1-Fundamentos MS Lucas

1-FUNDAMENTOS DE

ESPECTROMETRIA DE MASAOrlando Lucas A.

Evolucin histrica de la instrumentacin analtica

Cromatografa2012

2012

Cromatografo Liquido acoplado a Espectrmetro de Masa (LC-MS)

LC-MS: combina el poder de separacin de lacromatografa Liquida con el poder de deteccin dela espectrometra de masa.

Espectrmetro de Masa: forma, identifica y separaiones en fase gaseosa de acuerdo a su valor m/z

Para superar las limitaciones de la deteccin no especfica.

Porque acoplar la Cromatografa con MS?

ANAISSHighlight

Porque acoplar la Cromatografa con MS?

Para Incrementar la especificidad del detector para unamejor identificacin y cuantificacin de los picos.

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Componentes del Espectrmetro de Masa

INTRODUCCIN DE MUESTRA

SISTEMA DE DATOS

Alto Vacio

Flujo HPLC

MS

1-FUENTE DE

IONESINTERFASE

2-ANALIZADOR

DE MASA3-

DETECTOR

Columna HPLC

API

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Funcionamiento del Espectrmetro de Masa

1- Fuente de Ionizacin

2- Analizador de Masa Cuadrupolar

3- Detector

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LC-MS produce informacin en 3-D

Cromatograma de Ion Total -TIC

Espectro individual de Barrido al Minuto 1.453

A

b

u

n

d

a

n

c

i

a

%

Minuto

Espectro continuo Versin reducida Centroide

Cromatograma de Ion Total - TIC

ANAISSHighlight

COMPONENTE TIPO

FUENTE DE IONES

Impacto Electrnico EIIonizacin Qumica CIIonizacin por Electrospray ESIIonizacin Qumica a Presin Atmosfrica APCIFotoionizacin a Presin Atmosfrica APPIDesorcin/ionizacin por Lser asistida por una matriz MALDI

ANALIZADOR DE MASA

Cuadrulopo QTrampa de Iones TrapTiempo de vuelo TOFSector MagnticoResonancia Ion-Ciclotron con Transformada de Fourier FT-MSAnalizadores hbridos Q-Tof, Q-q-Q, Q-Trap,

LC (API)GC

Tipos de Espectrmetro de Masa

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ANAISSHighlight

ANAISSHighlight

ANAISSSticky NoteCargas negativas y positivas

Alto vacio


1- FUENTE DE IONES INTERFASE

2-ANALIZADOR DE MASA 3-DETECTOR

SISTEMA DE DATOS

Ionizacin a Presin Atmosfrica-APILa muestra es desolvatada e ionizada bajocondiciones de presin atmosfrica. Ionizacin Qumica a Presin Atmosfrica- APCI. Fotoionizacin a Presin Atmosfrica-APPI. Ionizacin Electrospray- ESI.

Ionizacin Electrospray-ESI Envuelve la aplicacin de un campo elctrico a

travs de una interface que forma una celdaelectroqumica.

Los iones en solucin son transferidos a la fasegaseosa.

Oxidacin

Reduccin

Electrones

Alto Voltaje Electrones

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ANAISSHighlight

ANAISSHighlight

ANAISSHighlight

ANAISSHighlight

ANAISSHighlight

1. NEBULIZACIN: Produccin y expulsin de gotascargadas hacia la regin de desolvatacion.

2. DESOLVATACIN: Eliminacin de solvente de las gotas.3. PRODUCCIN DE IONES EN FASE GASEOSA.

Proceso ESI

Zona de produccin

de ion en fase de gas

Zona de desolvatacin donde se produce la Fisin

Coulumbica

Punta del capilar Cono de muestra

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1- Nebulizacin ESI

CAPILAR: dimetro interno y externo, forma de lapunta y material de construccin (metlico, silica, etc)

VOLTAJE DEL CAPILAR (Vc). ELUYENTE HPLC: Flujo, tensin superficial y

concentracin de electrolitos. GAS DE NEBULAZACION: Flujo y temperatura.

