50/2010LaboratorioVeterinarioAvedila · zonas de España debido al continuo abandono de las zonas...

150/2010 Laboratorio Veterinario Avedila

CONSEJO DE REDACCIÓN

EDITOR:Marta Eulalia García Sá[email protected]

VOCALES:Gorka Adúriz RekaldeCarlos ÁlvarezRamón JustePere Busquets RelatsConcepción Caballero GalvánJosep Carrera MauriLourdes PorquetCarmina Nogareda BurchJosé Marín Sánchez

REDACCIÓN:Secretaría de AVEDILAParque Tecnológico de Bizkaia, 812Berreaga, 148160 DerioBizkaiaPágina web: http://www.avedila.com

EDITA:PRODIVE, S.A. para AVEDILA

PUBLICIDAD:PRODIVE S.AJorge Juan, 6828009 MADRIDTel: 91 563 60 02Fax: 91 564 09 40

IMPRIME:Anzos S.L.

DISENO Y MAQUETACIÓN:PRODIVE, S.A.

FOTO PORTADA:Diferentes tipos bacterianos aislados deintestino de ganso. (Foto cedida por gentilezade Grupo de Investigación COVEMI).

PUBLICACIÓN DE LA ASOCIACIÓN DEVETERINARIOS ESPECIALISTAS ENDIAGNÓSTICO LABORATORIAL

Dep. Legal: M-42157-1997ISSN 1697 – 8099

En el número de la revista que tenéis en vuestras manos sepublica un trabajo sobre el diagnóstico por ELISA de laTuberculosis bovina en jabalí, especie en expansión en muchaszonas de España debido al continuo abandono de las zonasrurales, y que aquí y en toda Europa se ha convertido en unimportante reservorio de patologías que afectan a nuestrosanimales de producción y también de algunas zoonosis: Pestesdel cerdo, Enfermedad de Aujeszky, Triquinosis......yúltimamente también de la Tuberculosis bovina.

Y hablando de zoonosis, conviene destacar el aumentoprogresivo de casos de Fiebre Q el los Países Bajos y Alemaniapor lo que ya se está discutiendo si se deben aplicar las normascomunitarias de erradicación de enfermedades animales a laFiebre Q. También se considera a la Besnoitiosis como unaenfermedad emergente de primer orden por lo que la EFSA yaestá tomando posiciones sobre esta patología. Como elementosclave en el diagnóstico de laboratorio de enfermedadesanimales, tendremos que estar muy atentos a la evolución deaquellas en nuestro territorio.

Además está comprobado que con el cambio climático habráun incremento en la temperatura media ambiental y lasestimaciones meteorológicas predicen una mayor concentraciónde precipitaciones en determinados momentos del año. Estos yotros cambios repercutirán en el conjunto de los seres vivos ypor supuesto un cambio en las condiciones medioambientalesva a tener un impacto directo el los ectoparásitos y en ladifusión de las enfermedades que estos transmiten. Pensamosque debe ser una misión de todos los profesionales implicadosen los diferentes sectores de las ciencias de la vida(veterinarios, médicos, biólogos, .........) prepararse y avanzarsea estos cambios futuros. Para ello es necesaria la colaboracióny el trabajo en equipo.

Finalmente haceros saber que desde el mes de Enero del añoen curso ya está disponible la página web (www.eavld2010.org)del Primer Congreso Bianual de la European Association ofVeterinary Laboratory Diagnosticians (EAVLD) que se va acelebrar en Lelystad (Holanda) del 15 al 17 de Septiembre deeste año. Entre los miembros de la Junta Provisional figuracomo ya sabéis un miembro de Avedila, José Antonio García dela UCM. Desde esta editorial os animamos a asistir y participaren este próximo evento.

La Junta Directiva

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RESUMEN

En las últimas décadas hemos asistido a grandestransformaciones en los sistemas de inspección delganado y de la carne en los mataderos.

La legislación de los países más desarrollados haliderado estos cambios y el Codex Alimentariuslos ha reflejado en sus Códigos recomendados deprácticas, que sirven para armonizar los intercam-bios internacionales de alimentos.

En este trabajo se definen las diferentes áreasque se deben considerar en los mataderos paraefectuar la inspección veterinaria de los animales yde sus productos, teniendo en cuenta la salud pú-blica y la sanidad animal. A pesar de que sólo serefieren a la especie bovina, gran parte de los crite-rios expuestos por el autor pueden aplicarse a lasdemás especies ganaderas.

La información obtenida en el matadero es inte-resante para la producción primaria; recíprocamen-

te, la información recopilada durante la producciónprimaria permite hacer más eficiente la utilizaciónde recursos en el matadero. Esta nueva concepciónpermite realizar procedimientos de inspección ba-sados en el riesgo, que irán reemplazando a los sis-temas tradicionales, a menudo demasiado rígidos ymecánicos, e incapaces de medir la gravedad delos peligros.

Los peligros emergentes, biológicos, físicos oquímicos y la utilización de nuevas tecnologías noautorizan acciones meramente rutinarias y obligana guardar una actitud de alerta, adaptada a los cam-bios permanentes que ofrecen las ciencias dedica-das a la inocuidad de los alimentos.

Otra tendencia es la participación activa de losoperadores, que deben asumir la responsabilidadprimaria en relación con la seguridad sanitaria delos alimentos que están elaborando.

La inspección veterinaria oficial que opera en elmatadero como parte de la denominada Autoridad


PAUTAS PARA LOS PROCEDIMIENTOS DEINSPECCION EN ANIMALES Y CARNES EN UN

MATADERO

A. Schnöller

Director de Fiscalización de Productos de Origen Animal. Servicio Nacional de Sanidad y CalidadAgroalimentaria (SENASA). Paseo Colón 367 - 6° Piso. 1063 Buenos Aires. Argentina

Trabajo publicado previamente en:Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., (2006), 25 (2), 849-860.Reproducido con permiso de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE)


Competente juega varios roles: detectar las enfer-medades de los animales, ejercer el control de lascarnes y productos cárnicos, y verificar los siste-mas de auditoría desarrollados en las empresas.Recientemente, las crisis debidas a la encefalopatíaespongiforme bovina y a las intoxicaciones pordioxinas pusieron en evidencia la necesidad de im-plementar la rastreabilidad (o trazabilidad) de losalimentos, es decir, de ofrecer a los consumidoresla posibilidad de conocer el origen de los produc-tos alimentarios, siguiendo la cadena habitualmen-te denominada "del campo al plato".

Por último, otra responsabilidad que tiene el ve-terinario del matadero es asegurar el bienestar ani-mal, para el que tiene una obligación ética indele-gable como profesional dedicado al cuidado de losanimales.

INTRODUCCIÓN

Sistemas de seguridad sanitaria de los ali-mentos

Los métodos ideados para garantizar la inocuidadde los alimentos siguen una tendencia mundial, ba-sada en sistemas que abarcan la participación de or-ganismos oficiales gubernamentales y los controlesefectuados por los operadores, que son los primerosresponsables ante los consumidores.

En la base de la pirámide se hallan los denomi-nados autocontroles, es decir los sistemas de autogestión de la calidad y de la inocuidad basados en"buenas prácticas de manufactura" (GMP), "proce-dimientos operativos estándar de saneamiento"(SSOP) y "análisis de peligros y puntos criticas decontrol" (HACCP).

La Autoridad Competente mantiene personal per-manente en los mataderos y salas de despiece, quecumplen funciones de control de las patologías delos animales al realizar la inspección antemortem,postmortem, de la higiene de los productos y de lasinstalaciones, además de otros factores como elbienestar de los animales, el manejo de materialesde riesgo para la encefalopatía espongiforme trans-misible de los animales, etc. Este personal oficial sedenomina Servicio de Inspección Veterinaria (SIV).

En todos los casos, el sistema debe ser super-visado, lo que generalmente se realiza en losniveles regional, provincial o estatal. A su vezesta estructura está situada bajo el mando de laAutoridad Competente Central que elabora lalegislación sanitaria, las políticas y la auditoríadel sistema, incluyendo los mencionados sub-sistemas.

La Figura 1 da un ejemplo de este tipo de organi-zación, a pesar de existir diferencias de un país aotro (19): algunos países son más extensos, otrosmás pequeños, unos son muy centralizados, otrosmás federativos; todos presentan pequeñas diferen-cias, pero en general comparten el tipo de estructu-ra señalada.

INSPECCIÓN ANTEMORTEM

Análisis de los documentos

Los animales que llegan al establecimiento de-ben venir acompañados de un documento en el quese describen su origen y condición sanitaria (7).

El origen exacto permite asegurar la rastreabili-dad (o trazabilidad), que se ha convertido en unainformación imprescindible para los consumido-res; por otra parte, la información procedente de lafase de producción primaria permite conocer lospeligros que deben atenderse en el matadero. Porlo tanto, la inspección veterinaria antemortem ypostmortem se basará en el riesgo deducido delanálisis de la información recopilada durante lafase de producción primaria (9).

Hoy se sabe que las prácticas de producción y dealimentación pueden incrementar el riesgo de pre-sencia de Escherichia coli Ol57:H7, Salmonellaspp., Campylobacter (15), etc., así como otros peli-gros físicos y químicos (6,7,9, 12,20,21).

