestión con mezcla ácida (HNO3 concentrado 65 % y HCLO4 concentrado 70%), donde
se produce la liberación de los elementos minerales, el producto de esta mezcla ácida se
filtra, del cual se toma una alícuota agregando óxido de lantano para minimizar las
interferencias (Calderón y Pavlona, 2001).
Condiciones ambientales
Las condiciones ambientales en las que normalmente se trabaja son:
Temperatura media: 20 °C con mínimas de 17 °C y máximas de 24 o C
Humedad relativa: 45 – 75 %
Tabla 3. Reactivos utilizados para la determinación de potasio.
Fuente. La Autora.
Reactivos
Preparación de reactivos
a. Mezcla ácida.- Se mezcló 250 ml de ácido nítrico (HNO3) concentrado al 65 % y
100 ml de ácido perclórico (HCLO4) concentrado al 70 %. Relación de mezcla
2,5:1.
b. Óxido de lantano.- Se pesó 58,64 g de óxido de lantano (La2O3), se agregó 200
ml de agua destilada y 200 ml de ácido clorhídrico concentrado (HCL), se agitó
hasta completa disolución se dejó enfriar y se aforó a 1 litro con agua destilada.
c. Estándar de potasio.- Se realizó estándar de potasio puro de 0,2; 0,4; 0,7 y 1
ppm tomando alícuotas de 5, 10, 18 y 25 µl respectivamente para cada uno de
ellos, y se aforó a 25 ml.
Reactivo
Fórmula Marca sugerida
Óxido de lantano La Sigma-Aldrich
Ácido clorhídrico HCL MERCK
Ácido nítrico 65% HNO3 MERCK
Ácido perclórico HCLO4 MERCK
Estándar de potasio MERCK
26
Materiales y equipos
Balanza analítica
Balones de aforo
Digestor TECATOR
Embudos
Espátula
Espectrofotómetro AA
Estufa con circulación de aire
Lunas de reloj
Papel filtro
Pera de succión
Pipetas
Varillas de agitación
Vasos de precipitación
Preparación del material
Todo el material que se utilizó para la determinación fue lavado con jabón líquido,
para evitar posibles adherencias de residuos al material.
Determinación
La metodología utilizada fue en base a Calderón y Pavlona (2001).
Digestión
Se pesó 0,5 g de muestra seca y molida y se llevó a un tubo de ensayo de 100
ml.
NOTA: Se debe pesar tanto las muestras con y sin recuperación y también se hace
un blanco.
Se agregó 3 ml de mezcla ácida y se colocó en la placa de digestión, donde la
temperatura no debe pasar de 200 o C.
Se tomó como punto final de la digestión cuando aparecieron humos blancos y el
digerido se tornó amarillo transparente, en este punto hubo aproximadamente 0,5
ml de solución.
Se dejó enfriar los tubos por aproximadamente 30 minutos, se agregó agua
destilada y se aforó a 25 ml.
27
Una vez aforado se filtró la muestra en balones de 25 ml, el cual se encuentra
listo para la lectura de K, además de P, S, K, Ca, Mg, Mn, Cu, Fe, Zn, Na.
Determinación de potasio
Del filtrado de la digestión se tomó una alícuota de 0,5 ml y se colocó en un balón
de aforo de 50 ml.
A las muestras y al blanco, se adicionó 48,5 ml de agua destilada y 1 ml de óxido
al 5 %, de esto resultó una relación de dilución de 50/ 0,5.
Se encendió el Espectrofotómetro de AA y se realizó la curva de calibración.
Se homogenizaron las muestras y se leyeron.
Los datos obtenidos se registraran en la hoja de cálculo para la regresión lineal.
(Calderón y Pavlona, 2001) (Ver Apéndice 4).
Cálculos de los resultados.
Siendo:
ppm = Partes por millón
V = Volumen
ppm K = Partes por millón leídas de potasio
0,5g = Peso de la muestra
0,5 = Factor de dilución
Expresión de los resultados
Los resultados se expresaron con tres cifras significativas.
En el informe del análisis, se indica el método usado y el resultado obtenido.
Además mencionar cualquier condición no especificada en esta norma o
considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber
influido sobre el resultado.
Por otra parte se debe de incluir todos los detalles para la completa identificación
de la muestra.
28
Eliminación de los residuos.
Todos los residuos que resulten del análisis deberán ser almacenados en recipientes
adecuados, para luego ser enviados al CRA (Centro de Remediación Ambiental), en
cartones identificados con hoja técnica adjunta.
Apéndice 4. Esquema del proceso de determinación de potasio por Espectrofotometría de
Absorción Atómica.
Fuente. La Autora.
2.4. Análisis de suelos
Un vez tomadas e identificadas las muestras de suelo fueron llevadas al laboratorios de
suelos agrícolas de la UTPL, en donde comenzó su proceso de secado y luego tamizado
(tamiz menor a 2 mm).
Los parámetros determinados fueron N, P y K.
29
Nitrógeno
Mediante el método micro Kjeldahl y Espectrofotometría de UV-V. (Bremmer, 1982), que
se basa en la mineralización del nitrógeno orgánico del suelo a través de la digestión
(Digestor TECATOR), que es ejecutada al calentar la muestra con ácido sulfúrico (SO4H2)
concentrado. Y seguido se lee la absorbancia en el Espectrofotómetro UV-V. (Jenway
6400 serie 13309) a una intensidad luminosa de 660 nm (Apéndice 5).
Fósforo
La extracción del fósforo se hizo utilizando el método de Bray y Kurtz. Se emplea la
solución de Bray y Kurtz: Ácido clorhídrico (HCL 0,025 N); fluoruro de amonio (NH4F
0,03N a pH 2,6) La lectura se realizó en el Espectrofotómetro UV-V. a 882 nm (Jenway
6400 serie 13309) (Apéndice 6).
Potasio
Se utilizó la solución Olsen y Espectrofotometría de absorción atómica (Perkin Elmer
AAnalyst 400). A la muestra de suelo le adicionamos la solución Olsen modificada que
contiene bicarbonato de sodio (NaHCO3) y EDTA (Etilen diamino tetra acético), agitamos
30 minutos y filtramos. Realizamos la lectura de acuerdo a las especificaciones del equipo
(Suárez, 1996) (Apéndice 7).
30
Apéndice 5. Determinación de nitrógeno en suelos por micro Kjeldahl y Espectrofotometría de UV-
V.
Fuente. La Autora.
Apéndice 6. Determinación de fósforo en suelos por Espectrofotometría UV-V.
Fuente. La Autora.
31
Apéndice 7. Determinación de potasio en suelos por Espectrofotometría de AA.
Fuente. La Autora.
2.5. Análisis estadísticos y de validación
El diseño experimental usado para el análisis de tejidos vegetales foliares fue el de
bloques completos (Figura 6). Realizando seis repeticiones para cada parámetro (N, P y
K); cada repetición estuvo conformada por diez muestras. Los análisis fueron realizados
en fechas distintas para poder cumplir con la validación y verificación de los métodos.
Figura 6. Diseño experimental de bloques completos. Fuente. La Autora.
32
Validación y verificación de los métodos analíticos
Los métodos utilizados fueron evaluados y sometidos a las siguientes pruebas para
asegurar que los resultados obtenidos son válidos y coherentes con el objetivo previsto
(validación).
Para la validación de los métodos de análisis se realizó las siguientes pruebas:
Linealidad (Ver anexo IV)
Límite de detección y cuantificación (Ver anexo V)
Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) (Ver
anexo VI y VII)
Exactitud (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) (Ver
anexo VI y VII)
Recuperación (Ver anexo VIII)
Incertidumbre de la medición (Ver anexo IX)
Además se realizó análisis de varianza (ANOVA) de una vía, usando la prueba de Tukey
subconjuntos homogéneos con un nivel de significancia p<0,05, utilizando el programa
SPSS Statistics 17.0; esto para determinar si existe diferencia significativa entre las
diferentes repeticiones y muestras determinadas. Además y para cumplir con el tercer
objetivo se realizó un análisis de correlación de Pearson entre los análisis foliares y
edáficos con un nivel de significancia de p < 0,05.
33
CAPÍTULO 3
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
34
Resultados para el primer y segundo objetivo:
Establecer metodologías adecuadas para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio
en tejidos foliares.
Validar los procesos metodológicos establecidos para los análisis foliares.
3.1. Resultados validación de nitrógeno
Los resultados presentados a continuación muestran la validación del método, en el cual
se ha examinado: límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, repetibilidad,
reproducibilidad, recuperación e incertidumbre.
Título del método analítico
Determinación de nitrógeno por micro Kjendal y Espectrofotometría de UV-V.
Resultados del estudio de validación
Linealidad
Para determinar la linealidad del método se realizó una curva de calibración con los datos
de la Tabla 4, para realizar dicha curva se prepararon soluciones estándar de diferentes
concentraciones conocidas con sulfato de amonio.
