CAPITULO VI. Caracterización molecular de organismos

fungosos por PCR-ITS de genes ribosomales

rDNA o rRNA. *CONOCIMIENTO BASICO*

y

DNA BARCODE OF LIFE ¡!!!!

http://www.barcoding.si.edu/

y, CHARLES DARWIN ????

Introducción

Actualmente las técnicas moleculares, paralelamente con la identificación

morfológica, son complementarias en la identificación de especies. Entre especies

fungosas con morfología difícil de diferenciar, la técnica molecular con uso de “primers

específicos”

Diagnóstico

diagnóstico,

organismos

es la única confiable. Las técnicas moleculares en Laboratorios de

Acreditados, se usan de rutina, y además, en casos de urgencia

permiten una rápida identificación por PCR en Tiempo Real de

en tejidos vegetales, semillas, etc., sin requerir del aislamiento

del

los

del

organismo en cult ivo. Otro uso de las técnicas es en análisis filogenéticos.

La técnica más comúnmente usada es ITS (Internal Transcribed Spacer) de las

regiones ITS1 e ITS2, por PCR (Polymerase Chain Reaction), y con uso de primers

universales que amplifican los genes nucleares rRNA: 18S-5.8S-28S, más sus regiones

internas ITS (ver mapa). Estos genes son de altamente conservados (18S) a un poco

menos conservados (28S), y sus regiones internas ITS tienen variabilidad (mayor

cuando las diferencias morfológicas son evidentes, menor cuando tales diferencias son

tenues, o nula en especies similares morfológicamente), en la secuencia de sus

nucleótidos que permite diferenciar especies y detectar mutaciones.

1

MODULO 2.2. INTRODUCCION A LA BIOLOGIA DE ORGANISMOS FUNGOSOS

Dra. María de Jesús Yáñez Morales: Tutor yanezmj@colpos.mx. Ofna. 118, Lab. 128

Noviembre, 2013 CP-Montecilllo: 595-95-20200, ext. 1663

VER DIAPOSITIVAS

VI.2. Pasos globales a seguir para realizar técnica:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Producción del micelio por cultivo monospórico

Extracción del ADN problema

Electroforesis

PCR

Electroforesis

Purificación

Secuenciación. MACROGEN: http://www.macrogenusa.com

8. Análisis de la secuencia: programa DNASTAR (altamente

requiere licencia)

recomendado,

9. Alineamiento de la secuencia en el banco de genes NCBI (National Center for

Biotechnology Information) (acceso libre en internet)

10. Depósito de las secuencias en NCBI (genera un número de registro o acceso)

11. Análisis filogenéticos (con Bootstrap, 5000 repeticiones) por MEGA.10

(libre en internet) o DNASTAR (requiere licencia), etc., etc.

12. Deposito de Arboles Filogenéticos en: TreeBASE

http://www.treebase.org/treebase-

web/home.html;jsessionid=2A8BA90B7B56713AFB9434DAAD582B69

TRABAJO DE LABORATORIO

A. Extracción de DNA y RNA por el kit: reactivo Plant RNA Purification Reagent

(Invitogen® No. Cat. 12322-012). Especial para extraer ADN de esporas tomadas

directo de los síntomas.

Existen múltiples kits de técnicas opcionales para extracción del DNA y también

de formulación en el propio laboratorio como la técnica de Ahrens and

Seemüller (1992), CTAB (Bromuro de Cetiltrimetilamonio), etc.

2

1. Colocar el micelio en un mortero previamente estéril y congelado (también se

puede usar nitrógeno liquido), triturar la muestra hasta dejarla en una

consistencia de polvo.

Depositar todo el polvo a un tubo de microcentrifuga estéril de 1.5 mL, con

500μL Plant RNA Purification Reagent, agitar en vortex por 30 seg. hasta que el

macerado este totalmente resuspendido.

Incubar por 5 min a temperatura ambiente (poner el tubo horizontalmente para

maximizar el área durante la extracción).

Clarificar la solución, por centrifugación a 12 000g por 2 min. Transferir el

sobrenadante a otro tubo estéril, ponerlo en hielo.

Adicionar100μL de NaCl 5M para clarificar el extracto y mezclar por inversión.

Adicionar 300 μL de cloroformo. Mezclar por inversión.

Centrifuga por 10 minutos a 12000g y transfiere cuidadosamente el

sobrenadante a un tubo de 1.5 mL limpio y estéril.

Precipitar el DNA del sobrenadante con un volumen igual de isopropanol, y

mezcla por inversión e incuba al menos por 10 minutos sobre hielo.

Centrifugar a 4oC por 10 minutos a 12 000g,

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10. Decanta el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder el pellet (pastilla). Lava

la pastilla con 1 mL de etanol al 70% y centrifuga a 12 000g por 5 minutos,

escurre los excesos de la pastilla sobre papel absorbente y espera a que seque

11. Resuspende la pastilla en 50μL de agua estéril libre de nucleasas y procede a la

verificación de la integridad, calidad y cantidad del DNA y el RNA.

