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2. Instrumentación

de microscopía óptica

2. Instrumentación de microscopía óptica

LentesUn medio transparentelimitado por dos superficies curvas


LentesDiferente curvatura


LentesDiferente índice de refracción


LentesDistancia focal: El punto de convergencia de los rayos refractados cuando los rayos incidentes provienen de una fuente tan lejana que pueden considerarse paralelos entre sí.

Distanciafocal


Lentes positivas (convergentes)

Biconvexa Plano-convexa Menisco

Enfocan los rayos paralelos en un punto detrás de la lente


Lentes negativas (cóncavas)

Bicóncava Plano-cóncava Menisco


Lentes negativas (cóncavas)Divergen los rayos de luz


Lentes negativas (cóncavas)Distancia focal

F


Aberraciones de las lentes

ABERRACIÓN:

Imperfección de un sistema óptico que produce una imagen defectuosa, deficiente en nitidez o en su semejanza al objeto.


Tipos de aberraciones

Aberraciones geométricas

● Aberración esférica● Astigmatismo● Coma● Distorsión● Curvatura de campo

Aberraciones cromáticas

● De posición● De magnitud


Aberración esférica

Los rayos que atraviesan la lente cerca de sus extremos convergen en un punto más cercano a la lente que los que cruzan por el centro.



Causas:● Daños en el objetivo, grasa de los dedos y restos de aceite de

inmersión en la lente frontal del objetivo.● Cubreobjetos de espesor o índice de refracción inadecuado.● Longitud de tubo incorrecta.● Medio de montaje inadecuado.● Espesor excesivo de la muestra.



Corrección:

● Combinación de lentes convergentes y divergentes con aberraciones esféricas opuestas.

● Insertando diafragmas fijos en el objetivo reduciendo el campo visual a la región central de la imagen.


Astigmatismo Las líneas verticales y horizontales se enfocan en dos puntos distintos del eje óptico.

Punto objeto

Punto de enfoque de las líneas horizontales

Punto de enfoque de las líneas verticales


Coma Diferentes zonas circulares concéntricas de la lente proporcionan aumentos distintos a una imagen desplazada del eje.

Punto objeto

Imagen


DistorsiónLa imagen aparece deformada a causa de un incremento o descenso gradual desde el centro hasta el contorno. Las líneas rectas aparecen curvadas.Se produce en lentes a las que se les pone un diafragma.

Imagen normal Distorsión de cojín Distorsión de barril


Curvatura de campoLa lente enfoca una superficie plana del objeto como si fuese esférica.Cuando están enfocados los bordes del objeto no lo está el centro y al revés.El centro y los límites de la imagen se enfocan a distancias distintas.


Aberración cromática de posición

Los distintos colores o longitudes de onda de la luz se enfocan a diferentes distancias de la lente.La imagen aparece rodeada de anillos con variedad de colores según el enfoque.

λ azul < λ verde < λ rojo


Aberración cromática de magnitud

Los rayos de luz de un determinado color se proyectan con más aumentos que los rayos de luz de otro color.


Aberración cromática

CORRECCIÓN:

● Utilizar una fuente de luz monocromática.

● Introducir un sistema de filtros que solo dejen pasar unas pocas longitudes de onda.

● Sustituir la lente simple por un doblete de lentes combinando distintos tipos con los índices de refracción y dispersión adecuados.

Descripción del microscopio óptico

Partes mecánicas:

Son las partes y dispositivos que tienen la misión de soportar los componentes ópticos a la vez que facilitan las manipulaciones y el uso del instrumento.



Pie

Columnao brazo

Tubo(binocular)

Revólver

Platina

Movimiento(foco)



Objetivo:



Objetivo:● Es el sistema óptico convergente colocado en

el extremo correspondiente al objeto.● La lente o conjunto de lentes que se sitúan

más cerca de la preparación.● Su finalidad es formar una imagen real de

ésta que será observada a través de un ocular o recogida en una pantalla.



Objetivo:Sus principales características son

● Aumento

● Apertura numérica


Descripción del microscopio óptico: objetivo

Aumento:

Aumento total = Aumento objetivo x aumento ocular

Generalmente ocular = 10X Por ejemplo, para un objetivo de 100X

Aumento total = 100 x 10 = 1000 aumentos


Descripción del microscopio óptico: objetivoAumento:¿Qué significa un aumento de 1000X?


¡Hay que poner siempre la escala en las imágenes!


● Ángulo de apertura:Es el formado por los rayos extremos que intervienen en la imagen.

2α

Objetivo

Muestra


Descripción del microscopio óptico: objetivo● Apertura numérica:

Es una medida de la capacidad para recoger la luz y resolver detalles pequeños a una distancia objeto fija.

Apertura numérica, A.N. = n x sen α

n es el índice de refracción del medio

α es el semiángulo de apertura



Apertura numérica:

● Expresa el diámetro del haz luminoso que puede recoger el objetivo.

● Se entiende que cuantos más rayos procedentes del objeto entren en la lente para formar la imagen mejor será la calidad de ésta, así como su definición.



