REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE INGENIERÍA

DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRÍA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

“Actividad antimicrobiana de los compuestos producidos por Lactobacillus

acidophilus ATCC 4356 sobre microorganismos contaminantes de

alimentos”

Trabajo presentado por la Ing. Mawill Rodríguez Marval ante La Universidad del Zulia para optar al título de

Magister Scientarium en Ciencia y Tecnología de Alimentos

Maracaibo; marzo de 2003

REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE INGENIERÍA

DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRÍA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

“Actividad antimicrobiana de los compuestos producidos por Lactobacillus

acidophilus ATCC 4356 sobre microorganismos contaminantes de

alimentos”

Realizado por Ing. Mawill Rodríguez Marval

C.I. 12620142

Tutora: Prof. Gisela Páez

Maracaibo; marzo de 2003

Este jurado aprueba el Trabajo de Grado titulado “Actividad

antimicrobiana de los compuestos producidos por Lactobacillus

acidophilus ATCC 4356 sobre microorganismos contaminantes de los

alimentos”, que presenta la Ing. Mawill Rodríguez Marval al Consejo Técnico

de la División de Estudios para graduados de La Universidad del Zulia, en

cumplimiento con los requisitos señalados en el artículo 51, aparte 51.6,

sección segunda, capítulo III del Reglamento de Estudios para Graduados,

para optar por el título de Magister Scientiarium en Ciencia y Tecnología de

Alimentos.

Maracaibo, marzo de 2003

Jurado:

__________________________________________

Prof. Gisela Páez

__________________________________________

Profa. Zulay Mármol

__________________________________________

Prof. José R. Ferrer

__________________________________________

Prof. Carlos Rincón

Director de Postgrado

I

AGRADECIMIENTO

Quiero expresar mi más profundo agradecimiento a todas las

personas e instituciones que de alguna manera colaboraron en la exitosa

culminación de este Trabajo de Grado.

A La Universidad del Zulia.

A FUNDADESARROLLO, por el financiamiento de mi Becaría.

A la Profesora Gisela Páez quien siempre ha tenido confianza en mi y

me animó cuando pensé que las cosas no salían bien. Gracias por todo,

especialmente por hacerme sentir como “estrella”.

A todas las personas del Laboratorio de Tecnología de Alimentos y

Fermentaciones Industriales. Todos los tesistas: Jasmín, Kena, Mireya.

Niohelis, David, Ronald, Ninoska, Karen y Eleana. Gracias a todos no sólo por

su colaboración con mi trabajo, sino también por construir momentos tan

agradables a pesar de las limitaciones y las circunstancias. A los profesores

del Laboratorio: José Ferrer, Cynthia Chandler, Zulay Mármol, Karelen Araujo

y a la Sra Bárbara.

A Eduardo y Marisela que siempre están allí no sólo con la respuesta,

sino también con el consejo.

Al Personal del laboratorio de Tecnología de Lácteos de la Facultad de

Veterinaria.

Al Sr. Edinson y Venelácteos por suministrar el suero de leche y

hacerlo con las ganas de ayudar de siempre.

A las Prof. Sofia de Valero y Luzmila Meza de la Facultad de Medicina

por su asesoría en la parte experimental.

A todos muchas gracias!!!

Mawill

DEDICATORIA

II

“Es justamente la posibilidad de realizar los sueños lo que hace la vida

interesante; … seas quien seas o hagas lo que hagas, cuando deseas con

firmeza alguna cosa, es porque este deseo nació en el alma del Universo. Es

tu misión en la tierra …. Y cuando quieres algo, todo el Universo conspira

para que realices tu deseo … La gente siempre está en condiciones de realizar

lo que sueña.”

Paulo Coelho en “El Alquimista”

Este trabajo está dedicado a todas esas personas que han creído en mi y que

me han ayudado a cumplir mis sueños; a todos aquellos con su amor y apoyo

han estado allí para mí, y se alegran conmigo cuando yo soy feliz y me

ayudan cada día a no desistir de mi “Leyenda Personal”.

A Dios quien ha sido bueno y generoso conmigo… siempre.

A Crispina, quien es la más feliz de todos por cada uno de mis éxitos.

A María y William, por su apoyo, su amor incondicional y su enorme

paciencia

A Melissa y Marcel, a quienes quiero ver cumplir todos sus sueños y a

quienes pretendo inspirar para seguir adelante y darse cuenta que vale la

pena el esfuerzo.

A Harvey, por su amor, paciencia, comprensión y apoyo en todos mis

proyectos.

A mis amigos de siempre… Gracias por tantos momentos de alegría.

RESUMEN

III

Rodríguez, Mawill. “Actividad antimicrobiana de los compuestos producidos por Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 sobre microorganismos contaminantes de los alimentos” Trabajo de Grado. La Universidad del Zulia. Facultad de Ingeniería. Laboratorios de Tecnología de Alimentos y Fermentaciones Industriales. Maracaibo, 2003

Se estudió la actividad antimicrobiana de los compuestos producidos por Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 sobre microorganismos contaminantes de los alimentos. Como medio de crecimiento para Lacobacillus acidophilus se emplearon caldo MRS y lactosuero suplementado con 0,3% p/v de extracto de levadura y 0,15% de peptona trípsica. Las fermentaciones se realizaron en erlenmeyers de 500 ml de capacidad a 37 ºC y pH 6,0 no controlado, 20% de inóculo y agitación de 50 rpm y sin agitación. Se evaluó el efecto de los dos medios de crecimiento, caldo MRS y lactosuero suplementado, y de la agitación sobre la constante específica de crecimiento () y la concentración de biomasa final (X

f). La detección de la actividad

antimicrobiana se llevó a cabo mediante la técnica de la difusión en el agar y la técnica de la difusión en el agar modificada, utilizando como microorganismos indicadores cepas de Candida, Kluyveromyces y Lactobacillus creciendo en caldo YM en el caso de las levaduras y caldo MRS en el caso de los lactobacilos. La máxima concentración de biomasa final se obtuvo en lactosuero suplementado sin agitación (2,9694 ± 0,2892 Kg/m3). La máxima velocidad de crecimiento se produjo en caldo MRS con 50 rpm de agitación (0,2131 ± 0,0192 h-1). No se detectó actividad antimicrobiana a ningún nivel sobre las cepas indicadoras utilizadas mediante las técnicas de análisis empleadas, posiblemente debido a la sensibilidad de la técnica.

Palabras clave: actividad antimicrobiana, Lactobacillus acidophilus,

microorganismos deterioradores

ABSTRACT

Rodríguez, Mawill. “Antimicrobial activity of compounds produced by

IV

University of Zulia. Faculty of Engineering. Food Technology and Industrial Fermentations Laboratories. Maracaibo 2003

Antimicrobian activity of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 against foodborne microorganism was studied. Lactobacillus acidophilus was grown in MRS broth and supplemented whey with 0,3% of yeast extract and 0,15% of peptone. Fermentation were carried out in 500 ml flasks at 37ºC and uncontrolled pH 6,O, 20% of inoculum, 50 rpm agitation and without agitation. The effect of the medium and agitation over specific growth rate () and biomass final concentration (X

f). Antimicrobial activity detection was

carried out using the agar diffusion assay and the agar diffusion assay modified, using strains of Candida, Kluyveromyces and Lactobacillus as indicator microorganisms. Indicator microorganisms were grown in MRS broth (lactobacillus) and YM broth (yeasts). Maximum biomas final concentration was obtained in supplemented whey without agitation (0, 9694 ± 0,2892 Kg/m3) and maximum specific growth rate was obtained in MRS broth at 50 rpm (0,2131± 0,092 h-1). Antimicrobial activity was not detected with the assays using in this study over any of the indicator microorganism, maybe because of the sensibility of the technique.

Key words: antimicrobial activity, Lactobacillus acidophilus, food

borne microorganism

ÍNDICE GENERAL

Pág.

V

Página de aprobación I

Agradecimiento II

Dedicatoria III

Resumen IV

Abstract V

índice de figuras VIII

índice de tablas IX

Introducción 1

Capítulo I. Revisión bibliográfica

1.1. Antecedentes históricos del uso de las bacterias ácido

lácticas (BAL) en la preservación de alimentos 5

1.2. Sustancias con actividad antimicrobiana de las

bacterias ácido lácticas y su uso como preservativos en

alimentos 6

1.2.1. Peróxido de hidrógeno 6

1.2.2. Diacetil 7

1.2.3. Reuterina 9

1.2.4. Dióxido de carbono 9

1.2.5. Productos finales de procesos de fermentación 10

1.2.6. Bacteriocinas 11

1.2.6.1. Definición 11

1.2.6.2. Clasificación 11

1.2.6.3. Diferencias entre las bacteriocinas y

los antibióticos 12

1.2.6.4. Mecanismo de acción 13

1.2.6.5. Usos 14

1.2.6.6. Consideraciones sobre la salud 16

1.3 Bacterias ácido lácticas y levaduras como

microorganismos contaminantes de los alimentos. 17

1.4. El Lactobacillus acidophilus 21

VI

1.4.1. Potencial terapéutico y beneficios a la salud

del Lactobacillus acidophilus 20

1.4.2. Bacteriocinas producidas por Lactobacillus

acidophilus 23

1.5. Suero de leche 24

1.5.1. Generalidades y composición 24

1.5.2. Usos del suero de leche 25

Capítulo II. Procedimiento Experimental

2.1. Materiales 30

2.1.1. Microorganismos 30

2.1.2. Medios de mantenimiento 30

2.2. Ultrafiltración y suplementación del lactosuero 30

2.3. Métodos de análisis 31

2.3.1. Nitrógeno 31

2.3.2. Proteína 31

2.3.3. Lactosa 31

2.3.4. Humedad 31

2.3.5. Biomasa 31

2.3.6. Actividad antimicrobiana 32

2.4. Fermentaciones 33

Capítulo III. Resultados y discusión 34

Capítulo IV. Conclusiones 46

Referencias bibliográficas 48

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Pág.

