ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN...
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ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE Ulex europaeus L. (FABACEAE) CAMILO ALEXANDER PARRA GARZÓN UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTÁ D.C. 2017
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ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL ACEITE
ESENCIAL DE Ulex europaeus L. (FABACEAE)
CAMILO ALEXANDER PARRA GARZÓN
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2017
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL ACEITE
ESENCIAL DE Ulex europaeus L. (FABACEAE)
CAMILO ALEXANDER PARRA GARZÓN.
Trabajo de Grado presentado como requisito para optar al título de Licenciado en
Química.
Director:
WILLIAM FERNANDO CASTRILLÓN CARDONA
QUÍMICO, MAGISTER EN CIENCIAS AMBIENTALES
MAGISTER INVESTIGACIÓN EDUCATIVA
Codirector:
JAVIER ANDRÉS MATULEVICH PELÁEZ
LICENCIADO EN QUÍMICA, ESPECIALISTA EN ANÁLISIS QUÍMICO
INSTRUMENTAL, MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS CON ÉNFASIS EN
FITOQUÍMICA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2017
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL ACEITE
ESENCIAL DE Ulex europaeus L. (FABACEAE)
CAMILO ALEXANDER PARRA GARZÓN
Aprobado
_______________________________________
ANTONIO GUZMÁN AVENDAÑO M.Sc.
(Jurado)
______________________________________________________
WILLIAM FERNANDO CASTRILLÓN CARDONA M.Sc.
(Director)
________________________________________________
JAVIER ANDRÉS MATULEVICH PELÁEZ M.Sc.
(Director)
“A mis padres, hermanos, familiares, docentes y amigos…”
AGRADECIMIENTOS
El autor expresa sus más sinceros agradecimientos a:
Mis padres, Jairo Alberto Parra Herrera y Olga Cecilia Garzón Rodríguez por darme la
vida, por sus continuos e incansables esfuerzos y sacrificios que durante muchos años
han hecho para que pueda lograr y alcanzar mis metas, a ellos mi más eterno
agradecimiento, lealtad y amor incondicional. A mi hermano Diego Alberto Parra
Garzón, por enseñarme que aunque la vida nos golpea fuerte y nos pone obstáculos
que creemos insuperables, siempre nos muestra la salida y nos permite avanzar con
pasos firmes día a día y por último a mi hermana Solanyi Jorleth Zapata por todo su
apoyo, colaboración y amor.
A la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, y cada uno de los Docentes y
compañeros de estudio que me brindaron sus conocimientos y enseñanzas durante
estos largos años, por ser mí segundo hogar, al docente Oscar Rodríguez de la
Universidad Distrital Francisco José de Caldas por su apoyo y colaboración con la
actividad antimicrobiana, a todos y cada uno de los docentes que me apoyaron en mi
proceso de formación, especialmente a la profesora Adis Ayala Fajardo.
Al Profesor Javier Andrés Matulevich Peláez de la Universidad Distrital Francisco José
de Caldas, a quien considero mi segundo padre, mi amigo, mi mentor y ejemplo a
seguir, a él expreso mi más profunda gratitud, admiración, lealtad y apoyo incondicional.
Al Profesor William Fernando Castrillón Cardona de la Universidad Distrital Francisco
José de Caldas, quiero expresar toda mi gratitud por su confianza, por sus enseñanzas,
por su apoyo, su amistad, a él mi gratitud y lealtad.
A mis apreciados compañeros de trabajo; Profesor Orlando Báez Parra y profesor
Néstor Fabián Bravo Piñeros por su confianza, consejos, regaños, pero en especial por
su amistad y apoyo.
A todos y cada uno de mis compañeros y amigos, en especial a Luz Andrea Jiménez,
Angie Viviana Cita y Wendy Tatiana Rosas, por su amistad, sus consejos y todo su
apoyo en este arduo proceso y especialmente a Yonara Gabriela Becerra Monroy por
brindarme su alegría, su apoyo, su compañía, su sonrisa…
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ....................................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 3
JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 6
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN .................................................................................. 8
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ................................................................................. 9
OBJETIVOS .................................................................................................................... 9
OBJETIVO GENERAL. ................................................................................................ 9
OBJETIVOS ESPECÍFICOS. ....................................................................................... 9
1 ESTADO ACTUAL DEL TEMA ................................................................................... 10
1.1 Aceites esenciales ............................................................................................ 10
1.2 Familia Fabaceae ............................................................................................. 11
1.2.1 Características morfológicas de la familia Fabaceae. ................................ 11
1.2.2 Distribución y hábitat de la familia Fabaceae. ............................................ 14
1.2.3 Usos etnobotánicos de la familia Fabaceae. ............................................. 15
1.2.4 Estudios químicos y actividad biológica de la Familia Fabaceae. .............. 16
1.3 Género Ulex. .................................................................................................... 20
1.3.1 Características morfológicas del género Ulex. ........................................... 20
1.3.2 Distribución del género Ulex. ..................................................................... 21
1.3.3 Etnobotánica del género Ulex. ................................................................... 23
1.3.4 Estudios químicos y actividad biológica del género Ulex. .......................... 23
1.4 Especie vegetal Ulex europaeus L. .................................................................. 25
1.4.1 Ulex europaeus L. ...................................................................................... 25
1.4.2 Distribución y hábitat de Ulex europaeus L. .............................................. 26
1.4.3 Características morfológicas de la especie Ulex europaeus L. .................. 28
1.4.4 Etnobotánica de la especie Ulex europaeus L. .......................................... 30
1.4.5 Estudios químicos y biológicos de la especie Ulex europaeus L. .............. 30
1.5 Actividad antimicrobiana ................................................................................... 33
1.5.1 Antimicrobianos ......................................................................................... 33
1.5.2 Métodos de evaluación antimicrobiana ...................................................... 34
2 METODOLOGÍA ......................................................................................................... 37
2.1 Recolección y preparación del material vegetal ............................................... 37
2.2 Extracción y caracterización del aceite ............................................................. 38
2.2.1 Extracción y caracterización química de los aceites esenciales por el
método de arrastre con vapor ................................................................................. 38
2.2.2 Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas................ 39
2.2.3 Análisis multivariado de los aceites esenciales extraídos de la especie
vegetal Ulex europaeus L. ...................................................................................... 40
2.3 Extracción con etanol y fraccionamiento del extracto etanólico de las partes
aéreas de Ulex europaeus L. ..................................................................................... 44
2.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana ........................................................ 47
3 RESULTADOS Y ANÁLISIS. ...................................................................................... 49
3.1 Análisis Fitoquímico Preliminar (AFP) .............................................................. 49
3.2 Obtención del aceite esencial por el método de arrastre con vapor ................. 50
