DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

La determinación de la actividad enzimática en alimentos es un aspecto importante, entre otras razones, porque:

a) Es un indicador del estado higiénico y conservación de los alimentos, en la medida en que algunos microorganismos que contaminan y se desarrollan en los alimentos son capaces de producir determinadas sustancias que alteran su calidad. Entre estas sustancias se encuentran las enzimas que los microorganismos generan para poder aprovechar los sustratos que encuentran en el medio; por ejemplo, la reductasa, la peroxidasa, etc.

b) La actividad enzimática es un indicador de la eficiencia del tratamiento térmico en algunos alimentos. Por ejemplo, la actividad de la fosfatasa, la peroxidasa y la aldehído-reductasa se usan para el control de la pasteurización y esterilización de la leche; la prueba de la ureasa residual en soya se usa para determinar si las sustancias con actividad antibiológica han sido destruidas totalmente. La actividad de la peroxidasa es importante también para determinar si el tratamiento de blanqueado o escaldado en algunos alimentos ha sido suficiente.

1. CATALASA

La presencia de catalasa junto con la reductasa sirve para conocer el estado de conservación de la leche, ya que el crecimiento o desarrollo microbiano en la leche conlleva a la producción de estas enzimas por los microorganismos.

La catalasa reduce al peróxido de hidrógeno (H₂O₂) produciendo O₂ y H₂O:

2 H₂O₂ catalasa O₂ + 2 H₂O

Prueba de la catalasa en la leche

En un catalasímetro apropiadao, que permite medir el volumen de oxígeno que se desprende, colocar 10 ml de leche y 5 ml de agua oxigenada (3 %).

Mantener durante 2 horas a 37 ºC y medir luego el volumen de gas que se desprende.

Expresar el resultado en ml de O₂.

La leche normal cruda desprende hasta 30 ml de O₂ %, la pasteurizada hasta 6 ml y la leche cocida o esterilizada no presenta desprendimiento (Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti, 1982).

Prueba de la catalasa en vegetales deshidratados

- Tomar un tubo de aproximadamente 1 pulg. de diámetro y 6 pulg. de altura y llenar con pequeños trozos del vegetal hasta más o menos 1 pulg. de altura.

- Cubrir con agua y dejar reposar por 10 min.

- Agregar igual volumen de peróxido de hidrógeno al 3% y mezclar agitando suavemente.

- La prueba es positiva si hay producción de oxígeno (Ranganna, 1977).

2. PEROXIDASA

La investigación de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o blanqueado de verduras y también en el control de la pasteurización de la leche: a la temperatura de pasteurización de la leche la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si la leche es sobrecalentada (más de 80-85 ºC), la peroxidasa pierde su actividad en forma definitiva (Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti, 1982). La peroxidasa posee la propiedad de regeneración, o sea que al inactivarla por medio del calor, recupera parcialmente su actividad después de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado, según Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti (1982), porque la fracción proteica de la enzima sufre una desnaturalización sólo parcial de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, produciéndose luego una reversión de la proteína a su estado normal por recombinación de sus grupos hidrógenos o sulfhidrílicos.

La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-fenilendiamina) sólo en presencia de peróxido de hidrógeno (H₂O₂). El sustrato oxidable más usado es el guayacol, el cual es oxidado a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa: La velocidad de formación del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad enzimática por lectura espectrofotométricas de las absorbancias en función al tiempo.

La actividad de la peroxidasa depende del vegetal, del sustrato oxidable que se emplea como reactivo, del pH y de la temperatura a la que se trabaja. Esta enzima es muy estable y su inactivación requiere mucho más tiempo, hasta 5 min. a 85 - 95 ºC.

Prueba de la peroxidasa en vegetales deshidratados

- Tomar una pequeña cantidad de muestra y reconstituir en agua fría por 10 a 15 min.

- Eliminar el exceso de agua y colocar pequeños trozos de la muestra reconstituida en un tubo de ensayo de 1 pulg. de diámetro hasta más o menos 1 pulg. de altura.

- Agregar 10 ml de agua y 1 ml de solución de guayacol (2-metoxifenol) al 1% (en alcohol de 95º) y 1 ml de solución fresca de peróxido de hidrógeno al 0.5%.