Tabla 4. Valores de nitrógeno para la curva de calibración (linealidad).
X Concentración (mg/l) Y Absorbancia
25 0,305
50 0,329
75 0,365
100 0,409
125 0,442
Fuente. La Autora.
En la Figura 7 (Anexo IV) se observa la curva de calibración del método, en la cual
obtuvimos que la pendiente (y) es igual a 0,0014 y la intersección con el eje x es igual a
0,2638; así mismo con un coeficiente de correlación (r2) de 0,991. Por lo que podemos
decir que el método verifica con lo requerido, cumpliendo el criterio establecido por Oficina
de las Naciones Unidas Contra la Droga y el Delito (2010) y Gutiérrez et al. (2000) la que
menciona que debe existir una relación directamente proporcional entre la respuesta
obtenida cuando se aplica el método y la concentración del analito en la matriz dentro del
35
rango de concentraciones del analito buscado, y el coeficiente de correlación debe ser
mayor a 0,99.
Figura 7. Curva de calibración de nitrógeno Fuente. La Autora.
Límite de detección (LDD) y cuantificación (LDQ)
Para determinar tanto el límite de detección como el límite de cuantificación de nitrógeno
se hizo la lectura de 10 blancos (agua destilada) obteniendo así el límite más bajo en el
que puede ser detectado el analito como podemos observar en la Tabla 5 (Anexo V). El
análisis se hizo utilizando un Espectrofotómetro UV-V.
Tabla 5. LDD y LDQ para nitrógeno.
N° Ensayos Blancos para N
1 0,072
2 0,066
3 0,069
4 0,064
5 0,07
6 0,068
7 0,068
8 0,061
9 0,063
10 0,068
Media 0,067
S(des stand) 0,003
%CV 0,051
LDD 0,077
LDQ 0,083
Fuente. La Autora.
36
Se determinó el límite de detección en la concentración de absorbancia de 0,077, siendo
esta la cantidad mínima de nitrógeno en la muestra que puede ser detectada y un límite
de cuantificación con concentración de absorbancia de 0,083 la cual consta como la
cantidad mínima de nitrógeno en una muestra que puede cuantificarse. De esta forma se
determina que el método es capaz de detectar y cuantificar de manera confiable
cantidades mínimas de nitrógeno en una muestra. Cumpliendo así lo señalado por el
Instituto de Salud Pública (2010) y Herrera et al. (2004) donde nos dice que el LDD debe
ser menor al LDQ.
Repetibilidad
En la Tabla 6 se presentan los datos obtenidos del análisis de repetibilidad. En el cual se
realizó la prueba de varianza ANOVA mostrando resultados satisfactorios y similares para
los tres niveles. Se realizó el cálculo de los cuadrados medios y el nivel de significancia
respecto a la prueba F con un nivel de confianza del 95 % (Anexo VI).
Tabla 6. Repetibilidad para nitrógeno.
Nivel F experimental F crítico Diferencia Coeficiente de variación %
1 0,951 4,74 NO 3,74
2 0,985 4,74 NO 1,77
3 1,008 4,74 NO 1,22
Fuente. La Autora.
Se alcanzó un F crítico mayor al F experimental en todos los casos, lo que nos indica que
no existe diferencia significativa en el método, cumpliendo con el criterio de aceptación
que nos dice que el F crítico debe ser mayor al F experimental y verificando lo establecido
por el Department of Health and Human Services Food and Drug Administration (2001) y
Arriola (2012) que manifiesta que existe repetibilidad en el método cuando el coeficiente
de variación es menor al 15%.
Reproducibilidad
En la Tabla 7 podemos observar los resultados del análisis de reproducibilidad de
nitrógeno para los distintos niveles, donde se realizó la prueba Fisher, teniendo como
resultado que el F crítico es mayor al F experimental para los distintos niveles,
demostrando que no existe diferencia estadística significativa (p<0,05) (Anexo VII)
37
Tabla 7. Reproducibilidad de nitrógeno. Prueba F para varianza.
Nivel Media F experimental F Crítico Diferencia
1 29,34 1,028 6,38 NO
2 45,82 0,983 6,38 NO
3 103,32 O,998 6,38 NO
Fuente. La Autora.
La Tabla 8 nos indica la reproducibilidad del método, ya que no existe diferencia
estadística significativa debido a que el T crítico es mayor al T experimental, cumpliendo
el criterio de aceptación, el cual manifiesta que el T crítico debe ser mayor que el T
experimental, confirmando así la reproducibilidad del método.
Tabla 8. Reproducibilidad de nitrógeno. Prueba T para 3 variables.
Nivel T Calculado T Crítico Diferencia
1 0,4 2,35 NO
2 0,6 2,35 NO
3 0,9 2,35 NO
Fuente. La Autora.
Recuperación
Para establecer la recuperación del método (Tabla 9) se realizó 10 análisis de muestras
de hojas de tomate de árbol, para obtener el valor del analito que se encuentra en la
matriz. La muestra se enriqueció con estándar de nitrógeno en distintas concentraciones
(1,25; 2,5 y 5 ppm). Para cada nivel de concentración se prepararon 10 muestras
independientes. Los datos obtenidos se analizaron introduciéndolos en la fórmula de
porcentaje de recuperación (Travieso et al., 2011). Para su determinación se evaluó en
base a la cantidad de recuperación obtenida. (Anexo VIII).
38
Tabla 9. Recuperación para nitrógeno.
N° Muestra Concentraciones más muestra Recuperación %
Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
1,25 ppm 2,5 ppm 5 ppm
1 0,257 0,303 0,337 0,424 92,00 80,00 83,50
2 0,259 0,307 0,339 0,422 96,00 80,00 81,50
3 0,252 0,305 0,340 0,421 106,00 88,00 84,50
4 0,258 0,307 0,340 0,421 98,00 82,00 81,50
5 0,256 0,305 0,338 0,421 98,00 82,00 82,50
6 0,258 0,307 0,339 0,422 98,00 81,00 82,00
7 0,259 0,305 0,339 0,422 92,00 80,00 81,50
8 0,252 0,304 0,339 0,426 104,00 87,00 87,00
9 0,258 0,303 0,338 0,425 90,00 80,00 83,50
10 0,256 0,306 0,341 0,422 100,00 85,00 83,00
Media 97,40 82,50 83,05
Fuente. La Autora.
El porcentaje de recuperación esperado debe encontrarse entre un 80 % y 120 %, según
la ecuación de Horwitz (Rivera., et al., 2001 y Jurado, 2008). En cada una de las
determinaciones de nitrógeno los porcentajes de recuperación se encuentran dentro del
rango establecido; como se puede observar en la Tabla 9 ningún valor es mayor al 120 %
o menor al 80 %.
Gráfico control
Con los datos obtenidos en la Tabla 9 se realizó el gráfico control de recuperación que se
presenta en la Figura 8.
39
Figura 8. Gráfico control para nitrógeno. Fuente. La Autora.
Todos los datos obtenidos del análisis de recuperación para nitrógeno están dentro de los
puntos máximos y mínimos en el gráfico de control.
Incertidumbre
En la Figura 9 se muestra la fuente de incertidumbre para nitrógeno que han sido
identificadas en el transcurso de la validación (Ver anexo IX).
Figura 9. Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de nitrógeno. Fuente. La Autora.
2. V muestra
U calibración
U temperatura
U repetibilidad
3. U V aforo
U calibración
U temperatura
U repetibilidad
4. U concentración
U sol. Trabajo
U regresión
5. U repetibilidad
U Tiempo
U reacción
U equipo
1. V alicuota
U repetibilidad
U temperatura
NITROGENO
40
En la Tabla 10 se presenta la incertidumbre de validación de nitrógeno, los resultados
obtenidos se muestran por nivel de trabajo. La incertidumbre expandida reporta un 95%
de confianza en el valor del método.
Tabla 10. Incertidumbre nitrógeno
Concentración mg/l U expandida mg/l
25 1,845882
50 1,736126
75 1,697964
100 1,736126
125 1,845882
Fuente. La Autora.
Discusión del método usado para nitrógeno
El método Kjeldahl ha sido y sigue siendo usado por varios autores; por ejemplo
Rodríguez et al. (1997) realiza análisis foliares en un cultivo de tomate de riñón para
estimar las concentraciones de nitrógeno y clorofila; mencionando que el método para
analizar el N foliar es el de Kjeldahl. El autor da a conocer que los resultados obtenidos
tanto en análisis como en correlaciones son satisfactorios. En otro estudio realizado por
Alonso et al. (2008) en una población de Laurus nobilis en Galicia también determinan el
N foliar por Kjeldahl en esta especia, mostrando resultados satisfactorios para el método.