3.3 Identificación de los componentes volátiles de los aceites esenciales ............. 51
3.4 Análisis Multivariado ......................................................................................... 57
3.4.1 Análisis de Componentes Principales (ACP) ............................................. 58
3.4.2 Análisis de Conglomerados Jerárquicos (ACJ) .......................................... 64
3.5 Actividad Antimicrobiana .................................................................................. 68
4 CONCLUSIONES ....................................................................................................... 77
5 RECOMENDACIONES............................................................................................... 79
6 BIBLIOGRAFÍA. .......................................................................................................... 80
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Actividad biológica y química de algunas especies de la familia Fabaceae. ... 17
Tabla 2. Clasificación taxonómica de la especie vegetal Ulex europaeus L. ................. 26
Tabla 3. Porcentaje de rendimiento calculado para cada extracción de aceite esencial
de la especie Ulex europaeus. ...................................................................................... 37
Tabla 4. Cepas de bacterias con las cuales se probó las fracciones del extracto
etanólico de la especie vegetal Ulex europaeus L. ........................................................ 48
Tabla 5. Resultados del Análisis Fitoquímico Preliminar de partes aéreas de la especie
vegetal Ulex europaeus L. ............................................................................................. 49
Tabla 6. Totalizado de los compuestos químicos reportados por CG-EM de los aceites
esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L. ..................................................... 51
Tabla 8. Totalizados de los porcentajes de área aportados por los compuestos
obtenidos por el análisis de CG-EM, de los aceites esenciales de la especie vegetal
Ulex europaeus L. ......................................................................................................... 55
Tabla 9. Matriz de correlaciones ACP de aceites esenciales de la especie vegetal Ulex
europaeus L. Análisis de los valores y vectores propios de la matriz de correlación. ... 59
Tabla 10. Determinación de la masa crítica de inhibición por cada fracción frente a las
cepas de bacterias Escherichia coli y Staphylococcus aureus. ..................................... 68
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación de las hojas de las fabáceas ..................................................... 11
Figura 2. Caracterización morfológica de las Fabaceaes .............................................. 13
Figura 3. Distribución de la familia Fabaceae a nivel mundial ....................................... 14
Figura 4. Descripción morfológica de las especies pertenecientes al género Ulex ....... 21
Figura 5. Distribución del género Ulex mundialmente. .................................................. 22
Figura 6. Distribución de especies de Ulex por países en la flora mundial .................... 22
Figura 7. Especie vegetal Ulex europaeus L. ................................................................ 25
Figura 8. Distribución mundial de la especie vegetal Ulex europaeus L ........................ 27
Figura 9. Mapa de la distribución de la especie vegetal Ulex europaeus L ................... 28
Figura 10. Descripción morfológica de la especie vegetal Ulex europaeus L ................ 29
Figura 11. Metodología MFP de las partes aéreas de Ulex europaeus L ...................... 45
Figura 12. Diagrama de Fraccionamiento Líquido-Líquido Discontinuo del extracto
etanólico de Ulex europaeus L ...................................................................................... 46
Figura 13. Cromatogramas de los nueve perfiles de aceites esenciales de la especie
vegetal Ulex europaeus L .............................................................................................. 56
Figura 14. Scree Plot de los nueve perfiles cromatográficos de los aceites esenciales de
Ulex europaeus L. ......................................................................................................... 58
Figura 15. Diagrama de dispersión de datos en los componentes principales (CP1 y
CP2), para cada uno de los compuestos químicos encontrados en los aceites
esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L ...................................................... 60
Figura 16. Gráfica de cargas para dispersión de la varianza aportada por los
componentes principales de los aceites esenciales de la especie vegetal Ulex
europaeus L. .................................................................................................................. 63
Figura 17. Dendograma de Conglomerados Jerárquicos de los nueve perfiles de aceites
esenciales teniendo en cuenta la similitud entre los perfiles ......................................... 65
Figura 18. Dendograma de Conglomerados Jerárquicos de los perfiles de aceites
esenciales asumiendo 5 conglomerados de similitud. ................................................... 66
Figura 19. Masa crítica de las fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico
frente Escherichia coli. .................................................................................................. 70
Figura 20. Masa crítica de las fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico
frente Staphylococcus aureus.. ..................................................................................... 71
Figura 21. Relación entre halos de inhibición (mm) por concentración (µg/mL) de cada
fracción frente a las cepas Escherichia coli y Staphylococcus aureus. ......................... 72
Figura 22. Gráfica de varianzas iguales para las fracciones frente a cada una de las
cepas ensayadas. .......................................................................................................... 73
Figura 23. Varianza de la media de halos de inhibición para cada una de las fracciones
frente a las cepas de bacterias ensayadas.................................................................... 74
LISTA DE ABREVIATURAS
ACJ Análisis de Conglomerados Jerárquicos
AcOEt
Hex
Acetato de etilo
Hexano
ACP Análisis de Componentes Principales
AFP Análisis Fitoquímico Preliminar
ButOH
CH2Cl2
CG - EM
Butanol
Diclorometano
Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
CP Componentes Principales
DMSO Dimetil Sulfóxido
EM Espectrometría de masas
IE Ionización Electrónica
IR Índice de retención
M Metros
m.s.n.m Metros sobre el nivel del mar
MBC Concentración Mínima Bactericida
MIC Concentración Mínima Inhibitoria
ml Mililitros
mm Milímetros
TIC Corriente Iónica Total
u.m.a Unidades de Masa Atómica
Μg Microgramos
Μm Micrómetros
1
RESUMEN
El presente trabajo de investigación describe los resultados del estudio fitoquímico y
biológico realizado con los aceites esenciales y el extracto etanólico de las partes
aéreas de la especie vegetal Ulex europaeus L. (Fabaceae) clasificada en el Herbario
Nacional Colombiano bajo el número de colección COL 596977 con el propósito de
contribuir a las investigaciones realizadas a la familia Fabaceae, al género Ulex y en
particular a la especie vegetal, ya que esta especie cuenta con pocos estudios
fitoquímicos.
Fueron obtenidos los componentes volátiles procedentes de la extracción de nueve
aceites esenciales por la técnica de arrastre con vapor a partir de las partes aéreas
frescas, bajo las mismas condiciones de extracción; la caracterización química de éstos
se realizó por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG-EM),
comparación de los índices de retención, los espectros de masas y los datos reportados
en la literatura, donde se pudo determinar eicosano; 8-hexilpentadecano; ácido
decanoíco; β-Citronelol; D-Isomentol y tetracosano, como los componentes que
presentaron el mayor porcentaje de composición relativa en los aceites extraídos.