- Agitar el tubo para mezclar y observar la reacción al cabo de 5-10 min. La reacción será:

Negativa: Si no hay decoloración, o aparecen pequeñas manchas rojas, o manchas alrededor de las venas.

Ligeramente positiva: Si aparecen manchas marrones esparcidas por todo el tejido, o enmarronamiento pronunciado de algunos trozos del producto.

Positiva: Si se produce una coloración marrón rojiza más pronunciada que el caso anterior (Ranganna, 1977).

3. FOSFATASA

La fosfatasa es una enzima que se encuentra en forma natural en la leche. Cuando la leche es pasteurizada, esta enzima es destruida, por lo tanto, la presencia de ella en una leche supuestamente pasteurizada indicaría un mal o insuficiente proceso térmico.

Determinación de fosfatasa en la lecheLa muestra de leche se mezcla con fenilfosfato disódico y buffer carbonato. Esta mezcla se coloca en una bolsa de diálisis, se calienta hasta 37 ºC y se mantiene así durante una hora. La fosfatasa presente reaccionará con el fenilfosfato para liberar fenol, el cual será dializado a través de la bolsa. Luego el fenol se hace reaccionar con CuSO4 y 2,6 dicloroquinonacloramina para producir un compuesto coloreado, el cual se lee en un espectrofotómetro a 650 nm.

El proceso de diálisis permite separar el fenol de las proteínas, las cuales interfieren en el desarrollo del color ( Meloan y Pomeraz, 1980):

4. POLIFENOLOXIDASA

Estas enzimas, presentes en los tejidos vegetales, son las principales causantes del pardeamiento enzimático, el cual ocurre cuando las frutas, verduras y tubérculos se cortan o golpean. Las polifenoloxidasas, que contienen cobre en su parte protéica, catalizan la oxidación de compuestos fenólicos a quinonas, las cuales continuan oxidándose por la presencia del oxígeno del aire sobre el tejido recién cortado, formándose pigmentos oscuros, melanoides, por polimerización.

Los sustratos responsables del pardeamiento enzimático son de tipo ortofenólico, entre ellos los siguientes: ácido clorogénico, tirosina, catecol, ácido cafeico, ácido gálico, hidroquinonas, antocianos, flavonoides. Mientras que las enzimas responsables son: tirosinasa, catecolasa, lacassa, ascórbico-oxidasa y polifenol-oxidasas (Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti, 1982).

Para que se produzca el oscurecimiento enzimático es necesario la presencia de los tres componentes: enzima, sustrato y oxígeno. Determinación de polifenoloxidasa (en peras y manzanas)

El método se basa en medir espectrofotométricamente, a intervalos de 1 minuto, el aumento en la absorbancia de una mezcla de la solución enzimática con ácido clorogénico como sustrato. Al graficar la absorbancia contra el tiempo, los resultados se expresan en aumento de absorbancia por minuto por gramo de proteína.

Procedimiento

En un matraz de 125 ml colocar 25 ml de solución tampón pH 5.2 y 10 ml de solución de ácido clorogénico. Mezclar suavemente y mantener por 10 minutos a 30 ºC.

Agregar 5 ml de solución enzimática ajustada a 0.1 mg/ml de proteína, agitar suavemente por unos segundos y volver a llevar a baño de agua a 30 ºC (sin agitación posterior).

A intervalos de 1 minuto o 30 segundos leer el aumento de la absorbancia a 390 nm.

Como blanco se usa una mezcla igual a la anterior, pero hervida por 10 minutos , reconstituyendo su volumen original con agua.

Cálculos

Para expresar la actividad enzimática se grafican la absorbancia por minuto y por gramo de proteína contra el tiempo (cada minuto) y se usa la pendiente inicial de la curva obtenida (porción recta).

Determinación de proteínas

En un tubo del fotocolorímetro Klett-Summerson se colocan 5 ml de la solución enzimática sobrenadante, se agregan 5 ml de ácido tricloroacético al 6 % y se mide la extinción a 515 nm, usando un filtro verde Nº 54. Se usa como blanco una muestra de 5 ml de agua más 5 ml de ácido tricloroacético al 6 %. Los valores obtenidos se pueden comparar con los de una solución tipo de seroalbúmina de concentración igual a 2mg /ml. El extracto enzimático original puede tener una concentración en proteínas mayor que 0.1 mg/ml; para poder ajustarla después a esta cifra se diluye con cloruro de potasio 0.3 M (Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti, 1982).