Por otra parte cabe mencionar y recalcar que la metodología de análisis foliar para N es
usada por autores como Calderón y Pavlona (2001), Bremer (1982) y Cadahia (2008), los
cuales recomiendan el uso de estas metodologías, ya que ellos han también han validado
el método. El método micro-Kjeldahl y Espectrofotometría UV-V. utilizado en este trabajo
es una simple variación del método micro-Kjeldahl mencionado anteriormente y certificado
por otros laboratorios de análisis químicos en plantas como Panreac de España
(www.panreac.com).
Como podemos ver los resultados de los autores antes mencionados son satisfactorios lo
que reafirman todo el proceso de establecimiento y validación de este trabajo; por lo cual
se puede decir que el método es aceptado.
41
3.2. Resultado validación de fósforo
Los resultados presentados a continuación muestran la validación del método, en el cual
se ha examinado: límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, repetibilidad,
reproducibilidad, recuperación e incertidumbre.
Título del método analítico
Determinación de fósforo por el método molibdato vanadato de amonio por
Espectrofotometría UV-V.
Resultados del estudio de validación
Linealidad
Se realizó la curva de calibración del método, para esto se prepararon soluciones de
diferentes concentraciones de estándar de fósforo puro, con los valores que podemos
observar en la Tabla 11 se pudo determinar la linealidad del método (Ver anexo IV).
Tabla 11. Valores de fósforo para la curva de calibración (linealidad).
X Concentración (mg/l) Y Absorbancia
0,05 0,307
0,1 0,310
0,15 0,314
0,2 0,317
0,25 0,322
Fuente. La Autora.
En la Figura 10 observamos la curva de calibración del método, en la cual obtuvimos una
pendiente (y) de 0,0726 y una intersección con el eje x de 0,3031, así mismo con un
coeficiente de correlación (r2) de 0,998. Por lo que podemos decir que el método cumple
con lo requerido, cumpliendo el criterio establecido por la Oficina de las Naciones Unidas
Contra la Droga y el Delito (2010) y Gutiérrez et al. (2000) que debe existir una relación
directamente proporcional entre la respuesta obtenida cuando se aplica el método y la
concentración del analito en la matriz dentro del rango de concentraciones del analito
buscado y el coeficiente de correlación debe ser mayor a 0,99.
42
Figura 10. Curva de calibración de fósforo. Fuente. La Autora.
Límite de detección (LDD) y cuantificación (LDQ)
Se analizaron 10 blancos (agua destilada) obteniendo así el límite más bajo que en el que
puede ser detectado el analito. En la Tabla 12 se muestran los resultados obtenidos para
el límite de detección y el límite de cuantificación (Ver anexo V).
Tabla 12. LDD y LDQ para fósforo
N° Ensayos Blancos para P
1 0,086
2 0,090
3 0,099
4 0,099
5 0,090
6 0,086
7 0,088
8 0,086
9 0,095
10 0,094
Media 0,091
S(des stand) 0,005
%CV 0,056
LDD 0,106
LDQ 0,117
Fuente. La Autora.
Los resultados obtenidos para fósforo, alcanzaron un límite de detección con
concentración de absorbancia de 0,106; siendo esta la cantidad mínima de analito en la
muestra que puede ser detectable, y un límite de cuantificación con concentración de
absorbancia de 0,117; siendo el límite de cuantificación la cantidad mínima de fósforo en
una muestra que puede cuantificarse. Por lo tanto se considera que el método es capaz
43
de detectar y cuantificar de manera confiable cantidades mínimas de fósforo en una
muestra. Cumpliendo así lo señalado por el Instituto de Salud Pública (2010) y Herrera et
al. (2004) donde nos dice que el LDD debe ser menor al LDQ.
Repetibilidad
En la Tabla 13 se presentan los datos obtenidos del análisis de repetibilidad. En el cual se
realizó la prueba de varianza ANOVA mostrando resultados satisfactorios y similares para
los tres niveles, Se realizó el cálculo de los cuadrados medios y el nivel de significancia
respecto a la prueba F con un nivel de confianza del 95% (Ver anexo VI).
Tabla 13. Repetibilidad para fósforo.
Nivel F experimental F crítico Diferencia Coeficiente de
variación %
1 0,175 4,74 NO 10,59
2 0,4698 4,74 NO 7,98
3 0,0538 4,74 NO 4,9
Fuente. La Autora.
Se alcanzó un F crítico mayor al F experimental en todos los casos, lo que nos indica que
no existe diferencia estadística significativa en el método, cumpliendo con el criterio de
aceptación que nos dice que el F crítico debe ser mayor al F experimental y verificando lo
establecido por el Department of Health and Human Services Food and Drug
Administration (2001) y Arriola (2012) que manifiesta que existe repetibilidad en el método
cuando el coeficiente de variación es menor al 15%.
Reproducibilidad
En la Tabla 14 se muestra los resultados del análisis de reproducibilidad donde se realizó
la prueba Fisher, obteniendo como resultado que el F crítico es mayor al F experimental
para los distintos niveles, demostrando que no existe diferencia significativa (Ver anexo
VII).
Tabla 14. Reproducibilidad de fósforo. Prueba F para varianza.
Nivel Media F
experimental F Crítico Diferencia
1 0,0946 0,951 6,38 NO
2 0,1525 0,985 6,38 NO
3 0,0506 1,008 6,38 NO
Fuente. La Autora.
44
En la Tabla 15 podemos observar la reproducibilidad del método, ya que no existe
diferencia estadística significativa debido a que el T crítico es mayor al T experimental,
cumpliendo el criterio de aceptación, el cual nos dice que el T crítico debe ser mayor que
el T experimental, confirmando así la reproducibilidad del método.
Tabla 15. Reproducibilidad de fósforo. Prueba T para 3 variables.
Nivel T Calculado T Crítico Diferencia
1 0,47 2,35 NO
2 0,35 2,35 NO
3 0,92 2,35 NO
Fuente. La Autora.
Recuperación
Para establecer la recuperación del método se realizó por triplicado el análisis de
muestras de hojas de tomate de árbol para así obtener el valor del analito que se
encuentra en la matriz, se enriqueció a la muestra base con estándar de fósforo en
distintas concentraciones de estándar puro de fósforo (0,1, 0,15 y 0,20 ppm), para cada
nivel de concentración se prepararon 10 muestras independientes. Los datos obtenidos se
analizaron introduciéndolos en la fórmula de porcentaje de recuperación (Travieso, et al
2011) (Ver anexo VIII). Para su determinación se evaluó en base a la cantidad de
recuperación obtenida (Tabla 16).
Tabla 16. Recuperación para fósforo.
N° Muestra Concentraciones Recuperación %
Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
0,1 ppm 0,15 ppm 0,2 ppm
1 0,304 0,311 0,315 0,318 87,50 91,67 87,50
2 0,302 0,31 0,315 0,318 100,00 108,33 100,00
3 0,301 0,309 0,313 0,316 100,00 100,00 93,75
4 0,302 0,309 0,314 0,317 87,50 100,00 93,75
5 0,303 0,31 0,314 0,317 87,50 91,67 87,50
6 0,302 0,31 0,315 0,318 100,00 108,33 100,00
7 0,301 0,308 0,314 0,317 87,50 108,33 100,00
8 0,302 0,309 0,313 0,318 87,50 91,67 100,00
9 0,303 0,31 0,315 0,318 87,50 100,00 93,75
10 0,303 0,311 0,313 0,317 100,00 83,33 87,50
Media 92,50 83,33 94,38
Fuente. La Autora.
45
El porcentaje de recuperación esperado debe encontrarse entre un 80% y 120% según la
ecuación de Horwitz (Rivera et al., 2001 y Jurado, 2008). En cada una de las
determinaciones de fósforo los porcentajes de recuperación se encuentran dentro del
rango establecido, Como se puede observar en la Tabla 15 ninguno es mayor al 120 % o
menor al 80 % en cada una de las concentraciones.
Gráfico control
Con los datos obtenidos en la Tabla 15 se realizó el gráfico control de recuperación que
se presenta en la Figura 11.
Figura 11. Gráfico control para fósforo. Fuente. La Autora.
Como podemos observar en la figura 11 los tres niveles de fósforo se encuentra dentro de
los puntos máximos y mínimos del gráfico de control.
Incertidumbre
En la Figura 12 se muestran las fuentes de incertidumbre para fósforo que han sido
identificadas en el transcurso de la validación (Ver anexo IX).
46
Figura 12. Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de fósforo. Fuente. La Autora
En la Tabla 17 se presenta la incertidumbre de validación de fósforo, los resultados
obtenidos se muestran por nivel de trabajo. La incertidumbre expandida reporta un 95%
de confianza en el valor del método.
Tabla 17. Incertidumbre fósforo.
Fuente. La Autora.
Discusión metodología de fósforo
El método de molibdato vanadato de amonio ha sido utilizado por diferentes autores como
Guerra et al. (2002) donde determina el contenido foliar de elementos nutricionales en tres
clones de guayaba, en el que el análisis utilizado para analizar la concentración de P es el
de molibdato vanadato de amonio, dando resultados satisfactorios para el método.