Los componentes volátiles obtenidos, fueron analizados estadísticamente mediante
Análisis de Componentes Principales (ACP), con el cual se logró identificar los
monoterpenos oxigenados: β-citronelol y D-isomentol; reportados por primera vez tanto
para la especie como para el género Ulex, siendo estos los compuestos químicos más
representativos del estudio de aceites esenciales de la especie vegetal. Además, los
perfiles también fueron analizados mediante el Análisis de Conglomerados Jerárquicos
(ACJ); el cual reveló variaciones quimiotipicas sobresalientes en cada uno de los
perfiles de los aceites esenciales obtenidos, esto indica que según el mes de
recolección y extracción de aceites de la especie vegetal se pueden obtener diferentes
compuestos químicos.
2
La actividad antimicrobiana fue ensayada a 4 fracciones (hexano, diclorometano,
acetato de etilo y butanol) obtenidas a partir del extracto etanólico de las partes aéreas
de Ulex europaeus L., las cuales fueron evaluadas frente a dos cepas de bacterias,
siguiendo el método de difusión en gel por perforación en placa; frente a Escherichia
coli, la fracción de hexano inhibió el crecimiento de la bacteria con una masa crítica de
181.60; la fracción de acetato de etilo inhibió la bacteria con una masa crítica de
216.59; la fracción de diclorometano no presento actividad antimicrobiana; la fracción
de butanol inhibió el crecimiento de la bacteria con una masa crítica de 246.14 y frente
a Staphylococcus aureus, todas las fracciones (hexano, acetato de etilo, diclorometano
y butanol) inhibieron el crecimiento de dicha bacteria con masas críticas (342.01;
162.35;367.94 y 279.53) respectivamente.
3
INTRODUCCIÓN
Desde tiempos remotos las plantas han sido catalogadas como recurso y fuente de
muchas necesidades humanas, debido a sus propiedades, características físicas y
químicas, como fuente de alimentos (algunos tallos, hojas, raíces y frutos), con fines
terapéuticos y medicinales (todas las partes de la planta). Las plantas son uno de los
mayores contribuyentes a nivel económico del país y del mundo, debido a que muchas
de estas se emplean en la industria farmacéutica con miras al desarrollo científico en el
avance de la medicina y la ciencia; para la producción de medicamentos, fragancias,
entre otros usos.
Colombia cuenta con un sistema montañoso prodigioso, por estar ubicada dentro del
sistema de montañas de los andes, gracias a esto posee todos los pisos térmicos y más
de un 44% de los páramos de Suramérica. En relación a ello se pueden apreciar
ecosistemas como bosques, sabanas, desiertos, selvas, pantanos, manglares,
montañas y llanuras, que permiten la existencia de cientos de especies endémicas
tanto animales como vegetales, siendo éstas últimas, unas 45.000 especies en
Colombia, cuyos estudios prometen ser una fuente potencial de sustancias naturales de
gran variedad química, que promueven el desarrollo tecnológico y científico con el fin
de proporcionar tratamientos eficientes para la cura de enfermedades entre otros fines
comerciales e industriales que se le pueden dar a las plantas (Shi et al., 2001; Proyecto
páramo andino, s.f.).
Así mismo, los virus y bacterias que han existido desde la creación del Universo,
constituyen una de las causales para incrementar los índices de mortalidad y morbilidad
en el mundo. Con el avance de la ciencia, la tecnología, la investigación química y
biológica; la industria farmacéutica ha desarrollado un gran interés por descubrir los
componentes activos de las plantas que ayuden a combatir enfermedades como
arterosclerosis, artritis, isquemia, lesiones en el sistema nervioso central, gastritis,
cáncer, malaria, dengue, fiebre amarilla entre otras muchas enfermedades producto de
los millones de virus y bacterias a los que está expuesta toda la población mundial.
4
Estudios fitoquímicos bioguiados y de actividad biológica, han permitido la extracción,
aislamiento, caracterización y síntesis de metabolitos secundarios que favorecen
elaborar medicamentos con base en principios activos identificados en el material
vegetal, salvando millones de vidas humanas (Shi et al., 2001) y combatir muchos de
estos agentes patógenos microscópicos que han sido causales de incontables muertes.
Uno de los recursos naturales más valiosos del planeta, es sin duda, las plantas por su
gran riqueza en metabolitos secundarios de donde derivan muchos de los compuestos
que actualmente se usan para producir medicamentos, fármacos, productos de belleza,
etc. De allí que sea importante el estudio de la flora del planeta y concretamente de
Colombia, puesto que allí se encuentra cerca del 10% de especies vegetales del
mundo.
La familia de las fabáceas (Fabaceae) a la cual pertenece la especie objeto de la
presente investigación, es una de las familias más representativas a nivel de plantas,
siendo ésta la segunda familia de plantas medicinales; tiene cerca de 730 géneros y
alrededor de 19.400 especies, la mayoría de estas empleadas en la medicina
tradicional y de las cuales, 31 especies pertenecen a los cerca de 20 géneros de la
familia entre los que se encuentran las plantas empleadas como materia prima de
medicinas y fármacos (Gao et al., 2010).
Sin embargo, muchas de estas plantas, no son estudiadas con el fin de determinar su
utilidad a nivel farmacológico; por ejemplo la especie vegetal Ulex europaeus L.
perteneciente a la familia Fabácea, género Ulex, conocido como retamo espinoso, pica-
pica, espino alemán, yáquil, aliaga, maticorena, corena, cachai, tejo, espinillo (Matthei,
1995), se conoce como gorse y furze en Gran Bretaña, Nueva Zelanda y Estados
Unidos.
El retamo espinoso, es empleado como arbusto ornamental debido a sus características
morfológicas dado que presenta inflorescencias (flores) muy llamativas y vistosas,
5
además de ser empleado como delimitador de áreas (cercas vivas) dada su principal
característica evolutiva (presenta espinas como remplazo de las hojas).
Estudios de carácter científico han revelado algunas aplicaciones a nivel médico por
ejemplo en el tratamiento y reconocimiento de grupos sanguíneos con el fin de
contribuir a la prevención de algunas enfermedades de la sangre (Pestean et al., 1995)
y en la determinación genética de la especie vegetal en particular, además de ello, ha
sido catalogado como especie invasora, y se ha reglamentado su manejo por parte de
la Corporación Autónoma Regional (CAR, 2010), sin embargo no se han realizado los
estudios fitoquímicos pertinentes que permitan determinar la utilidad de la especie
vegetal a nivel biológico u otro uso. Es por lo descrito anteriormente que el presente
trabajo se orientó al estudio de metabolitos volátiles de las partes aéreas de la especie
vegetal Ulex europaeus L., y la evaluación de la actividad antimicrobiana de las
fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico frente a las cepas de bacterias
Staphylococcus aureus y Echerichia coli.