Los siguientes factoresinteractan para establecerun ESI reproducible:

Cono de Taylor

Alto Voltaje

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ANAISSSticky NoteIonizacin Electrospray

Voltaje del capilar (Vc) Modo Spray Axial (Voltaje optimo) Modo Rim Emission (Seal inestable) Descarga de corona (Baja relacin seal/ruido)

Potencial Electrosttico (kV)

2- Desolvatacin ESI

GAS DE DESOLVATACION(Drying Gas):Gas nitrgeno200500o C. 5-50 L/min.

FISION COLUMBICA

Zona de produccin de ion en

fase de gas

Zona de desolvatacin

Punta del capilar

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3- Produccin de iones en fase gaseosa.Factores que determinan el numero de cargas dentrode la gota (N) y el radio de la gota (R): ELUYENTE HPLC: Flujo y composicin GAS DE NEBULIZACION : Tipo y flujo GAS DE DESOLVATACION: Temperatura y flujo CAPILAR: Voltaje

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Diseo Ortogonal ESI VENTAJAS: Reduce el tiempo de inactividad de la fuente con

menor requerimiento de limpieza (ROBUSTEZ) Muestreo de menos gotas en relacin a los iones Tolera flujos altos (Hasta 1mL/min)

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Diseo Ortogonal Zeta Spray Waters

Gas de desolvatacion en la sonda

Punta del capilar

Capilar Electrospray

Efecto del gas de cono o Curtain Gas en ESI:Previene el ingreso de iones cluster al analizador de masa:

Efecto de la fragmentacin por voltaje de cono Obtener informacin estructural de la fragmentacin

de iones en la fuente Ayuda a eliminar iones cluster (Ion Declustering),

para incrementar la relacin seal/ruido en LC-MS

Efecto del gas de cono: reduccin de clusters

ESI (+)

ESI (-)

Ionizacin por Electrospray

Analitos disponibles para ESICOMPUESTOS: Que contienen Heteroatomos (Cl , Br)

Clorpirifos

Que producen una carga a travs de un efectoinductivo (Azocompuestos, ftalatos, opiaceos)

Compuestos capaces de contener cargasmltiples (protenas, pptidos)

Atrazine

COMPUESTOS: Ionizables (cidos, bases, etc)

Que tienen un fuerte momento dipolar pero queno se pueden ionizar (Aldehidos, eteres, etc).Formacin de aductos Na, K o MeCN.

Carbofuran 2,4-D

Analitos disponibles para ESI

Ionizacin en solucin en ESIIONES POSITIVOS: Son producidos por la adicin de unin positivo ( H+, NH4+, Na+).aductos.

+ H +

CarbofuranH

+

IONES NEGATIVOS: Son frecuentemente producidos por laremocin de un protn (Ion hidrogeno) de una molcula.

- H +

-

2,4-D

H

ESI trabaja mejor ensoluciones con altoporcentaje de solventesorgnicos (acetonitrilo ometanol), aunque lasolucin debe tener algode contenido acuoso yalgunos iones.

Ionizacin en solucin en ESI

Las molculas con gran tendencia a la ionizacinpresentan seales de electrospray ms fuertes; porello ciertos aditivos de la fase mvil, como la adicinde cido frmico, pueden mejoran las seales enel ESI+.

Oxidacin

Reduccin

Electrones

Alto Voltaje Electrones


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Solventes y aditivos usados en LC-MS-APICRITERIOS DE SELECCIN:Ionizacin.Volatilidad: Es mejor usar buffers voltiles.cidos: H2SO4, HCl, Acido metasulfonico. Puedendaar el instrumento y no deben ser usados. Se debeusar cidos orgnicos voltiles (TFA, frmico, actico)Formacin de aductos: Sodio, Amonio, AcetatoSurfactantes: Afecta la formacin del spray, laevaporacin de la gota y compite con la ionizacin.Concentracin de buffers: Mantenerlo tan bajo comosea posible (en el orden de mM). Si el buffer es muy altopuede ocurrir supresin inica.

Solventes y aditivos comunes en LC-MS-API

Agua Metanol

Acetonitrilo

Acido Frmico (

Intercambio de polaridad ESI

Ionizacin Qumica a Presin Atmosfrica-APCI

BLOQUE DE CALENTAMIENTO

(450 - 550C)

Gas nebulizador

(Alta velocidad)

Aguja de descarga de corona (2 - 3.5 kV) (corona pin)

Al

analizador

de Masa

Vacio

Desde el

LC

Gas de

Desolvatacin

APCI versus electrospray

APCI Electrospray

FragmentacinIonizacin ms vigorosa.

