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Actividad anti-gérmenes in vitro de extractos etanólicos de propóleos
obtenido de abejas (Apis mellifera) en tres áreas geográficas de Colombia
Cesar Augusto Talero Urrego
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Bogotá DC, Colombia
2014
Actividad anti-gérmenes in vitro de extractos etanólicos de propóleos
obtenido de abejas (Apis mellifera) en tres áreas geográficas de Colombia
Cesar Augusto Talero Urrego
Tesis de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de
Magíster en Producción Animal
Directora
M. Sc. Judith Figueroa Ramírez
Línea de Investigación:
Microbiología y Epidemiología
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Bogotá DC, Colombia
2014
Dedico este documento de investigación a mi
directora de tesis la Dra. Judith Figueroa.
Agradecimientos
Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia en el marco del Proyecto
Cualificación de productos de las abejas: miel, polen y propóleos mediante indicadores
microbiológicos, convenio N° 057/07, contrato N° 2007C3476 111-5832007” y a la
Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, por cofinanciar esta investigación. A las
asociaciones de apicultores (Asoapiboy, Asoapicom, Asoapis) por el aporte de su trabajo
con las abejas. Al Grupo de Investigación AYNI Ciencia y Tecnología Apícola al
Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. A
Victor Solarte por su invaluable apoyo y a todas aquellas personas que de alguna
manera me brindaron su respaldo, colaboración y orientación.
Resumen y Abstract IX
Resumen
Con el objetivo de cualificar la actividad biológica in vitro de propóleos de abejas Apis
mellifera, se buscó correlacionar el origen geográfico y la actividad antimicrobiana, como
un aporte para la denominación de origen del producto apícola. Se estableció el
comportamiento del propóleo en cuanto a su capacidad antibacteriana frente a
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Escherichiae coli, Klebsiella
pneumoniae y Salmonella entérica considerando la Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI). Se determinó si los propóleos de las diferentes regiones presentan principios
activos antifungicos en el crecimiento de Trichophyton rubrum. Se valoró si los propóleos
colombianos presentan actividad antiprotozoaria asumiendo como modelo Giardia
lamblia. Se estandarizó una técnica para establecer el potencial antiviral del propóleo in
vitro utilizando el modelo del bacteriófago Lambda. Para las diferentes pruebas de
laboratorio se colectaron varias muestras de propóleo de distintos orígenes geográficos.
Los propóleos llevados a extractos etanólicos con el empleo del disolvente etanol al 70%
y 96% presentaron actividad frente a todas las cepas bacteriana en concentraciones de
3,2 a 0,1 mg/ml, con especial actividad frente a Klebsiella y B. subtilis. Los propóleos
colombianos presentan actividad fungistática y fungicida de acuerdo a las
concentraciones evaluadas y para los orígenes geográficos en estudio. La técnica in vitro
con el fago Lambda presentada en esta investigación es útil para determinar la actividad
antiviral de los extractos etanólicos de propóleos gracias a ser una prueba sencilla,
rápida, económica y sensible.
Palabras clave: Apis mellifera, Extracto Etanólico de Propóleo (EEP), actividad
biológica
X Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones de
Colombia como aporte para la denominación de origen
Abstract
In order to qualify biological activity in vitro of Apis mellifera’s propolis, were correlated
the geographical origin and antimicrobial activity, as a contribution to the denomination of
origin of beekeeping. Propolis performance was established in the antibacterial ability
against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Escherichiae coli,
Klebsiella pneumoniae and Salmonella enteric, considering the Minimum Inhibitory
Concentration (MIC). It was determined whether propolis in different regions had
antifungal actives in the growth of T. rubrum. We evaluated whether the Colombian
propolis have antiprotozoal activity taking Giardia lamblia as a model. It was standardized
a technique for establishing the antiviral potential of propolis in vitro using the
bacteriophage Lambda as a model. Were collected several samples of propolis from
different geographic origins for the laboratory tests. Propolis ethanol extracts with use of
70% and 96% ethanol solvent showed activity against all the bacterial strains in
concentrations of 3.2 to 0.1 mg/ml, with particular activity against Klebsiella and B.
subtilis. Colombian propolises have fungistatic and fungicidal activity according to the
concentrations and studied geographic origins tested. The technique in vitro with
bacteriophage Lambda presented in this research is useful to determine the antiviral
activity of the ethanolic extracts of propolis due to be a simple, rapid, economical and
sensitive test.
Keywords: Apis mellifera, Ethanolic Extract of Propolis (EEP), biological activity
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen IX
Lista de figuras ............................................................................................................. XIII
Lista de tablas ............................................................................................................. XIV
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Actividad biológica de propóleos (Revisión) ......................................................... 7 1.1 El Propóleo ...................................................................................................... 7 1.2 Propiedades Biológicas ................................................................................... 8
1.2.1 Actividad Antibacteriana ........................................................................ 8 1.2.2 Actividad Antifúngica ............................................................................. 9 1.2.3 Actividad Antiviral ................................................................................ 10
1.3 Antecedentes a nivel local ............................................................................. 10
2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de propóleo de Apis mellifera en Colombia ..................................................................... 15
Resumen .................................................................................................................. 15 2.1 Introducción ................................................................................................... 17 2.2 Materiales y Métodos ..................................................................................... 19
2.2.1 Recolección de muestras .................................................................... 20 2.2.2 Control de calidad microbiológico ........................................................ 20 2.2.3 Obtención de extractos etanólicos de propóleos ................................. 20 2.2.4 Análisis de datos ................................................................................. 21
2.3 Resultados ..................................................................................................... 21 2.4 Discusión ....................................................................................................... 24 2.5 Conclusiones ................................................................................................. 25 Referencias .............................................................................................................. 26
3. Actividad antibacterial de propóleos ligado al origen geográfico en Colombia 31 3.1 Introducción ................................................................................................... 31 3.2 Materiales y métodos ..................................................................................... 32
3.2.1 Recolección de muestras .................................................................... 33 3.2.2 Concentración mínima inhibitoria ........................................................ 33
3.3 Resultados ..................................................................................................... 34 3.4 Discusión ....................................................................................................... 35 3.5 Conclusiones ................................................................................................. 39 3.6 Bibliografía ..................................................................................................... 39
XII Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo en Colombia 43
4.1 INTRODUCCIÓN ...........................................................................................43 4.2 MATERIALES Y MÉTODOS ..........................................................................45
4.2.1 Recolección de muestras .....................................................................45 4.2.2 Activación de la cepa de referencia .....................................................45 4.2.3 Concentración mínima inhibitoria .........................................................46
4.3 Resultados .....................................................................................................46 4.3.1 Crecimiento .........................................................................................46 4.3.2 Inhibición .............................................................................................49 4.3.3 Concentración Mínima Fungicida .........................................................51
4.4 Discusión ........................................................................................................53 4.5 Conclusiones ..................................................................................................53 4.6 Bibliografía .....................................................................................................53
5. Uso del bacteriófago lambda como indicador de actividad antiviral in vitro de propóleos de Colombia .................................................................................................55
5.1 Introducción ....................................................................................................55 5.2 Materiales y Métodos .....................................................................................56
5.2.1 Bacteriofago y celula huésped .............................................................56 5.2.2 Medios de Cultivo ................................................................................57 5.2.3 Muestras de Propóleos ........................................................................57 5.2.4 Procedimiento ......................................................................................57 5.2.5 Plaqueo ...............................................................................................58
5.3 Resultados .....................................................................................................59 5.4 Discusión ........................................................................................................59 5.5 Conclusiones ..................................................................................................61 5.6 Bibliografía .....................................................................................................62
6. Discusión, conclusiones y recomendaciones ......................................................65 6.1 Discusión ........................................................................................................65 6.2 Conclusiones ..................................................................................................65 6.3 Recomendaciones ..........................................................................................66
A. Anexo: Calidad microbiológica de propóleo crudo y sólidos solubles de extractos de propóleos de Apis mellifera en Colombia ..............................................67
B. Anexo: Sólidos solubles totales de EEP ...............................................................69
Contenido XIII
Lista de figuras
Pág. Figura 3-1: Efecto antibacterial (Bacterias Gram positivas) de concentraciones mg/ml de EEP (Et. 70%) de tres origenes geograficos en Colombia . ............................................ 42
Figura 3-2: Efecto antibacterial (Bacterias Gram positivas) de concentraciones mg/ml de EEP (Et. 96%) de tres origenes geograficos en Colombia………………………………….42
Figura 3-3: Efecto antibacterial (Bacterias Gram negativas) de concentraciones mg/ml de EEP (Et. 70%) de tres origenes geograficos en Colombia………………………………….43
Figura 3-4: Efecto antibacterial (Bacterias Gram negativas) de concentraciones mg/ml de EEP (Et. 96%) de tres origenes geograficos en Colombia………………………………….44
Figura 4-1. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum en el Control…………………53
Figura 4-2. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Santander en Alcohol 70%...........................................................................................53
Figura 4-3. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Santander en Alcohol 96%...........................................................................................54
Figura 4-4. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Cundinamarca en Alcohol 70%....................................................................................54
Figura 4-5. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Cundinamarca en Alcohol 96%....................................................................................55
Figura 4-6. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Boyacá en Alcohol 96%................................................................................................55
Figura 4-7. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Trichophyton rubrum en los departamentos de Boyacá, Santander y Cundinamarca, en alcohol al 70% y en seis niveles de concentración de EEP………………………………………………………..……56
Figura 4-8. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Trichophyton rubrum en los departamentos de Boyacá, Santander y Cundinamarca, en alcohol al 96% y en seis niveles de concentración de EEP……………………………………………………………..56
Figura 4-9. Frecuencias relativas (%) para estimar las Concentración Mínima Fungicida en las seis diluciones de EEP, en etanol al 70% y 96%, en cuatro zonas diferentes……59
Figura 5-1: Porcentaje de muestras que presentaron conteos visibles de UFP y el efecto de los EEP sobre el fago con respecto al control…………………………………………….68
Contenido XIV
Lista de tablas
Pág. Tabla 1: Microorganismos utilizados en esta investigación. .............................................. 7
Tabla 2-1: Control de calidad microbiológico de muestras de propóleo de abejas Apis mellifera de Colombia colectadas en tres regiones de Colombia durante el periodo 2008-2010……………………………………………………………………………………………….28
Tabla 2-2: Control de calidad microbiológico de muestras de propóleo de abejas Apis mellifera de Colombia según el requisito de las normas internacionales .........................28
Tabla 2-3: Concentración de extracto seco a partir de dos concentraciones de etanol.................................................................................................................................29
Tabla 2-4: Porcentaje de muestras aceptables en rendimiento de extracto seco de propóleos de abejas Apis mellifera en Colombia comparadas con el porcentaje de extracto seco reportado en las normas para propóleo de Brasil, Argentina y Japón………………………….29
Tabla 3-1: Actividad antibacterial de EEP (MIC, mg/ml) diferenciada entre orígenes geográficos en Colombia………………………………………………………………………….…40
Tabla 3-2: Efecto de la concentración del etanol de los EEP sobre la actividad antibacterial según origen geográfico en Colombia……………………………………………………………...41
Tabla 3-3: Efecto de la concentración del etanol de los EEP sobre la actividad antibacterial de muestras extranjeras (Bélgica, Chile, Cuba, Nueva Zelanda) y el origen geográfico en Colombia……………………………………………………………………………………………….41
Tabla 4-1. Frecuencias relativas de la inhibición de las seis diluciones de EEP, en cuatro zonas, en etanol 70%........................................................................................................57
Tabla 4-2. Frecuencias relativas de la inhibición de las seis diluciones de EEP, en cuatro zonas, en etanol 96%........................................................................................................58
Tabla 4-3. Frecuencias relativas (%) para estimar las Concentración Mínima Fungicida en las seis diluciones de EEP, en etanol al 70% y 96%, en cuatro zonas diferentes……58
Tabla 5-1: Prueba antiviral contra el Fago Lamda de E. coli con exposición a tres concentraciones de EEP de tres orígenes geográficos diferentes…………………………67
Introducción
El propóleo es un producto natural de las abejas Apis mellifera, derivado del metabolismo
de las plantas, desde tiempos inmemorables ha sido utilizado por el hombre para su
salud, actualmente existe una tendencia mundial hacia la demanda de este producto,
registrándose aumentos en la producción mundial.
Colectado como material de refuerzo y estabilización de la colmena, dentro de la
actividad natural de Apis mellifera, juega diferentes funciones en la colmena, como el
fortalecimiento de la estructura, sellamiento de rendijas o aberturas y la prevención de
microorganismos por descomposición de los animales muertos en la colmena (FAO,
2005).
El propóleo viene ganando interés en la comunidad científica internacional, no solo desde
el punto de vista estructural o fisicoquímica, sino principalmente por sus propiedades
biológicas, que resultan importantes en la salud humana (Farré R. et al., 2004). La
literatura muestra una inequívoca actividad de esta resina natural contra una variedad de
patógenos en humanos y animales. Los grupos de investigación alrededor del mundo,
han reportado estudios acerca del origen botánico, la composición química, la actividad
biológica y usos terapéuticos del propóleo.