6
JUSTIFICACIÓN
La especie Ulex europaeus L, es nativa de Europa y África pero se ha distribuido a nivel
mundial, bien sea como planta introducida o por su proliferación. Es una planta que
posee un alto grado de propagación, razón por la cual ha tenido un alto impacto en el
continente americano, ya que la especie ha conseguido poblar la mayoría de
ecosistemas, convirtiéndose en una plaga o especie invasora, para lo cual se
implementan planes de gestión y erradicación de la especie vegetal en especial para
Colombia y en concreto en los Cerros Orientales del país, la CAR emitió un decreto
mediante el cual se prohíbe la plantación, comercialización, distribución, etc., de la
especie, sin tenerse en cuenta los aportes a nivel químico o biológico que pueda tener
ésta. (CAR, 2010).
La especie vegetal Ulex europaeus L., no cuenta con los adecuados estudios de
carácter químico o biológico en Colombia, que permitan establecer un aprovechamiento
de la planta, por el contrario, la mayoría de investigaciones en torno a la especie
radican en el manejo, distribución y erradicación de la especie vegetal (Muñoz, 2009;
Normabuena & Escobar, 2000; Pabón, 2013).
Si bien la familia de las Fabáceas es numerosa en cuanto a especies vegetales en
Colombia, particularmente la especie vegetal Ulex europaeus L, se ha distribuido
ampliamente en el país, no se encuentran reportes a nivel nacional de los estudios
químicos y/o biológicos de la especie; por el contrario, los escasos estudios químicos
y/o biológicos han sido reportados por entidades internacionales (Cao et al., 1997;
Lopez et al., 2016; Hornoy et al., 2012; Harborne, 1962; Spínola et al., 2016; Ligero et
al., 2011). Todos ellos realizados en Universidades a nivel mundial. Estudios han
demostrado la presencia de flavonoides y alcaloides, compuestos que están
relacionados directamente a actividades biológicas como por ejemplo la actividad
antimicrobiana, antifúngica, antioxidante, etc., (Harborne, 1962).
7
En cuanto a la composición química volátil de la especie se han encontrado escasos
reportes en literatura por ejemplo (Lopez-Hortas et al., 2016; (Cao et al., 1997), pero
ningún estudio en particular de los componentes volátiles de la especie a nivel nacional.
La importancia del estudio de las especies vegetales cuyas propiedades biológicas
únicas confieren a los seres vivos y a la naturaleza innumerables beneficios, en
particular por los aportes a nivel biológico sobre el ser humano en el tratamiento de
enfermedades, por ejemplo y como caso particular, la especie vegetal Ulex europaeus
L. contribuye al tratamiento de reumatismos y afecciones hepáticas (Menendéz, 2007).
Lo mencionado anteriormente indica que los estudios en plantas foráneas poco
trabajadas en la región latinoamericana como lo es Ulex europaeus L, son de suma
importancia por su aporte al conocimiento sobre la composición y actividad biológica de
la vegetación de países con alta biodiversidad como Colombia, donde no se encuentran
reportes del estudio químico o biológico de la especie.
8
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
El presente proyecto fue desarrollado al interior del Grupo de Investigación de
Productos Naturales Vegetales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas
bajo el título: ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL
ACEITE ESENCIAL DE Ulex europaeus L. (FABACEAE), estudio con el cual se
caracterizaron los compuestos químicos volátiles mayoritarios presentes en las partes
aéreas de la especie vegetal y se evaluó la actividad antimicrobiana de las fracciones
de polaridad creciente del extracto etanólico de la misma, frente a las cepas de
bacterias Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
Estudios realizados a la especie vegetal han reportado algunos carotenoides (Schon,
1936), chalconas y glicósidos flavonólicos (Harborne, 1962), estudios de biocontrol
(Normabuena & Escobar, 2000), algunos alcaloides e isoflavonas (Russell et al., 1990),
metabolitos a los cuales podría atribuirse la actividad antimicrobiana tal y como lo
reportan Ruiz & Roque (2009) en su estudio, donde el análisis fitoquímico preliminar de
las especies estudiadas allí, revela la presencia de flavonoides y alcaloides; algunos
estudios bioquímicos como afimran (Pestean et al., 1995).
Sin embargo, y pese a los grandes estudios a nivel químico y biológico que se han
realizado en plantas a nivel mundial, resultan siendo escasos los reportes a nivel
químico y biológico de la especie vegetal Ulex europaeus L., particularmente, dado que
su distribución, ubicación y abundancia relativa la convierten en una planta perene de
investigación en la flora silvestre tanto colombiana como mundial.
9
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
De acuerdo con lo expuesto anteriormente se plantea la siguiente pregunta de
investigación:
¿Cuál es la composición química de los aceites esenciales extraídos de las partes
aéreas de la especie vegetal Ulex europaeus L? ¿Presentan actividad antimicrobiana
las fracciones del extracto etanólico de la especie vegetal Ulex europaeus L?
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL.
Contribuir al estudio fitoquímico de las partes aéreas de la especie vegetal Ulex
europaeus L (Fabaceae) y evaluar la actividad antimicrobiana frente a las cepas de
bacterias: Escherichia coli (ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
• Identificar de manera cualitativa a través de Marcha Fitoquímica Preliminar los
posibles grupos de metabolitos secundarios presentes en las partes aéreas de la
especie vegetal.
• Extraer los aceites esenciales de las partes aéreas de la especie vegetal Ulex
europaeus L, empleando el método de arrastre con vapor y caracterizar
químicamente los aceites esenciales extraídos mediante análisis por CG-EM.
• Realizar un análisis estadístico mediante Análisis de Componentes Principales y
Análisis de Conglomerados Jerárquicos, los compuestos químicos obtenidos en
los aceites esenciales.
• Evaluar la actividad antimicrobiana de cuatro fracciones de polaridad creciente
del extracto etanólico frente a las cepas de bacterias: Staphylococcus aureus y
Escherichia coli.
10
1 ESTADO ACTUAL DEL TEMA
1.1 Aceites esenciales
Se le conoce por aceites esenciales, al destilado mediante vapor de agua de la planta
que se ha seleccionado para efectuar el proceso de extracción de los metabolitos
volátiles que hacen parte de ellas. Los aceites esenciales son una mezcla de
componentes volátiles producto del metabolismo secundario de las plantas, donde
intervienen hidrocarburos de tipo terpeno junto con otros compuestos casi siempre
oxigenados y que son los que le confieren a los aceites esenciales de las plantas los
aromas característicos (Stashenko et al., 2003). Generalmente el proceso se realiza
con vapor de agua, ya que si se realiza con solventes orgánicos, los metabolitos
pueden solubilizarse en el solvente y perderse en el proceso de evaporación natural del
solvente, en la medida, que lo que se quiere extraer son aceites, es relevante que el
solvente empleado para tal fin sea de polaridad contraria al producto que se desea
obtener. Los aceites esenciales tienen diversos usos, con base a su actividad biológica,
como por ejemplo, son empleados en la producción de fragancias para perfumes,
aditivos para alimentos, antiinflamatorios, antimicrobianos, antioxidantes, antifúngicos,
insecticidas, etc., como lo expresan (Gómez et al., 2013; Chaverri & Cicció, 2015;
(Fuentes et al., 1998) quienes han reportado diferentes tipos de compuestos extraídos
de los aceites esenciales de diferentes especies vegetales pertenecientes a la familia
fabácea.