VII

Figura 1. Mecanismos para la generación de peróxido de hidrógeno 7

Figura 2. Curvas de crecimiento del Lactobacillus acidophilus ATCC

4356 a pH 6,0 y 37 ºC 36

Figura 3. Determinación de la velocidad específica de crecimiento del

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 a pH 6,0 y 37 ºC 37

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla Pág.

VIII

IX

Tabla 1. Diferencias entre los antibióticos y las bacteriocinas 12

Tabla 2. Levaduras y bacterias ácido lácticas existentes en los alimentos 18

Tabla 3. Utilización del lactosuero 28

Tabla 4. Composición porcentual promedio del lactosuero fresco y desproteinizado 35

Tabla 5. Velocidad específica de crecimiento () del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 a 37 ºC y pH 6,0 39

Tabla 6. Concentraciones de biomas finales (Xf) obtenidas durante el

crecimiento de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 a 37 ºC y pH 6,0 39

Tabla 7. Detección de la actividad inhibitoria del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 mediante la técnica de la difusión en el agar 41

Tabla 8. Detección de la actividad inhibitoria del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 mediante la técnica de la difusión en el agar modificada 44

INTRODUCCIÓN

El Lactobacillus acidophilus, es una bacteria acidoláctica que produce

diversos metabolitos con actividad antimicrobiana, tales como peróxido de

hidrógeno y bacteriocinas, capaces de inhibir el crecimiento de cepas de los

géneros Kluyveromyces, Candida, Cladosporium (Plockova, Chumuchalova, y

Tomanova, 1997) y otros Lactobacillus (Kawai, Saito, Uemura, y Itoh, 1997;

Lewus, y Montville, 1991). Este microorganismo tiene la capacidad de crecer en

medios a base de suero de leche (Dave y Shah 1998), por lo cual este desecho

puede utilizarse como medio de cultivo para la producción de esos

metabolitos; la utilización del suero de leche como medio de crecimiento,

resulta en una disminución de su potencial contaminante, en el

aprovechamiento de sus componentes de alto valor biológico (como la lactosa

y las proteínas) y en la generación de productos tales como bebidas

fermentadas, ácidos orgánicos (Oberto y Carrasqueño, 1986), proteína

unicelular y sustancias con actividad antimicrobiana que pueden ser utilizadas

como preservativos contra el desarrollo de microorganismos contaminantes de

los alimentos.

En Venezuela y especialmente en la región zuliana, se cuenta con

cantidades importantes de suero de leche, un subproducto de la fabricación

de queso; la eliminación de este se ha convertido en uno de los problemas de

mayor importancia desde el punto de vista industrial y de la salud pública, ya

que el suero posee una Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) de 4000 –

4800 ppm (Scott, 1991), convirtiéndolo en un poluente de elevado potencial

contaminante cuando se descarga en corrientes y reservorios de agua.

Para el año 1999, se produjeron en el Estado Zulia 91346542 L de

suero de leche (Ministerio de la Producción y el Comercio, 1999). Sin embargo,

sólo una pequeña fracción de este gran total es aprovechado principalmente

como alimento animal y suplemento alimenticio. El resto es dispuesto en los

1

suelos y cuerpos de agua, lo que representa un grave problema de

contaminación; por estas razones resulta importante y necesario diseñar

sistemas de disposición y utilización de este subproducto, que en nuestra

región es vertido principalmente en las aguas del Lago de Maracaibo,

aumentado los niveles de contaminación de este estuario.

Debido a la elevada incidencia de levaduras y mohos en los productos

lácteos y tomando en cuenta el peligro que representa la contaminación de

alimentos con micotoxinas, resulta importante la búsqueda de cepas de uso

seguro que produzcan compuestos inhibidores del crecimiento de esos

microorganismos. Una cepa reconocida como de uso seguro es el Lactobacillus

acidophilus ATCC 4356, la cual es utilizada ampliamente en la elaboración de

alimentos fermentados tales como el yogurt y actualmente es reconocido como

“probiótico”. (Lindgren y Dobrogosz, 1990; Mital y Satyendra, 1995)

La bioconversión del suero de leche para producir compuestos con

actividad antimicrobiana partir del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356,

permite producir biopreservativos usando una materia prima muy económica,

al mismo tiempo que disminuye el potencial contaminante del suero. Las

sustancias con actividad antimicrobiana obtenidas a partir de este proceso

pueden utilizarse como preservativos alimenticios en sustitución de los

sulfitos, nitritos, parabenos y diacetatos, lo cual se corresponde con los

intereses de los consumidores que actualmente exigen alimentos procesados

más seguros. Por ejemplo, se conoce que algunas levaduras del género

Candida son capaces de resistir y adicionalmente atacar conservadores tales

como el ácido benzóico y ácido sórbico, los cuales son utilizados en la

industria de las bebidas alcohólicas (Mossell y Moreno, 1982).

Tradicionalmente los antibióticos como la nistatina y la anfotericina se utilizan

para combatir las infecciones por Candida en humanos (Leveau y Bouix, 2000).

Sin embargo estos compuestos no pueden ser utilizados como preservativos

alimentarios.

2

3

El objetivo de este trabajo es determinar si el Lactobacillus acidophilus

ATCC 4356 es capaz de producir, durante su crecimiento en suero de leche y

caldo MRS, compuestos con actividad inhibitoria del desarrollo de

microorganismos contaminantes de los alimentos de los géneros

Kluyveromyces, Candida y Lactobacillus.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1. Antecedentes históricos del uso de las bacterias acidolácticas

(BAL) en la preservación de alimentos

Las bacterias ácido lácticas (BAL) han sido utilizadas en la producción

de alimentos fermentados durante varios siglos; esto ha sido posible ya que

estos microorganismos poseen un efectivo sistema enzimático que les

permite la degradación de los componentes de la leche y otros alimentos

(lactosa, proteínas, lípidos, citrato, etc.), produciendo metabolitos que alteran

el olor y la textura de los alimentos, así como varios metabolitos secundarios.

Ambos, los metabolitos primarios y secundarios, pueden poseer carácter

antimicrobiano (Lindgren y Dobrogosz, 1990).

Históricamente, la preservación de alimentos mediante la

fermentación ácido láctica ha sido un proceso empírico, en el cual se

observaron los cambios en los alimentos que generaban alimentos diferentes

con cualidades de conservación mejoradas. Existe una amplia variedad de

alimentos crudos que son preservados a través de la fermentación ácido

láctica, los cuales incluyen la leche, carnes, frutas, vegetales y piensos

(Lindgren y Dobrogosz).

A pesar de que los alimentos fermentados son conocidos desde la

antigüedad, la observación de que ciertos microorganismos son responsables

del efecto preservativo no se conoció de manera general sino hasta

comienzos del siglo XIX. Las primeras investigaciones confirmaron que la

preservación de los alimentos fermentados se debía al efecto acidificante que

ciertas bacterias le impartían a los alimentos por la conversión de los

azúcares en ácidos orgánicos. Las acciones de preservación que estos

microorganismos imparten a los alimentos son principalmente la disminución

del pH y la remoción de grandes cantidades de carbohidratos por

fermentación. Sin embargo, es también reconocido que las BAL son capaces

de producir sustancias inhibitorias además de ácidos orgánicos, que son

5

antagónicas hacia otros microorganismos (Lindgren y Dobrogosz; Mital y

Satyendra, 1995; Kawai et al., 1997; Plockova et al. 1997). Estas sustancias

son producidas en cantidades mucho menores e incluyen el peróxido de

hidrógeno, diacetilo, bacteriocinas y productos de reacciones secundarias

(por ejemplo, el hipotiocianato generado por la acción de la lactoperoxidasa

sobre el peróxido de hidrógeno y el tiocianato). Otros metabolitos que

pueden producirse, especialmente durante procesos heterofermentativos y

que pueden presentar actividad antagónica son el ácido fórmico, acetoín y

2,3-butanediol (Lindgren y Dobrogosz).

Se cree que las bacteriocinas son importantes en la habilidad de las

BAL de competir en ecosistemas no fermentativos tales como el intestino

humano (Lindgren y Dobrogosz). Durante las décadas pasadas se ha

incrementado el interés por el uso de la actividad antagónica de las BAL para

extender la vida útil de alimentos ricos en proteínas tales como pescados y

carnes.

1.2. Sustancias con actividad antimicrobiana de las bacterias ácido

lácticas y su uso como preservativos en alimentos

1.2.1. Peróxido de hidrógeno

El peróxido de hidrógeno es uno de los principales metabolitos

producidos por los lactobacilos durante su crecimiento, el cual puede ser

generado a través de diferentes mecanismos (Figura 1). Usualmente es

producido por la reducción directa del oxígeno, a través de una reacción

catalizada por la -glicerolfostato oxidasa o por la lactato oxidasa. (Mital y

Satyendra, 1995).

6

Piruvato + O2 + PO

4

3- Acetilfosfato + CO2 + H

2O

2piruvato oxidasa

Lactato + O2

L-lactato oxidasaPiruvato + H

2O

2

Lactato + O2 Piruvato + H

2O

2

NAD-independienteD-lactato deshidrogenasa

NADH oxidasaNAD + H

2O

2NADH + H+ + O

2

Figura 1: Mecanismos de generación de peróxido de hidrógeno

por bacterias ácido lácticas

La acumulación de peróxido de hidrógeno en el medio de crecimiento

se debe a que los lactobacilos no poseen la enzima catalasa (Daeschel,

1998). Esta acumulación puede alcanzar niveles capaces de inhibir el

crecimiento de otros microorganismos, ya que el H2O

2 es un compuesto

citotóxico debido a su capacidad para generar redicales hidroxil activos, los

cuales tienen un efecto fuertemente oxidante. (Mital y Satyendra). Otro efecto

producido por el peróxido de hidrógeno es la destrucción de las estructuras

básicas de las proteínas de las células. (Lindgren y Dobrogosz).