En los análisis de la composición química han identificado al menos 300 compuestos en
el propóleo (Mani F., 2006) demostrándose la variabilidad y complejidad del producto,
que han dado validez y versatilidad del uso terapéutico. Principalmente incluyen grupos
químicos como los ácidos aromáticos, ácidos ester aromáticos, flavonoides, terpenoides,
ácidos alifáticos entre otros (Marcucci M.C., 1995). Estas sustancias identificadas en los
propóleos también son constituyentes habituales en algunos alimentos, aditivos de
alimentos y/o reconocidos generalmente como sustancias seguras (Burdock G.A., 1998).
2 Introducción
La actividad en contra de los microorganismos está más relacionada al efecto sinérgico
de los flavonoides (y otros fenoles), que a la acción de cada uno de ellos por separado
(Takaisi Kikuni y Schilcher, 1994). Los mecanismos de acción antibacteriana utilizan
varios mecanismos, tales como la formación de complejos estreptocócicos
pseudomulticelulares, desorganización del citoplasma, de la membrana plasmática y de
la pared celular, bacteriólisis parcial, e inhibición de la síntesis de proteínas. Además se
observó una inhibición de la división celular en presencia de propóleo y este hecho
sugirió que el propóleo podría actuar inhibiendo la replicación del DNA a través de la
RNA polimerasa e indirectamente, afectando la división celular (Havsteen Bent H., 2002).
Por otro lado, la cotización del propóleo diferenciado por su acción terapéutica ha
generado ingresos mayores para los apicultores, explotando con mayor inquietud el
producto; es el caso del propóleo verde del Brasil, que alcanzo en el mercado
internacional un precio entre US$ 100-140/kg en el año 2000 y los márgenes producidos
para el año 2006 en exportaciones habían sido de US$ 43.329 durante los primeros
cuatro meses. En contraste, los propóleos de producción indiferenciada como el de
origen Chino que llegaba a los US$ 35/kg, el de Uruguay a US$ 37-40/kg en el año 2006
o el argentino a US$ 19/kg con 7 toneladas exportadas hasta Junio del 2007 (SENASA,
2007); siendo los principales competidores a nivel mundial.
Orantes Bermejo et al. (2007) señalan que “con un censo de colmenas que supera ya las
500.000 colmenas y un precio muy variable de este producto (entre 35 - 300 euros/kg
dependiendo de su calidad), basta hacer unos simples cálculos para comprobar que se
está perdiendo varios millones de euros de las rentas agrarias de las explotaciones
apícolas andaluzas”.
En Colombia el precio del producto en el mercado nacional es variable (entre $ 40.000 y
$80.000), dependiendo de la calidad y procedencia, con argumentos en algunos casos
subjetivos.
El propóleo de Brasil, es exportado al Japón como materia prima para la elaboración de
productos farmacéuticos, denominado el “propóleo verde” brasileño, es colectado por las
abejas de una especie de arbusto llamado “alecrim-do-campo” (Baccharis dracunculifolia)
que tiene distribución en los estados de Sao Paulo y Minas Gerais y gracias a la
Introducción 3
exhaustiva investigación de su composición y sus características terapéuticas, ha
alcanzado grandes saltos en el valor comercial del producto (Weinstein T. et al., 2005).
Los expertos han determinado que la topografía colombiana con tres cordilleras, dos
océanos, selvas húmedas, llanuras tropicales, páramos e incluso montañas con nieves
perpetuas y su ubicación geográfica posibilitan la existencia de un gran número de
especies y vegetales distribuidas en varios ecosistemas. Uno de los datos más comunes
para determinar la biodiversidad colombiana es aquél que indica que el país ocupa el 0,7
por ciento de la superficie del planeta y posee entre el 10% y el 14% de todas las
especies de plantas y animales de la Tierra. Según datos del Ministerio de Ambiente,
Vivienda y Desarrollo Territorial, Colombia es el segundo país del mundo con mayor
diversidad de plantas: posee 55 mil especies. Una tercera parte de esas especies son
endémicas; es decir que únicamente se encuentran en Colombia. Esas instituciones
señalan que Colombia se encuentra entre los 12 países megadiversos, que poseen el
70% de la biodiversidad total del planeta (Instituto Alexander von Humboldt, 2007).
Esta diversidad botánica y las experiencias terapéuticas de conocimiento popular frente a
patologías en humanos y animales en el país, hacen entrever un potencial alto del
producto como agente antibiótico; de tal manera que esta actividad biológica debe ser
investigada y certificada, influyendo en el valor agregado del producto.
Los diferentes modelos biológicos (bacterias, hongos, protozoarios y virus) empleados en
este estudio van a permitir proponer la hipótesis sobre la correlación de las zonas
fitogeográficas de producción, algunos parámetros de composición química del propóleo
de Apis mellifera y su acción biológica en Colombia, lo que contribuye un aporte
fundamental para alcanzar denominación de origen.
Bibliografía
Burdock G. A. Review of the Biological Properties and Toxicity of Bee Propolis (Propolis)
Food and Chemical Toxicology 36. 347-363. 1998.
FAOSTAT. Banco de datos de FAO. Web Site: http:// faostat.fao.org. 2005
Farré R. et al. Propolis and human health. Ars Pharmaceutica, 45:1; 21-43, 2004.
4 Introducción
Havsteen BH. The biochemistry and medical significance of the flavonoid. Pharmacol
Therapeut;96(2–3):67–202. 2002
Instituto Alexander von Humboldt (www.humboldt.org.co). 2007.
Mani F. et al. Journal of Ethnopharmacology 105 : 95-98, 2006.
Marcucci M. C. Propolis: chemical composition, biological properties and therapeutic
activity. Apidologie. 26, 83-89. 1995.
Orantes Bermejo Fco. J, Torres C., Serra C., J., Kumazawa S. Capacidad antioxidante y
contenido en polifenoles del propóleos en Andalucía. Marzo-Abril, Nº 142 Vida Apícola
/41. 2007.
SENASA. Apicultura sin fronteras - Año II N 16 - Hoja 2 – Agosto 2007.
Takaisi-Kikuni, N.B. and Schilcher, H. Abstract. Electron microscopic and
microcalorimetric investigations of the possible mechanism of the antibacterial action of a
defined propolis provenance. Planta Med. 60, 222–227. 1994
Weinstein T. et al. Plant Origin of Green Propolis: Bee Behavior, Plant Anatomy and Chemistry. eCAM; 2(1)85–92. 2005.
Introducción 5
Objetivos
Objetivo general
Cualificar la actividad biológica in vitro de propóleos de abejas Apis mellifera de las zonas
productivas de los departamentos de Santander, Boyacá y Cundinamarca.
Objetivos específicos
Establecer el comportamiento del propóleo en cuanto a su capacidad antibacteriana
frente a bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus
subtilis subespecie spizizenii ATCC 6633, Micrococcus luteus kocuria spizizenii ATCC
9341 y Gram negativas: Escherichiae coli ATCC 31617, Klebsiella pneumoniae
subespecie pneumoniae ATCC 700603 y Salmonella entérica subespecie entérica
serovar typhimurium ATCC 14028 considerando la concentración mínima inhibitoria
(CMI).
Determinar si los propóleos de las diferentes regiones son activos en su capacidad
antifúngica en el crecimiento de Trichophyton rubrum ATCC 28188, como modelo
aplicado a hongos dermatofitos.
Estandarizar una técnica que permita establecer el potencial antiviral del propóleo in
vitro.
Comparar si la extracción de propóleo en etanol al 70% y 96% tiene la misma
actividad antibacteriana y antifúngica in vitro.
Correlacionar los hallazgos de la actividad en microorganismos con los extractos
etanólicos de propóleo en las zonas productoras en estudio.
1. Actividad biológica de propóleos (Revisión)
1.1 El Propóleo
El propóleo o própolis, se ha definido por varios autores según su apariencia, fuente y
utilización por las abejas. De esta manera Bankova V. (2005) lo define como una
sustancia resinosa de color pardo rojizo o amarillo verdoso producido por las abejas a
partir de resinas vegetales y que tiende a oscurecerse. Por su parte Farré et al. (2004) lo
describe como una resina cérea, de composición compleja y consistencia viscosa, que
las abejas elaboran y utilizan en la construcción, reparación, aislamiento y protección de
la colmena. Chaillou et al. (2004), como un producto apícola de composición compleja,
que las abejas Apis mellifera obtienen por adición de cera y secreciones salivares al
material resinoso, gomoso ó balsámico que recolectan de diversas plantas.
La abeja cuando encuentra el propóleo en una yema de un árbol, lo desprende
valiéndose de sus mandíbulas y ayuda de su primer par de patas, agregando
secreciones de las glándulas mandibulares. Luego, lo transfiere a la corbícula en el tercer
par de patas. Así al ingresar a la colmena, se dirigen inmediatamente al lugar donde éste
es requerido y permanecen quietas, permitiendo a las abejas “propolizadoras” llamadas
así por la actividad que realizan, tomar algunas partículas de la sustancia, comprimirlas y
agregarles cera para proceder a su ubicación (Asis M, 1991). Una vez propolizada la
colmena el apicultor lo recolecta y emplea como producto de interés comercial, por sus
propiedades terapéuticas.
Marcucci (1995), señala que los compuestos en el propóleo sin procesamiento se
originan de tres fuentes: 1) exudado de plantas colectados por las abejas, 2) productos
metabólicos secretados por el insecto (principalmente β-glucosidasa, ácido 10-hidroxi-2-
decenoico y ácido 9-oxo-2-decenoico) (Bruschi y Lara, 2006) y 3) materiales introducidos
durante la elaboración del producto como el polen.
8 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
Además de los granos de polen, pueden ser encontrados otros fragmentos vegetales que
son indicativos de las especies visitadas por las abejas para la colecta de resinas, tales
como fragmentos de hojas, pelos glandulares y no glandulares, cristales de oxalato de
calcio y discos secretores (Bastos E. M., 2001).
En las zonas templadas la mayor parte del propóleo procede del exudado de brotes de
chopos o álamos pertenecientes al género Populus spp; en la zona septentrional de
Rusia, de los brotes de abedul (Betula verrucosa) y de P. tremula (Wollenweber E. y
Buchmann SL, 1997); en las regiones mediterráneas, de las choperas y de las hojas de
Cistus spp. (Martos et al., 1997); en Brasil de las hojas de especies de Baccharis
dracunculifolia (Bankova V., 2000); en Venezuela y Cuba de la resina floral del género
Clusia y en zonas más tropicales se obtiene de otros vegetales (Cuesta Rubio et al.,
2002).
La composición química de los propóleos está estrechamente asociada con el origen
botánico. Los propóleos turcos, egipcios, brasileños, de Chile y de Cuba de procedencias
botánicas distintas muestran composiciones variadas, y en algunos casos compuestos
característicos que podrían ser de utilidad para la identificación de su origen (Bastos E.
M., 2001).
1.2 Propiedades Biológicas
1.2.1 Actividad Antibacteriana
Fue una de las primeras propiedades constatadas. Los principales responsables de esta
propiedad son los flavonoides galangina y pinocembrina y derivados de los ácidos
benzoico, ferúlico y cafeico. Farré R. et al., (2004) informa del estudio publicado en
Microbiology Research, donde el ácido cinámico y algunos flavonoides desactivan la
energía de la membrana citoplasmática, inhibiendo la motilidad bacteriana, haciéndolas
más vulnerables al ataque del sistema inmunológico y potenciando los antibióticos.
Mahmoud Lotfy, (2006) menciona la capacidad antimicrobiana de diferentes propóleos
ante el Helicobacter pylori demostrando la capacidad ante esta bacteria, siendo los
1. Revisión general. Actividad biológica de propóleos 9
principales responsables los flavonoides: pinocembrina en primer lugar y luego la
galangina y la crisina.
Los extractos etanólicos de propóleo tienen actividad antimicrobiana contra bacterias
Gram-positivas pero una actividad más baja contra bacterias Gram-negativas y buena
actividad contra las levaduras (Burdock, G.A., 1998). Se ha sugerido que la actividad
antimicrobiana del propóleo depende de sinergismo entre algunos flavonoides, ácidos
fenólicos y otros compuestos en los propóleos (Marcucci, M.C. et al., 2001). El modo de
la actividad antimicrobiana de los compuestos de los propóleos no está claro, pero las
explicaciones posibles son: inhibición de la motilidad bacteriana, afecto del potencial de
la membrana, inhibición de la RNA-polimerasa, desorganización del citoplasma, pared
citoplásmica de la membrana y de la célula, e inhibición de la síntesis de la proteína.