De allí la importancia del estudio de los componentes volátiles presentes en las
diversas especies vegetales que hacen parte de la flora mundial, ya que son muchos
los beneficios que se pueden obtener a nivel farmacológico, fitoquímico, medicinal e
industrial (Dabbah et al., 1970).
11
1.2 Familia Fabaceae
1.2.1 Características morfológicas de la familia Fabaceae.
La familia de las fabáceas o leguminosas, son una familia del orden de las fabales. Se
caracteriza por tener plantas herbáceas, trepadoras, arbóreas o arbustivas, anuales o
perennes, con hojas muy variadas, simples o compuestas (figura 1), éstas últimas
trifoliadas, pinnadas o digitadas. En ocasiones se encuentran reducidas a zarcillos,
transformadas en espinas o ausentes. Con frecuencia presentan estípulas. Poseen
flores hermafroditas, normalmente muy vistosas, adaptadas a la polinización por
insectos.
Figura 1. Clasificación de las hojas de las fabáceas. (Herrera, 2008)
Las hojas son casi siempre alternas y con estípulas, persistentes o caedizas,
generalmente compuestas, pinnadas o bipinnadas, digitadas o trifoliadas, a veces
aparentemente simples, los tallos se hallan transformados en filodios o pinnadas y con
zarcillos en el ápice. A menudo las hojas se hallan reducidas o son precozmente
caducas o nulas en las especies áfilas o subáfilas. El pecíolo y muchas veces los
peciolulos, tienen la base engrosada que permite los movimientos de “sueño y vigilia”.
Es frecuente la presencia de espinas por transformación del raquis de las hojas, de las
estípulas o del tallo.
12
La raíz de las fabáceas presenta un predominio del sistema primario, es decir, de aquel
que proviene de la radícula de embrión. Su sistema radical es normalmente pivotante.
Las raíces de las leguminosas son a menudo profundas y casi siempre presentan
nódulos simbióticos poblados de bacterias del genero Rhizobium que asimilan el
nitrógeno atmosférico.
Las flores pueden ser desde pequeñas o grandes, actinomorfas, como ocurre con las
papilionóideas y en la mayor parte de las cesalpinióideas. Las irregularidades en la
simetría floral en estos casos involucran al perianto y al androceo. El receptáculo de la
flor desarrolla un ginóforo se encuentra fusionado al hipanto en las cesalpinióideas, con
forma de cúpula. El hipanto puede estar presente o ausente, en este último caso está
remplazado por el tubo del cáliz, como es el caso en la mayoría de las fabóideas.
El perianto tiene casi siempre un cáliz y una corola diferenciada, el de las fabáceas
(leguminosas), técnicamente denominado legumbre, deriva de un ovario compuesto por
un solo carpelo, el cual, en la madurez de la planta; se abre longitudinalmente en dos
valvas, lo que indica que su dehiscencia ocurre por la nervadura media y por la unión
carpelar. Sin embargo, existe una gran variedad de formas y tamaños de frutos en la
familia como se indica en la figura 2.
13
Figura 2. Caracterización morfológica de las Fabaceaes. Fuente:
http://www.elmundoforestal.com/terminologia/leguminosas.html
Como se ha mencionado, las fabáceas realizan el proceso de fijación de nitrógeno
atmosférico mediante bacterias simbiontes tales como Allorhizobium, Rhizobium, etc,
elemento que está presente en nódulos radicales lo cual es una característica que
presentan muchas leguminosas (Aizpuru et al., 1993). Se clasifican acorde al sistema
de clasificación de Cronquist; encontrándose distribuida en tres subfamilias diferentes,
la familia Mimosaceae, Caesalpinaceae y Fabaceae, en ésta última se encuentran las
papiledoneas donde se distribuye el género Ulex.
Estípula
Inflorescencias
solitarias
Inflorescencias
terminales
Fruto leguminoso
Inflorescencias
Ápice
oblongado
Tallo
filodio
14
1.2.2 Distribución y hábitat de la familia Fabaceae.
La familia se distribuye de manera cosmopolita, es decir, a nivel mundial se encuentran
plantas pertenecientes a la familia. Los árboles son más frecuentes en las regiones
tropicales, mientras que las hierbas y los arbustos dominan en las extratropicales. En
particular la familia Fabaceae se encuentra ampliamente extendida en zonas boreales,
templadas y tropicales. Por esta afinidad en sus características morfológicas, se
encuentran en aproximadamente todos los hábitats, y frecuentemente son dominantes
en las comunidades forestales en los que ocurren, presentando así un número de
géneros en aproximadamente 730 y cerca de 19.400 especies a nivel mundial, por lo
que se distribuye en casi todo el globo terráqueo como se indica en la figura 3.
Entre los múltiples géneros que tiene la familia, los más representativos son el
Astragalus con 2000 especies, el género Indigofera con cerca de 700, el Crotalaria con
alrededor de 90, el Desmodium con 400 y por último el Trifolium con cerca de 300
especies (Bonifacino, 2013).
Figura 3. Distribución de la familia Fabaceae a nivel mundial. Los puntos amarillos indican los países donde se
encuentran distribuidas las diferentes especies pertenecientes a la familia. (Tropicos.org, tropicos.org, 2015)
15
1.2.3 Usos etnobotánicos de la familia Fabaceae.
La familia Fabaceae presenta gran importancia a nivel económico, debido a que se
emplean casi todas las especies bien sea con fines medicinales u ornamentales, como
en el caso de Cytisus (retama), Erythrina (ceibo), Laburnum (lluvia de oro), Lathyrus
(guisante de olor), Lupinus, Robinia y Wisteria cuyos usos están enfocados a la
ornamentación. Algunas especies del género Indigofera (índigo), se emplean
industrialmente con el fin de extraer colorantes, azul generalmente. Otros géneros, por
ejemplo, Dalbergia, Pterocarpus, son importantes fuentes de maderas de lujo.
(Bonifacino, 2013).