2. V muestra
U calibración
U temperatura
U repetibilidad
3. U V aforo
U calibración
U temperatura
U repetibilidad
4. U concentración
U sol. Trabajo
U regresión
5. U repetibilidad
U Tiempo
U reacción
U equipo
FOSFORO
2. V alícuota
U temperatura
U repettibilidad
Concentración mg/l U expandida mg/l
0,05 0,005671
0,1 0,005333
0,15 0,005216
0,2 0,005333
0,25 0,005671
47
Así mismo Bream et al. (2012) realiza un estudio del contenido mineral en hojas de
morera obtenidas durante el otoño y primavera, en el cual también determina la
concentración de P por el método de molibdato vanadato de amonio, mostrando
resultados satisfactorios en el análisis.
Otro estudio realizado por Delgado et al. (2012) compara la relación entre la nutrición de
plantas de las accesiones Patía, Cítrica y Típica de Lippia origanoides, donde determina
la cantidad de P presente en cada una de estas especies, para lo cual utiliza el método de
molibdato vanadato de amonio y obtiene resultados correctos y satisfactorios con este
método.
Cabe mencionar que la metodología utilizada en este trabajo de investigación para la
determinación de P ya ha sido validada por Calderón y Pavlona (2001), siendo así
recomendada para los análisis de foliares.
Como podemos observar los resultados de los autores antes mencionados son
satisfactorios, lo que confirma todo el proceso de establecimiento y validación, de este
trabajo, el mismo que ha cumplido satisfactoriamente las diferentes pruebas de validación
por el cual el método es aceptable y confiable.
3.3. Resultado de validación de potasio
Los resultados presentados a continuación muestran la validación del método, en el cual
se ha examinado: límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, repetibilidad,
reproducibilidad, recuperación e incertidumbre.
Título del método analítico
Método por Absorción Atómica
Resultados del estudio de validación
Linealidad
Para determinar la linealidad del método se hizo una curva de calibración con los datos de
la Tabla 18, para esta curva se prepararon soluciones estándar de potasio de diferentes
concentraciones (Ver anexo IV).
48
Tabla 18. Valores de potasio para la curva de calibración (linealidad).
X Concentración (mg/l) Y Absorbancia
0,2 0,058
0,4 0,113
0,7 0,182
1 0,263
Fuente. La Autora.
En la Figura 13 se observa la curva de calibración del método, en la cual obtuvimos que la
pendiente (y) es igual a 0,2531 y la intersección con el eje x es igual 0,0085; así mismo
con un coeficiente de correlación (r2) de 0,998. Por lo que podemos decir que el método
cumple con lo requerido, cumpliendo el criterio establecido por la Oficina de las Naciones
Unidas Contra la Droga y el Delito (2010) y Gutiérrez et al. (2000) que debe haber una
relación directamente proporcional entre la respuesta obtenida cuando se aplica el
método y la concentración del analito en la matriz dentro del rango de concentraciones del
analito buscado y el coeficiente de relación debe ser mayor a 0,99.
Figura 13. Curva de calibración de potasio. Fuente. La Autora.
Límite de detección (LDD) y cuantificación (LDQ)
Para determinar tanto el límite de detección como el límite de cuantificación de potasio se
hizo la lectura de 10 blancos (agua destilada) obteniendo así el límite más bajo en el que
puede ser detectado el analito como podemos observar en la Tabla 19 (Ver anexo V).
49
Tabla 19. LDD y LDQ para potasio.
N° Ensayos Blancos para K
1 0,08
2 0,013
3 0,07
4 0,031
5 0,017
6 0,013
7 0,015
8 0,018
9 0,022
10 0,014
S(des stand) 0,025
%CV 0,85
LDD 0,103
LDQ 0,153
Fuente. La Autora.
Se determinó el límite de detección en la concentración de 0,103 mg/Kg; siendo ésta la
cantidad mínima de potasio en la muestra que puede ser detectada y un límite de
cuantificación de 0,153 mg/Kg siendo la cantidad mínima de potasio en una muestra que
puede cuantificarse. De esta forma se determina que el método es capaz de detectar y
cuantificar de manera confiable cantidades mínimas de potasio en una muestra.
Cumpliendo así lo señalado por el Instituto de Salud Pública (2010) y Herrera et al. (2004)
donde nos dice que el LDD debe ser menor al LDQ.
Repetibilidad
Se presentan los datos obtenidos del análisis de repetibilidad en la Tabla 20. En el cual se
realizó la prueba de varianza ANOVA mostrando resultados satisfactorios y similares para
los tres niveles. Se realizó el cálculo de los cuadrados medios y el nivel de significancia
respecto a la prueba F con un nivel de confianza del 95 % (Ver anexo VI).
50
Tabla 20. Repetibilidad para potasio.
Nivel F experimental F crítico Diferencia Coeficiente de variación
%
1 0,3769 4,74 NO 0,47
2 0,4838 4,74 NO 0,65
3 0,2676 4,74 NO 0,42
Fuente. La Autora.
Se alcanzó un F crítico mayor al F experimental en todos los casos, lo que nos indica que
no existe diferencia significativa en el método, cumpliendo con el criterio de aceptación
que nos dice que el F Crítico debe ser mayor al F experimental y verificando lo
establecido por el Department of Health and Human Services Food and Drug
Administration (2001) y Arriola (2012) que manifiesta que existe repetibilidad en el método
cuando el coeficiente de variación es menor al 15%.
Reproducibilidad
En la Tabla 21 se muestra los resultados del análisis de reproducibilidad donde se realizó
la prueba Fisher, teniendo como resultado que el F crítico es mayor al F experimental
para los distintos niveles, demostrando que no existe diferencia estadística significativa
(Ver anexo VII).
Tabla 21. Reproducibilidad de potasio. Prueba F para varianza.
Nivel Media F experimental F Crítico Diferencia
1 0,6706 1,000 6,38 NO
2 0,7146 1,027 6,38 NO
3 0,0506 1,012 6,38 NO
Fuente. La Autora.
En la Tabla 22 podemos observar y confirmar la reproducibilidad del método, donde el T
crítico es mayor al T experimental por lo tanto no existe diferencia significativa,
cumpliendo así el criterio de aceptación, el cual manifiesta que el T crítico debe ser mayor
que el T experimental.
51
Tabla 22. Reproducibilidad de potasio. Prueba T para 3 variables.
Fuente. La Autora.
Recuperación
Para establecer la recuperación del método se realizó 10 análisis de muestras de hojas de
tomate de árbol para así obtener el valor del analito que se encuentra en la matriz, se
enriqueció a la muestra base con estándar de potasio puro en distintas concentraciones
(0,20; 0,40 y 0,60 ppm), para cada nivel de concentración se prepararon 10 muestras
independientes. Los datos obtenidos se analizaron introduciéndolos en la fórmula de
porcentaje de recuperación (Travieso et al., 2011) Para su determinación se evaluó en
base a la cantidad de recuperación obtenida (Ver anexo VIII).
Tabla 23. Recuperación para potasio.
N° Muestra Concentraciones Recuperación
Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
0,2 ppm 0,4 ppm 0,6 ppm
1 0,173 0,1774 0,1810 0,1850 110,00 100,00 100,00
2 0,174 0,1780 0,1825 0,1865 100,00 106,25 104,17
3 0,173 0,1769 0,1813 0,1860 97,50 103,75 108,33
4 0,174 0,1780 0,1828 0,1872 100,00 110,00 110,00
5 0,174 0,1779 0,1820 0,1870 97,50 100,00 108,33
6 0,174 0,1780 0,1824 0,1872 100,00 105,00 110,00
7 0,175 0,1790 0,1820 0,1860 100,00 87,50 91,67
8 0,174 0,1772 0,1810 0,1860 80,00 87,50 100,00
9 0,175 0,1790 0,1830 0,1882 100,00 100,00 110,00
10 0,173 0,1768 0,1812 0,1861 95,00 102,50 109,17
Media 98,00 100,25 105,17
Fuente. La Autora.
El porcentaje de recuperación esperado debe encontrarse entre 80% y 120%, esto según
la ecuación de Horwitz (Rivera et al., 2001) y (Jurado, 2008). En cada una de las
determinaciones de potasio los porcentajes de recuperación se encuentran dentro del
Nivel T Calculado T Crítico Diferencia
1 0,7808 2,35 NO
2 0,2887 2,35 NO
3 0,3771 2,35 NO
52
rango establecido, Como se puede observar en la Tabla 23 ninguno es mayor al 120 % o
menor al 80 % en cada una de las concentraciones.
Gráfico control
Con los datos obtenidos en la Tabla 23 se realizó el gráfico control de recuperación que
se presenta en la Figura 14.
Figura 14. Gráfico control para potasio. Fuente. La Autora.