Reactivos:

Solución de enzima

Para extraer la enzima se pesan 70 g de manzana o pera mantenidas, por lo menos 2 horas antes, en congelador a 0 ºC; luego se mondan y trozan. Se homogeniza en mezcladora eléctrica con KCl 0.3 M a 4 ºC, que actúa como líquido de extracción. La mezcla se centrifuga por 30 minutos a 10,000 rpm en centrífuga refrigerada a 0 ºC. El sobrenadante se filtra al vacío y luego se enrasa a 200 ml con la solución de KCl.

Cloruro de potasio 0.3 m

Solución tampón pH 5.2 :

23.3 ml de solución de ácido cítrico 0.1 M (19.21 g en 1 litro) más 26.7 ml de solución de fosfato disódico 0.2 M (53.65 g de fosfato disódico más agua en 1 litro) más agua destilada c.s.p. 100 ml.

Solución de ácido clorogénico 0.00333 M en solución tampón.

5. PECTINO-ESTERASA (P.E.) O PECTINO-METIL-ESTERASA

Esta enzima produce la hidrólisis de los grupos metilo de la pectina, formando ácido péctico o poligalacturónico y metanol, al actuar de preferencia sobre los enlaces metílicos, vecinos de grupos carboxílicos libres. Estas enzimas, al degradar la pectina, son las causantes de la pérdida de las características de turbidez de algunos jugos y néctares, por lo que éstos deben ser calentados para inactivar dichas enzimas.

Determinación de la actividad de la pectino-esterasa (P.E.)

La pectino-esterasa hidroliza los grupos metoxilos de la molécula de pectina, por ésto, es posible medir la liberación de los grupos carboxilos por titulación potenciométrica con álcali.

a) Obtención del extracto homogeneizado:

Se pesan 175 g del material (cebolla, naranja, pulpa y cácara) y se le agrega 5 g de cloruro de sodio (para activar la enzima y ayudar a su extracción) y se homogeniza en una juguera eléctrica.

b) Reactivos:

Sloución de pectina al 1 % (como sustrato) disuelta en cloruro de sodio 0.2 M.

Solución de hidróxido de sodio 0.01 N.

c) Procedimiento:

Se miden 2 ml de jugo de limón o 5 ml de zumo de papa (rallada y filtrada). Si se trata de cebolla se toma 1 parte del homogeneizado y 1 parte de agua; en el caso de la naranja se toma 1 parte del extracto crudo y 2 partes de agua. Se agita por 4 min. , dejando en reposo por un momento y luego se toman alícuotas para efectuar la reacción como sigue:

Se toman 50 ml de la solución de pectina al 1 % y se le agrega 10 ml de la solución del extracto, se coloca en baño de agua a 30 ºC. Se ajusta el pH a 7.5 con Na OH 0.01 N. Cada 5 min., durante 30 min., se ajusta el pH

anotando en cada intervalo la cantidad acumulativa de álcali gastado. Las curvas se obtienen graficando los ml gastados de álcali versus tiempo.

Se trabaja por duplicado y se calcula el promedio. El blanco, preparado con la solución enzimática calentada a baño de agua hirviente por 5 min., no debe presentar gasto de hidróxido de sodio, de lo contrario, su valor debe ser restado del consumo total. d) Cálculos: G x 3.1

Unidades de pectino-esterasa/ml de solución enzimática = ---------- E

Donde, G = Gasto total de ml de NaOH 0.1n E = Mililitros aplicados de la solución de enzima

3.1 = Factor de Kertesz

Las unidades de pectino-esterasa por ml de solución enzimática también representa los mg de grupos metoxilo separados por 1 ml de solución de enzima en 30 minutos.

6. UREASA

La ureasa es una enzima que se encuentra en algunos productos vegetales, como por ejemplo en la soya, la cual, según Cheftel et al. (1989), contiene una ureasa termolábil, cuyo grado de inactivación es un indicador de la destrucción de inhibidores de proteasas durante el tratamiento térmico de las tortas de soya destinadas a la alimentación animal.