Se han reportado algunos estudios que indican que algunas especies de Facaeaes se
emplean como analgésicos, contra reumatismos y como diurético (Castañeda et al.,
2017), algunos estudios indican que se emplean para tratar mordeduras de serpiente,
dolores de cabeza, estomacales y prevenir la diabetes. (Zambrano-Intriago et al., 2015).
Las hojas y frutos de Ceratonia siliqua L., se han empleado como antidiarreico y
antitusivo (Carrió & Vallès, 2012); así como las semillas de Lens culinaris medic, para el
tratamiento por deficiencia de hierro como lo reportan en el mismo estudio Carrió &
Vallès, 2012).
En la agricultura, algunas fabáceas se utilizan como abono verde antes de sembrar
plantas que necesitan mucho nitrógeno. Por el nitrógeno fijado muchas de estas plantas
fabáceas contienen mucha proteína, lo que se aprovecha al comer sus frutos
característicos como las legumbres y así como se aprovechan las proteínas que
sintetizan las plantas, algunas se exceden en su concentración de nitrógeno
ocasionando que la planta y todas sus partes sean tóxicas para el consumo. (ABC de
las Plantas Medicinales, 2013).
16
1.2.4 Estudios químicos y actividad biológica de la Familia Fabaceae.
La familia Fabaceae se caracteriza por la presencia de numerosas sustancias
bioactivas de diversa naturaleza química en corteza, hojas y raíz. De esta familia se han
caracterizado y reportado alcaloides, flavonoides y polifenoles. La bioactividad de este
tipo de metabolitos de plantas está asociada a su efecto antidiabético, antiinflamatorio y
antimicrobiano. (Martínez et al., 2011). Así mismo en la familia de las fabáceas se
encuentran especies las cuales reportan diversos estudios a nivel fitoquímico como se
indica en la tabla 1, las actividades mencionadas anteriormente, se pueden atribuir a
algunas especies vegetales en concreto y a mencionar: Inga vera, Crotaina retusa,
Caesalpinia coriaria, Cassia fistula, Bauhinia variegata, otras especies pertenecientes a
la familia; la Erythrina falcata, reporta compuestos de tipo alcaloides, taninos, glicósidos
antraquinónicos y flavonólicos, algunos de estos empleados por la población como
sedantes (Almeida, 2008). Se han reportado sesquiterpenos, monoterpenos como
componentes principales de los aceites esenciales de algunas especies vegetales
pertenecientes a la familia (Chaverri & Cicció, 2015; Gómez et al., 2013).
Muchos de los estudios entorno a los aceites esenciales que se han reportado para la
familia, indican que algunas especies pertenecientes tienen una actividad
antimicrobiana eficiente, tales como Lupinus ballianus, estudio que revela la actividad
antimicrobiana de los flavonoides y alcaloides presentes en dicha especie. (Fuentes et
al., 1998)
17
Tabla 1. Actividad biológica y química de algunas especies de la familia Fabaceae.
Referencias Actividad biológica
Órgano de la planta
y/o extracto
metabolito evaluado
Especie
Nombre común
(Chaverri & Cicció, 2015) Insecticida Aceite esencial de
flores y hojas Gliricidia sepium
(Gómez et al., 2013)
Hormonas vegetales,
antibióticos y
alelopáticas
Aceite esencial de
hojas Adesmia bijuga
(Khallouki et al., 2002) Insecticida Aceite esencial de
flores y hojas
Ononis natrix L.
Pegamoscas
(Teyeb et al., 2009)
Hepatotóxica,
antioxidante y
antimicrobiana
Aceite esencial de
hojas, flores y frutos
Astragalus
gombiformis
Pomelo
(Fuentes et al., 1998) Antimicrobiana y
antifúngica Hojas
Lupinus C.P. Smith
Jera
(Beltrán et al., 2013) Laxante Extracto de etanólico
de las semillas
Inga vera Willd.
Guama
(Beltrán et al., 2013)
Actividad antimicrobiana
Extracto etanólico de
las semillas
Crotalaria retusa L.
Cascabel
(Beltrán et al., 2013) Actividad antimicrobiana Extracto etanólico del
fruto
Caesalpinia
coriaria
Dividivi
(Beltrán et al., 2013) Actividad antimicrobiana Extracto etanólico de
las hojas
Cassia fistula
Caña fistula
(Martínez et al., 2011)
Actividad antimicrobiana
frente a Escherichia
coli.
Extracto etanólico de
las hojas
Bauhinia variegata
casco de buey
18
Entre algunos de los compuestos encontrados para la familia fabácea se han reportado
con respecto al grupo de metabolitos alcaloides en las semillas de la especie vegetal
Lupinus mexicanus tales como: lupanina (1), α-isolupanina (2), 3-β-hidroxilupanina (3),
multiflorina (4), afilina (5) y epiafilina (6) entre otros muchos que se han reportado para
la familia de las fabáceas (Zamora et al., 2008). Así como se han encontrado alcaloides,
también se han reportado algunos compuestos flavonoides, tales como:
trihidroxisoflavona (7), tetrahidroxiflavona (8), catequina (9), quercetina (10) como
posible antiinflamatorio (Matulevich & Gil-Archila, 2014), dihidroquercetina (11),
miricetina (12), y dehidromiricetina (13) (Moreno et al., 2007). Así mismo, para el
estudio de aceites esenciales se han reportado compuestos tales como: alcanfor (14),
α-eudesmol (15), hexanal (16), 2-hexenal (17), pentadecanal (18), caprolactama (19),
linalool (20), β-cariofileno (21), β-farneseno (22), β-Ionona (23) y α-pineno (24).
H
HR
O
N
N
(1)
H
H
O
N
N
(2) (3)
H
OH
H
H
O
N
N
(4)
O N
N
(5)
H
HO
N
N
(6)
H
O
N
N
(7)
OH
OH O
OOH
OCH3
(8)
OH
OHOH
OH O
O
19
(9)
OH
OH
OH
OH
O
OH
(10)
OH
OH
OH O
O
OH
OH
(11)
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
(12)
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
(13)
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
O
(14)
OH
(15)
(16)
O
H
(17)
O
H
O
NH
(19)
H
O(18) (20)
H OH
(21)
20
(22) (23)
O
(24)
1.3 Género Ulex.
1.3.1 Características morfológicas del género Ulex.
El género Ulex, se caracteriza por tener pocas especies vegetales, alrededor de veinte
especies de arbustos perennes, conocidos comúnmente como tojos, siendo la mayoría
de estos arbustos con espinas que remplazan a las hojas (figura 4). Las especies del
género varían desde arbustos elevados con ramificación abierta hasta plantas bajas,
compactas y densas. El color en la mayoría de los casos es verde, variando desde
verde oscuro a verde claro o amarillento, frente a un grupo de plantas verde
cenicientas, por estar recubiertas completamente por indumento denso y corto. se
considera por tanto que debe existir una genética que filie las especies de Ulex, sin
embargo, las espinas pueden resultar modificadas por condiciones ecológicas
particulares, como la sequedad edáfica y el grado de recubrimiento o apertura de la
comunidad vegetal donde crece la planta concreta. Es por ello, que las espinas tienden
a ser más curvadas a medida que las condiciones de humedad son menores, es decir,
cuando crece en suelos secos y los climas son más cálidos. (Espirito Santo et al.,
1997).