(Mirzoeva, O.K., 1997; Takaisi-Kikuni, N.B. y Schilcher, H., 1994; citados por Pepeljnjak
S., Kosalec I., 2004)
1.2.2 Actividad Antifúngica
Los propóleos centroeuropeos (Alemania, Francia y Austria), con composiciones
cualitativas similares y predominio del ácido trans-p-cumárico, muestran actividad frente
a Candida albicans, mientras que los mediterráneos (Bulgaria, Turquía, Grecia y Argelia),
que contienen flavonoides, ésteres del ácido cafeico y ácidos ferúlicos, presenta menor
actividad antifúngica. Por su parte, el propóleo egipcio de Dakahlia, con dos ésteres de
cafeato y dos triterpenoides, es más activo frente a Candida albicans que el de Ismailia
que no contiene ácidos aromáticos, ni ésteres, ni flavonoides y, estudios sobre la
incidencia de la paracoccidiomicosis en América latina, sugieren que,
independientemente de su origen geográfico, los macrófagos estimulados con propóleo
aumentan su actividad fungicida (Burdock, G.A., 1998).
La actividad in vitro de agentes antifúngicos y antisépticos fueron evaluados frente a
dermatofitos entre los que se encuentra el Trichophyton rubrum, la CMI fue determinada
por el método de dilución en agar, señalando que el propóleo tuvo un comportamiento
similar a los otros medicamentos comerciales (Soares y Cury, 2001).
10 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
1.2.3 Actividad Antiviral
En Francia Amoros et al. (1994), confirmaron la acción antiviral frente al herpes tipo 1 y 2,
pero también ante poliovirus. Establecieron que reduce la síntesis del ADN viral y que los
responsables son flavonoides, que actúan en sinergismo con un éster del ácido cafeico y
el ácido ferúlico. Gekker et al. (2005) probaron la acción antiviral del propóleo frente al
virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) observando la actividad in vitro del
producto natural en linfocitos (CD4+) con una máxima supresión de 66,6 μg/mL de
propóleo. Otra investigación midió la actividad antiviral de una fracción del propóleo
(Et2O) in vitro, inhibiendo significativamente la actividad del virus de la influenza A/Hong
Kong (H3N2) (Serkedjieva et al., 1997).
1.3 Antecedentes a nivel local
Barragán L. y Ortiz J. (1988), recolectaron muestras de propóleo provenientes de
Fusagasugá, Tunja y Neiva con el fin de verificar la actividad biológica del propóleo de
Colombia. Los microorganismos utilizados en la determinación de la concentración
mínima inhibitoria (CMI) provenientes del Laboratorio de Microbiología de la Universidad
Nacional de Colombia, fueron Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis,
Streptococcus piogens, Corynebacterium sp. (2 cepas). Los solventes seleccionados
para establecer un sistema de solubilidad del propóleo óptimo son etanol (96%),
propilenglicol y etanol: propilenglicol en proporciones 1 a 1, 1 a 2 y 2 a 1. En general los
resultados de la CMI están por debajo de 1,0 mg de propóleo por 10 ml de medio de
cultivo. Las muestras de Fusagasugá presentaron los menores valores de CMI y los
extractos de etanol:propilenglicol 1:2 presentaron menores valores de CMI.
Solano y Coronado (2000), seleccionaron tres tipos de propóleo de diferentes regiones
de Colombia (Boyacá, Quindío y Cundinamarca) con el fin de ser analizados por sus
propiedades antimicrobianas y antifúngicas. Los microorganismos de ensayo
seleccionados fueron Bacillus subtillis, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus,
Micrococcus luteus, Escherichia coli, Salmonella tiphy, Pseudomona aeruginosa,
Candida albicans, Aspergilus niger, Fusarium oxysporum, Mucor sp. Por medio de los
resultados del método de Perforación y Difusión en gel, se hallaron las Concentraciones
Criticas (CC) de los extractos de propóleo, realizando la grafica de los diámetros de
1. Revisión general. Actividad biológica de propóleos 11
inhibición al cuadrado (X2) vs. Logaritmo natural de la concentración. Concluyendo que
frente al Bacillus subtilis los propóleos presentaron una actividad antibacteriana elevada
(Concentraciones Criticas: 26, 20 y 17 μg/ml) y frente a S. agalactiae, M. luteus, B.
subtilis, S. aureus una concentración Critica de 5, 13, 17, 21 μg/ml respectivamente.
Martínez T. y Figueroa J. (2003), recolectaron 30 muestras de propóleo provenientes de
cuatro zonas biogeográficas de Colombia, con el objetivo de establecer el espectro
antimicrobiano del propóleo proveniente de apiarios de la zona norte del valle del Cauca
y sur del Quindío y evaluar el rendimiento, en extracto blando del propóleo tratado con
alcohol etílico en dos concentraciones de solvente: al 70% y 96%. Observaron que la
capacidad del propóleo para inhibir los microorganismos mediante la técnica de difusión
radial en doble capa de agar está mediada por el tipo de alcohol utilizado para la
extracción, siendo el más efectivo el extracto etanolico de propóleo de 96% y que la
actividad antimicrobiana se ve influenciada por el tiempo, asociada a la respuesta de la
especie del microorganismo.
Moreno Z., Martinez P. y Figueroa J. (2007), tomaron cuatro muestras de propóleo
argentino, cinco colombianos y uno cubano, buscando establecer el efecto
antimicrobiano in vitro sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, principal
microorganismo implicado en el desarrollo de la caries dental. Empleando la prueba de
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) en concentraciones 15 a 3.75 mg/ml, la totalidad
de las muestras analizadas manifestaron actividad contra S. mutans. Las muestras
colombianas presentaron mayor efecto bactericida (CMB) luego de 48 horas de
exposición al propóleo y el mejor efecto inhibitorio lo presento una muestra colombiana a
un periodo de exposición de 24 horas. A mayor exposición de las bacterias al propóleo,
las muestras colombianas mostraron un efecto superior, las argentinas un efecto
moderado y las demás muestras, permanecieron estables.
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2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de propóleo de Apis mellifera en Colombia
Cesar Talero1, D. Hernández1, J. Figueroa1
1 Grupo de investigación AYNI Ciencia y Tecnología Apícola, Facultad de Medicina
Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.
Publicado en: Rev. Med. Vet. Zoot. 59(2), Mayo-Agosto 2012: 109-118 (Anexo A)
Resumen
Se tomaron cincuenta y nueve muestras de propóleo crudo recolectadas en tres orígenes
geográficos de Colombia, a las cuales se les realizó control de la calidad microbiológica,
y se determinó el porcentaje de extracto seco obtenido de las extracciones etanólicas de
propóleo (EEP) al 70 y 96%. Se cuantificaron los grupos indicadores mesófilos aerobios,
coliformes totales, coliformes fecales, Staphylococcus sp., mohos y levaduras, y se
encontraron conteos en promedio de 93x103; 79x102; <1; 94; 10x104 UFC/g,
respectivamente. La detección de patógenos se realizó para Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, los cuales estuvieron presentes en el 4 y 2% de las muestras,
respectivamente. Los hallazgos microbiológicos se compararon con normas de calidad
de Japón, Perú y El Salvador; se encontró que el grupo indicador mohos y levaduras fue
el más crítico, donde 92 a 94% de las muestras evaluadas estuvieron por fuera de los
límites exigidos por estas normas. Los resultados indican que las extracciones con etanol
al 70 y 96% de propóleos colombianos, en promedio obtuvieron 93,0 y 175,3 mg/ml de
extracto seco, respectivamente. La concentración de extracto seco se comparó con la
normatividad existente en Brasil, Argentina y Japón. Para la norma más exigente, que
corresponde a la brasileña, se hallaron porcentajes de cumplimiento del 53,4 y 56,1%
para EEP 70 y 96%, respectivamente, y para la norma de Japón se encontraron
16 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
aceptables 75,9 y 69,7% de los EEP 70 y 96%, respectivamente. Los resultados están
asociados al origen fitogeográfico y a la producción no especializada de propóleos. En
este estudio se incluyeron muestras de propóleo crudo de países como Bélgica, Chile,
Cuba y Nueva Zelanda.
Palabras clave: propóleos, parámetros, clasificación, normas.
Raw propolis microbiologic quality and soluble solids of Apis mellifera propolis
extracts in Colombia
Abstract
Raw propolis samples from three different geographical origins were submitted to the
microbiological quality tests and to the extraction of the dry matter using two
ethanol extracts (70 and 96%). The aerobic mesophile, total coliforms, fecal coliforms,
Staphylococcus sp., molds and yeasts indicator groups were quantified, finding in
average 93x103; 79x102; <1; 94; 10x104 CFU/g respectively. The pathogen detection
was made for Escherichia coli obtaining 51 samples free of the pathogen and 2 samples
with presence of it, and for Staphylococcus aureus, which were present in 4 and 2% of
the samples respectively. The microbiologic results were compared with the quality
standards of Japan, Peru, and El Salvador, finding that the indicator groups molds and
yeasts was the most critical, where 92 to 94% of the evaluated samples were off limits of
the international standards. These results show that the ethanol extracts made at
concentrations of 70 and 96% of Colombian propolis, obtained in average 93.0 and 175.3
mg/ml of dry extract respectively. The concentration of dry extract was compared with the
standards of Brazil, Argentina and Japan. For the most strict standard, which is the
Brazilian, there were found complying percentages of 53.4 and 56.1% for propolis ethanol
extracts (PEE) of 70 and 96% respectively and for the Japan standard they were found
acceptable 75.9 and 69.7% of the PEE 70% and 96% respectively. The results are linked
to the flora, geographical origins and to the non specialized production methods. This
study included raw propolis samples from countries such as Belgium, Chile, Cuba and
New Zealand.
Key words: propolis, parameters, classification, standards.
2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de
propóleo de Apis mellifera en Colombia
17
2.1 Introducción
El propóleo o propóleos (propolis, ligamaza, beeglue) se ha definido como una sustancia
resinosa de color generalmente pardo rojizo a amarillo verdoso, que colectan las abejas
del exudado de plantas y la adición de productos metabólicos secretados por el insecto
(Bankova 2005; Chaillou et al. 2004), con inclusión de otros materiales durante la
elaboración del producto, como el polen (Marcucci 1995). El producto colectado por las
abejas (crudo) muestra una alta variabilidad en razón de su estrecha relación con la
región geográfica de producción, que puede llegar a presentar distinta cobertura vegetal,
dependiendo de las condiciones agroecológicas.
Las abejas en colmenas comerciales generalmente utilizan el propóleo para cubrir los
agujeros y las grietas con el fin de reducir la entrada de la colmena (Krell 1996). Se cree
que la utilización de propóleos de esta manera funciona para mantener en mejores
condiciones la homeostasis del medio ambiente dentro de la colmena. Esto podría ser el
resultado de disminuir el crecimiento microbiano en las paredes de la colmena e impedir
el flujo de aire sin control en el nido y las paredes de impermeabilización y la humedad
externa, además de crear algún tipo de protección contra los invasores (Visscher 1980,
citado en Simone-Finstrom y Spivak 2010).
La composición química del propóleo está estrechamente asociada con el origen
botánico (Greenaway et al. 1987, citado en Amoros et al. 1994). En las zonas templadas,
la mayor parte del propóleo procede del exudado de los brotes de chopos o álamos
pertenecientes al género Populus spp; en la zona septentrional de Rusia, de los brotes
de abedul (Betula verrucosa) y de P. tremula (Wollenweber y Buchmann 1997); en las
regiones mediterráneas procede de las choperas y de las hojas de Cistus spp. (Martos et
al. 1997); en las zonas donde los álamos no son plantas nativas, tales como Australia y
las regiones ecuatoriales de América del Sur, las abejas buscan otras plantas que reúnan
las cualidades requeridas para colectar los exudados con el fin de elaborar propóleos
(Park et al. 2002). En Brasil el propóleo procede principalmente de las hojas de especies
de Baccharis dracunculifolia (Bankova 2000); en Venezuela y Cuba, de la resina floral del
género Clusia, y en zonas más tropicales se obtiene de otros vegetales (Cuesta-Rubio et
al. 2002).
18 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
En los análisis de la composición química de los propóleos se han identificado al menos
300 compuestos (Mani et al. 2006) y hasta 150 compuestos para una misma muestra
(Greenaway et al. 1990); en la fracción aromática, más de 100 compuestos (Bankova
1987; Greenaway et al. 1987, 1988, citado en Amoros et al. 1994). Los propóleos están
constituidos fundamentalmente por flavonoides, derivados de ésteres y ácidos fenólicos.
Los principales grupos fenólicos identificados son: flavonoides, ácidos aromáticos y sus
ésteres, aldehídos aromáticos, cumarinas, triglicéridos fenólicos (Bedascarrasbure 2000).
Los flavonoides no son los marcadores químicos principales, pero los compuestos
menores también pueden ser involucrados en la actividad biológica (Bankova et al. 1987,
citado en Amoros et al. 1994). Existen otros componentes como los triterpenos (Pérez et
al. 2009); el primer reporte sobre la presencia de este tipo de metabolito secundario fue
la identificación del triterpeno acíclico escualeno, precursor de los triterpenos tetracíclicos
y pentacíclicos (Silva et al. 1992).