El peróxido de hidrógeno puede reaccionar con otros componentes

para formar sustancias inhibitorias. En la leche cruda, el peróxido de

hidrógeno generado por las bacterias ácido lácticas puede oxidar el

tiocianato endógeno, reacción que es catalizada por la lactoperoxidasa para

formar productos intermediarios de oxidación, los cuales tienen capacidad

inhibitoria hacia algunos microorganismos patógenos y deterioradores de los

alimentos. Este proceso se conoce como “sistema antibacterial de la

7

lactoperoxidasa” (LPS, por sus siglas en inglés), o “sistema lactoperoxidasa

tiocianato” (Mital y Satyendra), y ciertos estudios han indicado que este

sistema puede ser útil para extender la vida útil de la leche cruda no

refrigerada (Daeschel, 1998; Rodríguez, Tomillo, Núñez y Medina, 1997). El

efecto del LPS es muy variable; las bacterias Gram-positivas, incluyendo las

bacterias ácido lácticas, son mínimamente afectadas por el LPS, mientras que

bacterias Gram-negativas tales como Escherichia coli, Salmonella y

Pseudomonas son muy sensibles. El mecanismo antibacterial del LPS es

complejo y el mayor efecto ha sido atribuido a la oxidación de los grupos

SH- en enzimas vitales para el metabolismo, como la hexoquinasa, aldolasa y

la gliceraldehido-3 fosfato deshidrogenasa. (Lindgren y Dobrogosz).

La producción de peróxido de hidrógeno por las BAL depende no

solamente de la disponibilidad de oxígeno, sino también de la cepa en

particular (Lindaren y Dobrogosz). Su actividad antimicrobiana ha sido bien

reconocida y documentada. Su formación, acumulación y subsiguiente acción

antagonista ha sido demostrada contra especies tales como Staphylococcus

aureus, Pseudomonas sp. (Daeschel, 1998). Candida, Penicillium, y

Alternaria (Paraje, Albesa y Eraso, 2000).

1.2.2. Diacetil

El diacetil (2,3-butadieno) el un producto final del metabolismo de

las bacterias ácido lácticas, el cual es sintetizado a partir del piruvato. El

diacetil es bien conocido por su aroma a mantequilla, característico de los

productos lácteos (Lindgren y Dobrogosz); también es bien conocido por su

actividad antimicrobiana ya que tiene actividad inhibitoria a niveles de

200g/ml hacia levaduras y bacterias Gram-negativas, y a niveles de

300g/ml hacia bacterias no lácticas Gram-positivas (Daeschel)

A pesar de que el diacetil está ampliamente reconocido como seguro,

su utilidad como preservativo está limitada debido a las grandes cantidades

que se requieren para proveer efecto preservador, además de que su intenso

8

aroma no permite su uso en algunos alimentos. Su uso es recomendado para

la limpieza de superficies de trabajo debido a su alta volatilidad (Daeschel)

1.2.3. Reuterina

Se cree que la reuterina es un producto de bajo peso molecular, no

protéico, altamente soluble y de pH neutro producido por las especies

heterofermentativas Lactobacillus reuterii. Este compuesto ha sido descrito

como un agente antimicrobial de amplio espectro, el cual es activo contra

ciertas bacterias Gram-positivas y Gram-megativas, levaduras, hongos y

protozoarios. Algunos microorganismos de significación para la salud pública

que son inhibidos por la reuterina son Salmonella, Shiguella, Clostridium,

Staphilococcus, Listeria, Candida y Tripanosoma. Los lactobacilos

productores de reuterina pueden tener aplicación en la conservación de

alimentos humanos y animales, al reducir la carga de microorganismos

deterioradores de los mismos (Daeschel).

1.2.4. Dióxido de carbono

El dióxido de carbono es el resultado de la respiración endógena de

las células. La influencia del CO2 en la preservación de productos alimenticios

se debe a dos razones. Primero, juega un papel en la creación de un ambiente

anaeróbico remplazando el oxígeno molecular existente en el producto. En

segundo lugar, el CO2 en si mismo posee actividad antimicrobiana. El rol

protector del CO2 es especialmente importante en la fermentación de piensos

y vegetales para prevenir el crecimiento de mohos (Lindgren y Dobrogosz).

El CO2 en bajas concentraciones puede estimular el crecimiento de

algunos microorganismos, mientras que en altas concentraciones previene el

crecimiento de otros. La sensibilidad puede variar considerablemente, e

incluso existen microorganismos que no son sensibles al CO2 a ningún nivel

de concentración (Lindgren y Dobrogosz ).

9

Existen dos explicaciones acerca del mecanismo de acción del CO2;

uno implica la inhibición de las descarboxilaciones enzimáticas y el otro

apunta hacia la acumulación del CO2 en la membrana lipídica, lo cual resulta

en una disfunción en la permeabilidad de la misma (Lindgren y Dobrogosz).

1.2.5. Productos finales de procesos de fermentación

La acumulación de productos finales ácidos incrementa la actividad

antimicrobiana en los productos fermentados. La producción de ácido y la

correspondiente disminución del pH prolongan la fase de adaptación de los

microorganismos sensibles. Se han definido tres factores importantes para la

acción preservativa por sustancias ácidas: (1) el efecto del pH, (2) el alcance

de la disociación del ácido y (3) un efecto específico de la molécula de ácido

en si misma. La actividad antimicrobiana de los ácidos orgánicos de más de

cuatro carbonos generalmente se incrementa a un pH constante a medida

que aumenta la longitud de la cadena. Sin embargo, debido a su baja

solubilidad en agua, los ácidos de cadenas largas mayores de C10

o C11 no son

particularmente eficientes con respecto a la actividad antimicrobiana, y

aquellos cuyas cadenas son mayores de C8 son usualmente inefectivos contra

bacterias Gram-negativas. Los ácidos lipofílicos tales como el acético y el

láctico en sus formas no disociadas pueden penetrar la célula microbiana e

interferir con las funciones metabólicas esenciales tales como translocaciones

del sustrato y fosforilación oxidativa, y reducir el pH intracelular (Lindgren y

Dobrogosz).

El ácido acético ha sido reportado de producir mayor inhibición que el

ácido láctico, especialmente contra levaduras y mohos. Esto se debe al

alcance de la disociación, ya que el ácido acético posee entre dos y cuatro

veces más ácido en el estado no disociado comparado con el ácido láctico, en

un intervalo de pH de 4,0 a 4,6.

1.2. 6. Bacteriocinas

10

1.2.6.1. Definición

Las bacteriocinas son varias clases de pequeños péptidos que son

producidos naturalmente por varias clases de microorganismos, con efecto

antimicrobiano, efectivos generalmente contra especies cercanamente

relacionadas (Brink, Minekus, Van der Vossen, Leer y in’t Veld, 1994). Por

definición todas las bacteriocinas poseen una proteína o componente

protéico que es esencial para su acción antimicrobiana (Jack, Tagg y Ray,

1995), pero ciertos análisis químicos demuestran que algunas bacteriocinas

son moléculas complejas formadas por combinaciones de varias proteínas o

por la adición de lípidos y/o carbohidratos al componente protéico (Burianek

y Yousef, 2000).

1.2.6.2. Clasificación

Las bacteriocinas se agrupan en cuatro clases:

Clase I o lantabióticos

Son moléculas pequeñas (< 5 kDa), encapsuladas y que

presentan un amplio espectro de acción, dentro de este grupo la

nisina es la más conocida. Pueden ser producidas por bacterias no

ácido lácticas. Son generalmente producidas al final de la fase

logarítmica de crecimiento. Su nombre se deriva del hecho de que este

tipo de bacteriocinas contienen lantionina, -metil lantionina y

residuos deshidratados (Burianek y Yousef 2000).

Clase II

Incluye péptidos pequeños (< 10 kDa), estables al calor (80 –

120ºC), no contienen lantionina y contienen un péptido activo en la

membrana (Burianek y Yousef).

Clase III

11

Son moléculas largas (> 30 kDa), estables al calor ((Burianek y

Yousef).

Clase IV

Son moléculas grandes de proteínas o de compuestos de

proteínas con otros factores como carbohidratos o lípidos, que son

necesarios para la funcionalidad de la molécula

1.2.6.3. Diferencias entre las bacteriocinas y los antibióticos

Tabla 1: Diferencias entre las bacteriocinas y los antibióticos.

Bacteriocinas Antibióticos

Síntesis ribosómica

Existe un gen precursor que ha podido ser clonado y secuenciado

No son utilizadas para tratar o inhibir enfermedades infecciosas

Son utilizadas como preservativos en alimentos

No producen sensibilización, son atóxicas e inocuas

Son producidas por muchas bacterias

Síntesis enzimática.

Su estructura proviene de la síntesis enzimática por diferentes vías metabólicas

Se utilizan para inhibir o tratar enfermedades

Su uso como preservativo en alimentos no está permitido

Producen sensibilización, pueden ser tóxicos

Son producidos por pocos microorganismos

1.2.6.4. Mecanismo de acción de las bacteriocinas

12

La acción antimicrobiana de las bacteriocinas está asociada a la

despolimerización de los componentes de la membrana celular, lo cual

conduce a la salida de los componentes celulares y a la pérdida del potencial

a través de la membrana.

Sin embargo, las bacteriocinas presentan diferencias en cuanto a su

mecanismo de acción de acuerdo al microorganismo por el cual son

producidas. Así se tiene que las moléculas de bacteriocinas producidas por

los lactococos, son transportadas en el interior de la célula como péptidos

inactivos, los cuales contienen un extremo N-terminal en la secuencia líder

del péptido y C-terminal en el propéptido, siendo removido el péptido líder

por una peptidasa específica, dando origen al propéptido (Adams y Moss

1997). Se requiere de otras modificaciones antes de que los propéptidos sean

convertidos en moléculas activas, tal como la formación de la lantionina en el

caso de la nisina. Las moléculas activas de bacteriocinas son segregadas

desde el interior al medio a valores de pH 5,0 o superior. Las moléculas

tienen carga positiva y tienen la tendencia de formar agregados.