B. ELECTROFORESIS.

La electroforesis en gel de agarosa o acrilamida es el método estándar utilizado para

separar, identificar y purificar fragmentos de ADN (Sambrook et al., 1989). La

preparación del gel está basada en el volumen total del molde del gel (30, 50 o 100, 200

mL. El procedimiento es sencillo y consiste en lo siguiente:

1. Coloque en un matraz Erlenmeyer ultra pura agarosa (para un gel al 1 % p/v) y

agregue amortiguador TBE 1X.

2. Coloque el matraz en el horno de microondas por segundos hasta que inicie una

tenue ebullición y se disuelva la agarosa.

3

3. Transfiera el agarosa al portagel de la cámara de electroforesis y coloque los

correspondientes peines.

Después de 30 minutos, con el agar solidificado, retire con cuidado los peines.

Agregue a la cámara 200 ml de amortiguador TBE1X (hasta que se cubran los pozos

con el amortiguador).

Sobre parafilm, coloque la muestra1. Agregue 2 µl de colorante azul de bromofenol

y agua destilada para llevar el volumen final a 10 µl.

Con la micropipeta homogeneice la muestra y transfiérala a uno de los pozos del gel

de agarosa.

Encienda la fuente de poder programando el voltaje constante.

Permita que avance la electroforesis hasta que el azul de bromofenol recorra 2/3 de

la distancia del gel.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10. Apague la fuente de poder y retire cuidadosamente el gel.

11. Coloque el gel en una solución de bromuro de etidio y manténgalo durant e 15 min.

C. PCR-ITS (White et al., 1990)

Iniciadores (primers) universales:

4

ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS2 ver White et al., 1990

ITS3 ver White et al., 1990

ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

Condiciones de reacción del PCR:

1La cantidad de muestra que se agregue variara dependiendo de la concentración de ADN.

D. Programa de amplificación (termociclador):

Inicial desnaturalización 95°C durante 2’,

Desnaturalización 30 ciclos de 95°C x 1’,

Annealing 50°C x 30”,

Extensión 72° x 2’ y

Extensión final 72°C x 10 .́

REGRESAR: B, electroforesis

E. Purificación del producto de PCR (por QIAquick PCR purification Kit)

Ver VI.2. (pasos 7-11)

F. Secuenciación en dos direcciones con los mismos primers usados

G. Análisis de secuencias

H. Depósito de secuencias en NCBI

I. Deposito de Arboles Filogenéticos en: TreeBASE

5

Concentración

Volumen

µl

Ultrapura estéril

H2O

13.22

Buffer 1X 2.5

MgCl2 1.5 mM 2.08

dNTP´s

(mezcla de A, G,

C, T)

0.2 mM,

2.0

Taq DNA

polimerase

1U

0.2

ADN1

80 ng 1.0

ITS4 20 pmol 2.0

ITS5 20 pmol 2.0

VOLUMEN

FINAL:

(25, 50, o 100 µl)

25.0

Ejemplo aplicado. VER ARTICULO EN BB: González-Pérez, E., Yáñez-Morales,

Ma. de J., Ortega-Escobar, H. M. & Velásquez-Mendoza, J. 2009. Comparative analysis

among pathogenic fungal species that cause gladiolus (Gladiolus grandiflorus Hort.)

corm rot in Mexico. Revista Mexicana de Fitopatología 27 (1): 45-52.

FUENTES DE TAXONOMICA INFORMACION

1. NCBI (National Center for Biotechnology Information, GenBank).

Taxonomy: http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Nucleotide: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore&itool=toolbar

2. BARCODE OF LIFE DATA SYSTEMS. BOLDSYSTEMS.org

http://www.boldsystems.org./views/login.php

FUNGAL DATABASE

3. CBS. KNAW FUNGAL BIODIVERSITY CENTRE. http://www.cbs.knaw.nl/

4. MYCOBANK: http://www.mycobank.org → search

5. Bibliography of Systematic Mycology

6. CyberLiber

7. Biodiversity Heritage Library

8. Index Fungorum

Etc. etc.,

OTRAS BASES:

6

9. ITIS. Integrated Taxonomic Information System.

http://www.itis.gov/index.html

Welcome to ITIS, the Integrated Taxonomic Information System! Here you will find

authoritative taxonomic information on plants, animals, fungi, and microbes of North

America and the world. We are a partnership of U.S., Canadian, and Mexican agencies

(ITIS-North America); other organizations; and taxonomic specialists. ITIS is also a

partner of Species 2000 and the Global Biodiversity Information Facility (GBIF). The

ITIS and Species 2000 Catalogue of Life (CoL) partnership is proud to provide the

taxonomic backbone to the Encyclopedia of Life (EOL).

10. Google Scholar

11. BIOSIS, Biological abstracts

12. CABI

13. Agrícola

Etc., etc.

Referencias

Ahrens, U., and E. Seemüller. 1992. Detection of DNA of plant pathogenic mycoplasmalike organisms by polimerase chain reaction that amplifies a sequence of the 16s rRNA

gene. Phytopathology 82: 828-832.

White, T.J., T. Bruns, S. Lee, and J. Taylor. 1990. Amplification and Direct Sequencing of Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. MA Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White

(eds). Academic Press, San Diego, CA. USA. pp: 315-322.

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