La provisión de información relevante permitedesarrollar programas de higiene de la carne basa-dos en el riesgo (7), lo que se traduce en una mejoreficiencia de recursos. En algunas situaciones, porejemplo en caso de zoonosis como la cisticercosis,el conocimiento de las áreas afectadas permite to-mar medidas específicas.

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La Autoridad Competente debe considerar lossistemas de gestión de la calidad llevados a cabopor los productores primarios, entre ellos el siste-ma de buenas prácticas de higiene (5).

Otro factor esencial es la identificación de losanimales con miras a la trazabilidad; como lo vere-mos más adelante, éste es un factor pertinente a lolargo de la cadena de transformación de productosalimenticios (6).

Examen de los animales

El examen veterinario de los animales cumple ladoble función de prevenir la introducción de alte-raciones que puedan significar un peligro para lasalud humana, y de dar fundamento a las medidasque se han de tomar en caso de constatarse una en-fermedad animal. Esta información será de sumautilidad en los establecimientos de origen (produc-ción primaria).

Se debe prestar especial atención a las zoonosis yenfermedades listadas por la Organización Mun-dial de Sanidad Animal (OIE).

Una vez controlados sus documentos de trans-porte, los animales son examinados, en conjunto eindividualmente, para buscar cualquier anormali-dad o defecto que haga presumir la presencia deenfermedad.

Los animales sospechosos deben ser llevados auna manga o cajón para realizar su examen clíni-co y comprobar los parámetros fisiológicos (tem-peratura, estado de las mucosas, respiración, es-tado sensorial, etc.), además de las lesiones oanormalidades que puedan presentarse. En elcaso de requerirse mayor información se proce-derá a la necropsia del animal, actuando de lamisma manera con el resto del lote. Todas las ob-servaciones deben registrarse en un sistema defichas que a tal efecto llevará e! Servicio de Ins-pección Veterinaria.

Identificación de lote

Se designa por "lote" un grupo de animales pro-venientes de! mismo origen y conducidos en elmismo transporte. Deben ser alojados en el mismo

corral, comportando una ficha en la que se descri-ben los datos del lote, la identificación y los even-tos sanitarios.

Permanencia en corrales

Es aconsejable el descanso de los animales porun período de al menos seis horas, teniendo encuenta que el examen antemortem en animales ex-citados por el viaje resulta bastante dificultoso ypuede enmascarar enfermedades febriles.

Los animales que permanezcan en los corralespor más de 6 horas serán examinados al menos unavez cada 24 horas. Asimismo, no se aconseja quepermanezcan en los corrales más de 72 horas.Mientras se hallan alojados, se les debe suministrarsuficiente heno y agua.

Inspección de los animales conducidos a faenaPara examinar los animales que son conducidos

a la faena es necesario tenerlos en buena condi-ción de higiene de manera a poder observarloscorrectamente. La intensidad de la limpieza de-pende del estado de los animales en el momentode su llegada (7).

Es conveniente realizar una limpieza con agua apresión y, si es necesario, con detergentes para eli-minar la suciedad, sobre todo en los animales cuyopelambre se encuentra en un estado que requiereespecial atención, al provenir de predios que porrazones de producción (tener en cuenta especial-mente los feed lots), área geográfica y otras, ofre-cen condiciones de higiene mediocres.

Es aconsejable que esta tarea sea seguida de untiempo de escurrimiento lo suficientemente pro-longado para evitar que los animales entren de-masiado mojados en el cajón de noqueo, lo cualfacilita la contaminación durante las operacionesde cuereado.

Sin embargo, es conveniente mantener un ciertonivel de humedad de los pelambres, pues cuandoestán demasiado secos hay un riesgo de formaciónde polvillo muy contaminante.

Las intervenciones anteriores a la faena de losanimales, destinadas a reducir la presencia de bac-


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terias patógenas en éstos, y por ende en las car-nes, son muy numerosas y consisten en aplicar,entre otros, elementos biológicos que actúan porcompetencia (3).

En esta etapa debe restringirse el uso de ele-mentos que afecten el bienestar de los animales,especialmente rebenques y picanas eléctricas, yes aquí donde entra en juego el nivel de entrena-miento del personal afectado a estas tareas.

Rastreabilidad

En los mataderos, las primeras tareas y regis-tros referidos a la rastreabilidad empiezan en elmomento en que los animales entran en el esta-blecimiento. Cualquier error en este punto auto-máticamente se traslada a lo largo de la cadenahasta el consumidor.

La rastreabilidad (o trazabilidad) se define dela manera siguiente:

- según el Codex Alimentarius, la '"trazabili-dad es la capacidad para seguir el movimien-to de un alimento a través de la (s) etapa(s)especificada(s) de la producción, transforma-ción y distribución" (6);

- según la Unión Europea, en su Reglamento2002/178, Artículo 3, es "la posibilidad deencontrar y seguir el rastro, a través de todaslas etapas de producción, transformación ydistribución, de un alimento, un pienso, unanimal destinado a la producción de alimen-tos o una sustancia destinados a ser incorpo-rados en alimentos o piensos o con probabili-dades de serlo" (10).

Bienestar de los animales

Durante la estadía de los animales en los corra-les hasta su sacrificio, es función imprescindibledel Servicio de Inspección Veterinaria velar porsu bienestar.

El operador debe poseer un "manual de proce-dimientos" donde se indique el tratamiento dadoa los animales en las diferentes etapas, desde sullegada a la planta hasta su sacrificio, incluyendosu estadía en los corrales, movimiento, entrena-

miento del personal encargado de esta tarea, di-seño de las instalaciones, método de eutanasia(insensibilización y sangrado), etc.

La Autoridad Competente deberá auditar y ve-rificar las actividades realizadas por el opera-dor. Un soporte legal permitirá, en situacionesde no conformidad, tomar las medidas correcti-vas necesarias y suspender las actividades cuan-do corresponda (13, 14).

INSPECCIÓN POSTMORTEM

Aturdimiento y sangrado

La primera observación que se debe realizar enla manga de ingreso a la playa de faena y antes deentrar al cajón de noqueo, es el estado de limpiezade los animales. Si se aplicó un baño previo, comolo exigen la mayoría de las legislaciones naciona-les, el tiempo de escurrido debe ser suficiente,pues los animales deben estar apenas húmedospara evitar que el agua contaminada salpique lacarne durante las operaciones de cuereado.

La segunda observación es verificar que la insen-sibilización se efectúe respetando los criterios delbienestar animal (13, 14). Los diferentes sistemasde aturdimiento deben ser validados por la Autori-dad Competente (13, 14) y verificados periódica-mente por el Servicio Veterinario Oficial.

La operación del sangrado también será verifica-da periódicamente por el Servicio de InspecciónVeterinaria. El sangrado debe realizarse con doscuchillos, uno para rajar el cuero y el otro para in-cidir los grandes vasos, evitando seccionar el esó-fago o la tráquea. El tiempo del sangrado debe sersuficiente; para obtener un sangrado más eficientese puede usar la electroestimulación.

Este sector debe estar aislado del resto de la pla-ya de faena y tanto su diseño sanitario como susinstalaciones deben impedir la contaminación.

Cuereado

El sector siguiente es la zona intermedia dondese realiza la operación del cuereado. En esa fase el


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Servicio de Inspección Veterinaria debe verificarque los operarios de la empresa aplican correcta-mente las buenas prácticas de higiene, y verificarlos controles realizados por el operador (control decalidad) y los controles de autogestión.

La prevención de la contaminación de la carneen la etapa del cuereado es decisiva para preve-nir las toxiinfecciones transmitidas por los ali-mentos que más frecuentemente se describen enla literatura mundial. El área del cuereado debeestar separada de la zona limpia, pero lo másimportante que se ha de verificar es el flujo deaire, que debe conservar constantemente unapresión positiva desde las zonas limpias hacialas más contaminadas.

Eviscerado

La etapa siguiente es la evisceración, que consti-tuye la segunda gran posibilidad de contaminaciónde la carne por ingesta o materia fecal, peligro deigual gravedad que la etapa del cuereado descritaanteriormente.

Aquí la inspección debe analizar las buenas prác-ticas de manipulación de las menudencias y de li-gadura del esófago, intestino delgado, recto y veji-ga, para impedir la evacuación de sus contenidos.

La separación de la cabeza, su perfecto lavadopor dentro y por fuera, por los ollares y por la gar-ganta, en ese orden, también deben ser controladosy verificados.

Inspección veterinaria

La etapa siguiente, que se realiza dentro del árealimpia, es la inspección veterinaria de los animalesfaenados.

El Servicio de Inspección Veterinaria llevaráuna lista de matanza con toda la información so-bre el origen de los animales. Esta informaciónpermitirá que la inspección siga procedimientosbasados en el riesgo más bien que en sistemasrutinarios tradicionales, tal como lo recomiendael Comité de Higiene del Codex Alimentarius ensu reciente Código de prácticas de higiene parala carne (7).

Para las vísceras, se dispondrá de mesas de ins-pección, donde las rojas queden separadas de lasverdes. Se realizará la inspección visual de cadavíscera y se incidirán las linfoglándulas según loespecifique la Autoridad Competente. Algunas vís-ceras, como el pulmón, deben ser incididas trans-versalmente para visualizar los parénquimas y elhígado a nivel de los conductos biliares, para la de-tección de Fasciola hepatica si corresponde. Lasmesas o bandejas de inspección deben ser diseña-das de manera a evitar la contaminación cruzada.