Las investigaciones realizadas en las últimas décadas, orientadas a determinar las
propiedades biológicas del propóleo a nivel mundial, han permitido establecer que a los
compuestos fenólicos se les atribuye acción farmacológica, quedando establecidas sus
propiedades antibiótica, fungicida, antiviral y antitumoral, entre otras (Burdock, 1997). Sin
embargo, la presencia de triterpenos pentacíclicos en propóleos brasileños en particular y
en propóleos de países tropicales en general, constituye una característica importante de
su composición química vinculada a su actividad antiinflamatoria, anticancerígena y
antiviral (Pérez et al. 2009).
Los lineamientos de calidad para propóleo son complejos, ya que los propóleos
presentan diferentes colores, olores y composición; los lineamientos también tienen
directa relación con los métodos de extracción, además del cuidado y la higiene, tanto en
el almacenamiento como en la conservación del producto.
Los primeros esfuerzos propuestos en cuanto a estándares oficiales de calidad referidos
al producto “crudo o bruto” y a veces a sus extractos (forma tradicional de extraer
compuestos activos para ser empleados en la industria) iniciaron en los países del Este
europeo. Los límites máximos y mínimos para ciertos grupos químicos están
2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de
propóleo de Apis mellifera en Colombia
19
determinados, pero son pocas las pruebas estandarizadas que están disponibles para
establecer la actividad biológica de varios componentes (López y Ubillos 2004).
En la actualidad, las sustancias que determinan la calidad de los propóleos no se unifican
como norma, y cada país o compañía tiene sus propios estándares, incluidos los
términos específicos para los propóleos y sus productos relacionados. Los esfuerzos en
investigación se encaminan entonces hacia la “estandarización internacional de los
propóleos” como una de las propuestas para el Foro Mundial de Ciencias del Propóleos
(WPSF) (Lee y Jo 2011).
Colombia (Sur América) no posee ningún tipo de normatividad o estándar para el
propóleo crudo o sus extractos, aunque se han realizado investigaciones previas
alrededor de los propóleos en caracterización antimicrobiana y fisicoquímica (Moreno et
al. 2007; Palomino et al. 2009; Bastos et al. 2011a; Samara-Ortega et al. 2011; Viloria et
al. 2012). Hoy en día, la calidad de este producto y su valor comercial no tienen relación
directa; el precio es determinado por características como el aspecto, la presentación, el
color, olor y sabor que poseen cierta relación con la “calidad real” del producto, pero es
una valoración subjetiva. Complementar su evaluación mediante la determinación
analítica permitirá obtener valores de composición como parámetros fundamentales de la
calidad de los propóleos y, por tanto, establecer el valor comercial del mismo.
El presente estudio se desarrolló con el objetivo de evaluar la calidad microbiológica y de
porcentaje de extracto seco de propóleos de Apis mellifera en Colombia, y así establecer
parámetros de calidad para su comercialización como materia prima de uso industrial.
2.2 Materiales y Métodos
Este estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina
Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, en el
marco del Proyecto Cualificación de productos de las abejas: miel, polen y propóleos
mediante indicadores microbiológicos.
20 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
2.2.1 Recolección de muestras
Se emplearon 59 muestras de propóleo crudo, provenientes de tres orígenes
geográficos, 16 de Boyacá, 16 de Cundinamarca y 27 de Santander, en su mayoría
obtenidas mediante raspado de colmenas comerciales de Apis mellifera entre los años
2008 y 2010. Se incluyó en este estudio una muestra de propóleo crudo de cada uno de
los siguientes países: Bélgica, Chile, Cuba y Nueva Zelanda.
2.2.2 Control de calidad microbiológico
Para evaluar la calidad microbiológica, se siguieron los métodos de recuento en placa y
búsqueda de patógenos descritos en la International Commission on Microbiological
Specifications for Foods (ICMSF 2000). Se detectaron y cuantificaron los grupos
indicadores: mesófilos aerobios, coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli,
Staphylococcus sp., Staphylococcus aureus, mohos y levaduras, para 53 muestras
procedentes de Colombia.
Los resultados de la calidad microbiológica se compararon con el cumplimiento de la
normatividad internacional existente para este producto de los países de Japón, Perú y El
Salvador (Japan Council of Propolis. 2010; Proyecto de Actualización de la RM N° 615-
2003 SA/DM 2003; Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología 2003).
2.2.3 Obtención de extractos etanólicos de propóleos
A las muestras de propóleo crudo se les retiraron las impurezas mecánicas, y se
trituraron y homogeneizaron separadamente. Cada muestra fue pesada, dividida en dos
partes iguales y extraídas en recipientes de vidrio cerrados, con dos concentraciones
diferentes de disolvente etanólico (70 y 96%), conservando una relación disolvente:soluto
70:30 (Almeida 2003; Bruschi y Lara 2006). Se procedió a obtener principios activos en la
disolución, mediante agitaciones diarias por 1 minuto de los extractos de propóleo crudo
con etanol, durante 30 días, a temperatura promedio de 25°C y en la oscuridad con el fin
de evitar alteraciones en los metabolitos secundarios.
Posterior a los 30 días, la disolución se llevó a refrigeración a 4°C por 12 h para separar
las ceras que se precipitan (Bedascarrasbure et al. 2006) en la mezcla de solventes de
2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de
propóleo de Apis mellifera en Colombia
21
extracción. La mezcla se filtró al final del proceso para obtener el Extracto Etanólico de
Propóleo “madre” (EEPm).
El extracto seco (materia seca o sólidos solubles totales) se determinó para los EEPm,
adaptando la metodología de las Normas para propóleos de Brasil, Argentina y Japón
(Ministerio da Agricultura, Pecuaria e Abastecimento. Brasil 2001; Comisión Nacional de
Alimentos. Argentina 2008; Japan Council of Propolis. Japón 2010). Un (1) ml del EEPm
se pesó en un recipiente previamente aforado y se sometió a 100 ± 2°C por 60 min en
horno de secado para eliminar completamente el solvente. El conjunto se colocó en un
desecador hasta llegar a temperatura ambiente y se registró el peso; el procedimiento se
repitió con intervalos de 15 min, hasta obtener un peso constante.
2.2.4 Análisis de datos
Para el control de calidad microbiológico de las muestras de propóleo crudo se empleó
un análisis estadístico descriptivo. Los extractos secos de los EEP fueron expresados en
porcentaje (%ES) y se obtuvo la desviación estándar.
2.3 Resultados
La cuantificación de los grupos microbianos indicadores (aerobios mesófilos, coliformes
totales, coliformes fecales, Staphylococcus sp., mohos y levaduras) y la detección de los
microorganismos patógenos Escherichia coli y Staphylococcus aureus, en propóleos
colombianos se muestran en la Tabla 2-1.
El porcentaje de las muestras que cumplen con la normatividad internacional existente en
cuanto al control de calidad microbiológica (cuantificación de los grupos microbianos,
indicadores y detección de los microorganismos patógenos) de propóleos crudos de
Colombia se indica en la Tabla 2-2.
Los hallazgos en la concentración de sólidos solubles en los EEP expresados en mg/ml
de solución se presentan en la Tabla 2-3, según la zona de origen geográfico y la
solución hidroalcohólica empleada para la extracción (Anexo B).
22 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
TABLA 2-1. Control de calidad microbiológico de muestras de propóleo de abejas Apis
mellifera de Colombia colectadas en tres regiones de Colombia durante el periodo 2008-
2010
Indicador microbiológico N Promedio* Moda* Mínimo* Máximo*
Coliformes totales 53 79x102 < 1 < 1 29x10
4
Mohos y levaduras 53 10x104 < 1 < 1 16x10
5
Aerobios mesófilos 53 93x103 60 20 24x10
5
Coliformes fecales 53 < 1 < 1 < 1 10
Staphylococcus sp 53 94 < 1 < 1 30x102
Patógenos N Detección
Escherichia coli 51 Ausencia
2 Presencia
Staphylococcus aureus 52 Ausencia
1 Presencia
*Microorganismos por gramo de propóleo crudo (UFC/g)
TABLA 2-2. Control de calidad microbiológico de muestras de propóleo de abejas Apis
mellifera de Colombia según el requisito de las normas internacionales (n = 53)
Resultado por indicador
Indicador microbiológico Aceptables (%) Límites (UFC/g)
Japón Perú El Salvador Japón Perú
El Salvador
Coliformes totales 45 n.r. 23 0 n.r. < 100
Mohos y levaduras 6 8 8 ≤ 30 10-100 1-100
Aerobios mesófilos n.r. 57 57 n.r. 1.000-10.000 <10.000
Coliformes fecales n.r. n.r. 96 n.r. n.r. 0
Staphylococcus sp n.r. n.r. 85 n.r. n.r. < 1
Ausencia (%) Presencia (%)
Escherichiacoli n.r. 96 n.r. n.r. 3-10 n.r.
Staphylococcus aureus n.r. n.r. 98 n.r. n.r. 100
Resultado por norma 6 8 8
UFC/g: Unidades formadoras de colonia por gramo; n.r.: No reporta; ≤ : Menor o igual que;
< : Menor que
2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de
propóleo de Apis mellifera en Colombia
23
TABLA 2-3. Concentración de extracto seco a partir de dos concentraciones de etanol
Promedios de extracto seco por región geográfica y concentración del disolvente
Región EEP (Extracto seco mg/ml)
Et. 70% Et. 90%
Boyacá 81,9 ± 41,7 154,4 ± 49,8
Cundinamarca 85,0 ± 37,9 175,2 ± 62,7
Santander 103,3 ± 75,7 187,4 ± 90,4
Promedio 93,0 ± 60,0 175,3 ± 74,2
Chile 96,0 186,0
Nueva Zelanda 121,0 132,0
Cuba 105,0 211,0
Bélgica 146,0 249,0
Et: Concentración del etanol
Más del 50% de los EEP colombianos se consideraron aceptables para las normas de Brasil,
Argentina y Japón (Tabla 2-4).
TABLA 2-4. Porcentaje de muestras aceptables en rendimiento de extracto seco de
propóleos de abejas Apis mellifera en Colombia comparadas con el porcentaje de extracto
seco reportado en las normas para propóleo de Brasil, Argentina y Japón. (n = 118)
Aceptables (%)
Extracto seco (%)
EEP Brasil Argentina Japón Brasil1 Argentina
2 Japón
3
Et. 70% 53,4 58,6 75,9 11 10 8
Et. 96% 56,1 59,1 69,7
1. (Ministerio da Agricultura, Pecuaria e Abastecimento. Brasil 2001); 2. (Comisión Nacional
de Alimentos. Argentina 2008); 3. (Japan Council of Propolis. Japón 2010)
24 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
2.4 Discusión
Los principales indicadores del porcentaje de rechazo de las muestras evaluadas, según
la confrontación con las normas internacionales en cuanto a la calidad microbiológica del
producto, son los recuentos de mohos y levaduras. La presencia de hongos se puede
explicar debido a un mal manejo asociado a la humedad de la materia prima.
Adicionalmente, el crecimiento de estos microorganismos se puede dar por la presencia
de trazas de miel y polen en el propóleo crudo obtenido de la colmena.
Los coliformes totales y los aerobios mesófilos son indicadores microbiológicos de
importancia para las muestras de propóleo crudo evaluadas (Tabla 2-2); un porcentaje
alto de muestras superan los límites en las normas internacionales, lo cual indica
probablemente condiciones sanitarias deficientes en el proceso de recolección y
conservación de las muestras.
El 4% de las muestras de propóleo crudo fueron positivas para coliformes fecales (Tabla
2-2), en donde el criterio de aceptación es igual a cero en la norma salvadoreña; lo
anterior sugiere una probable contaminación de fuente fecal humana o animal,
contaminación que pudo producirse durante el proceso de recolección en campo de las
muestras. Para el indicador de E. coli, requisito en la norma peruana, 4% de las muestras
tuvieron presencia de esta bacteria.
El 2% de las muestras de propóleo crudo registraron presencia de S. aureus (Tabla 2-2.).
Esta bacteria es indicadora de condiciones de manejo o deficiencia de proceso; pueden
provenir de la piel, la garganta, la nariz durante la manipulación de la materia prima.
En cuanto a la determinación de materia seca parámetro que cuantifica el porcentaje de
sólidos solubles extraídos de propóleos, en promedio, el 9,3% de las muestras presentó
sólidos solubles entre 81,9 y 103,3 mg/ml, cuando se empleó como solvente etanol al
70%. Un aumento en la concentración de etanol (96%) incrementa el número de
muestras (17,5 en promedio) que muestran valores de sólidos superiores (154,4 – 187,4
mg/ml) al anteriormente mencionado (Tabla 2-3), resultados semejantes a los
anteriormente obtenidos con etanol al 70%, de EEP colombianos que variaron en un
2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de
propóleo de Apis mellifera en Colombia
25
rango de 2,72 a 9,17% (Bastos et al. 2011a), de propóleos brasileños (propóleo marrón)
que presentaron valores entre 2,6 a 27,6% (Bastos et al. 2011b) y de propóleos de Chile
(propóleo de producción especializada) 9,6% (Et. 70%) y 18,6 (Et. 96%); Cuba (propóleo
rojo cubano) 10,5 (Et. 70%) y 14,6% (Et. 96%); Nueva Zelanda (propóleo de colmenas en
producción de miel de Manuka) 12,1% (Et. 70%) y 13,2 (Et. 96%); Bélgica 21,1% (Et.