Apertura numérica:

A.N. = n x sen α

● Se puede aumentar α. Pero llegar al máximo teórico de 90º se ve limitado en la práctica.

● Se puede aumentar n. Mediante líquidos de inmersión.


Descripción del microscopio óptico: objetivo● Aumento útil:

Es la relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño del objeto.

Hay un mínimo para que se puedan resolver los detalles que está en torno a 500 veces la A.N.Hay un máximo más allá del cual no se obtiene más resolución ni más información y está en torno a 1000 veces la A.N., son aumentos vacíos.


Descripción del microscopio óptico: objetivo● Poder de resolución:

El inverso de la mínima distancia entre dos puntos que todavía se entienden como separados, d.

Se define en relación a la A.N. y a λ.

d = 0,61λ / A.N.



Poder de resolución: d = 0,61λ / A.N.Plan-apo (inmersión) 100 X - A.N.=1,40

● Luz azul (400 nm)d = 0,61*400/1,40 = 174 nm

● Luz roja (650 nm) d = 0,61*650/1,40 = 283 nm



● Distancia de trabajo:La distancia entre la lente frontal del objetivo y la muestra cuando ésta está enfocada.

Distancia de trabajo (WD)

Objetivo

Muestra


Descripción del microscopio óptico: objetivoDistancia de trabajo elevada:

Baja resolución


Distancia de trabajo corta:

Alta resolución

d = 0,61λ / A.N.A.N. = n x sen α


Tipos de objetivos según las correcciones:● Acromáticos: corregida la a. cromática para rojo y azul, y

la esférica para verde.● Semiapocromáticos (fluorita): corregida la a. cromática y

esférica para 2 ó 3 colores.● Apocromáticos: corrección cromática y esférica para 4 ó

más colores.● De campo plano: curvatura de campo muy corregida.



Tipos de objetivos según las correcciones:

Acromáticos

Plan-acromáticos

Fluorita

Plan-fluorita

Plan-apocromát.

A. esférica A. cromática Curv. campo

1 color

1 color

2 – 3 colores

3 – 4 colores

3 – 4 colores

2 color

2 color

2 – 3 colores

2 – 4 colores

4 – 5 colores

no

sí

no

sí

sí



Indicaciones en el exterior de los objetivos:

Fabricante

Correcciones

Aumentos Apertura numérica

Óptica corregida a infinito

Sin cubreobjetos

Distancia de trabajo


Descripción del microscopio ópticoLongitud de tubo: Óptica corregida a infinito (ICS)


tubo

Descripción del microscopio ópticoLongitud de tubo: Óptica corregida a infinito (ICS)

La distancia imagen se sitúa en el infinito, es decir, los rayos de luz que salen del objetivo son tan paralelos que parece que la imagen se forme en el infinito.

Se coloca estratégicamente una lente de tubo dentro del cuerpo del tubo entre el objetivo y el ocular para producir la imagen intermedia.


Descripción del microscopio óptico: (ICS)Óptica corregida a infinito

Óptica finita


objeto

objeto

objetivo

objetivo

ocular

ocular

lente intermedia


Sistemas de iluminación:

● Condensadora

● Fuentes de iluminación



Condensadora:

Es el sistema óptico convergente situado antes de la platina encargado de iluminar adecuadamente el objeto para obtener el máximo rendimiento del objetivo.


Cuando la A.N. de iluminación es casi igual a la A.N. máxima del objetivo se disminuye el contraste.

En las muestras de contraste alto con detalles diminutos se debería iluminar la A.N. del objetivo por completo.

Pero si la muestra tiene poco contraste se debe disminuir el cono de iluminación de la A.N. del objetivo para impedir que la imagen quede borrosa debido al poco contraste.


Descripción del m. óptico: condensadora

El cono de luz que ilumina la A.N. de objetivo se controla por medio de un diafragma de iris.

Si el diafragma está muy cerrado la imagen está demasiado contrastada y se pierde resolución.

Pero si está muy abierto la imagen sufre alteraciones a causa de la difracción.

La posición correcta será cerrar hasta aproximadamente 2/3 del campo de visión cuando se observa el plano focal posterior de la lente objetivo.


Descripción del m. óptico: condensadora

Descripción del microscopio ópticoFuentes de iluminación:

● Luz natural: ya no se usa.

● Lámpara incandescente: la más usada

● Lámpara de arco: iluminación intensa y sin estructura

● Lámpara de descarga: vapor de mercurio



Tipos de iluminación:

● Iluminación crítica

● Iluminación de Köhler



Iluminación crítica:

Se forma la imagen de la fuente luminosa sobre la imagen a observar, en el plano de la muestra.

● Iluminación muy brillante pero desigual con puntos de diferente brillo.



Iluminación de Köhler:

Se ilumina estricta y únicamente la parte observada del objeto.Proporciona una intensidad suficiente y uniforme.

● Evita la luz parásita que se produce en las partes iluminadas y no observadas de la muestra.