La inspección de la cabeza debe realizarse unavez separada la lengua, incididas las linfoglándulas- submaxilar, parotídea y retrofaringea - y/o lasque correspondan, e inspeccionadas y desechadaslas amígdalas. Se procede luego a incidir los mús-culos pterigoideos internos y externos para el diag-nóstico de la cisticercosis.

Se observarán las canales y medias canales y seincidirán todas aquellas linfa glándulas que ordenala Autoridad Competente. La iluminación en todaslas áreas de inspección será de 300 o 500 unidadeslux, según la regulación que se aplique.

La inspección veterinaria oficial realizará todoslos análisis microbiológicos, pruebas complemen-tarias y pruebas serológicas que considere necesa-rios a los fines de completar un diagnóstico.

El descarte y la posterior destrucción del materialde riesgo también deben ser controlados por el Ser-vicio de Inspección Veterinaria, por lo menos en loque se refiere al encéfalo y médula espinal, según elriesgo específico de cada país en relación con lasencefalopatías espongiformes transmisibles.

La información sobre los hallazgos de patologí-as, parasitosis, neoplasia s y otras alteracionesdebe apuntarse en el formulario que a tal efectolleva el Servicio de Inspección Veterinaria. Esta in-formación será integralmente remitida a la Autori-dad Competente así como al operador de la pro-ducción primaria.

La difusión a los sectores productivos de los in-formes sobre los hallazgos realizados en el mata-dero permite planificar acciones preventivas, loque se traduce en una mejora de la eficiencia.


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Cuando los animales que entran en el mataderoson objeto de un plan nacional o regional de con-trol de una enfermedad o de un plan de contingen-cia o de sacrificio por motivos sanitarios, el Servi-cio de Inspección Veterinaria debe tomar las pre-cauciones necesarias para el examen de losanimales, pero también para proteger la salud delos operarios y especialmente para prevenir la con-taminación cruzada.

Las enfermedades trasmitidas por alimentos quehan provocado la mayor cantidad de brotes en losúltimos años son las bacterianas, por ejemplo cau-sadas por E. colí 0157 (12), Salmonella, Campylo-bacter, etc. Todas estas bacterias se encuentran fre-cuentemente en el tubo intestinal (1,12,15, 18,20).

Esto justifica la creación de un punto de controlpara la detección de contaminaciones, denominado"cero contaminación de ingesta o fecal visible",que debe hacer parte del sistema de autogestión dela empresa y del sistema de inspección oficial.

En las regulaciones el lavado de las canales conagua a presión suele ser obligatorio (agua potable)y en muchos casos se aplican diversos tipos de sus-tancias inhibitorias de las bacterias, tales como áci-dos orgánicos, vapor de agua a altas temperaturascon vacío, etc.

Es frecuente aplicar ácidos como ácido acético,láctico, etc., para disminuir el riesgo de E. colí0157:H7. Algunos países tienen regulaciones al res-pecto. Sin embargo, debería analizarse con mayordetenimiento este procedimiento, pues existen indi-cios de desarrollo en pH ácido (2, 11, 16, 22,23).

Además, por la propia definición de "carne fres-ca", sólo se admite "el frio" como medio de con-servación, tanto en las regulaciones de la UniónEuropea como en las del Mercado Común del Sur(Argentina-Brasil-Paraguay-Uruguay) y de mu-chos otros países.

Marca sanitaria

Todas las canales y vísceras deben ser selladascon una marca que indica su aptitud para el consu-mo. Este sello se aplica con tinta o marca térmica,generalmente indicando el país y el número oficial

del establecimiento. En el mismo palco se aplicanotros sellos o tarjetas, relacionados con la trazabili-dad y con la calidad de las canales.

Oreado

Esta etapa tiene como objetivo secar la superficiey bajar la temperatura de las canales antes de lle-varlas a las cámaras frigoríficas. La inspecciónprestará especial atención a los sistemas utilizados,que deberán evitar la condensación.

Enfriado, cámaras frigoríficas

En esta etapa es esencial controlar la temperaturay los tiempos de enfriamiento, según los peligrosbiológicos que se consideren, es decir en funcióndel riesgo de que se desarrollen bacterias capacesde deteriorar el producto y de afectar la salud delos consumidores.

La inspección veterinaria de los establecimientosy los controles propios de la empresa deben llevarregistros de temperatura durante todo el proceso deenfriamiento y también en las etapas posteriores detransformación, depósito y transporte. Los regis-tros deben guardarse durante un tiempo suficientea disposición de la Autoridad Competente o en vis-tas de posibles reclamaciones por parte de los con-sumidores.

En los sistemas de HACCP esta etapa puedeconstituir un punto crítico de control.

El inspector oficial debe prestar especial aten-ción a la higiene de las cámaras frigoríficas, y con-trolar la forma en que se halla dispuesta la carga,que debe permitir la circulación del aire y sobretodo, el funcionamiento y disposición de los equi-pos de frío, evitando la condensación y la contami-nación consiguiente de las canales.

Corte y desosado

Como se explicó anteriormente, el control de latemperatura de la carne y de las salas es esencialen esta etapa. Para cuartear y desosar las canales seconsidera como óptima una temperatura de la car-ne comprendida entre 4°C y 7ºC y una temperaturaambiental de 10°C a 12°C.


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Las buenas prácticas de manufactura (5) inclu-yen el entrenamiento, la capacitación, la higiene yla salud del personal; el diseño, la limpieza y des-infección de las instalaciones, utensilios, entreotros componentes esenciales. La inspección vete-rinaria debe controlar el cumplimiento de estos re-quisitos en las salas de corte y despostado (7).

Etiquetado y empacado

El etiquetado constituye una importante etapa decontrol por parte de los servicios oficiales de ins-pección, pues produce la información que llegaráal consumidor final, la trazabilidad para determinarel origen, así como los demás datos referentes a lacalidad. La fecha de vencimiento, las propiedadesy las indicaciones de uso deben ser exactas y nofraudulentas.

El empacado también debe ser controlado. Losmateriales usados, las buenas prácticas de fabrica-ción, el uso adecuado del vacío o de las atmósferascontroladas resultan sumamente importantes, asícomo los procesos para evitar la contaminacióncruzada con los materiales de empaque secunda-rios, como cartones.

También conviene asegurarse de que esta etapadure lo menos posible, para que la temperatura delos cortes de carne no tenga tiempo de subir.

Depósito

Los depósitos frigoríficos deben estar provis-tos de termógrafos. Los registros deben ser ar-chivados durante un tiempo suficiente, y que-dar a la disposición de los servicios oficialesde inspección.

La higiene de los depósitos debe respetar los cri-terios de orden y de higiene que hemos descritopara las cámaras de medias reses, evitando en todomomento la condensación y la contaminación.

Certificación

La certificación de los productos por parte de losServicios Oficiales difiere según los países, y estárelacionada con el precinto de los medios de trans-porte. Existen diferentes sistemas para garantizar

la autenticidad de los productos transportados, asícomo la conservación de la cadena de frío.

La certificación para el tráfico internacional tam-bién supone requisitos específicos para cada país oregión.

Transporte

Los medios de transporte serán diseñadospara evitar toda contaminación y asegurar laconservación de la temperatura del productotransportado (7).

Las superficies internas del contenedor deben serlisas, inoxidables y lavables.

El Servicio de Inspección Veterinaria debe verifi-car que los contenedores han sido lavados y desin-fectados antes de la carga, y que los equipos de en-friamiento están en buen estado de funcionamien-to. La cadena de frío no debe interrumpirse bajoninguna circunstancia, por lo que se aconseja eluso de termo-registros que permitan el control dela temperatura durante todo el tiempo que dure eltransporte.

Sistemas de autogestión de la inocuidad

En la introducción se ha explicado la impor-tancia del rol que cumple el operador. En estesentido, las herramientas pertinentes son lasbuenas prácticas de manufactura, que incluyenlos prerrequisitos y procedimientos operativosestándar de saneamiento.

Estos aspectos se hallan en el Código interna-cional de prácticas recomendado para principiosgenerales de higiene de los alimentos del CodexAlimentarius (5) e incluyen requisitos que vandesde la producción primaria hasta el transportey comercialización .

Las buenas prácticas de manufactura son lasprácticas y procedimientos recomendados para lamanipulación de alimentos, teniendo en cuenta suidentidad, calidad e inocuidad (5).

El Codex recomienda que las buenas prácticas demanufactura sean parte integrante de las políticas


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de los gobiernos. El compromiso suscrito por lasempresas de aplicar estas buenas prácticas de ma-nufactura debe constar explícitamente en un docu-mento, y concretarse mediante programas y proce-dimientos a tal efecto.

Los prerrequisitos operativos y el sistemaHACCP son las herramientas que debe usar eloperador, primer responsable de la inocuidad delos alimentos que fabrica. Más adelante vere-mos el papel que aquí desempeña la AutoridadCompetente.

Prerrequisitos

Las actividades que deben llevarse a cabo parahacer funcionar el sistema HACCP son varias.

Las condiciones previas son imprescindibles ysin ellas no se puede construir un sistema de autogestión de la inocuidad en apoyo a la competitivi-dad de las industrias, particularmente las que dese-an comerciar con otros países.