70%) y 24,9% (Et. 6%), evaluados en el presente estudio (Tabla 2-3).
Las extracciones con etanol al 70% mostraron valores promedio de extractos secos
menores a los obtenidos con la extracción con etanol al 96%, lo cual se explica en parte
a la menor solubilidad de resinas y ceras en el agua (Tabla 2-3), justificado en parte por
la menor solubilidad de las resinas y las ceras en el agua, condición que se presentó al
emplear la disolución etanólica (70%) que contiene la mayor proporción de agua. Bastos
et al. (2011b) mencionan que las altas desviaciones estándar de la materia seca de EEP
están influidas por su ubicación geográfica, el origen botánico, el clima y la composición
del suelo, que se refleja en este parámetro fisicoquímico. Los EEP evaluados en este
estudio presentaron una alta fluctuación en cuanto al porcentaje de extracto seco en
cada región. Adicionalmente, en investigaciones anteriores hay evidencias de una mayor
actividad antibacteriana (S. aureus y E. coli) cuando el porcentaje de extracto seco es
más alto (Bastos et al. 2011a; Bastos et al. 2011b).
La normatividad internacional existente en Brasil, Argentina y Japón establecen un
mínimo de 11, 10 y 8%, respectivamente, en el de extracto seco obtenido del EEP (Tabla
2-4).
Las muestras de EEP colombianos que no cumplieron con la concentración exigida por
las normas internacionales se puede explicar por la calidad del propóleo crudo, en
términos de impurezas, y la proporción de cera de abejas en la materia prima.
2.5 Conclusiones
El modelo de obtención de propóleos en campo debe evaluarse en Colombia,
considerando la biodiversidad botánica presente en las distintas regiones y los sistemas
de producción. La normatividad para el control microbiológico y para la estandarización
26 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
de rendimiento en extracto seco ha de adoptarse mediante una norma propia, para dar
claridad de la condición de comercio de este producto dentro del territorio nacional.
Colombia ha avanzado en la tipificación en cuanto a actividad biológica de los propóleos
por regiones geográficas, pero se hace necesario un mayor conocimiento sobre la
composición fisicoquímica y la determinación de marcadores químicos que permitan
identificarlos. Adicionalmente, se requiere ampliar las zonas de estudio de tal manera que
se encuentren zonas recomendadas para la producción de propóleos, y apicultores
especializados en producirlo con sistemas productivos eficientes.
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3. Actividad antibacterial de propóleos ligado al origen geográfico en Colombia
3.1 Introducción
El propóleo que elaboran las Apis mellifera en particular y en general las abejas, a partir
de la colecta de resinas de las plantas, han mostrado por sus componentes un gran
potencial bioactivo. Los reportes indican que el propóleo presenta una eficiente actividad
frente a bacterias Gram positivas y limitada acción frente a bacterias Gram negativas
(Sforcin, Fernandes, Lopes, Bankova, & Funari, 2000). La actividad antibacteriana in vitro
ya fue evidenciada frente a varias cepas bacterianas incluyendo bacterias como la
Salmonella de importancia en alimentos y salud humana (Orsi, y otros, 2005), de la
cavidad oral como Streptococcus mutans (Moreno, Martínez, & Figueroa, 2007) y
algunas anaeróbicas (Santos, Bastos, Rodrigues, & et al, 2002) y otras de interés
veterinario (Bastos, Simone, Jorge, & et al, 2008).
La actividad antimicrobiana de los compuestos de los propóleos no está clara. Takaisi-
Kikuni y Schilcher (Takaisi-Kikuni & Schilcher, 1994) proponen que los extractos
etanólicos de propóleo intervienen con la división de Streptococcus agalactiae
promoviendo la desorganización citoplasmática y la inhibición de la síntesis de proteína.
Los principales responsables de estos efectos reportados son alcoholes, aldehídos,
aminoácidos, ácidos alifáticos, ácidos aromáticos, ésteres aromáticos, flavonoides,
ácidos grasos, ácidos p-cumáricos prenilados, ácidos cafeoilquínicos, lignanos, ácidos
diterpénicos, triterpenos, esteroides y azúcares (Marcucci M. , 1995) (Bankova, de
Castro, & Marcucci, 2000). La actividad antimicrobiana de propóleos europeos ha sido
asociada con presencia de flavonoides y derivados de ácido cafeico (Hegazi, Abd-El-
Hady & Abd-Allah, 2000; Prytzyk y otros, 2003), en el caso de muestras tropicales, los
compuestos bioactivos principales son ácidos fenólicos y derivados prenilatados
(Trusheva, y otros, 2004).
32 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
La composición química del propóleo varía de acuerdo a la región, la especie de las
abejas recolectoras (Ghisalberti, 1979, citado en Bastos, Galbiati , Loureiro, & Scoaris,
2011), pero sobretodo está estrechamente asociada con el origen botánico (Greenaway
et ál. 1987, citado en Amoros, Lurton, Boustiel, & Girre, 1994), lo que refleja la diversidad
de actividades biológicas que presenta el producto. Encontrándose diferencias entre
muestras de países templados y tropicales e inclusive diferencias entre muestras
tropicales según la flora local en el lugar de colecta (Marcucci & Bankova, 1999; Park,
Alencar, & Aguiar, 2002). Como ejemplos, el propóleo verde brasilero o “propóleo
alecrim” es originario de Baccharis dracunculifolia (Asteraceae) (Park, Paredes-Guzman,
Aguiar, Alencar, & Fujiwara, 2004; Teixeira, Negri, Meira, Message, & Salatino, 2005), el
propóleo rojo cubano de Clusia nemorosa (Clusiaceae) (Hernandez, Fernandez, Cuesta-
Rubio, Piccinelli, & Rastrelli, 2005) y más recientemente el propóleo rojo colectado en la
región norte de Brasil (Trusheva, y otros, 2006).
Colombia (Sur América) como país tropical, tiene una gran diversidad botánica, para la
colecta de propóleos por parte de las abejas, haciendo difícil la determinación de las
especies vegetales que originan la composición química; a diferencia de las zonas
templadas en donde predominan grandes extensiones de especies vegetales específicas
haciendo posible esta correlación.
El presente estudio tiene por objetivo evaluar la concentración mínima inhibitoria
propóleos de las abejas Apis mellifera de diferentes orígenes geográficos extraídos
mediante dos concentraciones diferentes de etanol y su actividad antibacteriana in vitro.
3.2 Materiales y métodos
Este estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina
Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, en el
marco del Proyecto Cualificación de productos de las abejas: miel, polen y propóleos
mediante indicadores microbiológicos, convenio N° 057/07, contrato N° 2007C3476 111-
5832007” financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia.
3 Actividad antibacterial de propóleos ligado al origen geográfico de Colombia 33
3.2.1 Recolección de muestras
Se emplearon muestras de propóleo crudo provenientes de tres origenes geográficos, 16
de Boyacá, 20 de Cundinamarca y 34 de Santander, en su mayoría obtenidas mediante
raspado de colmenas comerciales de Apis mellifera entre los años 2008 y 2010. Se
incluyó en este estudio una muestra de propóleo crudo de cada uno de los siguientes
países: Bélgica, Chile, Cuba y Nueva Zelanda.
3.2.2 Concentración mínima inhibitoria
La Concentración Mínima Inhibitoria (MIC, siglas en ingles), fue determinada por medio
del método de microdilución en caldo descrito por el Clinical Laboratory Standards
Institute (CLSI, 2012; Andrews, 2001). Cepas bacterianas de la American Type Culture
Collection (ATCC) fueron empledas tales como Staphylococcus aureus ATCC 6538,
Escherichia coli ATCC 31617, Klebsiella pneumoniae subespecie pneumoniae ATCC
700603, Salmonella entérica subespecie entérica serovar typhimurium ATCC 14028,
Bacillus subtilis subespecie spizizenii ATCC 6633 y Micrococcus luteus kocuria spizizenii
ATCC 9341, La activación de las cepas se realizo de acuerdo a la indicación de la casa
comercial, en caldo BHI (Oxoid Ltd Basingstone, Hampshire, England) e incubación
durante 18h a 37°C. Inoculos bacterianos fueron preparados en Agar Plate Count
(DifcoTM Le Pont de Claix, France) rayando por agotamiento e incubando a 24h a 37°C;
se observo el crecimiento bacterial como control de verificación de la idoneidad de la
bacteria, posteriormente se tomó una colonia aislada para una segunda siembra en Agar
Plate Count; tomando de allí una colonia media para ser ajustada al 0,5 del estándar de
turbidez de McFarland (1 x 108 UFC ml-1) en 10 ml de solución salina. En una placa de
microdilución de 96 pozos fueron colocados 100 µl de caldo Mueller-Hinton y de EEP
obtenidos a partir de etanol al 70 y 96% en un experiemento previo (Talero & Figueroa,
2012), estos fueron llevados en un tubo a una concentración de 6,4 mg/ml y se adicionó
100 µl de cada uno a los primeros pozos, posteriormente se realizaron diluciones
seriadas en base dos hasta completar 6 diluciones (3,2; 1,6; 0,8; 0,4; 0,2; 0,1 mg/ml),
utilizando los restantes pozos para la repetición, de cada placa de microdilución. De esta
manera se consiguieron las diluciones ó concentraciones (mg/ml) de EEP, a probar. De
la suspensión bacterial 10 µl fue adicionada en los pozos que contenían propóleo. Luego
de este proceso, se incubo por 24 h a 37°C. Pasado este lapso de tiempo se realizo un
subcultivo con asa calibrada de 1 µl en placa de Petri en Agar Mueller-Hinton (Oxoid Ltd.,
34 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
Basingstone, Hampshire, England) y se llevó nuevamente a incubación bajo las mismas
condiciones anteriores.
Para este estudio se incluyó un control con alcohol etílico al 96% en el mismo volumen
de cada EEP, un control de crecimiento libre de las bacterias y uno de esterilidad del
caldo.
La concentración mínima inhibitoria (MIC) fue definida como la más baja concentración o
la más alta dilución del EEP en que el subcultivo dio negativo o no presentó colonias
visibles.
3.3 Resultados
Los resultados obtenidos fueron analizados a partir de sus medianas y se empleó el
análisis de varianza no paramétrico de Kruskal-Wallis (H) para determinar las diferencias
significativas, los datos fueron ordenados para establecer los valores de P entre orígenes
geográficos por bacteria en la Tabla 3-1 y los valores de P dentro de cada origen
geográfico para las extracciones de propóleo con etanol al 70 y 96% (Et. 70 y 96%) para
cada bacteria empleada en el estudio (Tabla 3-2).
Los análisis de varianza no paramétricos de MIC de EEP (Et. 70 y 96%) frente a E. coli y
S. aureus de muestras extranjeras (países: Bélgica, Chile, Cuba, Nueva Zelanda) y
colombianas se presentan en la Tabla 3-3.
TABLA 3-1. Actividad antibacterial de EEP (MIC, mg/ml) diferenciada entre orígenes geográficos
en Colombia.
EEP (Et. 70%) E. coli Salmonella Klebsiella Micrococcus S. aureus B. subtilis
MIC
Santander 0,8 H=0,865 P=0,649
0,8 H=2,368 P=0,306
0,1 H=1,793 P=0,408
0,8 H=3,937 P=0,139
0,8 H=0,292 P=0,864
0,1 H=4,168 P=0,124
Boyacá 1,2 1,2 0,1 1,6 0,8 0,1
Cundinamarca 0,8 1,6 0,7 1,6 0,4 0,1
EEP (Et. 96%) E, coli Salmonella Klebsiella Micrococcus S, aureus B, subtilis
MIC
Santander 0,8 H=1,902 P=0,386
0,8 H=2,552 P=0,279
0,1 H=0,289 P=0,865
0,4 H=9,868 P=0,007*
0,3 H=7,184 P=0,027*
0,1 H=1,930 P=0,381
Boyacá 0,8 0,8 0,1 0,8 1,2 0,1
Cundinamarca 0,8 0,8 0,1 0,8 0,4 0,1
H=Kruskal-Wallis; P=Probabilidad; MIC=Concentración minima inhibitoria; EEP= Extracto etanolico de propoleo; Et.=Etanol; * P<0,05.
3 Actividad antibacterial de propóleos ligado al origen geográfico de Colombia 35
TABLA 3-2. Efecto de la concentración del etanol de los EEP sobre la actividad antibacterial
según origen geográfico en Colombia.
TABLA 3-3. Efecto de la concentración del etanol de los EEP sobre la actividad antibacterial de
muestras extranjeras (Bélgica, Chile, Cuba, Nueva Zelanda) y el origen geográfico en Colombia.