En la Figura 14 podemos observar que los tres niveles de potasio se encuentran dentro
de los límites máximos y mínimos del gráfico control.
Incertidumbre
En la Figura 15 se muestran las fuentes de incertidumbre para potasio que han sido
identificadas en el transcurso de la validación (Ver anexo IX).
53
Figura 15. Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de potasio. Fuente. La Autora.
En la Tabla 24 se presenta la incertidumbre de validación de potasio, los resultados
obtenidos se muestran por nivel de trabajo. La incertidumbre expandida reporta un 95%
de confianza en el valor del método.
Tabla 24. Incertidumbre potasio.
Concentración mg/l
U expandida mg/l
0,2 0,126588
0,4 0,129095
0,6 0,139439
Fuente. La Autora.
Discusión de metodología de potasio
El método de potasio por absorción atómica ha sido y sigue siendo muy utilizado por
diferentes autores, un ejemplo de ello es Schroeder (2011) que realizó la determinación
de las concentraciones foliares y dinámica estacional de nutrientes en Petiveria
alliacea L., mencionando que el método utilizado para determinar el K es por absorción
atómica, el autor nos da a conocer que los resultados obtenidos en los análisis son
satisfactorios.
2. V muestra
U calibración
U temperatura
U repetibilidad
3. U V aforo
U calibración
U temperatura
U repetibilidad
4. U concentración
U sol. Trabajo
U regresión
5. U repetibilidad
U Tiempo
U reacción
U equipo
1. U fd
U calib. U temp. U repet. U calib. U temp. U repet.
U aforo U alícuota
POTASIO
54
En otro estudio realizado por Molero et al. (2008) determina los niveles de N, P, K, Ca,
Mg, Zn, Cu, Fe, y Mn en tejido foliar del cultivo Musa AAB, en el cual el método utilizado
para la determinación de K también fue por absorción atómica, el cual arrojó resultados
confiables para la investigación efectuada.
Así mismo, el método realizado en este trabajo de K por absorción atómica ha sido
establecido y validado por Calderón (2001) y utilizado por la CNA (2004), los que
recomiendan el uso de esta metodología.
Todos los resultados de los autores antes mencionados son satisfactorios lo que reafirma
todo el proceso de establecimiento y validación de este trabajo de investigación, por lo
que se puede decir que el método es confiable y aceptable para su aplicación.
En nuestro caso los análisis de K han resultado con cierta variabilidad entre las
repeticiones, sin mostrar diferencias significativas; estas posibles variaciones de lecturas
de K entre las repeticiones realizadas se atribuye posiblemente a factores como: la
calibración del equipo, lectura de diferentes parámetros en el mismo equipo y de
diferentes tipos de muestras y a que la cantidad de K que posee la muestra usada pueda
ser muy baja.
Resultados para el tercer objetivo
Realizar correlaciones entre los resultados de análisis de tejidos foliares frente a
los resultados de suelos.
3.4. Resultados de análisis de suelos y foliares
Las siguientes Tabla 25 y 26 muestran los resultados obtenidos y sus interpretaciones
para los análisis de suelos del cultivo de tomate de árbol.
Tabla 25. Porcentajes de nutrientes en el suelo del cultivo de tomate de árbol.
Repetición N (mg/Kg)
N (%)
P (mg/Kg)
P (%)
K (mg/Kg)
K (cmol/Kg)
K (%)
1 2499,8 0,25 2,79 0,00027 439,5 1,13 0,043
2 2059,8 0,21 1,38 0,00014 502,5 1,29 0,050
3 2088,8 0,21 1,74 0,00017 410,0 1,05 0,041
Fuente. La Autora.
55
Tabla 26. Interpretaciones de los resultados obtenidos en suelos (Tabla 25).
Interpretación N (mg/Kg)
N (%)
P (mg/Kg)
P (%)
K (mg/Kg)
K (cmol/Kg)
K (%)
1 Medio Bajo Alto
2 Medio Bajo Alto
3 Medio Bajo Alto
Fuente. La Autora.
3.5. Resultados de análisis foliares (Cultivo de tomate de árbol).
Tabla 27. Porcentajes de nutrientes en la planta del cultivo de tomate de árbol.
Nro. N
(mg/Kg) N
(%) P
(mg/Kg) P
(%) K
(mg/Kg) K
(cmol/Kg) K
(%)
1 31870,58 3,187 391,15 0,039 136,25 0,349 0,014
2 32213,72 3,221 398,11 0,040 135,00 0,346 0,014
3 32066,66 3,207 389,16 0,039 135,00 0,346 0,014
4 32703,92 3,270 387,67 0,039 136,25 0,349 0,014
5 31870,58 3,187 391,15 0,039 137,50 0,353 0,014
6 33047,05 3,305 378,72 0,038 137,50 0,353 0,014
7 32360,78 3,236 384,19 0,038 138,75 0,356 0,014
8 32360,78 3,236 382,20 0,038 140,00 0,359 0,014
9 32360,78 3,236 391,15 0,039 136,25 0,349 0,014
10 32556,86 3,256 378,72 0,038 137,50 0,353 0,014
Fuente. La Autora.
Tabla 28. Interpretaciones de los resultados obtenidos en foliares (Tabla 25) (Ver anexo X).
Repetición N
(mg/Kg) N
(%) P
(mg/Kg) P
(%) K
(mg/Kg) K
(cmol/Kg) K
(%)
1 normal deficiente Deficiente
2 normal deficiente Deficiente
3 normal deficiente Deficiente
4 normal deficiente Deficiente
5 normal deficiente Deficiente
6 normal deficiente Deficiente
7 normal deficiente Deficiente
8 normal deficiente Deficiente
9 normal deficiente Deficiente
10 normal deficiente Deficiente
Fuente. La Autora.
56
En el siguiente apartado se menciona los resultados de análisis foliares en el cultivo:
Nitrógeno
No existe diferencia estadística significativa (p<0,05) entre muestras y repeticiones en
diferentes fechas de los análisis foliares, lo que indica que el método está funcionando de
manera adecuada. En la Figura 16 se puede observar los resultados obtenidos en los
análisis de este elemento. Las siglas R significan cada una de las repeticiones realizadas
en diferentes periodos de tiempo. Las letras sobre las barras de desviación estándar son
los diferentes grupos a los que pertenecen.
Figura 16. Resultados de las absorbancias de nitrógeno en análisis foliares (Ver anexo XI).
Fuente. La Autora.
Fósforo
De manera similar al N, no se aprecia diferencia estadística significativa (p<0,05) entre
muestras y repeticiones de los análisis foliares; por tal razón se puede nuevamente
verificar que el método de análisis foliar usado para el fósforo es el apropiado. En la
Figura 17 se ve los datos en los análisis de este elemento. Las siglas R significan cada
una de las repeticiones realizadas en diferentes periodos de tiempo. Las letras sobre las
barras de desviación estándar son los diferentes grupos a los que pertenecen.
57
Figura 17. Resultados de la absorbancias de fósforo en análisis foliares (Ver anexo XII).
Fuente. La Autora.
Potasio
Los análisis de K son los que mayores variaciones tuvieron entre repeticiones, mostrando
una pequeña inestabilidad en el método usado; sin embargo los análisis estadísticos no
mostraron diferencia estadística significativa (p<0,05); por lo que el método se cree
conveniente para su uso. En la Figura 18 se ve los datos en los análisis de este elemento.
Las siglas R significan cada una de las repeticiones realizadas en diferentes periodos de
tiempo. Las letras sobre las barras de desviación estándar son los diferentes grupos a los
que pertenecen.
Figura 18. Resultados de las absorbancias de potasio en análisis foliares (Ver anexo XIII). Fuente. La Autora.
58
3.6. Correlaciones entre nitrógeno, fósforo y potasio de la planta y suelo.
Para detectar correlaciones entre los contenidos de nutrientes en suelos y planta se
realizó análisis foliares del cultivo, con un total de 60 repeticiones, cabe recalcar que estos
análisis servirán solamente para el desarrollo de este objetivo (tres), además de fortalecer
la validación como la repetitibilidad y reproducibilidad de los análisis foliares establecidos.
Las muestras del cultivo de tomate de árbol y de los suelos de esta plantación han dado
como resultado lo siguiente:
Para las correlaciones, se usó una prueba de normalidad de Shapiro Wilk y una z score.
Una vez que se comprobó la normalidad de los datos se realizó un análisis de correlación
mediante la prueba de Pearson (r<0,05). Obteniendo como resultado que existen
correlaciones tanto positivas como negativas entre los macronutrientes de plantas y
suelos (Tabla 29). Sin embargo las correlaciones dadas no tienen diferencias significantes
en ninguno de los parámetros analizados.
Tabla 29. Correlaciones de Pearson para nitrógeno, fósforo y potasio entre planta y suelo.