Estos prerrequisitos son condiciones básicaspara el funcionamiento de los mataderos, y debenser considerados por los operadores de los mata-deros, por un lado, y por la Autoridad Competente,por el otro.

Los más importantes son los siguientes:

- el emplazamiento de la planta: el mataderodebe estar ubicado en un terreno no inundable,con abastecimiento de agua potable en abun-dancia, alejado de actividades que generencontaminación ambiental;

- el diseño higiénico de las instalaciones: las sa-las deben ser fáciles de limpiar, las superficieshan de ser lisas e impermeables, los encuentrosentre pisos y paredes redondeados para permi-tir la eliminación de la materia orgánica. Elaire debe circular de las zonas más limpias ha-cia las más contaminadas. Los drenajes debenestar dotados de sifones con válvulas de reflujopara los afluentes;

- el diseño del flujo operacional: el diagramade flujo (flow chart) debe ser lineal y sin re-trocesos, con el fin de evitar la contamina-ción cruzada;

- el mantenimiento de las instalaciones: debeexistir un plan de mantenimiento preventivode las instalaciones, diseñado por los servi-cios de control de calidad de la empresa decomún acuerdo con el Servicio de InspecciónVeterinaria;

- el diseño y mantenimiento higiénico de losequipos: de la misma forma que las instala-ciones, los equipos deben estar diseñadospara permitir su saneamiento y mantenimien-to permanentes;

- la provisión de agua potable: el matadero debecontar con una provisión suficiente y se reali-zarán análisis microbiológicos y físico-quími-cos con una periodicidad basada en el riesgo,por lo menos una vez al mes;

- la higiene de los operarios: este aspecto estádirectamente relacionado con la capacitacióndel personal. Los operadores deben llevar ropalimpia, cambiada a diario o con mayor fre-cuencia cuando lo determine el Servicio deInspección Veterinaria;

- la higiene durante el transporte;- la eliminación adecuada de los desechos: lasdiferentes categorías de deshechos orgánicosdeben eliminarse permanentemente para evitarla proliferación de fuentes contaminantes. Losmataderos deben poseer dispositivos para laesterilización de determinados tipos de tejidospatógenos, así como manómetros, termómetrosy registros. El material de riesgo con relación alas encefalopatías espongiformes transmisiblesdebe ser tratado en función de la situación par-ticular de cada país;

- el control de plagas: este control lo debe llevara cabo el propio establecimiento, bajo la super-visión del Servicio de Inspección Veterinaria.Comprende la lucha contra los insectos y roe-dores. Deben existir registros de seguimientode esta actividad;

- el manejo de sustancias tóxicas y productosquímicos: estas sustancias, entre las que se in-cluyen los productos para la limpieza y desin-fección, deben depositarse y prepararse en sa-las independientes;

- la capacitación del personal a todos los nive-les: el entrenamiento adecuado del personal esnecesario en todos los niveles y el Servicio ofi-cial de inspección debe participar a las activi-dades de formación;


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- el etiquetado del producto y la informacióndel consumidor: existen al respecto regulacio-nes oficiales que deben ser respetadas por losoperadores y controladas por la AutoridadCompetente.

Procedimientos operativos estándar desaneamiento

Son procedimientos escritos, que se relacionan con:

- el mantenimiento general,- las sustancias utilizadas para la limpieza y ladesinfección,

- el almacenamiento de sustancias tóxicas,- el control de plagas,- la higiene de las superficies que están en con-tacto con la carne,

- el almacenamiento y la manipulación de equi-pos y utensilios limpios,

- el depósito de los sacos de basura y su eli-minación.

Estos procedimientos deben aplicarse de manerapermanente, en particular en lo que se refiere a lahigiene de las superficies en contacto con la carne,e incluir:

- el monitoreo,- las acciones correctivas,- la verificación,- el registro.

Es esencial mantener registros donde se notifiquenlas operaciones de limpieza y desinfección de las su-perficies en contacto con la carne, controladas porlos servicios de supervisión del establecimiento. Unode los controles debe realizarse fuera de los horariosde actividad (pre-operacional) y otro durante los ho-rarios de actividad (operacional).

Cuando existan diferencias, los registros deben des-cribir las acciones correctivas llevadas a cabo. El per-sonal designado para manejar el sistema de autocon-trol de la empresa debe verificar y validar las activida-des realizadas sobre estos registros, dentro de plazospredeterminados en los procedimientos escritos.

La Autoridad Competente también debe verificarla eficacia con que se lleva a cabo esta actividad,

controlando los registros, las instalaciones, las ta-reas, y efectuando verificaciones microbiológicaso de otro tipo cuando lo considere necesario.

Análisis de peligros y puntos críticos de controlEn tan solo quince años, desde que empezó a

aplicarse en la industria alimenticia, el sistemaHACCP se ha ido generalizando en todos los paí-ses del mundo.

Se trata de un sistema "auditable" de orientaciónpreventiva, basado sobre el concepto del análisisde peligro o de riesgo a través de todas las etapasde la cadena alimentaria. En 1997 fue editada laversión final de Sistema de análisis de peligros yde puntos criticos de control (HACC?) y directri-ces para su aplicación por el Codex Alimentarius,anexada al Código internacional recomendado deprácticas (4).

Algunos requisitos indispensables para la aplica-ción del HACCP son los siguientes:

- el compromiso de la dirección de la empresa ysus responsables de aplicar e implementar elsistema;

- la construcción de vínculos con proveedores,autoridades y clientes;

- el estudio y el conocimiento del sistema degestión de inocuidad;

- la elaboración del plan como resultado de esteestudio;

- la capacitación del personal en sus funciones yde la forma estipulada en el plan;

- la implementación del plan;- el monitoreo, las acciones correctivas, la veri-ficación y la mejora continua.

Generalmente se considera que la decisión deimplementar un sistema HACCP pertenece a lasmáximas autoridades de la empresa; sin embargo,en varios países se han desarrollado guías o siste-mas HACCP genéricos, sobre todo en pequeñas omedianas empresas, pero sin dotar a éstas de losmedios financieros suficientes para hacer frente asu costo.

Sin pretender redactar un manual o guía deHACCP, pues existen muchos y muy buenos, se daa continuación una breve descripción de lo que


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debe ser un sistema HACCP, mostrando algunaspautas que deben tenerse en cuenta.

En los mataderos el primer paso es la constitu-ción del equipo de personas responsables del siste-ma en los diferentes sectores y dirigido por un lí-der. Es muy importante que participen los encarga-dos de: producción, mantenimiento, limpieza, etc.,formando lo que se denomina un equipo multidis-ciplinario.

Entre los pasos que siguen, es de suma importan-cia elaborar el diagrama de flujo sobre el que sedesarrollará el plan HACCP, que consta de los "7principios" que se exponen a continuación.

a) el primero es el análisis de peligros: éste es sinduda el que requiere más conocimientos, expe-riencia y sobre todo información científica yepidemiológica. Se realiza a partir del diagra-ma de flujo que permite seguir una secuenciaordenada con los diferentes pasos en la pro-ducción del alimento. Interesa definir aquí laposibilidad y la probabilidad de que un deter-minado peligro ocurra;

b) el segundo es la determinación de los puntoscríticos de control, siguiendo una secuencia dedecisiones, para definir, en determinadas eta-pas de la cadena, qué medida de control existepara prevenir, eliminar o reducir un peligro aniveles aceptables;

c) luego se fijarán los límites críticos, es decir elvalor o criterio que separa lo aceptable de loinaceptable;

d) la vigilancia o monitoreo es el cuarto principioy consiste en una secuencia planeada de obser-vaciones o mediciones con el fin de verificarque se está respetando el límite fijado;

e) establecer acciones correctivas cuando ocu-rren desviaciones fuera de los límites críticos;

f) establecer procedimientos de verificación:aplicación de métodos, procedimientos, prue-bas, auditorías que permiten asegurar que elplan HACCP cumple con todos los requisitosprefijados. La validación, que frecuentementese incluye dentro de la verificación, consisteen obtener pruebas que demuestren que loselementos del plan son efectivos para alcanzarlas metas propuestas. En general, se acepta laidea de que la validación debe realizarse en el

momento de iniciar el plan HACCP (valida-ción inicial), y luego una vez por año o cuandovaríen algunos elementos o aspectos de los ali-mentos, equipos o instalaciones;

g) El último principio consiste en establecer unsistema de registro y documentación que reco-pile las pruebas documentales u objetivas deque los límites críticos funcionan dentro de loestablecido, así como las acciones correctivastomadas en caso de desviaciones. En los regis-tros también deben figurar la verificación rea-lizada sobre los puntos críticos, las calibracio-nes de los equipos de medición y otros contro-les, entre ellos los análisis microbiológicos.

Los planes HACCP son realizados por las pro-pias empresas elaboradoras de alimentos, comopor ejemplo los mataderos, pero los Servicios Ve-terinarios que operan en las plantas, tal como loprevén los sistemas de inocuidad en la mayoría delos países y especialmente en los desarrollados, de-ben ejercer controles para verificar y validar el co-rrecto cumplimiento de los planes HACCP.

Generalmente estos planes vienen acompañadosde un control del proceso de higiene de la carne,mediante pruebas microbiológicas (9).