EEP (Et. 70%) E. coli S. aureus
Santander
H=0,944 P=0,815
H=5,142 P=0,161
Boyacá
Cundinamarca
Extranjeras
EEP (Et. 96%) E. coli S. aureus
Santander
H=0,905 P=0,824
H=7,077 P=0,069
Boyacá
Cundinamarca
Extranjeras
E. coli
EEP (Et. 70 - 96%) S. aureus
EEP (Et. 70 - 96%)
Extranjeras
MIC EEP (Et. 70%) EEP (Et. 96%)
H=2,734 P=0,098
0,8 0,6
H=0,202 P=0,653
0,1 0,3
H=K-W; P=Probabilidad; MIC=Concentración minima inhibitoria; EEP= Extracto etanolico de propoleo; Et.=Etanol; * P<0,05.
3.4 Discusión
Los propóleos de los tres orígenes geográficos evaluados (Tabla 3-1), presentan una
MIC frente a bacterias Gram positivas estadísticamente similar cuando se empleó
extracción con etanol al 70%, no encontrado diferencias significativas; sin embargo en la
Santander Boyacá Cundinamarca
EEP (Et.)
70% 96% 70% 96% 70% 96%
E. coli
H = 8,739 P = 0,003*
H = 1,244 P = 0,265
H = 4,728 P = 0,029*
Salmonella
H = 0,901
P = 0,343 H = 0,271 P = 0,602
H = 0,493 P = 0,483
Klebsiella
H = 0,193
P = 0,660 H = 1,063 P = 0,302
H = 0,056 P = 0,812
Micrococcus
H = 9,423
P = 0,002* H = 0,516 P = 0,472
H = 3,216 P = 0,073
S. aureus
H = 5,713
P = 0,017* H = 1,560 P = 0,212
H = 0,926 P = 0,336
B. subtilis
H = 9,668
P = 0,002* H = 0,479 P = 0,489
H = 1,736 P = 0,188
H=K-W; P=Probabilidad; EEP= Extracto etanolico de propoleo; Et.=Etanol; * P<0,05.
36 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
Figura 3-1, se observa que los EEP de los tres departamentos presentaron mayor
actividad frente a B. subtilis con una MIC de 0,1 mg/ml.
En la Tabla 3-1, los resultados muestran que existe diferencia significativa (P<0,05) entre
los propóleos evaluados en su actividad antibacteriana (Gram positivas) de los tres
orígenes geográficos cuando se empleo extracción con etanol al 96%. Persiste la
susceptibilidad de B. subtilis para los EEP (Et. 96%). En la Figura 3-2 se observa que los
propoleos del departamento de Santander presentaron mayor actividad antibacterial para
las tres bacterias Gram positivas incluidas en el experimento.
3 Actividad antibacterial de propóleos ligado al origen geográfico de Colombia 37
En cuanto al modelo de extracción etanólica cuando se empleo etanol al 70 o al 96% y su
actividad antibacteriana en Gram positivas, los propóleos del departamento de Santander
presentaron diferencias significativas (P<0,05) (Tabla 3-2).
La evaluación de MIC de los EEP (Et. 70%) de bacterias Gram negativas no mostraron
diferencias significativas (P>0,05) (Tabla 3-1); sin embargo, Klebsiella presentó mayor
susceptibilidad con medianas en concentraciones de 0,1 mg/ml (Figura 3-3).
Igualmente no se presentaron diferencias significativas (P>0,05) entre los EEP (Et. 96%)
en la actividad antibacteriana de Gram negativas (Tabla 3-1). Las MIC (medianas) para
los EEP de los tres departamentos frente a Klebsiella fueron de 0,1 mg/ml, las MIC frente
a Salmonella y E. coli se comportaron similarmente (Figura 3-4).
En la Tabla 3-2, se observa que en el modelo de extracción etanólica cuando se empleo
etanol al 70 o al 96% y su actividad antibacteriana en Gram negativas, los propóleos del
departamento de Santander y Cundinamarca presentaron diferencias significativas
(P<0,05) únicamente para la bacteria E. coli.
Los resultados de las muestras extranjeras no mostraron diferencias significativas
(P>0,05) con los resultados de las muestras nacionales frente a las bacterias E. coli y S.
38 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
aureus, tampoco en el empleo de los dos modelos de EEP con etanol al 70% y al 96%
(Tabla 3).
Cabe notar que de acuerdo con datos de la literatura se afirma que los propóleos son
activos frente a bacterias Gram positivas, pero limitada actividad contra bacterias Gram
negativas (Bankova, y otros, 1999; Sforcin, Fernandes, Lopes, Bankova, & Funari, 2000;
Drago, De Vecchi, Nicola, & Gismondo, 2007). Los propóleos llevados a extractos
etanólicos en este estudio presentaron actividad frente a todas las cepas en
concentraciones de 3,2 a 0,1 mg/ml, con especial actividad frente a Klebsiella (Gram
negativa) y B. subtilis (Gram positiva). Estos mismos autores describen a E. coli, como
una bacteria Gram negativo de gran interés clínico, como una bacteria de baja
susceptibilidad a los propoleos (Bastos, Galbiati , Loureiro, & Scoaris, 2011), también
estudios llevados a cabo por la empresa Apis Flora Industrial e Comercial LTDA
(Ribeir˜ao Preto, SP, Brazil) muestra resistencia de E. coli cuando fue expuesto a
extractos etanolicos de propóleo y extractos acuosos de propoleos (PWE, siglas en
ingles) (Alves Rocha, Pires Bueno, de Oliveira Lima Leite Vaz, & et al,
2013), encontrando en el presente experimento MIC entre 0,8 a 1,2 mg/ml de EEP de
origen geográfico en Colombia para la cepa en estudio.
3 Actividad antibacterial de propóleos ligado al origen geográfico de Colombia 39
3.5 Conclusiones
Es necesario realizar muestreos experimentales de propóleos crudos diferenciados en
áreas de alta producción de la materia prima, e incluir análisis de laboratorio de su
procedencia botánica, así como la fotoquímica presente en las muestras. Los resultados
obtenidos son alentadores considerando la bibliografía internacional, se hace necesario
profundizar en ensayos que permitan la estandarización de los EEP por su actividad
biológica y la concentración de sus compuestos activos, que es uno de los pasos que en
la actualidad busca la investigación e industria internacional.
Actualmente existen nuevas metodologías para la obtención de EEP (aceites, agua, etc),
es necesario ahondar en su composición química y la actividad biológica, para propóleos
obtenidos en el país, con una alta oferta de fuentes botánicas, bajo estas metodologías..
El entendimiento de los procesos o “mecanismos de acción del propoleo en celulas
bacterianas es complejo y no puede ser una simple analogia del modo de acción de
cualquier antibiotico clasico” (Takaisi-Kikuni & Schilcher, 1994). Es necesario realizar
para los propoleos investigaciones de biologia celular, por ejemplo en los mecanismos
que afectan la adesión de la bacteria hasta ahora desconocidos (Drago, De Vecchi,
Nicola, & Gismondo, 2007), existen hipótesis para explicar la adherencia disminuida en
Staphylococcus aureus (Scazzocchio, D’Auria, Alessandrini, & F., 2006).
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4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo en Colombia
4.1 INTRODUCCIÓN
El propóleo es un producto natural de las abejas Apis mellifera, derivado del metabolismo
de las plantas, desde tiempos inmemorables ha sido utilizado por el hombre para su
salud, actualmente existe una tendencia mundial hacia la demanda de este producto,
registrándose aumentos en la producción mundial.
Los propóleos se utilizan ampliamente en la preparación de los medicamentos en
diferentes regiones del mundo, en Europa y en algunos países de Sur América como
Brasil y Uruguay se han utilizado como un agente terapéutico durante muchos años
(Azevedo et al. 1999). Su composición puede variar de acuerdo a las plantas que
puedan ser encontradas en cada región. (Sawaya, y otros, 2002) y la temporada de su
colección (Quiroga, Sampietro, Sobero, Sgariglia, & Vattuone, 2005).
Como alternativa a la micosis, se encuentra el propóleo (Silici, Koç, Ayangil, & Çankaya,
2005). La micosis superficial es una enfermedad de la piel y sus apéndices, es causada
por hongos y afecta los tejidos ricos en queratina, Tiene la afinidad para parasitar
queratina tejidos ricos, produciendo respuesta térmica inflamatoria y picazón intensa
además de un aspecto cosméticamente pobre. En este contexto, es necesario a largo
plazo la terapia supresora con agentes antifúngicos, que puede conducir a la selección
de cepas resistentes (Silici & Koc, 2006).
Los flavonoides, ácidos aromáticos, ácidos diterpénicos ácidos y compuestos fenólicos
parecen ser los componentes principales que son responsables de la actividades
biológicas de muestras de propóleos (Silici, Koç, Ayangil, & Çankaya, 2005). Los
flavonoides en el propóleo (principalmente pinocembrina) ha sido considerado
44 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
responsable de su efecto inhibitorio sobre la Candida, pero sólo se han encontrado trazas
de estos compuestos en propóleos de origen sudamericano (Sawaya, y otros, 2002).
Los propóleos centroeuropeos (Alemania, Francia y Austria), con composiciones
cualitativas similares y predominio del ácido trans-p-cumárico, muestran actividad frente
a Candida albicans, mientras que los mediterráneos (Bulgaria, Turquía, Grecia y Argelia),
que contienen flavonoides, ésteres del ácido cafeico y ácidos ferúlicos, presenta menor
actividad antifúngica. Por su parte, el propóleo egipcio de Dakahlia, con dos ésteres de
cafeato y dos triterpenoides, es más activo frente a Candida albicans que el de Ismailia
que no contiene ácidos aromáticos, ni ésteres, ni flavonoides. Estudios sobre la
incidencia de la paracoccidiomicosis en América latina, sugieren que,
independientemente de su origen geográfico, los macrófagos estimulados con propóleo
aumentan su actividad fungicida (Burdock G. A., 1998).
Compuestos como la pinocembrina y galangina, aislados de propóleo del noreste de
Argentina demuestran que los extractos etanólicos de propóleo purificados y sus
compuestos aislados tienen actividad antifúngica y pueden ser empleados como
antifúngicos naturales (Quiroga et al. 2005).
En Brasil se correlacionó la composición química de los extractos etanólicos de
propóleos, de dos regiones geográficas, con la actividad antimicrobiana, lo cual demostró
que ácidos como el cumárico son importantes sobre la actividad biológica que presentan
los propóleos brasileros (Salomão, y otros, 2008).
Actividad in vitro de agentes antifúngicos y antisépticos fue evaluada frente a
dermatofitos incluido Trichophyton rubrum, la concentración mínima inhibitoria fue
determinada por el método de dilución en agar, señalando que el propóleo tuvo un
comportamiento similar a los otros medicamentos comerciales (Soares & Cury, 2001). De
la misma manera, en un estudio posterior utilizando además propoleo verde y rojo
brasilero se evaluó para Trichophyton rubrum la actividad fungicida y fungistática
(Siqueira et al. 2008).
4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo 45
El objetivo de esta investigación fue evaluar los propóleos colombianos frente a la
actividad antifúngica con Trichophyton rubrum.
4.2 MATERIALES Y MÉTODOS
Este estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina
Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, en el
marco del Proyecto Cualificación de productos de las abejas: miel, polen y propóleos
mediante indicadores microbiológicos, convenio N° 057/07, contrato N° 2007C3476 111-
5832007 financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia.
4.2.1 Recolección de muestras
Se emplearon muestras de propóleo crudo provenientes de tres orígenes geográficos, 15
de Boyacá, 13 de Cundinamarca y 16 de Santander, en su mayoría obtenidas mediante
raspado de colmenas comerciales de Apis mellifera entre los años 2008 y 2010. Se
incluyó en este estudio una muestra de propóleo crudo de cada uno de los siguientes
países: Chile, Cuba y Nueva Zelanda.
4.2.2 Activación de la cepa de referencia
Se reconstituyó la cepa de referencia, Trichophyton rubrum ATCC 28188 liofilizada, con
0,5 ml de agua estéril hasta lograr una mezcla homogénea, se dejó por dos horas para
que se sedimentara y posteriormente se mezcló la suspensión para inocular en superficie
en 250 ml del medio de cultivo. Se incubó a 30º C y cuando hubo crecimiento
considerable del hongo (fase esporulada), formando un tapete sobre toda la superficie de
la botella, se realizó un lavado con 30 ml de solución salina al 0.86% y perlas de vidrio
estériles para desprender las esporas. Al obtenerse una suspensión densa del hongo se
filtró y homogenizó verificando la concentración de UFC/ml mediante recuento en
Cámara de Neubauer. Posteriormente se realizaron las alícuotas en crioviales plásticos
con agua estéril rotulando el vial con el código correspondiente de la cepa y la fecha de
recolección y se guardaron en el refrigerador a una temperatura de 4 °C (Petrikkou, y
otros, 2001).