21
Figura 4. Descripción morfológica de las especies pertenecientes al género Ulex. Fuente: César Fernández
González, 24/11/2014, Asturias, Parres, Alrededores de lla mina de Curiellu, Llerandi.
Dado que la mayoría de especies del género, presentan las mismas caracteristicas
morfológicas, la descripción de los ejes y ramas principales, así como de las espinas,
aplican para la mayoría de las especies.
1.3.2 Distribución del género Ulex.
El género Ulex, es uno de los géneros más recientemente estudiados, sin embargo, a
nivel mundial son pocos los estudios que se ha realizado entorno a las especies
pertenecientes a éste, a nivel mundial, se encuentra distribuido en América (norte,
centro y sur), Europa (España y Francia), en África de Sur y en India como se indica en
la figura 5, sin embargo en la figura 6 se presenta con mayor claridad que la mayor
fuente de especies de éste género, se encuentran distribuidas en Colombia, hallándose
alrededor de nueve especies.
Tallo
Inflorescencia
Hoja secundaria
Hoja primaria
(Alternada)
Vaina
Fruto
Cáliz
aplanado
22
Figura 5. Distribución del género Ulex mundialmente. Los puntos amarillos indican los países en los cuales se
encuentran especies pertenecientes al género Ulex. (Tropicos.org, 2015)
Como se ha mencionado, la variedad de pisos térmicos que ofrece Colombia, permite la
proliferación de muchas especies vegetales de un alto valor económico, cultural y
científico, en Colombia, se encuentran alrededor de nueve especies de Ulex, entre las
que se encuentra una especie vegetal en particular Ulex europaeus L.
Figura 6. Distribución de especies de Ulex por países en la flora mundial. Los puntos amarillos indican los países
donde se encuentran las especies pertenecientes al género Ulex. La tabla a la derecha indica la cantidad de
géneros que se encuentran por país, Colombia, como el país que mayor cantidad de especies de Ulex
contiene (tropicos, 2015).
23
1.3.3 Etnobotánica del género Ulex.
La mayoría de las especies pertenecientes al género Ulex, debido a sus características
morfológicas (presentan espinas) son empleadas como delimitadores de zonas, es
decir, se emplean como cercas que restringen el acceso a ciertas áreas, zonas o
viviendas de las comunidades rurales.
Si bien el género es nativo de Europa y África, se ha logrado distribuir por algunas
partes del mundo, debido a su alta capacidad de adaptación a cualquier clima y hábitat,
presentando condiciones de invasión, debido a que en distintos países se ha
introducido algunas especies con fines ornamentales, sin embargo, su alta capacidad
de proliferación ha dado las condiciones para su alta distribución (Muñoz, 2009).
Hasta el momento, se han reportado alrededor de veinte especies pertenecientes al
género, entre las cuales se encuentran Ulex airensis, Ulex argenteus, Ulex australis,
Ulex boivinii, Ulex borgiae, Ulex canescens, Ulex cantabricus, Ulex densus, Ulex
eriocladus C. Vicioso, (endemismo ibérico), Ulex europaeus, Ulex jussiaei, Ulex gallii,
Ulex genistoides, Ulex micranthus, Ulex portuguese, Ulex minor y Ulex parviflorus,
muchas de estas especies, solo han sido clasificadas a nivel taxonómico y por lo tanto
muchos de los aspectos químicos, biológicos del género se desconocen. (Máximo et al.,
2006)
1.3.4 Estudios químicos y actividad biológica del género Ulex.
En cuanto a las especies pertenecientes al género Ulex, se han encontrado pocos
reportes químicos de su actividad biológica, sin embargo, algunos estudios han
señalado que en la composición química del género Ulex se han encontrado algunos
alcaloides y compuestos de tipo flavonoide, como por ejemplo: (-)-2,3,4-trimetoxi-8,9-
metilendioxi-pterocarpeno (25), β-isosparteina (26), jussiaeina-β (27), N-metilcitisina
24
(28), citisina (29), 5,6-dehidrolupanina (30), lupanina (31), N-formilcistina (32), entre
otros. (Máximo et al., 2006).
(24)
H3CO
H3CO
H3CO
H
HO
O O
O(25)
H
H
N N
(26)
H3CO
H
H
N
H
CH2OH
N
(27)
(28) OH
CH3
N NMeO
CH2 (29)O
H
HN
NH
(30)
H
H
H
O
N
N
(31)
H
H
O
N
N
R
(32)
O
O
N
N H
25
1.4 Especie vegetal Ulex europaeus L.
1.4.1 Ulex europaeus L.
La especie Ulex europaeus L, (figura 7) pertenece al género Ulex de la familia
Fabaceae. Se le conoce con diferentes nombres en el mundo, entre los más
representativos se encuentra el Gorse del inglés, en Portugal se le conoce como Tojo,
en España como Toxo cachás, en Asturias se conoce como Coyota, árgoma, toxu, en el
País Vasco se le conoce como otaka, otalera y en muchos países de Latinoamérica se
le conoce como retamo espinoso o espinillo.
Figura 7. Especie vegetal Ulex europaeus L. (arbusto maduro con inflorescencias).
Fuente: Castroviejo & al. (eds.), Flora ibérica (Real Jardín Botánico).
http://www.rjb.csic.es/floraiberica/ http://www.anthos.es
La especie vegetal Ulex europaeus L., ha sido clasificada bajo la clave taxonómica que
se muestra en la tabla 2, indicando que pertenece a la familia de las Fabeceaes, género
Ulex. Es una planta muy prolifera y se propaga fácilmente ya que sus requerimientos de
subsistencia son muy bajos, crece en climas húmedos y en cualquier tipo de
ecosistema.
26
Tabla 2. Clasificación taxonómica de la especie vegetal Ulex europaeus L.
Clasificación taxonómica Ulex europaeus L.
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Rosidae
Orden Fabales
Familia Fabaceae
Subfamilia Faboideae
Tribu Genisteae
Género Ulex L.