N suelo P suelo K suelo
N planta Correlación de Pearson -0.906 -0.962 0.667
Sig. (bilateral) 0.278 0.176 0.535
P planta Correlación de Pearson -0.408 -0.548 0.992
Sig. (bilateral) 0.733 0.631 0.081
K planta Correlación de Pearson 0.996 0.970 -0.205
Sig. (bilateral) 0.055 0.157 0.869
Fuente. La Autora.
Discusión correlación entre análisis de suelo y planta
Nitrógeno
Con respecto al N se puede apreciar que tanto el suelo como la planta tienen contenidos
medios de este elemento, esto se puede evidenciar con observación directa en la planta
en campo, ya que ve que su crecimiento es adecuado; sin embargo se comienza ver
principios de deficiencias (Figura 20) esto posiblemente se deba a que este nutriente se
ve afectado por factores como: aportes externos de fertilizantes no acertados, formas
disponibles de N no están presentes en el suelo, y la extracción de la planta por cosecha.
Ansorena (1995) comenta que la concentración del N en el suelo puede ser afectada
debido a la absorción de la planta y microorganismos, a la fertilización realizada ya sea
59
orgánica o química, a lixiviación y pérdida gaseosa. En la parcela muestreada y como ya
se lo mencionó puede estar ocurriendo que el contenido medio de nitrógeno en planta y
suelo se deba a los factores ya comentados.
El contenido bajo de materia orgánica también puede ser otra causa de los principios de
deficiencias mostrados en la planta, ya que el suelo al recibir poco aporte de materia
orgánica el contenido de N ligado a la misma va a decrecer en valores (Figura 19).
Fósforo
El nutriente P tanto en el suelo y en la planta es bajo, las posibles razones para esto
puede ser a que el pH del suelo es ácido, lo cual disminuye la disponibilidad del P, otra de
las posibles razones podría ser la textura gruesa del suelo, ya que este tipo tiene menor
contenido de agua que el suelo de con textura fina a cualquier succión matriz, y por lo
tanto la difusión de P en la planta será menor. Todo esto concuerda con lo mencionado
por Sanzano (s/f) en su publicación técnica del fósforo del suelo; además menciona la
disponibilidad del P está ligada a la materia orgánica, ya que a mayor contenido de
materia orgánica mayor cantidad de P tanto en suelos como en plantas, lo que es otro
indicador del bajo contenido de este nutriente en suelos y plantas muestreados en este
trabajo (Figura 19).
Figura 19. Suelo desprovisto de materia orgánica en la plantación de tomate de árbol. Estación Agroecológica UTPL.
Fuente. La Autora.
Con respecto a la fertilización a base de fósforo en la estación agroecológica se puede
mencionar que la cantidad de fertilizante utilizado no es el adecuado para cumplir y
satisfacer las necesidades requeridas por el cultivo; esto se puede evidenciar en las
cantidades bajas que existe tanto en suelo como en planta. Ansorena (1995) dice que el P
añadido al suelo como fertilizante aumenta a inicios de la fertilización y posterior decrece
la cantidad de P disponible.
60
Figura 20. Deficiencias de macronutrientes en el cultivo de tomate de árbol. Fuente. La Autora.
En la figura 20 se aprecia deficiencias de P, ya que al observar el cultivo se ve en sus
hojas zonas distorsionadas y en algunos casos áreas muertas. Barbazan (1998) indica
que en general los síntomas de deficiencias en plantas aparecen en hojas ya sean
jóvenes o viejas, en la que las deficiencias se manifiestan en forma asimétrica y
relacionadas a las nervaduras, estas formas pueden ser difusas angulares y en algunos
casos se puede producir necrosis y muerte en la planta.
Potasio
En los contenidos de K se ve resultados opuestos, en el suelo existe niveles altos,
mientras en la planta los contenidos son bajos. Ansorena (1995) dice que el potasio junto
con el calcio es muy abundante en la corteza terrestre, comentando que la proporción de
este elemento va a depender de la naturaleza y grado de mineralización en suelo.
También indica que la capacidad del suelo para suministrar potasio a la planta va a
depender de la cantidad almacenada como reserva en forma intercambiable. Mientras que
para las plantas (Figura 20) se aprecia síntomas de deficiencia de potasio, viendo que los
síntomas aparecen en las hojas más viejas las cuales comienzan a volverse amarillas en
los bordes y más tarde se vuelven cafés e inclusive podrían llegar a arrugarse y verse
manchas necróticas.
Los valores altos en el suelo se puede mencionar que tal vez se deban a las altas
aplicaciones de muriato de potasio realizadas por los técnicos de la Estación
Agroecológica, por otro lado la textura del suelo al ser arcillosa va a retener más cantidad
de potasio. Uribe y Mestre (1976) ha registrado respuestas positivas con el aporte de
potasio al suelo cosa similar a lo que se piensa está ocurriendo en las parcelas para que
tenga altos contenidos de potasio en el suelo; mientras que se cree que los bajos
contenidos de potasio en la planta se deban a la gran extracción de la floración y
fructificación en las plantas.
61
De manera general se puede atribuir que existen balances desnutricionales en los suelos
y cultivo de tomate, indicando que estas falencias se puedan deber a que la fertilización
ha sido llevada únicamente con análisis físico químico de suelos, sin embargo no se han
realizado análisis foliares lo que sería de mucha importancia a la hora de realizar
dosificaciones en cada fertilización.
62
CAPÍTULO 4
CONCLUSIONES
63
En base a los análisis realizados en la validación se llegó a las siguientes
conclusiones:
Los métodos analíticos establecidos y validados presentaron resultados similares o
equivalentes, lo cual es favorable ya que ha permitido comprobar que los
procedimientos usados son útiles para la determinación de nitrógeno, fósforo y
potasio en plantas (análisis foliares) y por lo tanto pueden ser validados.
La exactitud, repetitibilidad, reproducibilidad y recuperación de los análisis
realizados son aceptables según los criterios considerados para la validación.
Pese a que existen correlaciones ya sea positivas o negativas entre los
macronutrientes de la planta y suelo, éstas no presentan diferencia significativa, lo
que hace pensar que la planta no solamente está absorbiendo nutrientes por la vía
edáfica, sino también posiblemente de la fertilización mineral, orgánica ya sea en
forma directa al suelo o por vía foliar.
64
CAPÍTULO 5
RECOMENDACIONES
65
La muestra seca y triturada debe estar guardada en una funda bien sellada y libre
de humedad.
Al momento de tomar la muestra necesaria para la digestión para cualquiera de los
métodos se debe homogenizar todo el contenido.
En el proceso de digestión deben desaparecer completamente los humos blancos
presentes en las muestras.
Realizar la lectura de absorbancia de las muestras lo más pronto posible y si se
necesita guardar las muestras cubrirlas con papel aluminio y guardarlas en un
lugar oscuro, ya que el exceso de luz puede afectar a las concentraciones de
nutrientes de la muestra.
Los reactivos utilizados deben ser preparados en el día para obtener mejores
resultados.
Utilizar celdas limpias y en lo posible sin rayaduras.
La revisión y calibración de equipos es necesaria para minimizar los errores de los
métodos.
Realizar ejercicios de validación en diferentes cultivos para reafirmar el adecuado
funcionamiento de los métodos.
66
CAPÍTULO 6
BIBLIOGRAFÍA
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72
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métodos espectrofotométricos para la cuantificación de taninos y flavonoides
(quercetina) en Psidium guajaba, L. Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad
de la Habana.
73
CAPÍTULO 7
ANEXOS
74
ANEXO I
Nitrógeno en foliares
INSTRUCTIVO
MUESTRA FRESCA
SECADO
Secar la muestra a (60˚C por 24h)
TAMIZADO
Tamizar la muestra con tamiz (2 mm)
PESADO
Pesar 0,10 g de muestra seca y triturada en un tubo de ensayo de 100 ml de aforo
DIGESTION
Adicionar 0,5 gramos de mezcla catalizadora
Adicionar 5 ml de ácido sulfúrico
Precalentar el equipo digestor a 100o C
Ubicar los tubos con la muestra en los orificios del equipo digestor y subir la temperatura
paulatinamente hasta llegar 350o C. Se toma como punto final de la digestión cuando
desaparecen los humos blancos y ya el digerido se encuentra totalmente trasparente
ENFRIAMIENTO
Apagar el equipo digestor y dejar enfriar los tubos por aproximadamente 30 minutos
Agregar aproximadamente 25 ml de agua destilada y se dejar enfriar nuevamente,
seguido se afora a 50 ml, se tapa con parafilm y se agita para homogenizar los
compuestos presentes.
75
Se coloca los tubos verticalmente para que se precipiten los sólidos existentes.
DETERMINACION
Tomar una alícuota de 2 ml del sobrenadante transparente y colocarlo en tubo de ensayo
Adicionar 8 ml de la solución de fenol
Adicionar 10 ml de la solución de hipoclorito de sodio
Agitar y se dejar reposar por 1 hora (Preferentemente en oscuridad) hasta que la muestra
genere color azul
Una vez generado el color leer el en el Espectrofotómetro a una longitud de onda de 660
nm.