46 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
4.2.3 Concentración mínima inhibitoria
La determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC, siglas en ingles) de los
extractos etanólicos de propóleo (EEP) colombianos frente a Trichophyton rubrum ATCC
28188, se realizó empleando la técnica de dilución agar en placa (CLSI, 2002; Soares &
Cury, 2001), y se evaluó los EEP obtenidos a partir de etanol al 70 y 96% en un
experiemento previo (Talero, Hernandez, & Figueroa, 2012), haciendo diluciones del
extracto con Agar PDA, para obtener concentraciones entre 0,5 a 16,0 mg/ml del EEP.
Se determinó la actividad fungistática y fungicida de los propóleos observando el
crecimiento radial del hongo, haciendo una medición en centímetros (cm) tanto del
control como de las muestras corridas, determinando el porcentaje de inhibición del
crecimiento (Reyes et al. 1997). La medición se realizó cada 72 horas en un periodo de
15 días.
Para este estudio se incluye un control con alcohol etílico al 96% en el mismo volumen
de cada EEP y un control del crecimiento libre del hongo.
La actividad fungicida se define como la más baja concentración o la más alta dilución del
EEP en que el subcultivo da negativo o no presente colonias visibles y la actividad
fungistática será definida como la más baja concentración o la más alta dilución del EEP
en que el subcultivo presenta disminución del diámetro con respecto al control.
4.3 Resultados
4.3.1 Crecimiento
Se midió el crecimiento del hongo Trichophyton rubrum ATCC 28188 sometido a seis
niveles de concentración de Extracto Etanólico de Propóleo (EEP).
El crecimiento se determinó midiendo el diámetro (cm) y se transformó a unidades de
área (cm2). Durante el desarrollo del experimento se realizaron 24 controles con los que
se construyó la curva de crecimiento del hongo (Figura 4-1).
4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo 47
En la Figuras 4-3 se muestran las curvas de crecimiento de Trichophyton rubrum de las
muestras de los departamentos de Santander, Cundinamarca y Boyacá, con dos
concentraciones de alcohol. No se construyeron las curvas de crecimiento para los
propóleos de Boyacá (70%) y extranjeros (70 y 96%) porque no hubo crecimiento en los
seis niveles de concentración del EEP.
Donde está la tasa de crecimiento del control de solventes?
Figura 4-1. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum en el Control. La curva se
ajusta a un modelo logístico que corresponde a con s = 0.437, r2 =
0.996
Donde está la tasa de crecimiento del control de solventes?
48 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
70% 96%
Sa
nta
nd
er
Cu
nd
ina
ma
rca
Bo
ya
cá
Figura 4-3. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP
en Santander, Cundinamarca y Boyacá, en Alcohol 70% y 96%
( , mg/ml, mg/ml, mg/ml, mg/ml, mg/ml)
En los tres departamentos, a diferentes diluciones del EEP, tanto en alcohol a 96% como
a 70%, el crecimiento de Trichophyton rubrum (medido en cm2) estuvo por debajo del
crecimiento en el control. De especial interés resultan las diluciones de 8 mg/ml de EEP
en alcohol al 70% y 96% en los departamentos de Santander y Cundinamarca en los que
el crecimiento del hongo fue totalmente inhibido.
100% de inhibición
4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo 49
4.3.2 Inhibición
El crecimiento del hongo fue inhibido en el 100 % en las diluciones de EEP del 16mg/ml.
En el departamento de Boyacá la inhibición fue mucho mayor que en Santander y
Cundinamarca (Figuras 4-7 y 4-8). Las muestras señaladas como ‘Extranjeras’ (1 de
Nueva Zelanda, 1 de Chile y 1 de Cuba) presentaron el mayor porcentaje de inhibición
del hongo en todas las concentraciones. Es importante advertir que las desviaciones
estándar (1 DE) tienden a ser mayores en la medida que las diluciones de EEP son
menores (Tablas 4-1 y 4-2).
Figura 4-7. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Trichophyton rubrum en los
departamentos de Boyacá, Santander y Cundinamarca, en alcohol al 70% y en seis
niveles de concentración de EEP
50 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
Figura 4-8. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Trichophyton rubrum en los
departamentos de Boyacá, Santander y Cundinamarca, en alcohol al 96% y en seis
niveles de concentración de EEP
Desde la perspectiva estadística, no se presentaron diferencias estadísticas entre
concentraciones de etanol al 70% y 96% (F=0.000042, p=0.9948), pero sí fueron muy
altamente significativas entre departamentos (F=28.69, p<0.0001). Efectivamente, el
comportamiento de los promedios de inhibición de las concentraciones de etanol al 70%
y 96% fueron bastante similares (Figuras 4-7 y 4-8), mientras que los promedios de
inhibición entre Cundinamarca y Santander con Boyacá y Extranjeras fueron muy
diferentes (32% y 41%, 96% y 100%, respectivamente); la acción inhibidora de los EEP
en alcohol al 70% y 96% de Boyacá son muy similares a las muestras ‘Extranjeras’.
Tabla 4-1. Frecuencias relativas de la inhibición de las seis diluciones de EEP, en cuatro
zonas, en etanol 70%
EEP (70%)
ZONA 16,00 8,00 4,00 2,00 1,00 0,50
Boyacá Promedio 100 100 100 100 100 98.7
DE - - - - - 5.2
Cundinamarca Promedio 100 100 93.6 71.3 49.2 33.9
DE - - 15.7 29.5 32.7 35.3
Santander Promedio 100 98.4 85.2 61.4 49.5 37.0
DE - 5.3 26.3 39.5 40.9 40.2
4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo 51
Extranjeras Promedio 100 100 100 100 100 100
DE - - - - - -
DE: Desviación Estándar
4.3.3 Concentración Mínima Fungicida
Las Concentraciones Mínimas Fungicidas (CMF) fueron estimadas según las frecuencias
relativas en cada una de las diluciones, en las cuatro zonas, en etanol al 70% y 96%. En
Boyacá y en las muestras ‘Extranjeras’, las CMF son las correspondientes a las
diluciones al 0,5 mg/ml, tanto para etanol al 70% como al 96%; en Cundinamarca y
Santander, las CMF son las correspondientes a las diluciones al 4 mg/ml (si se tiene en
cuenta únicamente la mediana de cada muestra), aunque porcentualmente hubo más
muestras con diluciones al 8% en Santander, tanto para etanol al 70% como al 96%
(Tabla 4-3, Figura 4-9).
Tabla 4-2. Frecuencias relativas de la inhibición de las seis diluciones de EEP, en cuatro
zonas, en etanol 96%
EEP (96%)
ZONA 16,00 8,00 4,00 2,00 1,00 0,50
Boyacá
Promedio 100 100 100 100 97.2 93.1
DE - - - - 7.5 14.7
Cundinamarca
Promedio 100 97.4 84.2 63.0 39.7 30.5
DE - 7.1 20.9 32.5 28.3 34.6
Santander
Promedio 100 100 88.7 67.4 53.5 44.9
DE - - 20.9 33.4 39.6 44.6
Extranjeras
Promedio 100 100 100 100 100 100
DE - - - - - -
DE: Desviación Estándar
52 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
Tabla 4-3. Frecuencias relativas (%) para estimar las Concentración Mínima Fungicida
en las seis diluciones de EEP, en etanol al 70% y 96%, en cuatro zonas diferentes
Diluciones EEP Mediana
16,0 8,0 4,0 2,0 1,0 0,5
Boyacá 70% 6,7 93,3 0,5
96% 13,3 6,7 80 0,5
Cundinamarca 70% 25 33,3 25 0 16,7 4,0
96% 14,3 28,6 28,6 21,4 7,1 4,0
Santander 70% 7,1 28,6 21,4 7,1 7,1 28,6 4,0
96% 6,3 37,5 18,8 6,3 31,3 4,0
Extranjeras 70% 100 0,5
96% 100 0,5
Figura 4-9. Frecuencias relativas (%) para estimar las Concentración Mínima Fungicida
en las seis diluciones de EEP, en etanol al 70% y 96%, en cuatro zonas diferentes
4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo 53
4.4 Discusión
Los EEP en estudio mostraron actividad fungistatica cuando la concentración inicia en
0,5 mg/ml en T. rubrum y son fungicidas cuando la concentración se incrementa hasta
16,0 mg/ml, la zona que presentó mayor actividad antifúngica frente a T. rubrum es el
origen geográfico de Boyacá en comparación con Cundinamarca y Santander.
Los extractos con etanol al 70% de los tres orígenes geográficos presentaron mayor
actividad antifungica en comparación a los extractos que se obtuvieron con etanol al 96%
proponiendo que el modelo de extracción hidroalcoholico para estos propóleos en
Colombia, podría generar mejores actividades biológicas frente a hongos.
Los EEP (Et. 70 y 96%) de los tres orígenes geográficos son activos en las
concentraciones de 0,5 a 16,0 mg/ml, comparable con las muestras extranjeras incluidas
en el estudio y con los trabajos previos (Silici, Koç, Ayangil, & Çankaya, 2005; Soares &
Cury, 2001; Siqueira, y otros, 2008).
4.5 Conclusiones
De acuerdo con los resultados obtenidos en el presente trabajo es posible concluir que el
EEP demostró una actividad antifúngica más eficiente al extraerse con etanol al 70% y
para la zona de Boyacá. La cepa de T. rubrum demostró ser sensible a la actividad
antifúngica de los extractos alcohólicos.
Se sugieren estudios en el futuro con aplicaciones como tratamiento alternativo contra T.
rubrum, T. tonsurans y T. mentagrophytes spp.
4.6 Bibliografía
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5. Uso del bacteriófago lambda como indicador de actividad antiviral in vitro de propóleos de Colombia
5.1 Introducción
Propóleos es el nombre genérico para una sustancia resinosa fuertemente adhesiva
colectada por las abejas Apis mellifera de los árboles y los brotes de las hojas (Gekker,
Hu, Spivak, Lokensgard, & Peterson, 2005). En la última década, ha ganado popularidad
como un componente de los alimentos y bebidas para mejorar la salud humana (Popova,
y otros, 2011).
Se han analizado los efectos biológicos de varios propóleos y sus fracciones en
diferentes investigaciones (Serkedjieva & Manolova, 1992) en bacteriófagos (Maskova,
Albert, & Simuth, 1990); virus de plantas, virus vaccinia, virus Aujeszky, virus de la
estomatitis vesicular y virus de la influenza descritos por Serkedjieva y Manolova (1992);
así mismo virus de las hepatitis B, virus herpes aviar y virus herpes simplex descritos por
Amoros et al. (Amoros, Lurton, Boustiel, & Girre, 1994)(1994); Reo virus (El Hady &
Hegazi, 2002), HIV-1 (Gekker, Hu, Spivak, Lokensgard, & Peterson, 2005), IBDV y virus
de la enfermedad de Newcastle (ElHady, Hegazi, & Wollenweber, 1997).
La actividad antiviral del propóleos es variada según la composición química,
dependiendo del origen fitogeográfico, diferencia considerable en las actividades
biológicas (Kujumgiev, Tsvetkova, Serkedjieva, Bankova, Christov, & Popov, 1999).
Ciertas estructuras de flavonoides (acacetin, kaempferol, chrysina, quercetina y
galangina) y triterpenos pentacíclicos (ácidos betulínico, ácido morónico, ácido betulónico
y las meliferonas) presentan una importante capacidad antiviral ( (Debiaggi, Tateo,
Pagani, Luini, & Romero, 1990); (Geetha & Varalaxmi, 1998); (Ito, y otros, 2001)). Este
tipo de estudios, en la mayoría de los casos requiere técnicas dispendiosas, costosas o
muy demoradas, lo cual limita su uso, especialmente para ser empleadas rutinariamente.
56 Título de la tesis o trabajo de investigación
Adicionalmente en Colombia hasta el momento no se han llevado a cabo estudios sobre
la actividad antiviral de propóleos producidos en el país, por tal razón el objetivo de este
estudio fue implementar una técnica sencilla, rápida y económica in vitro, para evaluar la
capacidad antiviral de propóleos de tres regiones de Colombia, mediante el uso del
bacteriófago lambda.
5.2 Materiales y Métodos
La investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina
Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá D.C.,
como parte del Proyecto “Cualificación de productos de las abejas: miel, polen y
propóleos mediante indicadores microbiológicos, convenio N° 057/07, contrato N°
2007C3476 111-5832007” financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
de Colombia.
5.2.1 Bacteriofago y celula huésped
Se emplearon en este estudio una bacteria huésped Escherichia coli LE392 ATCC 33572
(sensible al fago lambda). La cepa huésped fue suspendida en viales de 5 ml con caldo
LB en tubos de vidrio estériles y puesta a incubación (overnight) a 37°C con agitación
lenta. Una vez se comprobó el crecimiento bacteriano mediante observación de la
turbidez del tubo, fueron centrifugados a 3000 rpm por 5 minutos y desechado el
sobrenadante obtenido. El pellet bacteriano formado fue resuspendido en 2 ml de MgSO4
10mM y conservado a 4°C. Para cada caja de Petri para plaqueo se emplearon 100 µl de
suspensión bacteriana (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, 1989).