El objetivo es establecer el criterio de rendimien-to microbiológico, fijado en general por las legisla-ciones de los organismos oficiales. Así, suelen uti-lizarse bacterias indicadoras de contaminación,como E. colí genérico, recuento de mesófilos tota-les, enterobacterias, o Salmonella (9).

En la playa de faena es muy frecuente la elec-ción de un punto crítico de control relativo a lacontaminación fecal o ingesta. El límite críticoque se busca es "cero contaminación fecal". Lasmedidas correctivas, cuando se producen desvia-ciones, varían entre las plantas en función de de-terminados criterios. El peligro biológico que sepretende eliminar, o al menos minimizar, es el dela presencia de E. coli 0157:H7 y Salmonella,entre otros patógenos.

Otro ejemplo que resulta muy frecuente en losmataderos es el de los puntos críticos relativos altiempo y a la temperatura de enfriamiento de lascanales.


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¿Cuál será entonces el rol del Servicio de Inspec-ción Veterinaria o de la Autoridad Competente?Será sin duda de verificar que los prerrequisitos, elplan HACCP y todos sus requerimientos han sidoimplementados correctamente. Deberá controlar,entre otras cosas, los registros de monitoreo de lospuntos críticos, las eventuales acciones correctivasy preventivas, constatar las desviaciones y contro-lar las verificaciones realizadas por los servicios decontrol de calidad de las empresas.

Además, la Autoridad Competente debe llevar acabo auditorías de conformidad que demuestren yconfirmen que el sistema es efectivo, que se hantenido en cuenta en el análisis todos lospeligros/riesgos y que efectivamente éstos últimosse encuentran bajo control.

Plan Nacional de Control de Residuos yMedicamentos

Después de las crisis debidas a la contaminaciónpor dioxinas y a la encefalopatía espongiforme bo-vina en la década de los 90, la idea de que losavances de la biotecnología podían representar a lavez graves peligros para la salud fue ganando te-rreno en la percepción de los consumidores.

Actualmente, la Autoridad Competente Centraldebe llevar a cabo sistemáticamente un plan decontrol de residuos en carnes y realizar activida-des de control sobre los animales vivos, las car-nes y determinados órganos con el fin de investi-gar la presencia de los elementos que se debenanalizar.

La Autoridad Competente debe realizar un análi-sis de riesgos, evaluando inicialmente el uso de losantibióticos, antiparasitarios y otros medicamentoso productos usados en medicina veterinaria.

Recientemente la resistencia bacteriana comoconsecuencia del uso indiscriminado de productosantimicrobianos en la alimentación y en terapéuti-ca animal y humana, es motivo de preocupación entodos los ámbitos científicos (8, 17).

El plan de vigilancia de residuos debe considerarla posibilidad de metales pesados, toxinas o mico-toxinas y cualquier tipo de residuos.

En los mataderos el Servicio de Inspección Vete-rinaria debe saber de dónde vienen los animalespara conocer los antecedentes y características delos animales, y orientar el muestreo hacia aquellosque puedan resultar sospechosos.

La Autoridad Competente debe establecer los lí-mites máximos de residuos (LMR) para los resi-duos que se consideran permitidos. Los que estánprohibidos deben figurar en la categoría de los re-siduos para los cuales no se admiten límites.

Para poner en práctica un plan de control de resi-duos, se debe disponer de personal capacitado parala toma de muestras, su acondicionamiento y en-trega, y contar con una red de laboratorios acredi-tados por la Autoridad Competente para realizarlos análisis .

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FICHA DE INSCRIPCIÓN

NOMBRE: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

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ENTIDAD OFICINA DÍGITOCONTROL

NÚMERO DE CUENTA

��

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RESUMEN

Antecedentes: La tuberculosis bovina (bTB) su-pone un problema significativo en muchas partesde España, principalmente por contacto entre gana-do y reservorios salvajes en sistemas de pastoreoextensivo. El jabalí (Sus scrofa) es una de las espe-cies envueltas en la transmisión de la enfermedad aotras especies. Los métodos de detección rápidos ysimples serían muy prácticos para evaluar la preva-lencia de la infección, para el estudio de los meca-nismos de transmisión del patógeno y para monito-rizar los efectos de las medidas de control frente ala tuberculosis (TB).

Resultados: Se desarrolló y validó un ELISA parala detección de anticuerpos frente a Mycobacterium

bovis en 185 sueros de jabalí positivos y negativos aTB. Estos jabalíes fueron cazados y distribuidos endos grupos, tuberculosis positivo y tuberculosis ne-gativo, dependiendo de lesiones compatibles contuberculosis, resultado de cultivo y análisis molecu-lar. Tras la optimización del ratio entre positivos ynegativos a diferentes combinaciones de dilución desuero y concentración de conjugado, el test dio unasensibilidad del 72.60% y una especificidad del96.43% para el mejor punto de corte.

Conclusiones: Aunque algunos animales delgrupo de negativos mostraron una reacción po-sitiva al ELISA (<3%), este ensayo presenta unalto potencial para el diagnóstico de TB en ja-balí, ya que el amplio rango dinámico que lorespalda supone un buen poder discriminatorio


DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN ELISAPARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

FRENTE A MYCOBACTERIUM BOVIS EN JABALÍ

Olaia Aurtenetxe1, Marta Barral1, Joaquín Vicente2, José de la Fuente2, Christian Gortázar2,Joseba M. Garrido1, Ramón A. Juste1,*

1 Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER-TECNALIA), Berreaga 1, 48160 Derio, España.2 Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos, IREC (CSIC-UCLM-JCCM), Ronda de Toledo s/n., 13071 Ciudad Real, España.* Corresponsal. Tel.: +34 94 4034300; Fax: +34 94 4034310.

Publicado originalmente en: BMC Veterinary Research 2008, 4:43doi:10.1186/1746-6148-4-43© 2008 Aurtenetxe et al; licensee BioMed Central Ltd.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecom-mons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the originalwork is properly cited.Direcciones de E-mail:OA: [email protected] ; MB: [email protected] ; JV: [email protected] ;JF: [email protected] ; CG: [email protected] ; JGA: [email protected] ;RAJ. [email protected]

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y un balance satisfactorio entre sensibilidad yespecificidad.

ANTECEDENTES

La tuberculosis bovina (TB), causada por Myco-bacterium bovis y por otras micobacterias cercanasdel complejo Mycobacterium tuberculosis, es en-démica en muchos países. Esta micobacteria es ca-paz de infectar un rango amplio de animales do-mésticos y salvajes [1-3]. Los animales salvajesson realmente importantes en la diseminación y elmantenimiento de la infección por M. Bovis, espe-cialmente en aquellos lugares en los que el esfuer-zo por la erradicación de la enfermedad reduce laincidencia en el ganado doméstico [2,4]. La exis-tencia de reservorios de TB en animales salvajes yla dificultad en el control de la enfermedad en es-tas especies son los problemas más importantes atener en cuenta en los programas de erradicación[3]. Entre los reservorios salvajes de TB conocidosse encuentran, por ejemplo, el tejón (Meles meles)en el Reino Unido e Irlanda [5,6], la zarigüeya(Trichosurus vulpecula) en Nueva Zelanda [3], elciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus) enel norte de los Estados Unidos [7], el búfalo(Syncerus caffer) en Sudáfrica [8,9], o el bisonte(Bison bison) en Canadá [10].

En España, la prevalencia de la TB es relativa-mente baja en el ganado vacuno (0.42 en 2006),pero la infección persiste en otro tipo de ganadocomo cabras y cerdos en montanera, además existeun amplio rango de especies salvajes susceptibles ala enfermedad [11]. Estudios previos sugieren unatransmisión interespecífica del complejo M. tuber-culosis entre ungulados silvestres y ganado [11-14].El jabalí (Sus scrofa) es uno de los ungulados en-vueltos en la epidemiología de la tuberculosis en Es-paña. Hay evidencias epidemiológicas, patológicasy microbiológicas recientes que sugieren firmemen-te que, en ecosistemas mediterráneos españoles, losjabalíes son capaces de mantener la infección de TBen el medio salvaje y probablemente puedan trans-mitir la enfermedad a otras especies, actuando comoverdaderos reservorios salvajes [15]. Teniendo encuenta los factores de riesgo como la edad del hos-pedador y el manejo, incluyendo la alimentación yel cercado, la prevalencia de la TB en jabalí oscila

según la patología entre 18-100% [16,17]. El diag-nóstico de la infección por M. bovis en animales vi-vos generalmente depende de la respuesta inmunecelular a los antígenos de M. bovis en las primerasfases de la infección [18]. La técnica más usada esla prueba de la hipersensibilidad retardada basadaen la inoculación intradérmica de antígenos crudos[19-21]. Esta técnica, descrita por Robert Koch, esactualmente el método de diagnóstico de TB másutilizado en el ganado. También es utilizado en ru-miantes salvajes [22,23]. En cualquier caso, los testcutáneos tienen una sensibilidad limitada, y anima-les sensibilizados con otras micobacterias fuera delcomplejo M. tuberculosis pueden dar reacciones noespecíficas [24,25].