En general, la acción bacteriocida de las bacteriocinas que no

contienen lantionina contra las células sensibles es producida principalmente

por la desestabilización de las funciones de la membrana, más que por la

pérdida de la integridad de la estructura de la misma. Este efecto es el

resultado de la disipación de la fuerza impulsora del protón y pérdida de la

permeabilidad de la barrera independientemente de la energía, en contraste

con la acción dependiente de la energía de las bacteriocinas que contienen

lantionina (Burianek y Yousef).

Ambos tipos de bacteriocinas parecen afectar la permeabilidad de la

membrana por la formación de canales llenos de agua o poros,

probablemente por un mecanismo de ataque a la membrana. Adicionalmente,

previo a la formación de los poros, todas las bacteriocinas que no contienen

lantionina parecen interactuar con los receptores de proteínas asociados a la

13

membrana, otra vez en contraste directo con lo que ocurre con las

bacteriocinas que si contienen lantionina, las cuales no tienen ese

requerimiento (Jack et al., 1995).

Las cepas productoras de bacteriocinas poseen un gen de inmunidad

que parece producir proteínas de inmunidad específica que previenen la

formación de poros en la célula productora a través de un mecanismo que

hasta ahora no ha sido aclarado. Sin embargo este mecanismo debe estar

acompañado por un escudo de los receptores de proteínas, o por una

interacción competitiva con las moléculas de bacteriocinas o por un bloqueo

de los poros (Jack et al.; Entian y de Vos, 1996).

Las colonias sensibles difieren en el grado de sensibilidad hacia una

bacteriocina específica. Las bacterias Gram-negativas son resistentes a la

nisina y a la pediocina AcH, pero si se exponen a condiciones de estrés tales

como congelamiento, secado, tratamiento con EDTA o ácido, se pueden hacer

susceptibles a estas bacteriocinas. Las células subletalmente estresadas, con

una membrana externa lesionada, probablemente permiten la entrada de la

molécula de bacteriocina a su interior estableciendo contacto con la

membrana citoplasmática y desestabilizando sus funciones.

Las bacteriocinas producidas por los miembros del género

Lactobacillus generalmente tienen espectro de acción reducido o limitado y

usualmente actúan contra los miembros de la familia Lactobacillaceae. Su

acción es generalmente bactericida.

1.2.6.5. Usos de las bacteriocinas

Las investigaciones sobre bacteriocinas producidas por BAL han

aumentado en las últimas décadas, en la medida que han surgido varias

aplicaciones potenciales muy interesantes:

1. Las bacteriocinas de los microorganismos productores pueden

utilizarse como preservativos

14

2. Las determinantes genéticas para la producción de las bacteriocinas

y para la inmunidad del microorganismo productor, pueden utilizarse en la

producción de vectores para ser usados a nivel de alimentos, mejorando así

las cepas mediante el uso de la tecnología del ADN y

3. La producción de bacteriocinas puede utilizarse en estudios

taxonómicos.

En vista de la creciente demanda de los consumidores por

preservativos naturales, la mayor parte de la investigación está enfocada en la

primera posibilidad.

Existen varias estrategias posibles para la aplicación de las

bacteriocinas en la biopreservación de alimentos. Por una parte es posible la

inoculación de los alimentos con bacterias ácido lácticas (cultivos iniciadores)

que produzcan la bacteriocina en el producto (producción in situ). También

es posible agregar la bacteriocina purificada o semipurificada como

preservativo alimentario (Milo, 2000), o el uso de un producto previamente

fermentado con una cepa productora de bacteriocina como un ingrediente en

el procesamiento de alimentos (Schillinger, Geisen y Holzapfel, 1996).

Existen varios factores que afectan la producción de bacteriocinas por

las bacterias ácido lácticas (Schillinger et al., 1996), entre los cuales podemos

citar:

1. Inadecuadas condiciones ambientales (pH, temperatura, nutrientes,

etc.) para la producción de bacteriocinas

2. Pérdida espontánea de la capacidad de producción

3. Infección por fagos

4. Antagonismo con otros microorganismos presentes en el alimento

Adicionalmente existen factores que pueden afectar que interfieren

con la actividad de las bacteriocinas ya producidas:

15

1. Bacterias patógenas o deteriorativas emergentes resistentes a las

bacteriocinas

2. Condiciones que desestabilizan la actividad biológica de proteínas

como proteasas y procesos de oxidación.

3. Enlazamiento a componentes del alimento tales como partículas de

grasa y superficies protéicas

4. Inactivación por otros aditivos

5. Baja solubilidad de la bacteriocina que ocasiona una desigual

distribución en el alimento

6. Efecto del pH sobre la estabilidad y actividad de la bacteriocina

1.2.6.6. Consideraciones sobre la seguridad

El uso intencional o incidental de BAL en la producción de alimentos

fermentados se ha considerado como un proceso seguro ya que se carece de

evidencia que demuestre lo contrario. Por lo tanto es razonable asumir que

las sustancias antimicrobianas producidas por las BAL a los niveles

encontrados en los alimentos fermentados son seguras cuando se ingieren

como parte del alimento en el cual son producidas.

La nisina (cuyo nombre deriva de “group N inhibitory susbtance”), es la

única bacteriocina aprobada para su uso como preservativo en alimentos.

Esto se logró en U.S.A. en 1988, sólo después de 25 años de uso seguro en

varios países europeos. Se utiliza como agente inhibidor del crecimiento de

esporas de C. botulinum y la formación de toxinas en ciertos quesos

pasteurizados (Daeschel). El uso de la nisina en la preservación de alimentos

se considera seguro en más de 50 países alrededor del mundo e incluso hay

investigaciones que señalan su uso para controlar úlceras en humanos y

combatir infecciones como la mastitis en ganado (Delves-Broughton,

Blackburn, Evans, y Hugenholtz, 1996).

16

1.3. Bacterias ácido lácticas y levaduras como microorganismos

contaminantes de los alimentos.

Los microorganismos existentes en un alimento proceden tanto de la

microflora propia de la materia prima como de los microorganismos

introducidos durante las operaciones de recolección, sacrificio, tratamiento,

almacenamiento y distribución. En la mayoría de los casos, esta microflora no

ejerce un efecto aparente por lo que el alimento es consumido sin reparos y

sin consecuencias adversas. No obstante, algunas veces los microorganismos

manifiestan su presencia en una de las siguientes formas (Adams y Moss,

1997):

1. Causan alteración;

2. Causan una enfermedad transmitida por el alimento;

3. Transforman las propiedades de un alimento de una forma

beneficiosa, como es el caso de los alimentos fermentados.

En la actualidad se conoce que las condiciones del tratamiento y del

almacenamiento crean un medio en el que pueden prosperar determinados

tipos de organismos. La inmensa mayoría de los alimentos fermentados es

producida por la actividad de bacterias acidolácticas y de hongos,

principalmente levaduras pero también, aunque en menor medida, por

mohos. Ambos grupos de organismos comparten un nicho ecológico común,

siendo capaces de crecer bajo condiciones de pH bajo y actividad de agua

reducida, aunque en anaerobiosis sólo prosperarán las bacterias ácido

lácticas y las levaduras facultativas. En consecuencia, con frecuencia estos

organismos se hallan juntos en los alimentos fermentados; en algunos casos

representantes de ambos grupos actúan conjuntamente para producir un

determinado producto mientras que en otros, uno de los grupos desempeña

la función de organismo causante de alteración. En la Tabla 2 se presentan

algunos ejemplos de estos últimos (Adams y Moss).

17

Tabla 2: Levaduras y bacterias acidolácticas existentes en

diferentes alimentos

Levaduras1 Bacterias acidolácticas2 Levaduras y bacterias ácido lácticas

Cervezas europeas actuales

Pan

Vino

Sidra

Yogur

Chucruta

Salami

Queso

Pan de masa ácida

Kefir

Salsa de soja

Cervezas africanas

Cerveza Lambic 1La presencia de bacterias ácido lácticas con frecuencia va acompañada de alteración 2La presencia de levaduras con frecuencia va acompañada de alteración

En general, las levaduras se encuentran en diversos alimentos, como

un ingrediente o como contaminante. En este último caso, se produce una

fermentación no deseada de los azúcares del alimento, lo cual no sólo

deteriora el producto, dándole un sabor “alcohólico”, sino que también puede

ser peligroso, ya que la fermentación genera dióxido de carbono, capaz de

presurizar las botellas y otros envases hasta hacerlos explotar (Berger y Welt,

2001; The Society of Food Higiene Technology, 2003)

Las levaduras del género Kluyveromyces se encuentran en diversos

alimentos tales como frutas, conservas, maíz, leche y productos lácteos en

general (Banwart, 1981). Las especies capaces de fermentar la lactosa tales

como K. lactis y K. fragilis (Quintero et al., 2001; Montiel et al., 2000) se

encuentran en los productos lácteos y producen CO2, etanol y acetaldehído

(Müller, 1981). También se encuentran presentes, en gran proporción, en la

flora de los granos de kefir (Simova et al., 2002). Algunas especies son

osmofílicas y otras son capaces de sobrevivir en pulpa de frutas congeladas

(Trindade, Resende, Silva, y Rosa, 2002).

Las levaduras del género Candida se encuentran ampliamente

dispersas en la naturaleza. La C.albicans se encuentra en animales y humanos

y se presume que su presencia en otros ambientes es provocada por la

18

contaminación a partir de estos (Baker, 1997). Esta levadura ha sido aislada

de hojas de plantas, flores, agua y suelos. Se ha reportado como causa

común de infecciones en la superficie de la piel, boca y vagina. Las células de

este microorganismo generalmente no son transportadas por el aire y se

consideran componentes normales de las mucosas de la boca y otras

membranas del cuerpo. La mayoría de las infecciones por esta levadura

ocurren después de tratamientos prolongados con antibióticos o esteroides.