Mantenimiento, limpieza y conservacióndel microscopio óptico


Mantenimiento, limpieza y conservación2. Instrumentación de microscopía óptica

Cualquier componente es INCREÍBLEMENTE CARO

Enemigos primordiales del microscopio:● Polvo ¡¡Enemigo número 1!!● Agua y humedad ambiental● Grasa procedente de los dedos o del propio equipo● Restos de medios de inmersión, medios de montaje y

medios de cultivo● Ambientes químicamente agresivos● Sol directo y fuentes de calor


Normas básicas:

● Cuando se hace mantenimiento de instrumentación hay que invertir paciencia, no energía.

● Siempre es mejor prevenir que reparar.● El microscopio óptico es un instrumento de precisión.● Hay que trabajar sobre una superficie estable,

absolutamente limpia y con buena iluminación.● Usar la herramienta del tamaño apropiado.● No forzar nunca ningún elemento mecánico ni óptico

cuando se procede a desmontar y montar.


● Cuando se retira cualquier elemento óptico o mecánico que deje abierto el camino óptico, es imprescindible cegar inmediatamente el hueco que queda libre con la ayuda de una tapa ciega, o bolsa de plástico y cinta adhesiva con el fin de evitar la entrada de polvo y suciedad.

● No dejar nunca los tubos oculares o alguna posición del portaobjetivos vacío, colocar un tapón ciego.

● Cuando se desmonta un objetivo, mientras una mano lo desenrosca la otra lo sujeta.

● Cuando se monta un elemento óptico, no retirar la mano hasta que no tengamos la absoluta certeza de que ha quedado bien sujeto.


● Está desaconsejado desarmar los elementos de los conjuntos ópticos (ocular, objetivo, condensador, …) si no es absolutamente imprescindible, puesto que se pueden producir desajustes irreversibles en el posicionamiento de las lentes, ya que, en muchos casos, han sido centradas en fábrica por medio de banco óptico, y hacerlos reajustar es caro.

Si se tuviera forzosamente que desarmar, es recomendable apuntar la posición, el orden y la orientación de todos los elementos ópticos y de las respectivas piezas de sujeción.


● Las ópticas y demás piezas que se vayan desmontando hay que dejarlas en lugar seguro (cajas, estuches, …) para evitar que rueden y caigan al suelo, depositándolas en posición vertical y con el extremo que queda en el interior del camino óptico protegido del polvo.

● Si hay que reparar cualquier elemento situado en la base del microscopio y para ello hay que tumbarlo o darle la vuelta, primero es necesario retirar todos los elementos que se sostienen por gravedad (filtros, oculares, …).

● En ningún caso tocar el interior de los caminos ópticos con los dedos, puesto que éstos suelen tener un tratamiento superficial de color negro mate, y cualquier huella de los dedos podría ocasionar brillos no deseados.


● Evitar golpear la lente frontal de los objetivos contra la preparación que se observa o contra cualquier otro objeto. Esto podría producir rayas o señales sobre la lente, fisuras en el cemento que fija la lente, e incluso su desplazamiento hacia atrás. Si se fisura el cemento se corre el riesgo de que entren líquidos como los medios de inmersión o de montaje.

● Los objetivos de inmersión hay que limpiarlos inmediatamente al finalizar la sesión de observación.


● Los restos de aceite o de otros medios de inmersión, además de retener suciedad, pueden acabar introduciéndose por capilaridad entre la montura y la lente frontal del objetivo.

● Al acabar la observación, limpiar el microscopio.● Siempre que no se esté utilizando el microscopio, debe

estar completamente tapado por medio de una funda. Las fundas de plástico son un buen aliado para proteger los microscopios.


Electrónica, fuentes de alimentación y sistemas de iluminación:

Retirar el polvo de las ranuras de ventilación.-Soplando con una pera de goma

-Aire o nitrógeno a presión-AspiraciónAyudándose de un pincel limpio, seco y libre de grasa.


Limpieza de la lámpara:

● Alta temperatura, refrigeración por aire = polvo adheridoDejar enfriarGuantes de algodónRetirar y limpiar con etanol

Suciedad carbonizada, usar amoníaco


Sustitución de la lámpara:

● Respetar la duración máxima de las lámparas de vapor de mercurioSe limpia antes de colocarla como si fuese una lámpara usada


Parte mecánica:

Retirar el polvo superficial con un trapo fino.

En caso de vertido accidental de medios de montaje líquidos o medios de inmersión, etc.

● Absorber el líquido con papel● Disolver y limpiar los restos con agua destilada● Secar bien


Parte óptica:

Retirar el polvo soplando con pera, nitrógeno o aire.

Limpiar en húmedo con papel óptico o trapo suave humedecido en etanol, cristasol, isopropanol... con movimiento circular.

Secar.


● En aquellos microscopios en que trabajan varias personas la limpieza periódica de los oculares contribuye a minimizar el riesgo de contraer conjuntivitis.

● Las huellas, los restos de medios de inclusión o de montaje y el polvo presentes en el objetivo, sean del tipo que sean, ocasionan una pérdida de resolución y contraste debido a que dispersan la luz, dando la sensación de que se tiene una aberración de esfericidad elevada.


¡No usar nunca benceno, tolueno o xileno!

Son disolventes altamente tóxicos y muy agresivos frente a pinturas y cemento de unión.

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