Las pruebas de diagnóstico utilizadas en anima-les salvajes tienen asociado un riesgo respecto a lacaptura, tanto para las personas que atrapan el ani-mal como para el propio animal, debido al estrés yheridas causadas por el manejo. Además, resulta-dos previos en el test de hipersensibilidad realiza-do en jabalíes con estado de TB conocido sugierenuna baja sensibilidad (datos sin publicar). Por lotanto, sería deseable obtener un test basado en unsolo muestreo para el estudio del mecanismo detransmisión y monitorización de los efectos de lasmedidas de control sobre la enfermedad.

Mientras que una reacción de hipersensibilidadretardada es indicativa de infección o exposición,la formación de anticuerpos parece estar relaciona-da en gran parte por la multiplicación de las bacte-rias y la carga antigénica en el individuo infectado.El test ELISA no se utiliza de rutina en los progra-mas de control de la TB bovina por su reducidasensibilidad [26], aunque se ha sugerido su usocomo complemento del test de la tuberculina, es-pecialmente para detectar los casos anérgicos a latuberculosis en el ganado [27,28].

El objetivo de este estudio fue desarrollar y vali-dar un test de ELISA para la detección de anticuer-pos frente a Mycobacterium bovis en suero de ja-balí. Para conseguir este propósito, la respuesta hu-moral obtenida con este test se midió primero enjabalíes confinados y sensibilizados con el antíge-no bacteriano inactivado, y los resultados fueronvalidados con sueros obtenidos de jabalíes con es-tado microbiológico de TB conocido.



METODOLOGÍA

Sueros de referencia

Inmunización de jabalíesCon el fin de obtener sueros control para el ELI-

SA, se utilizaron cuatro jabalíes adultos en cautivi-dad procedentes de un área libre de M. bovis. En eldía 0, el jabalí 1 (WB1) y el jabalí 4 (WB4), se in-munizaron por vía subcutánea con 1 ml de suspen-sión con 103-106 unidades-formadoras de colonias(CFU; 2.5 mg) de M. bovis inactivado. El jabalí 3(WB3) fue inmunizado con 1ml (103-106 CFU) deM. avium inactivado (los antígenos de M. bovis yM. avium fueron proporcionados generosamentepor Cooper Zeltia Veterinaria, S.L., España), y eljabalí 2 (WB2) con 1 ml (2.5 mg) de vacuna co-mercial de M. avium paratuberculosis inactivado(Gudair® también proporcionada gratuitamente porCooper Zeltia Veterinaria, S.L.). Previamente a lainmunización se recogió una muestra de suero (S1)de cada animal. Treinta días después se cogió unasegunda muestra de suero (S2) y todos los anima-les se reinmunizaron de la misma manera que lavez anterior. Tras noventa días se obtuvo la terceramuestra de suero (S3) de todos los animales. Todoslos sueros se almacenaron congelados a -20ºC has-ta su uso en el test.

Jabalíes con estado conocido de TBPara validar el ELISA se analizaron 185 sueros

procedentes de casos con estado conocido de tu-berculosis (suero con estado conocido). Entre lossueros se incluían 73 sueros procedentes de jabalí-es TB positivos (infectados naturalmente), es decir,individuos con lesiones compatibles con TB [50] yaislamiento del complejo M. tuberculosis confir-mado por PCR (datos no publicados). También seencontraban 112 sueros de jabalíes TB negativos,definidos como animales sin lesiones compatiblescon TB visibles y con cultivo negativo. Estos sue-ros fueron analizados con el protocolo de ELISAoptimizado, usando como controles positivos el S3de WB1 o WB4, y como control negativo el S1.

Optimización del ELISA indirecto

El derivado proteico purificado (PPD) de la tu-berculina bovina (Cooper Zeltia Veterinaria, S.L.,España) se diluyó a 5 µg/ml en tampón carbonato(63 mM, pH 9.6). Las placas (High binding ELISA

microplate, Greiner bio-one, Alemania) se fijaroncon 100 µl de PPD bovina diluida y se usaron di-rectamente, evitando su almacenaje. Los sueros ylos controles se enfrentaron (1/1) con una suspen-sión salina de Mycobacterium phlei (5 gr/l; Dr. O.Fuentes, INIA, España), para eliminar anticuerposanti-Mycobacterium spp. no específicos. Tras incu-bar toda una noche a 4ºC, las muestras se diluyeronen PBS-Tween (0.14M NaCl; 3 mM KCl; 10 mMtampón fosfato; 0.05 Tween 20; pH 7.4) y se aña-dieron 100 µl de cada dilución por duplicado en po-cillos contiguos de las placas fijadas con PPD bovi-na. Las placas se incubaron 2 horas a temperaturaambiente. Tras tres lavados con PBS-Tween, seañadieron 100 µl de conjugado Proteína A o G y seincubaron las placas 2 horas a temperatura ambien-te. Se lavaron otra vez las placas 3 veces, se añadie-ron 100 µl de sustrato ABTS (Sigma-Aldrich) encada pocillo y se incubó 20 minutos en oscuridad ya temperatura ambiente. Las densidades ópticas(DO) se midieron con filtros de 405 y 450 nm(MultiskanEX, Thermolabsystems). El resultado dela muestra se expreso como Índice ELISA (IE), cal-culado como la razón entre la media de DO de lamuestra y la media de DO del control positivo.

La combinación óptima de diluciones fue determi-nada evaluando el análisis por duplicado de la reac-tividad de diluciones seriadas (1/10; 1/100; 1/200;1/500; 1/1000 y 1/2500) de los sueros de referenciade los cuatro jabalíes inmunizados S1, S2 y S3 encombinación con diluciones seriadas del conjugadoProteína G o Proteína A peroxidasa recombinante deStreptococcus sp. (2.5 µg/ml; 1 µg/ml; 0.5 µg/ml;0.05 µg/ml) (Sigma-Aldrich). La dilución de sueroy la concentración de Proteína G en las cuales el ra-tio entre las DO de S2 y S1 es mayor y aparente-mente más representativo se uso para analizar elconjunto de sueros de estado conocido. Estos suerosfueron testados posteriormente con las siguientes 4combinaciones (dilución de suero-concentración dePrG): 1/10-0.05 µg/ml, 1/200-2.5 µg/ml, 1/200-0.5µg/ml y 1/200-0.05 µg/ml.

Validación del ELISA indirecto

Los índices ELISA del grupo de sueros de estadoconocido se incluyeron en una hoja de cálculo (RAJuste, sin publicar), que permitió calcular la sensi-bilidad y especificidad para cada valor de corte. La

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hoja de cálculo permitió analizarla semisuma de la sensibilidad yespecificidad (el rango del valordiagnóstico desde 0 a 100) y losratios de la especificidad a la sen-sibilidad (índice de discrimina-ción de la especificidad - SpDI) yde la sensibilidad a la especifici-dad (índice de discriminación dela sensibilidad - SeDI). Final-mente la hoja de cálculo sirviópara trazar todos los valores enun gráfico que permitió ver a lavez el comportamiento de estasvariables a lo largo del rango di-námico del test. La comproba-ción de estos análisis se hizo uti-lizando el programa de gráficosde SigmaPlot (Addlink, Barcelo-na, España), que se utilizó tam-bién para realizar el histogramade IE del grupo de sueros positivos ynegativos, y calcular el intervalo deconfianza al 95% de sensibilidad y es-pecificidad para cada umbral.

El umbral final para el test se eligiócomo aquel en el cual se alcanza lasemisuma más alta, esta localizadoen una región donde la semisuma novarie sustancialmente cuando el pun-to de corte se modifica ligeramente(Figura 2), y en el histograma esta lo-calizado en el intervalo más grandesin valores (Figura 3).

RESULTADOS

Respuesta humoral frente a antíge-nos micobacterianos

Los dos jabalíes inmunizados con M. bovis(WB1 y WB4) presentaron un incremento impor-tante en el nivel de anticuerpos en los sueros entrela preinmunización (S1) y 30 días después de la in-munización (S2), mientras que 90 días post inmu-nización el incremento fue mucho menor (Tabla 1;Figura 1). Los otros dos jabalíes, inmunizados conM. avium (WB3) y M. paratuberculosis (WB2),

presentaron un incremento muy leve en el nivel deanticuerpos frente a PPD bovina entre la muestrade suero antes de la inmunización y los controlesS2 y S3 (Tabla 1).

Las densidades ópticas (DO) obtenidas mostra-ron una mejor discriminación a diluciones mayo-res, pero a diluciones de suero mayores de 1/200observamos una disminución en los valores de DOhasta lecturas rozando el blanco. Los sueros reac-


Figura 2.- Dinámica de sensibilidad (Sen) y especificidad (Spe), valor diagnóstico de la semi-suma (SE+SP), índice de discriminación de la especificidad (SpDI) e índice de discrimina-ción de la sensibilidad (SeDI) en las condiciones elegidas (dilución de muestras de suero

1/200 y conjugado PrG a 0.05 _g/ml).

Figura 3.- Histograma de distribución de los valores de IE en las condiciones defini-das (1/200 y 0.05 _g/ml) y según el estado de los animales: positivo (POSITIVO) onegativo (NEGATIVO). La línea horizontal representa el valor umbral seleccionado.