La ureasa cataliza la siguiente reacción (Pomeraz y Meloan, 1982):

NH₂ O = C + H₂O CO₂ + 2 NH₃

NH₂

Ambos productos de esta reacción pueden ser medidos y, por lo tanto, usados para la determinación del contenido de úrea de una muestra. El CO₂ puede ser medido gasométricamente o colorimétricamente; el amoníaco puede ser determinado directamente después de la destilación sobre un recipiente adecuado, o por titulación después de una difusión. El amoníaco también puede ser determinado colorimétricamente con el reactivo de Nesslers después de su separación por destilación o por cromatografía de intercambio iónico.

La reacción que cataliza esta enzima sobre la úrea, la liberación de amoníaco, es el principio sobre el cual se basa la siguiente prueba (Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti, 1982) para determinar la presencia de ureasa:

a) Reactivos

Substrato: Solución de úrea 0.17 M en agua bidestilada, a 30 ºC (pH 6.1).

HCl 0.1 N

b) Preparación del extracto problema

El material a ensayar (poroto de soya) se muele, y se extrae la enzima con agua destilada a temperatura de 30 ºC. Se filtra o centrifuga, usándose el sobrenadante para la determinación de la actividad enzimática.

c) Procedimiento:

Colocar 50 ml del substrato (solución de urea) en un matraz Erlenmeyer y agregar una alícuota del extracto enzimático en estudio.

Dejar la mezcla a 30 ºC durante 10 minutos.

Valorar el amoníaco liberado con HCl 0.1 N, ajustando el pH a 6.1 con ayuda de un potenciómetro.

d) Unidad enzimática (U)

1 U corresponde a la cantidad de enzima que bajo las condiciones de ensayo disocia 1 micromol de úrea por minuto.

7. ACTIVIDAD DIASTASICA

La Actividad Diastásica es la capacidad que tienen las enzimas diastásicas para convertir el almidón en azúcar. Las principales enzimas diastásicas en una harina son las y amilasas.

A la Actividad Diastásica también se le conoce como Indice de Diastasa o Poder Diastásico.

En el caso de la miel, la Actividad Diastásica se define como la cantidad, en centímetros cúbicos, de una solución de almidón al 1 % hidrolizada en una hora por la enzima contenida en 1 g de miel.

8. REDUCTASA

La reductasa es una enzima que puede estar presente en la leche y que puede tener su origen como producto de la acción microbiana, y bajo la forma natural como aldehído- reductasa (componente de la leche). Por lo tanto, la determinación de la reductasa sirve para inferir sobre el estado higiénico de la

leche, así como para controlar el tratamiento térmico (pasteurización) al que ha sido sometida la leche.

Prueba de la reductasa

En un tubo de ensayo, grande y estéril, verter ascépticamente 20 ml de leche (dentro de las 4 horas siguientes a la extracción de la muestra) y 1 ml de solución de azul de metileno (mezcla de 5 ml de solución alcohólica saturada de azul de metileno + 195 ml de agua).

Tapar el tubo y calentar a 37 ºC por 5 minutos.

Invertir el tubo varias veces para asegurar la distribución uniforme de la crema e incubar a 37 - 38 ºC en posición vertical, invirtiendo cada media hora y protegido de la luz solar o eléctrica.

Medir el tiempo desde que se inicia la incubación hasta que por lo menos los 4/5 de la leche se han decolorado.

La leche cruda y la pasteurizada deben resistir más de 5 1/2 horas sin decolorarse, y la destinada a la pasteurización, por lo menos 3 horas.

BIBLIOGRAFIA

Meloan, C. Y Pomeraz, Y. 1980. Food Analysis Laboratory Experiments. Segunda edición. The AVI Publishing Company, Inc. : Connecticut (USA).

Pomeraz, Y. Y Meloan, C. 1982. Food Analysis: Theory and Practice. The AVI Publishing Company, Inc. : Connecticut (USA).

Ranganna, S. 1977. Manual of Analyisis of Fruit and Vaegetable Products. Tata McGraw Hill Publishing Company limited. New Delhi (India).

Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti. 1982. Las Enzimas en los Alimentos. Editado por Fundación Chile: Santiago.