La C. krusei es uno de los microorganismos responsables de la

fermentación del cacao, y ha sido aislada de cerveza, productos lácteos y

salmueras (Micology OnLine, 2003). También ha sido encontrada en el aire,

hombre y otros mamíferos.

La C. parasilopsis se encuentra en humanos y otros mamíferos, en el

té, jugos de frutas y agua.

Las infecciones por Candida en humanos representan un grave

problema, especialmente para aquellas personas con deficiencias del sistema

inmunológico, tales como pacientes con HIV, diabetes mellitus, transplantes

de órganos, etc. La sobrepoblación en humanos de diferentes especies de

Candida de se conoce como candidiasis, que puede presentarse en diferentes

órganos del cuerpo humano. La infección por cándida es la más frecuente de

las infecciones micóticas del esófago, en particular las ocasionadas por C.

albicans. Otras especies como la C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei o C.

parasilopsis pueden ser patógenas ocasionalmente, ya que pueden ser

contaminantes de los alimentos y también poseen la capacidad de adherirse a

las mucosas (Gastroenterología, 2003).

Otra infección producida por diferentes especies de Candida en la

candidemia, una complicación infecciosa grave en pacientes con neoplasias

hematológicas, con una mortalidad relacionada cercana al 40% (Jarque et al.,

2002)). Estas infecciones pueden ser causadas no sólo por Candida albicans,

que es bien conocida como patógena, sino también por las especies C. krusei

19

y C. parasilopsis (Frasquet et al., 2002). Las infecciones por C. albicans y C.

krusei también son comunes en pacientes con quemaduras severas (Khardori,

2002).

Se han reportado a las carnes ahumadas, frutas y quesos como

fuentes importantes de la contaminación por Candida en pacientes

inmunocomprometidos (Tomsikova, 2002).

En general, antimicóticos como el clotrimazol, itraconazol y la

nistatina, y antibióticos como el fluconazol, la anfotericina y la flucitosina se

utilizan para combatir las infecciones por Candida en humanos (Leveau y

Bouix, 2000; Gastroenterología, 2003). La introducción de la profilaxis con

fluconazol a principio de la década de 1990 se ha asociado con un

incremento en las infecciones por las especies de C. krusei que muestran

resistencia intrínseca al fluconzol (Jarque et al., 2002; Baker, 1997). Sin

embargo estos compuestos no pueden utilizarse como preservativos

alimentarios.

La natamicina es una bacteriocina producida por Streptomyces

natelensis, la cual muestra un efecto antimicótico hacia levaduras y mohos.

Se ha probado que previene el crecimiento de este tipo de microorganismos

en la superficie de quesos (Milo, 2000). También se ha reportado la inhibición

de diferentes especies de Candida por varias especies de Lactobacillus

(Paraje, Albesa y Eraso, 2000), que incluyen el Lactobacillus acidophilus (Mital

y Satyendra).

1.4. El Lactobacillus acidophilus

Los lactobacilos forman parte de la familia de las bacterias

ácidolácticas (BAL), la cual incluye además los géneros Leuconostoc,

Pediococcus y Lactococcus (grupo N estreptococos). Es bien conocido que las

BAL están involucradas en la preservación de ciertos alimentos y que son

responsables de algunas características sensoriales únicas de los mismos

(tales como textura y aroma), las cuales no es posible obtener por métodos

20

de preservación distintos de la fermentación por BAL. Adicionalmente las

pérdidas del valor nutricional se consideran mínimas durante los procesos de

fermentación mientras se extiende la vida útil de los alimentos al ser estos

menos propensos al ataque de microorganismos patógenos.

El grupo de Lactobacillus acidophilus ha sido recientemente dividido

en 6 subgrupos de acuerdo a la homología en el ADN y a los análisis de

composición de la pared celular (Kawai et al.). Estos subgrupos son:

Grupo A1: L. acidophilus

Grupo A2: L. crispatus

Grupo Ag3: L. amylovorus

Grupo A4: L. gallinarium

Grupo B1: L. gasseri

Grupo B2: L. johnsonii

1.4.1. Potencial terapéutico y beneficios a la salud del

Lactobacillus acidophilus.

Se ha propuesto que la longevidad de los búlgaros se debe en parte al

consumo de grandes cantidades de leches fermentadas que contienen

lactobacilos. Esta observación inició un rápido crecimiento en la búsqueda del

rol de los cultivos ácido lácticos y productos lácteos fermentados en el alivio

de desórdenes gastrointestinales en animales y humanos.

Los recientes avances en el conocimiento de las actividades

biosintéticas de las bacterias ácido lácticas y su acción antagónica contra

organismos patógenos, tóxicos y putrefactores, han añadido una nueva

dimensión a la importancia de las leches fermentadas en la nutrición y salud

humanas.

El surgimiento de bacterias resistentes a los antibióticos y de vías

naturales para la supresión del crecimiento de patógenos ha contribuido al

21

concepto de “probióticos”. Las bacterias probióticas no sólo compiten y

suprimen las “fermentaciones no saludables” en el intestino humano, sino

que también producen efectos beneficiosos en la salud por ellas mismas

(Kailaspathy y Chin, 2000).

Los microorganismos que han sido usados comúnmente como

probióticos en humanos son Lactobacillus acidophilus, L. casei,

Bifidobacterium bifidum, B. longum y la levadura Saccharomyces boulardii

(Jack et al.). Las bacterias probióticas se pueden aplicar en los desórdenes del

balance microbiano intestinal y otras disfunciones del tracto gastrointestinal.

El Lactobacillus acidophilus es ampliamente utilizado en productos

lácteos tales como yogur y leches ácidas, como probiótico, para proveer de

funciones fisiológicas eficientes en el intestino humano (Kawai et al.).

Adicionalmente, propiedades tales como actividad antitumoral y

anticolesterolémica, reacciones químicas asociadas con la reducción de

nitritos, mejoramiento del estado inmunológico y disminución de los

desórdenes gatrointestinales, han sido atribuídos al consumo de productos

lácteos fermentados (Lindgren y Dobrogosz). Los principales beneficios

terapéuticos y a la salud del Lactobacillus acidophilus son (Kailasapathy y

Chin, 2000):

1. Mejoramiento de la inmunidad contra infecciones intestinales

2. Mejoramiento inmune

3. Prevención de enfermedades diarreicas

4. Prevención de cáncer de colon

5. Prevención de hipercolesterolemia

6. Mejoramiento de la utilización de la lactosa

7. Prevención de enfermedades del tracto gastrointestinal

8. Estabilización de la barrera de la mucosa intestinal

22

La contribución de las bacterias presentes en el yogur en el

mejoramiento de la microflora intestinal ha sido ampliamente reconocida. La

incorporación de L. acidophilus y B. bifidum en los cultivos inciadores del

yogur resulta en un producto lácteo de excelente valor terapéutico. El

consumo regular de yogur (400 – 500 g/semana) provee de 1.0x106 UFC/g de

L. acidophilus y B. bifidum, que son capaces de sobrevivir en las regiones

más altas del tracto gastrointestinal humano, lo cual es esencial para lograr el

efecto terapéutico (Kailasapathy y Chin).

1.4.2. Bacteriocinas producidas por L. acidophilus.

La mayoría de las bacteriocinas producidas por las distintas especies

de lactobacilos, pertenecen a la clase II, las cuales son péptidos pequeños,

hidrofóbicos, estables al calor y sintetizados como precursores (Bogovic-

Matijasic, Rogelj, Nes y Holo, 1998).

La producción de bacteriocinas está ampliamente distribuída dentro

de los Lactobacillus acidophilus y sus especies relacionadas, tales como L.

gasseri y L. johnsonii (Bogovic-Matijasic et al., 1998).

La lactacina F fue la primera bacteriocina del Lactobacillus acidophilus

caracterizada genética y bioquímicamente; es en realidad una bacteriocina de

dos componentes activa contra otras especies de lactobacilos y Enterococcus

faecalis (Bogovic-Matijasic et al.).

Posteriormente un estudio sobre 52 cepas de Lactobacillus acidophilus

reveló que la mayoría de ellos producía un compuesto que inhibía el

crecimiento de otros lactobacilos y se identificó como lactacina B (Lindgren y

Dobrogosz).

Otra bacteriocina producida por L. acidophilus es la acidocina B, que

tiene un espectro de inhibición que incluye algunas bacterias no

acidolácticas, tales como Clostridium sporogenes, Listeria monocitogenes y

Brochotix thermosphacta. La acidocina A es otra bactericiocina producida por

23

Lactobacillus acidophilus con un interesante espectro de actividad, que

incluye algunos patógenos de los alimentos tales como Listeria

monocitogenes. (Bogovic-Matijasic et al.).

La bacteriocina CH5 también es producida por Lactobacilus

acidophilus y su espectro de inhibición incluye varias especies de levaduras y

hongos, lo cual resulta de gran interés, ya que estos microorganismos son

responsables de gran parte del deterioro de los alimentos (Plockova et al.,

1997).

Más recientemente se han descrito otras bacteriocinas, tales como la

acidocina J1132, acidocina LF221 A y acidocina LF221 B (Bogovic-Matijasic, B.

et al.) y la lacidina es producida por Lactobacillus acidophilus OSU1333 y

tiene actividad contra Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis

(Burianek y Yousef).

1.5. Suero de leche

1.5.1. Generalidades y composición

El suero es un subproducto líquido de la industria de elaboración del

queso; es el fluido que se obtiene cuando se separa el coágulo de la leche

entera, precipitando las grasas y las proteínas (González, 1996)

Los sueros procedentes de la elaboración de quesos blandos o de

quesos de veteado azul son ácidos (0.18 – 1.25% de acidez), pero los

procedentes de quesos muy prensados son más ácidos (0.22 – 0.4% de

acidez) (Scott, 1991).