Se producen ms fragmentos

Ionizacin suave.

Se producen menos

fragmentos.

Tipos de

muestras

Bajo PM< 1000. Puede ser menos polar

Molculas pequeas y grandes.

Tiende a ser ms polar.

CargasUsualmente de carga

simple.Puede ser de carga mltiple.

Tasa de flujo 0.2 2 mL/min 0.001 1 mL/min.

Temperatura

Fuente : 120-140C

Sonda. 450-550C

Infusin: Fuente: 80C , Desolvatacin: 120C

HPLC: Fuente: 120C, Desolvatacin: 350C

ANAISSSticky NoteIonizacin por Electrospray ESIIonizacin Qumica a Presin Atmosfrica APCIFotoionizacin a Presin Atmosfrica APPI

PO

L

A

R

I

D

A

D

PESO MOLECULAR

BAJA

MEDIA

ALTA

1 kD 10 kD 100 kD

ESI

APCI

APPI

Dominios y aplicaciones de los tipos de ionizacin

Alto vacio




SISTEMA DE DATOS

Cuadrulopo Q Trampa de Iones Trap Tiempo de vuelo TOF Sector Magntico Doble Sector magntico-elctrico Analizadores hbridos Q-Tof, Q-q-Q,

Q-Trap, etc Resonancia Ion-Ciclotron con

Transformada de Fourier FT-MS Ion mobility Orbitrap

Tipos de Analizadores de masa

Los iones de diferente m/z son separados mediante unacombinacin de voltajes dc y rf (radiofrecuencia)

A un determinado valor de voltajes solamente una molcula devalor de m/z tiene una trayectoria estable

Analizador de masa cuadrupolar

Ion resonanteIon no resonante

Voltajes Dc y Rf

Rf y -dc

Rf y +dc

Detector

Fuente

Analizador de masa cuadrupolar

VOLTAJE RF

LINEA DE SCAN

924

923

922

V

O

L

T

A

J

E

D

C

PENDIENTE= WIDTH GAIN

WIDTHOFFSET

Diagrama de estabilidad del cuadrupolo

Uso de cuadrupolo como filtro de masas (U, V varan linealmente)

Uso de cuadrupolo como filtro de masas Ejemplo de una mejor lnea operacional (mejor resolucin)

Uso de cuadrupolo como filtro de masas Ejemplo de una lnea operacional ptima (ptima resolucin)

Mtodo de Ion Individual Mtodo de Ion Doble

Representa la habilidad para separar dos masas adyacentes.

50%

m= 0.3 Daltons deancho de pico

Ancho total a la mitad de la altura mxima

(FWHM) o a 50% de la altura del pico.

mR =

m

R = 279/0.3 = ~ 1 000

mR =

mr

R = 1 000/1 = ~ 1000

2 picos de iones adyacentes con un valle

mximo de 10%

Resolucin de masa

3 compuestos diferentes

Misma masa nominal

Baja resolucin

3 compuestos diferentes

3 diferentes masas exactas

Alta resolucin, alta exactitud.

mR =

mr

R = 249.07/0.0120 = ~ 20 000

249.0479

Resolucin y exactitud de masa

319.8 319.9 320.0 320.1 Mass

%

0

20

40

60

80

100 319.8965

319.8 319.9 320.0 320.1 Mass

%

0

20

40

60

80

100

319.9329

Resolution = 10,000

Resolution = 1,000

Separacin de Masas a baja y alta Resolucin

Alto vacio




SISTEMA DE DATOS

Detector

Tubo FotomultiplicadorLos electrones inciden dentro de la luz emitiendo fsforo

que esta pticamente acoplado a un fotomultiplicador.

dinodo

fsforofotomultiplicador

IONESIONES

ELECTRONES

Multiplicador de electronesSe utiliza un dinodo de conversin para convertir ya sea losiones positivos o negativos en electrones. En el dinodo deconversin se usa altos potenciales para acelerar los ionesde masa elevada y de esta manera mejorar la sensibilidad.

Orlando Lucas A.

Gracias por su atencin

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