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cionaron con los dos conjugados, Proteína G yProteína A, pero los valores de DO eran más ho-mogéneos y la discriminación era mayor con laProteína G. Finalmente, las combinaciones entre ladilución de suero y la concentración de conjugadoProteína G que mostraron mayor incremento entreS1 y S2, se utilizaron para la validación junto conlos sueros con estado conocido: 1/10-0.05 µg/ml,

1/200-2.5 µg/ml, 1/200-0.5 µg/mly 1/200-0.05 µg/ml.

Análisis de los sueros conestado conocido y determina-ción del valor umbral

El resumen de los resultados delELISA en la Tabla 2, muestra quea la mayor semisuma la especifi-cidad era >93% y la sensibilidadera >69% en todas las combina-ciones. La mayor semisuma se

obtuvo a una dilución de suero 1/200 y a una con-centración de conjugado de 2.5 µg/ml. Estas dilu-ciones produjeron la sensibilidad más alta(80.26%) entre todas las combinaciones testadas,pero al mismo tiempo la especificidad se redujo aun 95.61%. La siguiente mejor combinación fue auna dilución de suero de 1/200 y una concentra-ción de conjugado de 0.05 µg/ml, con una sensibi-


Dilución de suero Dilución de Proteína G1/10 1/100 1/200 1/500 1/1000 1/2500 2.5 1 0.5 0.05

µg/ml µg/ml µg/ml µg/mlS2/S1 9,2805 9,2610 9,6143 9,5895 9,1172 6,4596 6,3067 8,3368 10,702 11,129

WB1 S3/S1 10,465 11,061 11,38 11,574 11,730 9,1666 7,5116 10,252 12,074 13,751+ S1 0,1758 0,1089 0,0855 0,0596 0,0465 0,0355 0,1428 0,0981 0,0728 0,0275WB4 S2 1,0053 0,8198 0,7176 0,57 0,4293 0,2521 0,7832 0,729 0,6658 0,3514

S3 1,0706 0,9049 0,7892 0,6605 0,5357 0,3438 0,8763 0,8273 0,7576 0,4086S2/S1 1,4873 1,2624 1,2840 1,1513 1,2033 1,1837 1,2756 1,2966 1,3386 1,1372S3/S1 5,9384 5,5608 5,0313 3,6979 2,8577 2,3318 4,0252 4,7892 5,1064 3,0244

WB2 S1 0,0941 0,0669 0,055 0,0523 0,0414 0,0305 0,094 0,062 0,0491 0,0217S2 0,1473 0,0841 0,0719 0,061 0,0504 0,0353 0,125 0,0844 0,0657 0,0248S3 0,5771 0,3818 0,2885 0,2023 0,1224 0,0686 0,4152 0,3324 0,2779 0,0683S2/S1 3,1229 2,4333 2,6135 2,0944 1,8366 1,4173 2,2195 2,3216 2,5731 1,8978S3/S1 4,0662 3,3376 4,0625 3,1850 2,8014 2,1894 3,0310 3,3525 3,7237 2,9875

WB3 S1 0,1119 0,0671 0,054 0,0611 0,0485 0,0383 0,1052 0,0704 0,0543 0,0241S2 0,3505 0,1645 0,145 0,1318 0,0914 0,0543 0,2504 0,8477 0,1515 0,0464S3 0,41 0,2215 0,2269 0,1994 0,1374 0,0839 0,3213 0,8577 0,213 0,0731

Tabla 1: Promedio de las lecturas de DO para la combinación entre dilución de suero y proteínaG. Todas las concentraciones de proteína G para cada dilución de suero, y todas las diluciones de

suero para cada concentración de proteína G.

WB1+WB4: Suma de resultados del jabalí 1 y del jabalí 4. S2/S1 y S3/S1: Tasa de Incremento entre resultados pre- y post-inmunización. S1, S2 y S3: valores de DO.

Figura 1.- Tasa de incremento (S2/S1) en la lectura de la densidad óptica en el ELISA conPPD bovina y proteína G en WB1 y WB4 (inmunizados con M. bovis), WB2 (M. avium para-tuberculosis) y WB3 (M. avium).

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lidad del 72.60% y una es-pecificidad del 96.43%.

A fin de conseguir una re-producibilidad del ELISA yvalidar el test, se repieron lasdos mejores combinaciones(1/200 y 2.5 µg/ml, y 1/200y 0.05 µg/ml) en 2 días dife-rentes. Se observó que lasreplicas en la combinación1/200 y 0.05 µg/ml variabanmenos que las de la otra combinación. Además, elcoeficiente de variación (CV) entre días de cada testera menor y en el rango dinámico era más ampliopara la combinación 1/200 y 0.05 µg/ml (Tabla 3).

La Figura 2 muestra la dinámica de la sensibilidad,especificidad, el valor diagnóstico de la semisuma, ylos valores de SeDI y SpDI del ELISA para la com-binación de suero/conjugado 1/200 y 0.05 µg/ml. Sepuede ver que el rango entre 0.115 y 0.655 tiene unvalor diagnóstico superior a 80%, con un primer picollamativo entre 0.195 y 0.275, y un segundo entre0.415 y 0.475. El máximo de SeDI y de SpDI estánen los dos extremos del primer pico, e indican el ren-dimiento óptimo cuando la sensibilidad o la especifi-cidad son el principal objetivo para el test. Si el obje-tivo es un buen equilibrio, entonces la opción es unvalor intermedio. En este caso, teniendo en cuenta ladistribución que muestra el his-tograma, un valor alrededorde 0.2 parece ser que propor-ciona el major balance. Estafigura muestra que hay unadistribución bimodal para lossueros de referencia negati-vos y positivos. Esta distribu-ción bimodal es menos clarapara el grupo de negativos yaque, excepto cuatro, todosellos están por debajo delpunto de corte de 0.2. Lospositivos tienen una distribu-ción más polarizada con unasmodas altas en los dos extre-mos del rango de IE y unadistribución siempre continuaentre ellos. Por ello, el puntode corte de 0.2 fue elegido fi-

nalmente como el único que alcanza el mejor balan-ce entre la especificidad y la sensibilidad, y localiza-do en una región donde no se encuentra ningun va-lor, indicando una separación biológica entre pobla-ciones de IE.

DISCUSIÓN

Hoy en día no hay estudios en los que se utilicenantígenos experimentalmente para determinar larespuesta inmune en jabalí y en cerdo frente a M.bovis. En este caso se utilizaron con exito antíge-nos micobacterianos inactivados para estimularuna respuesta inmune humoral específica en jabalí-es sanos. La inoculación de antígenos provocó unaumento en los anticuerpos específicos, pero la ad-ministración de una segunda dosis de antígeno no


ELISA SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD SEMISUMA SpDI SeDI1/10-0.05ug/ml 70,67% 93,81% 0,8224 11,4076 3,19791/200-2.5ug/ml 80,26% 95,61% 0,8794 18,3000 4,84441/200-0.5ug/ml 69,33% 97,35% 0,8334 26,1156 3,17431/200-0.05ug/ml 72,60% 96,43% 0,8452 20,3288 3,5196

Tabla 2: Valores de Sensibilidad, Especificidad, Semisuma, Indice dediscriminación de la Especificidad (SpDI) e Indice de discriminaciónde la Sensibilidad (SeDI) a diferentes combinaciones de suero y

conjugado PrG.

COMBINACIÓN 1/200-0.05µg/ml COMBINACIÓN 1/200-2.5µg/mlELISA 1 ELISA 2 ELISA 1 ELISA 2

n 182 182 183 183Promedio 0,3578 0,4152 0,5485 0,4862DS 0,4633 0,5475 0,3855 0,3572CV 129% 132% 70% 73%DO max. 1,3902 1,6046 1,3907 1,1906DO min. 0,0127 0,0213 0,0544 0,0604Rango 1,3775 1,5833 1,3363 1,1302Media CV 13,85% 19,91%Max. CV. 46,74% 94,32%

Tabla 3: Estadística descriptiva de las dos combinaciones elegidas.

DS: Desviación Estandar; CV: Coeficiente de Variación; DO max.: valor máximo deDensidad Óptica; DO min.: valor mínimo de Densidad Óptica; Media CV: media delcoeficiente de variación para las dos replicas de cada suero; Max. CV: valor máximodel coeficiente de variación.

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elevó los niveles de anticuerpos mucho más. No seobservaron reacciones cruzadas en el ELISA entreanticuerpos específicos de M. avium y M. avium pa-ratuberculosis (WB 2 y WB 3) y la PPD bovina, sal-vo alguna excepción en el WB2 tras la estimulación.Por lo tanto, el ensayo de la inmunización proporcio-nó sueros control negativos y positivos frente a M.bovis para el desarrollo del ELISA, así como suerosde referencia para un futuro.

Está generalmente reconocido que la inmunidadhumoral no es muy importante en el diagnóstico de latuberculosis [29], sin embargo, puede ser útil en ladetección de animales con enfermedad severa, ya quela concentración de anticuerpos está relacionada conla distribución y la severidad de las lesiones, así comode la cantidad de bacilos [18,22,26,30-32]. Las infec-ciones micobacterianas inducen la producción de an-ticuerpos en rumiantes, pero el perfil de la expresiónde las inmunoglobulinas (Ig) en los animales infecta-dos con M. bovis no está muy claro [33-36]. En estu-dios previos se ha descrito que las cadenas pesadas yligeras de las Ig están sobrereguladas en jabalíes in-fectados con M. bovis [37]. No obstante, la determi-nación de los sueros sugiere un nivel elevado de IgGen jabalíes no infectados comparando con animalesinfectados con M. bovis [38]. Se desconoce el meca-nismo de la expresión diferencial de Ig en jabalíes in-fectados con M. bovis, pero sí reflejan diferentes es-tados durante la infección micobacteriana. Además,el análisis de expresión de los genes en respuesta a lainfección micobacteriana en jabalí sugiere que la res-puesta de anticuerpos frente a M. bovis podría ser im-portante en infecciones naturales en especies silves-tres y podría ser útil en la vigilancia de la TB bovinay monitorización del tratamiento [35,39-41].

