Post on 02-Oct-2015
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Produccin de protenas recombinantes en cl eucariotasProblemas que suelen aparecer cuando protenas eucariticas se expresan en cl procariotasinestablessin actividad biolgicacontaminantes procariticos
Sistemas de expresin eucariotasPara eliminar los problemas de expresin en procariotas, se han desarrollado sistemas de expresin eucariotasEsp. importantes para protenas teraputicasNecesidad de que tengan idnticas propiedades a la protena natural : bioqumicas biofsicas funcionales
Sistemas de expresin eucariotasCul es la diferencia?Modificacin post-traduccional de la mayora de las protenas eucariotas Cl procariotas no pueden realizar estas modificaciones
Modificaciones post-traduccionalesFormacin de uniones disulfuro correctasClivaje proteoltico del precursor inactivoGlicosilacin- agregado de residuos de azcarAlteracin de aminocidos en la protenafosforilacinacetilacinagregado de grupos sulfatoAgregado de cidos grasos
Sistemas de expresin en levaduras: ventajasOrganismo unicelularBien caracterizadas gentica y fisiolgicamentePromotores fuertes disponiblesPlsmido natural (2m) Eucariotas, ocurren modificaciones post-transduccionalesSegregan algunas protenasNo patgeno
Vectores de levaduras
YIp: integrativos - una copia integrada a un cromosoma YEp: episomales- ori 2m (alto nmero de copias) YCp: centromricosARS, CEN (1 o 2 copias por cl)Todos tienen marcador de auxotrofia y son shuttle
Vectores episomalesSon ampliamente usadosA menudo inestables en cultivos a gran escala (>10L)
Estrategia - alterar las condiciones de crecimiento para estabilizar el vector episomalusar cepas mutantes que requieren nutrientes especficos.Leucina, Triptofano, Histidinael gen que provee el fenotipo salvaje se encuentra en el plsmido episomal
Promotores de levaduras PromoterStatus
Acid phosphatasePHO5InducibleAlcohol dehydrogenase IADH IConstitutiveAlcohol dehydrogenase IIADH IIInducibleGalctokinaseGAL 1InducibleMetallothioneinCup 1InduciblePhosphoglycerate kinasePGKConstitutiveTriose Phosphate isomeraseTPIConstitutive
Sistemas de expresin en levaduras: desventajasInestabilidad de plsmidos en gran escalaVectores episomalesSuperglicosilacin de glicoprotenas100+ residuos manosa vs. 8-13 normalpuede alterar la actividad de la protenaProtenas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared celular)se usan seales peptdicas
Soluciones a los problemas en sistemas de expresin en levadurasLevaduras modificadas genticamente para llevar a cabo glicosilacin = humanosScience Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003)Delecin de genes de glicosilacin de levadurasAgregado de genes de glicosilacin humanos
Soluciones a los problemas en sistemas de expresin en levadurasUsar otro tipo de levadurasPichia pastorisHansenula polymorphaNo slo Saccharomyces cerevisiaeUsar otros eucariotasCl de insectosCultivos de cl de mamferos