76
ANEXO II
Fósforo en foliares
INSTRUCTIVO
MUESTRA FRESCA
SECADO
Secar la muestra a (60˚C por 24 h)
TAMIZADO
Tamizar la muestra con tamiz (2 mm)
PESADO
Pesar 0,50 g de muestra seca en un tubo de ensayo de 100 ml de aforo
DIGESTION
Adicionar 3 ml de mezcla ácida
Precalentar el equipo digestor a 50oC
Ubicar los tubos con la muestra en los orificios del equipo digestor y subir la
temperatura paulatinamente hasta 200o C; ya que a mayor temperatura se puede
volatizar el fósforo
Se toma como punto final de la digestión cuando desaparecen los humos blancos, y el
digerido se encuentre de color amarillo transparente
ENFRIAMIENTO
Apagar el equipo digestor y dejar enfriar los tubos por aproximadamente 30 minutos
Agregar aproximadamente 24,5 ml de agua destilada; se filtra con papel filtro en un balón
de 25 ml, y tapar con parafilm
77
DETERMINACION
Agitar la muestra y tomar una alícuota de 0,5 ml del filtrado de la digestión y colocar en un
tubo de ensayo
Adicionar 2 ml de agua destilada
Adicionar 1 ml de la solución Molibdato- Vanadato de Amonio, desarrollándose
inmediatamente el color amarillo, se deja 5 minutos en reposo (De preferencia en
oscuridad)
Leer en el Espectrofotómetro UV-V.isible a una longitud de onda de 430 nm.
78
ANEXO III
Potasio en foliares
INSTRUCTIVO
MUESTRA FRESCA
SECADO
Secar la muestra a (60˚C por 24 h)
TAMIZADO
Tamizar la muestra con tamiz (2 mm)
PESADO
Pesar 0,50 g de muestra seca en un tubo de ensayo de 100 ml de aforo
DIGESTION
Adicionar 3 ml de mezcla ácida
Precalentar el equipo digestor a 50o C
Ubicar los tubos con la muestra en los orificios del equipo digestor y subir la temperatura
paulatinamente hasta llegar 200o C, ya que a mayor temperatura se puede volatizar el
potasio
Se toma como punto final de la digestión cuando desaparecen los humos blancos y el
digerido se encuentra de color amarillo trasparente
ENFRIAMIENTO
Apagar el equipo digestor y dejar enfriar los tubos por aproximadamente 30 minutos
79
Agregar aproximadamente 24,5 ml de agua destilada; filtrar con papel filtro en un balón de
25 ml, y se tapa con parafilm
DETERMINACION
Agitar la muestra, tomar una alícuota de 0,5 ml del filtrado de la digestión, y colocarlo en
un balón de 50 ml
Adicionar 48,5 ml de agua destilada
Adicionar 1 ml de óxido de lantano al 5 %
Agitar y leer en el Espectrofotómetro de absorción atómica
80
ANEXO IV
Cálculo de linealidad para fósforo
X(Concentración fósforo en mg/l) Y (Absorbancia)
0,05 0,307
0,1 0,310
0,15 0,314
0,2 0,317
0,25 0,322
Cálculo de pendiente e intercepto
N° x (concentración
de fósforo en mg/l)
Y (Area Medida)
XY X^2
1 0,05 0,307 0,01535 0,0025
2 0,1 0,310 0,03101 0,01
3 0,15 0,314 0,04712 0,0225
4 0,2 0,317 0,06348 0,04
5 0,25 0,322 0,08038 0,0625
sumatoria 1 1,570 0,237 0
Pendiente
0,0726
Intercepto
81
Coeficiente de correlación
X(P) (X-x) (X-x)2
Y
Y-y (Y-y)2 (X-x)2(Y-
y)2
1 0,05 -0,10 0,01 0,307 -0,007 0,000 0,0007
2 0,1 -0,05 0,00 0,310 -0,004 0,000 0,0002
3 0,15 0,00 0,00 0,314 0,000 0,000 0,0000
4 0,2 0,05 0,00 0,317 0,003 0,000 0,0002
5 0,25 0,10 0,01 0,322 0,007 0,000 0,0007
Sumatoria 1
0 1,570 0,000 0,0018
media 0,15
0,314
√
√
0,99902
82
ANEXO V
Cálculo del límite de detección (fósforo)
N° Ensayos Blancos para P
1 0,086
2 0,090
3 0,099
4 0,099
5 0,090
6 0,086
7 0,088
8 0,086
9 0,095
10 0,094
Media 0,091
S(des stand) 0,005
%CV 0,056
LDD 0,106
LDQ 0,117
mg/l
Cálculo límite de cuantificación (fósforo)
mg/l
83
ANEXO VI
Cálculo de Repetibilidad (fósforo)
Nivel 1
Absorbancias
0,308 0,306 0,306
0,307 0,307 0,308
0,306 0,307 0,307
0,308
Concentraciones
0,0671 0,040 0,040
0,0533 0,053 0,067
0,0395 0,053 0,053
0,067
Promedio de absorbancias y concentraciones
n1 3 T1 0,160 T12 0,026
n2 3 T2 0,146 T22 0,021
n3 4 T3 0,227 T32 0,052
Sumatorias 10 Tt 0,533 Tt2 0,284
∑∑
84
SCT= 0,001
SCA= 0,00011067
SCE= 0,001
∑
85
ANEXO VII
Cálculo de reproducibilidad (fósforo)
Prueba F para varianza de muestras
A B A-A B-B (A-A)^2 (B-B)^2
1 0,067 0,053 6,71E-02 5,33E-02 4,50E-03 2,84E-03
2 0,053 0,040 5,33E-02 3,95E-02 2,84E-03 1,56E-03
3 0,040 0,067 3,95E-02 6,71E-02 1,56E-03 4,50E-03
4 0,040 0,053 3,95E-02 5,33E-02 1,56E-03 2,84E-03
5 0,053 0,067 5,33E-02 6,71E-02 2,84E-03 4,50E-03
Sumatoria 0,01331 0,01625
Desviación 0,05768 0,06373
Varianza 0,12008 0,12622
Prueba F
A B
Media 0,0506 0,0561
Varianza 5,37E-02 5,37E-02
Observaciones 5 5
Grados de Libertad
4 4
F 4,6576
Valor crítico F 6,38
Diferencia NO
VA
86
4,6597
Prueba t para dos variantes correlacionadas
A B X
1 0,067 0,053 0,014
2 0,053 0,040 0,014
3 0,040 0,067 -0,028
4 0,040 0,053 -0,014
5 0,053 0,067 -0,014
MEDIA 0,051 0,056 -0,00551
Desviación Estándar
0,01152424 0,01152424 0,018
Grados de libertad
4 4 9
=
= 0,00550964
= 9,9606E-05
= 0,5
87
ANEXO VIII
Cálculos recuperación (fósforo)
Fórmula para el cálculo de recuperación
88
ANEXO IX
Cálculos para incertidumbre (fósforo)
Incertidumbre debido al aforo
2. V muestra
U calibración
U temperatura
U repetibilidad
3. U V aforo
U calibración
U temperatura
U repetibilidad
4. U concentración
U sol. Trabajo
U regresión
5. U repetibilidad
U Tiempo
U reacción
U equipo
FOSFORO
2. V alícuota
U temperatura
U repettibilidad
Marca Volumen Tolerancia
GERMANY 25 ± 0,03
Repeticiones Volumen
24,3556 24,8554
24,4208 24,9219
24,5040 25,0068
24,5903 25,0949
24,4649 24,9669
24,5501 25,0539
24,5049 25,0078
24,5034 25,0062
24,5741 25,0784
24,5048 25,0077
Temp. ºC 20
d(g/ml) 0,9798916
S 0,0717695
89
Incertidumbre debido a la Alícuota
Marca Volumen Tolerancia
Pipeta 0,5 ± 0,03
Repeticiones Volumen
0,4920 0,5034
0,4875 0,4988
0,4811 0,4923
0,4821 0,4933
0,4900 0,5014
0,4923 0,5037
0,4933 0,5047
0,4861 0,4974
0,4852 0,4964
0,4971 0,5086
Temp. ºC 20
0,97734
S 0,005272919
√
√(
)
(
)
( )
√(
)
(
)
√
√(
)
(
)
( )
90
Incertidumbre del peso de muestra
Marca Volumen Tolerancia