En general el suero de leche contiene lactosa (3,3 – 6%), proteínas

(0,32 – 0,7%), grasas (0,15 – 1%) y trazas de sales. Si está seco, está

constituido principalmente por 70% de lactosa, 9 a 14% de proteínas y 9% de

cenizas. La proteína consiste de -lactobulina (50%), -lactobulina (25%) y

otras proteínas (25%), incluyendo inmunoglobulinas (25%) y es el componente

económicamente más valiosos del suero. A partir de estas proteínas es

24

posible preparar concentrados de proteínas con un amplio rango de

propiedades funcionales (González, 1996).

La composición de los sueros de quesería varía de acuerdo con el tipo

de queso elaborado y por tanto también su contenido de proteínas, sales

ácidos grasos, lactosa y ácido láctico. La concentración de lactosa en el suero

suele ser bastante constante pero depende de la proporción de lactosa

original que ha sido degradada a ácido láctico. El contenido de proteínas

depende en su mayor parte del tipo de coágulo y de su tratamiento, y puede

incrementarse debido a la presencia en el mismo de partículas de cuajada así

como una manipulación inadecuada de ésta. Aunque el contenido de sales es

usualmente constante, depende de la adición a la leche de algunos

compuestos como nitratos, etc., pero muy especialmente de cloruro o

hidróxidos cálcicos. El contenido de grasa, así como también el de proteínas

se ve modificado por procesos como el tamizado o la centrifugación del

suero (Scott).

1.5.2. Usos del suero

El uso que más frecuentemente se le da al suero de leche es la

alimentación de cerdos. Sin embargo, dado su bajo contenido de nitrógeno,

su administración en grandes cantidades puede ocasionar un desequilibrio

nutritivo; por lo tanto es importante complementar cuidadosamente la ración

de cereales, alimentos concentrados, etc., para cubrir todos los

requerimientos nutricionales de los animales. Adicionalmente el consumo

excesivo de suero puede provocar diarrea a los cerdos; esto se evita

añadiendo al suero amonio cuaternario (Veisseyre, 1972).

En algunos casos el queso es de importancia secundaria siendo de

mayor interés la obtención de un suero con poca acidez. Tal es el caso

cuando se trata de la suplementación de dietas o de la elaboración de

alimentos para niños, para lo que se requiere un suero de bajo contenido en

ácido láctico (0.12 – 0.13% de acidez). Este tipo de sueros resulta muy

25

adecuado cuando lo que se persigue es una mayor concentración de lactosa

no degradada como componente de los mismos. (Scott).

Como el suero es un líquido que fermenta rápidamente, debe ser

tratado adecuadamente para garantizar su conservación. La concentración al

vacío y la deshidratación son métodos excelentes desde el punto de vista

técnico, mediante los cuales es posible obtener jarabe o almíbar de suero,

con un contenido de agua siete veces menor que el original. También es

posible concentrar el suero hasta obtener una pasta con más de 60% en peso

de extracto seco y se puede obtener suero concentrado y azucarado, para

confitería, pastelería o para la fabricación de quesos fundidos. Mediante la

deshidratación profunda del suero por el método de los cilindros o por

atomización permite obtener suero en polvo que se utiliza en la preparación

de alimentos para el ganado (Veisseyre, 1972).

El suero de leche constituye un excelente medio de cultivo para una

gran variedad de microorganismos. El lactosuero suplementado ha sido

utilizado previamente en el crecimiento de cepas de lactobacilus (Jakymec et

al., 2001; Vielma y Urribarrí, 1999); Ramones, 2001) y en la producción de

sustancias tales como ácido láctico, al cual se le atribuye actividad

antimicrobiana, por la disminución del pH que ocasiona en el medio de

crecimiento (Daeschel).

Es posible también someter el suero a la fermentación butírica

provocada por Clostridium acetobutylicum. A través de este proceso de

obtienen butanol y acetona (González).

Otros microorganismos que pueden producirse usando como sustrato

el suero de leche, son las levaduras capaces de metabolizar la lactosa del

suero y que se utilizan como fuente de proteínas y vitaminas para animales.

Entre estas se encuentran algunas cepas de Torula y de Kluyveromyces. El

suero se utiliza como medio de mantenimiento y propagación de

microorganismos tales como Penicillium glaucum y Penicillium candidum

26

27

para la producción que quesos Camembert, Brie, Carré, etc. (Quintero et al.,

2001).

Recientemente se ha desarrollado la utilización de las proteínas del

suero de leche en la confección de películas que actúan como barreras

protectoras de los alimentos de baja o intermedia humedad contra factores

como oxígeno y aromas. Las películas de proteína de suero proveen una

mayor vida útil del alimento cuando se utilizan como recubrimiento de los

mismos. Los enlaces disulfuro y enlaces iónicos ayudan a la formación de

geles cristalinos a base de suero de leche. Bajo las apropiadas condiciones de

calentamiento, las proteínas del suero contribuyen a las características de

viscosidad y estabilidad al calor del gel. Las potenciales aplicaciones de esta

tecnología incluyen recubrimientos para separar ingredientes ricos en lípidos

de otros componentes en alimentos heterogéneos, y barreras para el oxígeno

y aromas en alimentos de baja humedad cuando se utiliza en combinación

con películas de recubrimiento simples. Las películas de proteína de suero

podría potencialmente eliminar el uso de barreras sintéticas para el oxígeno y

aromas en empaques con múltiples capas, además de reducir las pérdidas

por deterioro y extender la vida útil de los alimentos (Milo). En la Tabla 2 se

resumen los usos más importantes del lactosuero

Tabla 2. Utilización del suero (Scott).

Piensos para cerdos y aves

Suplementación del valor nutritivo del pan

Inclusión en alimentos para niños y alimentos dietéticos

Bebidas carbónicas y bebidas fermentadas

Precipitados de albúminas y globulinas como aditivos alimentarios

Preparados de albúminas utilizados como suplemento del valor nutritivo de algunos alimentos

Preparados cosméticos y farmacéuticos

Fabricación de alcohol y lactosa

Fabricación de jarabes de galactosa/glucosa

Queso de suero, Ziger, Urda, Ricotta, etc.

Aislamiento de riboflavina

Fabricación de ácido láctico para la industria en general, farmacéutica o alimentaria

Como medio de fermentación para la fabricación de antibióticos, combustibles (metano), biomasa para la producción de alimentos, o fabricación de jarabes de galactosa/glucosa para pastelería o fabricación de cerveza

28

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

2.1. Materiales 2.1.1. Microorganismos

Se utilizó como microorganismo productor de compuestos inhibitorios

el Lactobacillus acidophilus ATCC 4356.

Como microorganismos indicadores se utilizaron cepas de

Lactobacillus delbrueckii helveticus, Lactobacillus delbruekii bulgaricus,

Lactobacillus helveticus, Candida parasilopsis, Candida krusei, Candida

albicans y Kluyveromyces fragilis.

2.1.2. Medios de mantenimiento

Las levaduras se mantuvieron en cuñas con YMA (Yeast Medium Agar)

en nevera a 4ºC antes de su utilización y se replicaron cada cuatro días.

Los lactobacilos se mantuvieron en tubos con caldo MRS (De Man,

Rogosa y Sharpe), en nevera a 4ºC antes de su uso y se replicaron una vez

por semana.

2.2. Ultrafiltración y suplementación del lactosuero

Se utilizó suero de leche resultado de la producción de queso blanco

prensado, suministrado por la empresa Venelácteos, ubicada en Santa Rosa

de Agua, Maracaibo, Edo. Zulia. Este suero fue sometido a un proceso de

centrifugación, en una desnatadora para eliminar la mayor parte de la grasa

(Laboratorio de Lácteos, Fac. de Ciencias Veterinarias, LUZ). Luego fue

ultrafiltrado para separar las proteínas. La ultrafiltración se realizó en una

planta piloto de filtración tangencial (Laboratorio de Fermentaciones

Industriales y Tecnología de Alimentos, Fac. de Ingeniería, LUZ). Después de

pasar a través del equipo de ultrafiltración, el suero fue sometido a un

tratamiento termoácido (pH 4,5, 90 ºC, 10 minutos) para precipitar las

proteínas que aún permanecieran en solución. Luego de este tratamiento se

30

enfrió hasta 35 ºC y se paso nuevamente a través de las membranas de

ultrafiltración con el objetivo de remover las proteínas precipitadas con el

tratamiento termoácido. Posteriormente se procedió a la suplementación con

0,3% p/v de extracto de levadura y 0,15% p/v de peptona trípsica, y a su

esterilización en autoclave a 118 ºC durante 15 minutos.

2.3. Métodos de análisis

2.3.1. Nitrógeno

El contenido de nitrógeno del suero de leche se determinó por el

método Kjeldah (Association of Oficial Analitical Chemist, 1990).

2.3.2. Proteínas

El contenido de proteínas del suero de leche se determinó como el

porcentaje de nitrógeno multiplicado por el factor 6,38 (A.O.A.C., 1990).

2.3.3. Lactosa

El contenido de lactosa del suero de leche se determinó utilizando el

método espectrocolorimétrico de Dubois y colaboradores, previa

construcción de una curva de calibración (Dubois, Pilles, Hamilton, Rebers y

Smith, 1956).

2.3.4. Humedad

Se determinó el contenido de humedad del suero utilizando el método

de la A.O.A.C. (A.O.A.C.).

2.3.5. Biomasa

La concentración de biomasa en el medio se determinó

turbidimétricamente, midiendo la absorbancia de la muestra en un

espectrofotómetro Cary 50 (Australia) a una longitud de onda de 660 nm

(Parente y Hill, 1992; Shimizu et al., 1999), previa construcción de una curva

de calibración.

2.3.6. Actividad antimicrobiana

31

La detección de la actividad antimicrobiana del sobrenadante se llevó

a cabo utilizando la técnica de la difusión en el agar (Parente, Brienza, Moles

y Ricciardi, 1995).