Estudios previos en ganado han obtenido sensibili-dades del 74% y especificidades del 90% en el usodel test ELISA [26], y entre el 79% y 98% de especi-ficidad y 37% de sensibilidad del ELISA aplicado atejones [41-43], aunque en este último hay un incre-mento en tejones con tuberculosis progresiva [44].Además, el resultado positivo del ELISA en tejonesestá relacionado con un aumento en la probabilidadde obtener cultivos positivos en un futuro [45]. Algu-nos antígenos micobacterianos también han sido utili-zados en ELISA de tuberculosis bovina en otros estu-dios. Esto incluye, por ejemplo, tests de ELISA basa-dos en MPB70 y MPB83 en ganado, que han

generado especificidades del 89% y 96.4%, y sensibi-lidades del 18.1% y 37.5% [46,47]. Los resultadosobtenidos en el presente estudio, indican que el rendi-miento del ELISA fue muy bueno en jabalí, especial-mente en términos de sensibilidad (72.60%) y sinperder apenas en especificidad (96.43%), teniendo encuenta que generalmente las sensibilidades y especi-ficidades de los protocolos de ELISApara el diagnós-tico de la tuberculosis bovina son muy bajas respectoa las que se obtienen para otras enfermedades [48].

Alrededor del umbral elegido hubo algunos anima-les del grupo negativo que presentaron un nivel me-dio de anticuerpos en la reacción frente a la PPD bo-vina. Es posible que alguno de estos animales fueraun individuo infectado sin lesiones visibles y sinbacterias detectadas, o fuera un animal potencial-mente resistente, es decir, verdaderos no infectadospero si expuestos a la infección por M. bovis. Ac-tualmente, los resultados positivos de ELISA se con-sideran solo evidencias a la exposición [17] y no ne-cesariamente infección en curso. Tampoco se puedendescartar definitivamente reacciones cruzadas causa-das por otras micobacterias, aunque sabiendo el ori-gen de los animales en áreas infectadas y el intervalode IE para el resto de controles negativos, podemospensar que es poco probable que estén involucrados.Por otro lado, hay animales de los que se ha aisladoM. bovis, que tienen lecturas de IE muy bajas. Estosanimales pueden representar individuos recien infec-tados que no han desarrollado aun una respuesta hu-moral o animales anérgicos con una limitada res-puesta inmune debido a una pobre condición física.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a CZ Veterinaria, S.L. (España) porproporcionarnos los antígenos micobacterianos utili-zados en el experimento. El manejo de los animalesestuvo supervisado por el comité ético de experi-mentación animal de Neiker de acuerdo con las leyesespañolas. Este trabajo se suvencionó con los pro-yectos INIA-RTA03-074-C2 y “Control de la tuber-culosis en fauna silvestre” de la Fundación Marceli-no Botín-Banco Santander (para C. G. y J. F.); por elDepartamento de Agricultura, Pesca y Alimentacióndel Gobierno Vasco; por la beca de investigaciónAGL2005-07401, y por el FEDER (España). Tam-bién se contó con las ayudas de OAPN y SDGSA


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(MMA-MRM); MAPA; Fundación Candido Iturria-ga y María de Dañobeitia, y las Diputaciones Foralesde Vizcaya, Guipúzcoa y Álava. Queríamos agrade-cer también a Karpin Aventura (Iniciativas Ambien-tales de Euskadi, S.L.) y Alfredo Peña por su contri-bución en la inmunización de los animales.

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Doce años han transcurrido desde que la Organi-zación Mundial de Sanidad Animal (OlE) dedicaraa la "Prevención de la propagación de las enferme-dades de los animales acuáticos" uno de los núme-ros de su Revista científica y técnica (Vol. 15 [2],junio de 1996), y casi diez desde que abordó lasemergencias zoosanitarias en animales acuáticosen el número sobre "La gestión de emergencias zo-osanitarias" (Vol. 18 [1], abril de 1999). Desde en-tonces, las estrategias de lucha contra las enferme-dades de los animales acuáticos han evolucionadoconsiderablemente.

El Código sanitario para los animales acuáticosde la OIE, ahora revisado exhaustivamente, ofreceun nuevo y más práctico marco de referencia inter-nacional con respecto a la seguridad sanitaria en elcomercio de animales acuáticos y sus derivados.Las recomendaciones contenidas en cada uno delos capítulos dedicados a las enfermedades estánpensadas para reducir al mínimo el riesgo de pene-tración en el país importador, teniendo en cuenta lanaturaleza del artículo importado y el uso al queesté destinado, así como la situación zoosanitariadel país exportador en lo que respecta a los anima-les acuáticos. En el Código se definen una serie de

condiciones básicas de seguridad biológica, que re-quieren la existencia de un sistema de detecciónrápida en el que participen veterinarios o especia-listas en sanidad de animales acuáticos formadospara reconocer y notificar procesos patológicossospechosos.

Con el auge del cultivo de "nuevas" especies deanimales acuáticos y el consiguiente descubrimien-to de enfermedades nuevas o emergentes, parecede lo más oportuno poner al día la información so-bre las diversas estrategias de gestión de emergen-cias zoosanitarias. El principal objetivo de este nú-mero de la Revista consiste por lo tanto en presen-tar una panorámica y una valoración actualizadasde dichas estrategias, que abarquen desde las polí-ticas sobre el tema hasta instrumentos de trabajoeminentemente prácticos, y desde el plano interna-cional hasta el ámbito de la simple explotación.Con ello se desea proporcionar información útil yde carácter genérico, elaborada por especialistasmundialmente reconocidos, sobre la gestión deemergencias ligadas a enfermedades de los anima-les acuáticos. Cabe pensar que el resultado será degran utilidad y ofrecerá una visión contemporáneay realmente planetaria del tema.


LIBROS

EVOLUCIÓN DE LA GESTIÓN DE EMERGENCIASSANITARIAS EN ANIMALES ACUÁTICOS

COORDINADO POR:EVA-MARIA BERNOTH

REVISTA CIENTÍFICA Y TÉCNICA

Volumen 27 (1), abril de 2008


CONTENIDOS

Preface (B. Vallat)

Introduction (D.J. Mellor)

Chapter 1: Pain and pain management -Overview

Pain management: an international perspective(J. A. MacArthur Clark)

Public perceptions of animal pain and animal wel-fare (G. Coleman) Pain as an animal welfare issue(C. Phillips)

A cost-benefit analysis of pain relief for farm ani-mals (D. J. Mellor, M.w. Fisher & K. J. Stafford)

Pain-free animals: an acceptable alternative?(R. M. Gardner & A. M. Goldberg)

Chapter 2: Pain and pain management -Clinical perspectives

Behavioural effects of pain in animals (K. Seksel)

Practical pain management in dogs and cats(M. Pearson)

Pain and pain management: a pharmacologicalperspective (S. Dolan & A. M. Nolan)

Chapter 3: Pain and pain management -Research perspectives

New approaches to identifying and measuringpain (C. B. Johnson)

New research on pain-alleviating methods forfarm animals (A D. Fisher, D. R. Paull, C. Lee, S.J. Atkinson & I. G. Colditz)

Identifying pain in farm animals (D. M. Weary &D. Fraser)

Chapter 4: Pain and pain management -Laboratory animal perspectives

Avoiding and alleviating pain in research animals(S. J. Atkinson)

Lessons learned from pain management in humans(C.B. Johnson)

Conclusion

Future prospects for animal pain and its management(D J. Mellor)

EVALUACIÓN CIENTÍFICA Y MANEJO DEL DOLORANIMAL

COORDINADO POR:DAVID J. MELLAR, PETER M. THARNBER, A.C. DAVID BAYVEL & SARAH KAHN

La Organización Mundial de Sanidad Animal (OlE) es el organismo internacional con capacidad normativaen materia de bienestar animal. En esta oportuna publicación se tratan todos los aspectos de la evaluacióncientífica y el tratamiento del dolor en los animales, lo que constituye un elemento básico del bienestar ani-mal. Aunque se basa principalmente en una serie de comunicaciones presentadas durante la "Cumbre científi-ca sobre el dolor y su tratamiento", organizada por la sociedad australiana de estrategia en materia de bienes-tar animal (Australian Animal Welfare Strategy: AAWS) y celebrada en Melbourne en mayo de 2007, estaobra contiene también artículos inéditos procedentes de otras partes del mundo.

Esta publicación será una lectura indispensable para cuantos trabajan sobre la evaluación y el manejo deldolor en los animales.

Por el momento se encuentra disponible sólo en inglés, aunque se espera una pronta edición en español.

50/2010LaboratorioVeterinarioAvedila · zonas de España debido al continuo abandono de las zonas...

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