GERMANY 0,5 ± 0,01
Repeticiones Volumen
0,4990 0,4989
0,5000 0,4999
0,5010 0,5009
0,5020 0,5019
0,4980 0,4979
0,4990 0,4989
0,5000 0,4999
0,5010 0,5009
0,5020 0,5019
0,4990 0,4989
Temp. ºC 20
g/ml 1,0002
S 0,001370046
√(
)
(
)
U calibración
U temperatura
U repetibilidad
√
√(
)
(
)
( )
91
Incertidumbre de la concentración
Incertidumbre debido a la solución de trabajo
Incertidumbre debido a la pureza
Descripción ppm
Fósforo ± 5
√(
)
(
)
92
Incertidumbre debido al balón de 50
Marca Volumen Tolerancia
GERMANY 50 ± 0,1
Repeticiones Volumen
49,8780 50,9015
49,2890 50,3005
49,3950 50,4086
49,7510 50,7719
49,9270 50,9516
49,1960 50,2056
49,7100 50,7301
49,7890 50,8107
49,9330 50,9577
49,7490 50,7699
Temp. ºC 20
g/ml 0,993234
S 0,274640081
Incertidumbre debido a la alícuota de 2,5 ml
√
√(
)
(
)
( )
√(
)
(
)
93
Marca Volumen Tolerancia
Pipeta/ BRAND 5 ± 0,03
Repeticiones Volumen
4,9870 5,4092
4,7990 5,2053
4,8210 5,2292
4,9810 5,4027
4,7900 5,1956
4,9660 5,3865
4,9870 5,4092
4,8990 5,3138
4,8910 5,3051
1,9760 2,1433
Temp. ºC 20
g/ml 0,92194
S 1,007290894
Incertidumbre combinada debido a la solución de trabajo
√(
)
(
)
(
)
√(
)
(
)
(
)
√
√(
)
(
)
( )
√(
)
(
)
94
Incertidumbre de la curva de calibración
Pendiente (m) 0,0726
Intersección con el eje x (b) 0,3031
Como ejemplo se tomó la concentración de 0,05 mg/l de fósforo
Incertidumbre combinada debido a la concentración
√∑
√
√
√
√(
)
(
)
√(
)
(
)
95
Incertidumbre de la repetibilidad
Incertidumbre combinada fósforo
Incertidumbre expandida de fósforo para concentración de 0,1 ppm
U= 0,0865 => 2%
5. U repetibilidad
U Tiempo
U reacción
U equipo
0,01016
√(
)
(
)
(
)
(
)
√(
)
(
)
(
)
(
)
96
ANEXO X
Tabla de interpretación análisis foliar de tomate
Concentraciones de nutrientes en hojas completamente desarrolladas, cercanas a las ápice de
crecimiento
ELEMENTO DEFICIENTE NORMAL ALTO UNIDAD
Nitrógeno <3.0 4.5-5.5 >5.6 %
Fósforo <0.17 0.3-0.8 >0.81 %
Potasio <2.5 3.1-5.1 >5.1 %
Calcio <1.5 2.5-4.0 >4.1 %
Magnesio <0.3 0.4-0.6 >0.61 %
Hierro <60 120-300 >301 ppm
Manganeso <40 61-350 >351 ppm
Cobre <4.0 8-15 >16 ppm
Zinc <15 20-79 >80 ppm
Boro <20 35-60 >61 ppm
97
ANEXO XI
Análisis de nitrógeno en foliares desviación estándar y z score
Repetición Nitrógeno media desvest Z score
1 0,252 -0,929
1 0,254 -0,051
1 0,253 -0,490
1 0,257 1,266
1 0,252 -0,929
1 0,259 2,144
1 0,255 0,388
1 0,255 0,388
1 0,255 0,388
1 0,256 0,255 0,002 0,827
2 0,252 -0,929
2 0,256 0,827
2 0,251 -1,368
2 0,254 -0,051
2 0,258 1,705
2 0,256 0,827
2 0,260 2,583
2 0,255 0,388
2 0,254 -0,051
2 0,258 0,255 0,003 1,705
3 0,253 -0,490
3 0,254 -0,051
3 0,254 -0,051
3 0,252 -0,929
3 0,253 -0,490
3 0,256 0,827
3 0,256 0,827
3 0,255 0,388
3 0,255 0,388
3 0,258 0,255 0,002 1,705
4 0,255 0,388
4 0,254 -0,051
4 0,253 -0,490
4 0,254 -0,051
4 0,252 -0,929
4 0,253 -0,490
4 0,256 0,827
98
4 0,253 -0,490
4 0,252 -0,929
4 0,256 0,254 0,001 0,827
5 0,253 -0,490
5 0,253 -0,490
5 0,253 -0,490
5 0,255 0,388
5 0,252 -0,929
5 0,254 -0,051
5 0,251 -1,368
5 0,255 0,388
5 0,253 -0,490
5 0,254 0,253 0,001 -0,051
6 0,250 -1,807
6 0,254 -0,051
6 0,255 0,388
6 0,250 -1,807
6 0,249 -2,246
6 0,250 -1,807
6 0,253 -0,490
6 0,256 0,827
6 0,258 1,705
6 0,253 0,253 0,003 -0,490
Figura de z score para nitrógeno
99
ANEXO XII
Análisis de fósforo en foliares, desviación estándar y z score
Repetición Fósforo 1 media desvest z score
1 0,307
0,526
1 0,311
1,930
1 0,306
0,175
1 0,305
-0,175
1 0,307
0,526
1 0,300
-1,930
1 0,303
-0,877
1 0,302
-1,228
1 0,307
0,526
1 0,300 0,305 0,004 -1,930
2 0,307
0,526
2 0,307
0,526
2 0,306
0,175
2 0,304
-0,526
2 0,308
0,877
2 0,306
0,175
2 0,307
0,526
2 0,307
0,526
2 0,304
-0,526
2 0,304 0,306 0,001 -0,526
3 0,306
0,175
3 0,307
0,526
3 0,307
0,526
3 0,311
1,930
3 0,309
1,228
3 0,307
0,526
3 0,305
-0,175
3 0,308
0,877
3 0,301
-1,579
3 0,301 0,306 0,003 -1,579
4 0,309
1,228
4 0,301
-1,579
4 0,310
1,579
4 0,304
-0,526
4 0,303
-0,877
4 0,302
-1,228
4 0,309
1,228
100
4 0,307
0,526
4 0,300
-1,930
4 0,304 0,305 0,004 -0,526
5 0,310
1,579
5 0,305
-0,175
5 0,300
-1,930
5 0,304
-0,526
5 0,304
-0,526
5 0,309
1,228
5 0,300
-1,930
5 0,304
-0,526
5 0,304
-0,526
5 0,307 0,305 0,003 0,526
6 0,306
0,175
6 0,306
0,175
6 0,307
0,526
6 0,307
0,526
6 0,308
0,877
6 0,306
0,175
6 0,305
-0,175
6 0,308
0,877
6 0,306
0,175
6 0,305 0,306 0,001 -0,175
Figura z score para fósforo
101
ANEXO XIII
Análisis de potasio en foliares, desviación estándar y z score
Repetición Potasio Media Desvest z score
1 0,109 -0,59985308
1 0,108 -0,96711007
1 0,108 -0,96711007
1 0,109 -0,59985308
1 0,110 -0,23259609
1 0,110 -0,23259609
1 0,111 0,1346609
1 0,112 0,50191788
1 0,109 -0,59985308
1 0,110 0,110 0,00126491 -0,23259609
2 0,112 0,31828939
2 0,110 -0,41622459
2 0,113 0,86917487
2 0,108 -0,96711007
2 0,113 0,86917487
2 0,114 1,23643186
2 0,113 0,68554638
2 0,109 -0,78348158
2 0,114 1,23643186
2 0,112 0,112 0,00219596 0,50191788
3 0,111 0,1346609
3 0,111 -0,0489676
3 0,115 1,60368885
3 0,107 -1,33436706
3 0,107 -1,33436706
3 0,112 0,50191788
3 0,109 -0,59985308
3 0,114 1,23643186
3 0,114 1,23643186
3 0,114 0,11135 0,0029632 1,23643186
4 0,110 -0,23259609
4 0,112 0,50191788
4 0,113 0,86917487
4 0,109 -0,59985308
4 0,110 -0,41622459
4 0,113 0,86917487
4 0,112 0,50191788
4 0,113 0,86917487
102
4 0,114 1,23643186
4 0,112 0,112 0,00168737 0,50191788
5 0,113 0,86917487
5 0,106 -1,70162405
5 0,106 -1,70162405
5 0,105 -2,06888104
5 0,110 -0,23259609
5 0,112 0,50191788
5 0,117 2,33820283
5 0,112 0,50191788
5 0,115 1,60368885
5 0,109 0,1105 0,00403457 -0,59985308
6 0,110 -0,23259609
6 0,108 -0,96711007
6 0,111 0,1346609
6 0,108 -0,96711007
6 0,108 -0,96711007
6 0,111 0,1346609
6 0,103 -2,80339501
6 0,113 0,86917487
6 0,109 -0,59985308
6 0,109 0,109 0,00266667 -0,59985308
Figura z score para potasio