Para la técnica de la difusión en el agar se prepararon 20 ml de agar

(YMB para el caso de las levaduras y MRS para los lactobacilos) que se

colocaron en una placa de Petri de 90 mm de diámetro y se dejaron secar

durante 30 minutos. Luego se prepararon las diluciones del sobrenadante,

comenzando con el sobrenadante puro, y utilizando el mismo medio utilizado

para su producción (caldo MRS o suero de leche) por duplicado. Se colocaron

10l de la dilución sobre el agar ya seco y se dejó difundir durante 30

minutos. Luego se cubrió el agar con 5 ml de agar semisólido (YMB para el

caso de las levaduras y MRS para los lactobacilos) previamente inoculado con

la cepa indicadora, con un inóculo estandarizado (D.O. 0,9 1,0 a 660 nm). Las

placas se incubaron en condiciones de acuerdo con el microorganismo

indicador utilizado: para los lactobacilos la incubación se realizó durante 16h

y a 37 ºC; para las levaduras la incubación se realizó a 30 ºC durante 2 días.

Luego de completar el periodo de incubación correspondiente se

revisaron las placas para verificar la existencia de zonas de inhibición.

Para la técnica de la difusión en el agar modificada, se preparó el agar

(YMB para las levaduras y MRS para los lactobacilos) y se distribuyó en tubos

de vidrio de 25x150 mm. Luego se agregó a los tubos el sobrenadante en la

dilución deseada y se colocó en placas de Petri de 90 mm y se dejó secar. Una

vez solidificado el agar se procedió a colocar sobre este una dilución de un

cultivo de los microorganismos indicadores correspondientes. Las placas se

incubaron y se compararon con los controles para determinar si existe

inhibición. El grado de inhibición se describió como: sin inhibición, inhibición

leve, inhibición moderada, inhibición completa.

2.4. Fermentaciones

32

33

Para las fermentaciones se utilizaron dos medios de crecimiento: caldo

MRS y en suero de leche.

Las fermentaciones se llevaron cabo en fiolas de 500 ml de capacidad

utilizando 300 ml de medio de crecimiento y un inóculo del 20%. Se permitió

el crecimiento del microorganismo productor durante 12 -14 horas, con un

pH inicial de 6,0, el cual no fue controlado durante la fermentación.

Transcurrido este tiempo, el sobrenadante se separó del medio de

crecimiento por centrifugación a 10000 g por 15 minutos. Luego se ajustó el

pH a 7,0. El sobrenadante así obtenido se esterilizó por filtración con filtros

Millipore de 0.2 de diámetro del poro y se llevó a congelación a -18 ºC,

cuando no se utilizó inmediatamente.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Composición del suero de leche

En la Tabla 4 se presenta la composición porcentual promedio del

lactosuero fresco y desproteinizado.

Tabla 4. Composición porcentual promedio del lactosuero fresco y desproteinizado.

% Lactosuero fresco Lactosuero desproteinizado

Lactosa 4,72 ± 0,04 6,33 ± 0,06

Nitrógeno 0,229 ± 0,031 0,072 ± 0,001

Proteínas 1,464 ± 0,193 0,459 ± 0,001

pH 6,45 ± 0,01 4,72 ± 0,16

La caracterización del lactosuero indica que es un suero dulce, debido

a que el pH (6,45 ± 0,01) se encuentra en el rango de pH reportado en la

literatura para el suero dulce (5,9 – 6,5) (González).

La concentración de lactosa aumentó después de la desproteinización,

mientras que el porcentaje de proteínas y nitrógeno disminuyeron

considerablemente, lo cual muestra la eficacia del método de ultrafiltración.

Curvas de crecimiento

El pH y la temperatura utilizados para el crecimiento del Lactobacillus

acidophilus fue de 6,0 y 37 ºC respectivamente, condiciones reconocidas

como óptimas para el crecimiento de este microorganismo (Barefoot y

Klaenhammer, 1983; Bernet-Camard et al., 1997; Banina et al., 1998; Brink,

et al., 1994; Plocková et al.; Kawai et al.). En la Figura 1 se observan las

curvas de crecimiento

35

36

del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, creciendo bajo estas condiciones en

caldo MRS y en lactosuero suplementado.

37

Se realizaron las curvas de crecimiento con y sin agitación, ya que este

es un factor primordial en la producción de H2O

2, debido a que favorece la

incorporación de O2 en el medio de crecimiento. Se utilizaron 50 rpm de

agitación para garantizar la suspensión homogénea de las células en el medio

de crecimiento y la incorporación de cierta cantidad de aire que permitiera la

producción de peróxido de hidrógeno pero no inhibiera el crecimiento del

microorganismo por exceso de oxígeno disuelto, ya que el Lactobacillus

acidophilus se conoce como microaerofílico y se ha reportado su crecimiento

en presencia de mezclas de gases tales como H2, CO

2 y N

2 para promover

condiciones anaerobias (Barefoot y Klaenhammer, 1983; Bernet-Camard et

al., 1997; Brink et al.).

En la Tabla 5 se presentan los valores de la velocidad específica de

crecimiento () de este microorganismo a las condiciones antes citadas, y el

efecto de la agitación y del medio de crecimiento sobre este parámetro. Se

realizó un análisis de la varianza y no se encontraron diferencias

significativas entre los valores encontrados. Se puede observar que el mayor

valor se obtiene cuando este microorganismo se desarrolla en caldo MRS a 50

rpm de agitación. Sin embargo en la Tabla 6, donde se presentan los valores

de concentración final de biomasa del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 a

37 ºC y pH 6,0, puede observarse que los valores de máximos de

concentración de biomasa final se obtuvieron en el lactosuero sin agitación, a

pesar de que el caldo MRS es el medio específico utilizado para el crecimiento

de lactobacilos. Esto indica que el lactosuero es un medio de crecimiento

adecuado para el desarrollo del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, lo cual

representa una alternativa a los altos costos de disposición de este desecho y

de los medios específicos para el crecimiento de este microorganismo. En la

Tabla 6 también se observa el efecto de la agitación sobre la velocidad de

crecimiento, la cual aumento cuando se utilizaron 50 rpm de agitación. Sin

embargo el efecto sobre la concentración de biomasa final fue inverso, ya que

esta disminuyó por efecto de la agitación.

38

Tabla 5. Velocidad específica de crecimiento (h-1) del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 a 37 ºC y pH 6,0

(h-1)

Medio de crecimiento

0 rpm Factor de correlación

(r)

50 rpm Factor de correlación

(r)

Caldo MRS 0,2121±0.007

3

0,986 0,2131±0.019

2

0,9798

Lactosuero suplementado

0,1332 ± 0.008

0,9907 0,152 ±0.0064 0,9546

Tabla 6. Concentraciones de biomasa finales (Xf) obtenidas durante el crecimiento de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 a 37 ºC y pH 6,0

Xmáx (Kg/m3)

Medio de crecimiento 0 rpm 50 rpm

Caldo MRS 1,8526 ± 0,0594 1,3444 ± 0,1192

Lactosuero suplementado

2,9694 ± 0,2892 2,7559 ± 0,1309

El tiempo de crecimiento de 12 – 14 horas coincide con el reportado

por Brink, B. et al., quienes reportan que la fase estacionaria del crecimiento

comienza alrededor de la hora 12. Este tiempo fue seleccionado para detener

la fermentación y separar la biomasa del sobrenadante para la aplicación de

las técnicas de detección de la actividad antimicrobiana.

Detección de la actividad antimicrobiana del Lactobacillus

acidophilus ATCC 4356.

El Lactobacillus acidophillus, se reconoce como productora de

compuestos inhibitorios, y en especial la cepa ATCC 4356 (American Type

Culture Collection, 1990), utilizada en este estudio, es reconocida por ser

productora de peróxido de hidrógeno cuando se emplea agitación de manera

39

que se incorpore oxígeno al medio de crecimiento, necesario para la

producción de este compuesto (Mital y Satyendra).

La selección de las cepas de Candida, Kluyveromyces y Lactobacillus

como microorganismos indicadores se basó en diversos factores,

principalmente: incidencia en los alimentos como microorganismos

deterioradores, utilización previa como microorganismos indicadores,

disponibilidad y seguridad para su manipulación (Plocová et al.; Nagendra, y

Rajiv, 2001).

En la Tabla 5 se presentan los resultados obtenidos al utilizar el

método de la difusión en el agar. Se observa que en ninguno de los casos el

sobrenadante inhibió, en ningún grado, el crecimiento normal de la cepa

indicadora utilizada.

Plocková et al., reportan la inhibición de cepas de Kluyveromyces,

Candida, Lactobacillus, Cladosporium, Alternaria y Penicillium, todas cepas

con aplicaciones en la industria de los productos lácteos. En ese estudio se

reporta que la inhibición era claramente visible por el método de la difusión

en el agar, al apreciarse sólo un débil crecimiento en el caso de las levaduras

y cambios en la tasa de crecimiento y en la apariencia típica del desarrollo de

los micelios de los hongos. Estos resultados son atribuidos a sustancias

antimicrobianas diferentes de los ácidos orgánicos y el peróxido de

hidrógeno, ya que estos autores trataron térmicamente el sobrenadante

obtenido para evitar la acción del peróxido de hidrógeno y cualquier otra

sustancia termoestable. Además garantizaron la completa remoción de las

células viables del sobrenadante para evitar la producción de ácido láctico

durante el periodo de incubación requerido por la técnica de análisis, que

pudiera ser causante de inhibición de la cepa indicadora.

En el caso de este estudio todas las células fueron removidas del

sobrenadante por filtración. Sin embargo el sobrenadante no fue tratado

térmicamente, de manera que cualquier efecto inhibitorio sobre las cepas

40

indicadoras puede ser causado por múltiples factores que incluyen ácido

láctico, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas y sustancias tipo antibióticos

(Nardi et al., 2003)).