El título del bacteriófago (1 x 107 UFP/ml) se confirmó antes de su uso, utilizando la
técnica estándar de agar de recubrimiento, a través de diluciones en serie del stock y el
cálculo de unidades formadoras de placas (UFP/ml) (Fankhauser, 2010). De este stock
se realizaron diluciones en base 10 en Solución Tampón SM (Tris Base 0.121%, MgSO4
0.12%, gelatina 0.01%) para obtener una dilución que generará un número mayor a 1000
UFP en cada caja de petri, en este caso la dilución óptima fue 1:10.000 (1 x 103 UFP/ml).
Capítulo (…) 57
5.2.2 Medios de Cultivo
Se prepararon tres medios de cultivo, Agar Luria-Bertani (LB) duro (Triptona 1%, extracto
de levadura 0,5%, NaCl 1%, agar o agarosa 1,5%), Agar LB suave (Triptona 1%, extracto
de levadura 0,5%, NaCl 1%, agar ó agarosa 0,7%) y caldo LB (Triptona 1%, extracto de
levadura 0,5%, NaCl 1%).
5.2.3 Muestras de Propóleos
Doce extractos etanolicos de propóleo (EEP) obtenidos en una extracción con etanol al
70% (Almeida, 2003; Bruschi, y otros, 2006), fueron seleccionados según el origen
geográfico en Colombia (4 de Cundinamarca, 4 de Boyacá y 4 de Santander) y llevados
por separado a una solución stock a 2 mg/ml de extracto seco. Se realizaron diluciones
en base dos en viales, iniciando con 200 µl del EEP solución stock en 100 µl de solución
tampón SM (Buffer SM: Tris Base 0.121%, MgSO4 0.12%, gelatina 0.01%) y 100 µl de
caldo LB (volumen total 400 µl) para obtener concentraciones finales de 1,00; 0,50 y 0,25
mg/ml; estas 3 diluciones fueron sometidas a la prueba de actividad antiviral por
duplicado.
Los EEP en el actual estudio presentaron en promedio concentraciones mínimas
bactericidas (MIC) in vitro con valores de 1,2 mg/ml frente a Escherichia coli, en ensayos
llevados anteriormente por este grupo de investigación. De tal forma que las diluciones
de EEP finales para evaluar la actividad antiviral permite el crecimiento de la cepa de E.
coli hospedadora.
5.2.4 Procedimiento
Los títulos de la bacteria fue ajustada mediante la dilución con MHB antes de su uso.
De cada una de las diluciones de EEP (1,00; 0,50 y 0,25 mg/ml) se tomaron 200 µl en
viales mezclándolos con 20 µl de la dilución de fago elegida 1:10.000 y con 200 µl de la
solución que contenía la bacteria (volumen total 420 µl); se emplearon 210 µl para cada
caja de petri. Todas las mezclas se realizaron en tubos eppendorff, con agitación lenta.
58 Título de la tesis o trabajo de investigación
Para el control positivo del plaqueo se emplearon 20 µl de la dilución de fago elegida y se
mezclaron con 100 µl de solución tampón SM, más 100 µl de caldo LB. (Total 220 µl).
Estos 220 µl, alcanzaron para dos cajas de petri (duplicado), empleando 110 µl, para
mezclar con 100 µl de la solución que contiene la bacteria por caja (Total 210 µl por
caja).
Para el control negativo se emplearon 20 µl de agua destilada estéril y se mezclaron con
100 µl de solución tampón SM, más 100 µl de caldo LB. (Total 220 µl). 110 µl se
mezclaron con 100 µl de la solución que contiene la bacteria por caja por duplicado.
Cada tubo eppendorff que contenía los controles positivos, negativos y las pruebas de los
propóleos, se incubaron a 37°C por 20 minutos, para permitir que los fagos infectaran a
las bacterias.
5.2.5 Plaqueo
Una vez terminado los 20 minutos de incubación de los viales, fueron llevados a la cabina
de flujo laminar y se tomaron 210 µl de cada uno de los viales, depositándolos en tubos
con 3 ml de agar LB suave cada uno, que previamente se había fundió, calentándolo en
horno microondas a fin de poderlo alicuotar. Los tubos fueron mezclados manualmente y
mantenidos en un beaker con agua a 47°C; se incluyó en este procedimiento los
controles.
Posteriormente se depositó el contenido de los tubos sobre la capa de agar duro de la
caja de Petri (previamente atemperadas, sin condensación en las tapas), moviéndola en
forma circular para que se forme una sobrecapa homogénea, sin grumos y que cubra
toda la superficie. Se dejó solidificar el agar blando por un espacio de 20 minutos, luego
se invirtieron las cajas y se depositaron en la incubadora a 37°C, permitiendo el
crecimiento hasta el siguiente día (overnight).
Al día siguiente se comprobó si hubo crecimiento bacteriano en la caja de control
negativo, se realizó el conteo respectivo de Unidades Formadoras de Placa en las cajas
del control positivo y en las cajas de prueba de los propoleos. Comparando el número de
UFP del control positivo frente a las cajas de prueba de los propoleos.
Capítulo (…) 59
5.3 Resultados
Los hallazgos en las pruebas microbiológicas realizadas son reportados en la Tabla 5-1,
se puede apreciar que los extractos etanólicos de propóleo inhibieron (actividad antiviral)
al fago a las 24 horas de incubación.
TABLA 5-1. Prueba antiviral contra el Fago Lamda de E. coli con exposición a tres
concentraciones de EEP de tres orígenes geográficos diferentes.
Muestra / Origen Geográfico
EEP
Control 1,00 mg/ml 0,50 mg/ml 0,25 mg/ml
105/Cundinamarca - + - - 192/Cundinamarca - + + + 362/Cundinamarca - + + - 456/Cundinamarca - - - - 091/Boyacá - + + - 102/Boyacá - + + - 137/Boyacá - + + + 146/Boyacá - + - - 092/Santander - + - - 093/Santander - + - - 101/Santander - + + - 103/Santander - - - - EEP: Concentración del extracto etanólico de propóleo; +: UFP entre 0 y 500 (Actividad antiviral positiva); - : UFP incontables (Actividad antiviral negativa).
En la Figura 5-2 se puede observar el efecto de los EEP sobre las UFP y el porcentaje de
muestras que presentaron efecto inhibitorio sobre el fago o ningún efecto visible,
encontrando incontables UFP.
5.4 Discusión
El control positivo, generó incontables Unidades Formadoras de Placas de lisis en cada
caja de Petri. El control negativo presentó el crecimiento adecuado de la cepa de E. coli,
sin la presencia de UFP.
De los 12 propóleos ensayados, 10 presentaron actividad antiviral con EEP en la
concentración 1 mg/ml; los valores más bajos (mejor actividad antiviral) fueron de cero
(0) UFP, para 4 propóleos (2 de Boyacá, 1 de Cundinamarca y 1 de Santander); los
siguientes valores variaron entre 4 y 500 UFC.
60 Título de la tesis o trabajo de investigación
FIGURA 5-1. Porcentaje de muestras que presentaron conteos visibles de UFP y el
efecto de los EEP sobre el fago con respecto al control.
a. Porcentaje de muestras que se encontraron dentro de los rangos visibles para conteo de UFP;
b. Porcentaje de muestras que se consideraron como inhibición del fago con respecto al control.
De los EEP con concentración de 0,5 mg/ml seis (6) propóleos presentaron actividad
antiviral, aunque como era de esperarse, el número de UFP aumentó, pero aun
manteniéndose bajo con respecto al control positivo.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Control EEP 1,00 mg/ml
EEP 0,50 mg/ml
EEP 0,25 mg/ml
a.
Incontables
251-500
1-250
0
Capítulo (…) 61
La concentración más baja de los EEP correspondiente a 0,25 mg/ml, presento dos
propóleos que mantuvieron actividad antiviral, mientras que los 10 restantes perdieron su
actividad antiviral en esa dilución, pues se produjeron incontables UFP.
Las unidades formadoras de placa se reducen en función de la concentración de
propóleo; el efecto puede ser explicado según Maskova (1990) probablemente por el
lugar de intervención en el sistema de transcripción de la proteína, inhibiendo el fago en
la bacteria, pudiendo ser usado para la estandarización de propóleos y para la búsqueda
de sustancias purificadas originarias del propóleo con efecto antiviral.
Los resultados obtenidos permiten concluir que esta técnica in vitro con el fago Lambda,
es útil para determinar la actividad antiviral de los extractos etanólicos de propóleos
gracias a ser una prueba sencilla, rápida, económica y sensible. El modelo estudiado es
comparable con modelos en virus humanos (Maillard, 1996).
Es necesario realizar más experimentos con un número mayor de muestras de propóleo.
5.5 Conclusiones
El empleo del bacteriófago Lambda y de su célula huésped, resultó ser un método
sencillo, económico y reproducible para estimar la capacidad antiviral presente en los
EEP al 70%.
Esta prueba podría ser empleada como tamiz que permita seleccionar propóleos con
capacidad antiviral y permite además hacer un acercamiento del mayor o menor grado
de capacidad antiviral de los propóleos analizados. Se sugiere posteriores estudios que
permitan establecer correlaciones entre esta técnica rápida y otras de mayor
especificidad descritas para agentes virales particulares.
La técnica descrita contribuirá a futuro en la estandarización de los extractos etanólicos
de propóleos a nivel comercial que por su diversidad geográfica y seguramente botánica
presenta una alta variabilidad de sus componentes y por ende de su bioactividad y uso
terapéutico. Proporcionando una condición, en este caso actividad antiviral, para la
estandarización.
62 Título de la tesis o trabajo de investigación
5.6 Bibliografía
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6. Discusión, conclusiones y recomendaciones
6.1 Discusión
La investigación general contemplo la estandarización de protocolos de laboratorio para
la obtención de sólidos solubles totales de propóleos crudos, las concentraciones
mínimas inhibitorias para bacterias y hongos, de lisis parasitaria y de unidades
formadoras de placa para el modelo antiviral, que tuvieron en cuenta protocolos
internacionales y soporte de literatura científica.
Los resultados obtenidos corroboran la información reportada por países europeos y de
Sur América. Colombia ha venido avanzando en la investigación con propóleos desde
diferentes áreas del conocimiento reforzando los resultados de la presente investigación.
Se debe destacar que los sólidos solubles totales obtenidos de los propóleos crudos con
etanol al 96% presentaron una mayor concentración, los extractos etanólicos de propóleo
obtenidos presentaron una alta actividad antibacterial frente a B. subtilis y Klebsiela y la
actividad antifúngica frente a T. rubrum; por otro lado el bacteriófago en estudio presento
susceptibilidad a los propóleos evaluados.
6.2 Conclusiones
El estudio que se emprendió con el objetivo de dar aportes a la acción antibiótica de
propóleos como parámetros de evidencia para procesos de sellos de calidad, es de tipo
innovador en nuestro país desde el punto de vista de la cualificación microbiológica de
propóleos crudos y sus extractos, de zonas agroecológicas diferentes. Estudios alrededor
del mundo ya hace varios años han demostrado la eficiencia in vitro e in vivo, del
66 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones
de Colombia como aporte para la denominación de origen
producto de las abejas y con manifestaciones claras de comercio mundial en
aplicaciones terapéuticas.
Las metodologías empleadas en los ensayos experimentales son un aporte a la
estandarización de técnicas de laboratorio para la evaluación de este producto y
potencial servicio de extensión a la cadena productiva de las abejas y la apicultura en
Colombia; también permite realizar comparaciones con resultados en laboratorios de
instituciones de investigación fuera del país.
Correlacionar el efecto de los propóleos en los modelos biológicos incluidos en este
experimento (Bacterias, Hongos, Parasitos y Virus) permite concluir que la metodología
empleada para la extracción de propóleos es útil para la recuperación de compuestos
activos.
La estructura general del estudio permite en su ejecución la adquisición de competencias
de investigación en campo y laboratorio que permite a futuro el abordaje de propuestas
de investigación a futuro en este campo de conocimiento.
6.3 Recomendaciones
Existen para el país un número importante de publicaciones frente a la composición
fisicoquímica y actividad microbiológica de propóleos que permitiría realizar un análisis
estadístico multivariante, que permitiría establecer una base médica confiable de este
producto.
Se hace necesario para la apicultura colombina un estudio zonificado de producción de
propóleo crudo de calidad, la definición del origen botánico y de la composición química.
Que integre el eslabón primario, la industria y la investigación.
Los aportes de las investigaciones internacionales y nacionales permitirían proponer una
norma técnica para la obtención, extracción y estandarización de propóleos colombianos.
A. Anexo: Calidad microbiológica de propóleo crudo y sólidos solubles de extractos de propóleos de Apis mellifera en Colombia
68 Título de la tesis o trabajo de investigación
B. Anexo: Sólidos solubles totales de EEP
70 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro
regiones de Colombia como aporte para la denominación de origen
By: Boyaca, Cu: Cundinamarca, Sr: Santander.