Tabla 7: Detección de la actividad inhibitoria del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 mediante la técnica de la difusión en el agar

Medio de crecimiento Microorganismo indicador

Caldo MRS Lactosuero

suplementado

Lactobacillus helveticus SI SI

Lactobacillus bulgaricus SI SI

Lactobacillus delbruekii bulgaricus SI SI

Candida krusei SI SI

Candida parasilopsis SI SI

Candida albicans SI SI

Kluyveromyces fragilis SI SI

SI: sin inhibición

La técnica de difusión en el agar puede arrojar “falsos negativos”

debido a agregación, inactivación por proteasas o no difusión de las

sustancias antibacterianas (Lewus y Montville, 1991), lo cual ocasiona que

estas sustancias no produzcan el efecto esperado en el microorganismo

indicador utilizado. En algunos casos es necesaria la purificación de las

sustancias inhibitorias del tipo bacteriocinas por alguno de los siguientes

métodos: precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio

iónico o interacción hidrofóbica (Bogovic-Matijasic et al.). Adicionalmente es

posible que las células del microorganismo productor adsorban en su

superficie las moléculas de las bacteriocinas que producen, las cuales, al ser

separadas del sobrenadante, se llevan consigo parte de la capacidad

inhibitoria del mismo (Yang, Jonson y Ray, 1992), lo cual puede afectar los

resultados de la técnica aplicada para detectar inhibición.

41

La técnica de la difusión en el agar y sus diferentes modificaciones

han sido ampliamente utilizadas en la detección de actividad antimicrobiana

(Plocková et al.; Bogovic-Matijasic et al.; Brink et al., 1994; Yang, et al., 1992;

Burianek y Yousef; Banina et al., 1998; Parente y Hill, 1922; Rodríguez et al.,

1997). Sin embargo, en un estudio realizado por Lewus y Montville (1991) se

compararon diversos métodos para la detección de bacteriocinas producidas

por BAL. Los resultados de este estudio muestran que el método de la

difusión en el agar produce una mayor cantidad de falsos negativos

comparados con otros métodos de detección de antimicrobianos tales como

la técnica del los puntos sobre el agar y de la capa de agar invertida.

Adicionalmente Parente y Hill reportan que los ensayos fotométricos proveen

resultados más reproducibles y precisos que aquellos obtenidos con los

métodos de difusión en el agar.

Lewus y Montville sugieren que la sensibilidad de la técnica podría

incrementarse aumentando el tiempo de difusión de la solución del

componente inhibitorio en el agar antes de la incubación; también sugiere

aumentar la cantidad de muestra del componente antimicrobiano aplicado en

cada ensayo.

En base a estas observaciones se realizaron las modificaciones a la

técnica de la difusión en al agar utilizada previamente. Estas modificaciones

consistieron en aumentar hasta 20% la cantidad de sobrenadante utilizado en

cada ensayo y adicionalmente se combinó el sobrenadante con el agar

licuado a 37 ºC, antes de que este último solidificara. Por otra parte es

extendió de 30 minutos hasta 2 horas el lapso de tiempo entre la aplicación

del sobrenadante al agar y la inoculación de las placas con el microorganismo

indicador correspondiente. Con estas modificaciones se esperó mejorar la

difusión del sobrenadante en el agar, ya que al encontrarse este en forma

líquida, la distribución podía hacerse de manera más uniforme.

42

Debido a que parte del efecto inhibitorio puede ser ocasionado por la

disminución del pH producida por la presencia de ácido láctico en el medio,

se realizaron una serie de experimentos omitiendo la neutralización del pH

final del sobrenadante (el cual osciló entre 5,70 y 4,32), previa a la aplicación

de la técnica de detección. Adicionalmente y debido a que la congelación

podría también afectar la actividad de los compuestos antimicrobianos,

también se realizaron pruebas utilizando el sobrenadante inmediatamente

después de finalizada la fermentación (SC) y después de 2 días de

congelación a -18 ºC (C).

La Tabla 6 presenta los resultados obtenidos al aplicar la técnica de

difusión en el agar modificada. Puede apreciarse que las modificaciones

realizadas no arrojaron resultados diferentes de los obtenidos en las pruebas

realizadas previamente. Adicionalmente la neutralización del pH parece no

tener efecto sobre la actividad del sobrenadante. Sin embargo es posible que

esto afecte la concentración de ácido láctico en el medio, el cual es uno de

los principales agentes inhibitorios del crecimiento de otros microorganismos

(Mataragas, Drosinos y Metaxopoulos, 2003), especialmente los lactobacilos,

ya que en el caso de las levaduras se conoce que estas pueden desarrollarse

en un amplio rango de pH (Adams y Moss)

El hecho de que las cepas utilizadas en este estudio no presenten

sensibilidad a los compuestos antimicrobianos producidos por L. acidophilus

ATCC 4356, no significa que otras cepas contaminantes de alimentos no sean

sensibles y puedan inhibirse. Plockova et al. (1997) reportan que la cepa de

Candida famata, no fue afectada por la bacteriocina CH5; en cambio las

cepas de Kluyveromyces marxianus y Candida kefir fueron inhibidas

levemente. En el caso de los mohos, algunas cepas de Penicillium no fueron

inhibidas por la bacteriocina y las cepas de Cladosporium y Alternaria

resultaron ser las más sensibles, al mostrar una fuerte supresión de su

crecimiento en presencia de la bacteriocina CH5.

43

Tabla 8: Detección de la actividad inhibitoria del Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 mediante la técnica de la difusión en el agar

modificada

Medio de crecimiento

Caldo MRS Lactosuero suplementado

pH sobrenadante

7.0

pH sobrenadante sin ajustar

pH sobrenadante 7.0

pH sobrenadante sin ajustar

Microorganismo

indicador

C S/C C S/C C S/C C S/C Lactobacillus

helveticus SI SI SI SI SI SI SI SI

Lactobacillus

bulgaricus SI SI SI SI SI SI SI SI

Lactobacillus

delbruekii

bulgaricus

SI SI SI SI SI SI SI SI

Candida krusei SI SI SI SI SI SI SI SI

Candida

parasilopsis SI SI SI SI SI SI SI SI

Candida albicans SI SI SI SI SI SI SI SI

Kluyveromyces

fragilis SI SI SI SI SI SI SI SI

SI: sin inhibición S/C: muestras no congeladas C: muestras congeladas durante 2 días a -18 ºC

La sensibilidad de los microorganismos indicadores puede afectar

grandemente los resultados obtenidos. En general la actividad inhibitoria de

los compuestos producidos por bacterias ácido lácticas se limita a especies

estrechamente relacionadas. Lewus y Montville sugieren que deben utilizarse

diferentes géneros de microorganismos indicadores en los programas de

identificación de bacteriocinas y otros compuestos inhibitorios, con el

objetivo de evitar la no identificación de un microorganismo productor. Por

esta razón en este estudio se utilizaron cepas de lactobacilos previamente

reportados como microorganismos indicadores sensibles a los compuestos

inhibitorios producidos por el Lactobacillus acidophilus (Kawai et al.). Lewus

44

45

y Montville reportan el Lactobacillus sake Lb 706 como el microorganismo

más sensible a los compuestos antimicrobianos producidos por otras cepas

de Lactobacillus, ya que en su estudio esa cepa fue inhibida por la mayoría de

los microorganismos productores utilizados.

Brink et al., reportan que Lactobacillus acidophilus M46 no inhibió el

crecimiento de Candida albicans ni de los microorganismos indicadores

Gram-negativos utilizados en su estudio. También reporta que los productos

formados por L. acidophilus M46 inhibieron sólo una cepa de Lactobacillus,

mientras que la actividad inhibitoria fue mayor contra Clostridium

sporogenes.

La eficacia de los compuestos inhibitorios también puede verse

afectada por la aparición espontánea de microorganismos mutantes

resistentes a los compuestos antimicrobianos, dentro de cepas sensibles a

estos (Schillinger et al., 1996).

La efectividad de los compuestos antimicrobianos puede

incrementarse mediante la simbiosis de estas sustancias con otros factores.

Por ejemplo Banina et al. reportan un aumentos del crecimiento del

Lactobacillus acidophilus cuando crece en simbiosis con otros

microorganismos. Por su parte Dykes, Amarowicz y Pegg (2003) reportan un

aumento en la actividad antimicrobiana de la nisina cuando esta se usa

mezclada con extracto de hojas de bayas.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

No se detectó actividad antimicrobiana en el sobrenadante de los

cultivos de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 en caldo MRS o lactosuero

suplementado sobre los microorganismos indicadores utilizados,

posiblemente debido a la sensibilidad de la técnica. Ninguna de las

modificaciones efectuadas a la técnica original tuvieron efecto sobre los

resultados obtenidos previamente.

Se recomienda el uso de técnicas más sensibles en la detección de

actividad antimicrobiana, así como el uso de una mayor variedad de

microorganismos indicadores que incluyan los reportados como más

sensibles a los compuestos antimicrobianos. Adicionalmente se recomienda

la purificación de los compuestos antimicrobianos por técnicas tales como

HPLC, interacción hidrofóbica y precipitación con sulfato de amonio.

A pesar de que la velocidad de crecimiento fue mayor en el caldo MRS,

los mayores valores de concentración de biomasa se obtuvieron en lactosuero

suplementado. La velocidad de crecimiento del microorganismo fue mayor

con agitación de 50 rpm que sin agitación. Las concentraciones de biomasa

finales fueron menores cuando se utilizaron 50 rpm de agitación.

El lactosuero suplementado es un medio adecuado para el crecimiento

de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 ya que con su uso se obtienen

valores de velocidad de crecimiento y biomasa comparables a los obtenidos

con el medio específico para el crecimiento de lactobacilus (caldo MRS). Esto

constituye una alternativa de utilización del lactosuero, disminuyendo su

potencial contaminante y los altos costos de su disposición como desecho.

Adicionalmente es una alternativa como medio de crecimiento ante los costos

de los medios específicos para este microorganismo (caldo MRS).

47

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