1.4.2 Distribución y hábitat de Ulex europaeus L.
La especie Ulex europaeus L, es nativa de Europa y África pero se ha distribuido a nivel
mundial como se indica en la figura 8, bien sea como planta introducida o por su
proliferación. En la península ibérica tiene un alto grado de propagación, sin embargo
ha tenido un alto impacto en el continente americano, ya que la especie ha conseguido
los medios de propagación más eficientes, que la convirtieron en una plaga o especie
invasora, para lo cual se implementan planes de gestión y erradicación de la especie
vegetal en especial para Colombia y en concreto en los Cerros Orientales del país, la
CAR, emitió un decreto mediante el cual se prohíbe la plantación, comercialización,
distribución, etc. de la especie, sin tenerse en cuenta los aportes a nivel químico que
pueda tener la especie. (CAR, 2010).
27
Figura 8. Distribución mundial de la especie vegetal Ulex europaeus L. Los puntos rojos indican los países en los
cuales se encuentra distribuida la especie vegetal. (Acuña, 2011)
En Colombia (ver figura 9) la especie se encuentra reportada en los departamentos de
Boyacá, Santander, Cundinamarca, Cauca, Huila, Nariño, Tolima, Caldas y Risaralda
(Acuña, 2011). Aunque la especie está distribuida por todo el país teniendo en cuenta
que se adapta fácilmente a cualquier ecosistema.
Si bien la especie vegetal tiene las características correspondientes a la familia
Leguminoseae, hace algunos años se indicó que la clave taxonómica de ésta la
clasifica en esta familia, sin embargo, estudios más recientes, han corroborado que la
clasificación taxonómica del retamo espinoso debe hacerse de acuerdo al orden de los
fabales en la familia de las Fabácea. (Ireson et al., 2013).
28
Figura 9. Mapa de la distribución de la especie vegetal Ulex europaeus L., en Colombia.
Los puntos rojos, indican los departamentos donde se ha reportado la existencia de la especie. (Acuña, 2011)
1.4.3 Características morfológicas de la especie Ulex europaeus L.
Es una planta espinosa (ver figura 10), de 60 a 200 cm de altura, con los tallos
principales rectos o ascendentes, muy ramificados en las zonas más jóvenes pero no
en las más viejas por lo general; esta ramificación es abierta o algo compacta. Las
ramas tienen un indumento formado por pelos largos y patentes y pelos cortos y
adpresos. Las espinas primarias, que son ramas cortas, miden hasta 4 cm de largo, son
rígidas y más o menos rectas; en ellas se implantan espinas secundarias y terciarias, s
o menos fasciculadas, sobre todo las de la base de la planta. Las hojas son alternas,
sin estípulas, trifoliadas y pecioladas en las plantas más jóvenes pero que en las
maduras se reducen a filodios de 5 a 12 cm, lanceolado – lineares a triangulares,
rígidos y espinosos. Las flores aparecen en inflorescencias racemiformes o
paniculiformes, sobre las espinas primarias y en ocasiones en las secundarias, las
flores, pecioladas, tienen una bráctea basal a veces no perceptible y dos bractéolas, de
2 a 6 x 2 a 7.5 mm, más pequeñas bajo el cáliz. El cáliz, de 11 a 16 mm, persistente,
29
aplanado lateralmente, es amarillento y tiene unos pelos gruesos y patentes; el labio
superior de hasta 6 mm de anchura tiene 2 dientes y el inferior 3. La corola, amarilla,
típica papilionácea de la familia, está formado por un estandarte y unas alas más largas
que el cáliz, además de la quilla; el estandarte mide de 14 a 21 x 8 a 17 mm, las alas de
12 a 21 x 3 a 6.5 mm y la quilla de 11 a 16 x 4 a 7 mm. El androceo está formado por
10 estambres soldados para formar un tubo por el cual pasa el estilo y el gineceo por un
ovario sentado y peloso del que sale un estilo curvado en la parte superior. El fruto es
una legumbre pelosa de 10 a 20 x 5 a 7 mm cuyo contenido varía entre 2 y 8 semillas,
como lo indica la figura 6-10.
Figura 10. Descripción morfológica de la especie vegetal Ulex europaeus L. Prof. Dr. Otto Wilhelm Thomé ''Flora von
Deutschland, Österreich und der Schweiz'' 1885, Gera, Germany.
Bracteola
Labio
superior
Inflorescencia
Semilla
Fruto
Estambres soldado
Vista interna del fruto
Cáliz
Vista interna de la semilla
Androceo
30
1.4.4 Etnobotánica de la especie Ulex europaeus L.
Son hasta el momento, muy pocos los estudios que se han realizado alrededor de la
especie vegetal, reportan que las ramas y las flores contienen carotenoides y pigmentos
flavónicos. Las vainas y las semillas contienen alcaloides hepatotóxicos. Las flores son
diuréticas, siendo empleadas en reumatismos y afecciones hepáticas (Menendéz,
2007).
En la mayoría de poblados donde se encuentra la especie vegetal, se le emplea como
cerca viva, dado que se desconoce sus características etnobotánicas.
1.4.5 Estudios químicos y biológicos de la especie Ulex europaeus L.
Si bien la revisión bibliográfica data que el género Ulex se encuentra compuesto por
alrededor de veinte especies, algunas de estas han sido estudiadas de manera sencilla
y superficial, la especie de interés no cuenta con grandes reportes a nivel químico en el
mundo, y su distribución, ubicación y abundancia relativa la convierten en una planta
perene de investigación en la flora silvestre tanto colombiana como mundial. El retamo
espinoso (Ulex europaeus L.), presenta estudios realizados en la Universidad de
Coimbra en Portugal encontrándose algunos carotenoides (Schon, 1936), el Instituto
John Innes de Inglaterra donde se reportaron algunas chalconas y glicósidos
flavonólicos (Harborne, 1962), estudios de biocontrol en Chile (Normabuena & Escobar,
2000), algunos estudios bioquímicos (Pestean et al., 1995) y un estudio de
determinación de algunos alcaloides e isoflavonas en Nueva Zelanda (Russell et al.,
1990), metabolitos a los cuales podría atribuirse la actividad antimicrobiana tal y como
lo reportan Ruiz & Roque en su estudio, donde el análisis fitoquímico preliminar de las
especies estudiadas allí, revela la presencia de flavonoides y alcaloides (Ruiz & Roque,
2009), que podrían estar relacionados directamente con la actividad antimicrobiana y
antifúngica de las especies reportadas.
31
Es de mencionar, que la especie vegetal no es nueva en el conocimiento botánico del
país, sin embargo, son pocos los estudios a nivel fitoquímico que se han realizado en la
especie, entre los estudios realizados a la especie, la mayoría se han enfocado a
determinar y caracterizar molecularmente la estructura genética de la especie, algunos
con carácter medicinal (Pestean et al., 1995), sin embargo, si se han efectuado estudios
pertinentes a la fitoquímica de la especie, con tal de contribuir al conocimiento y
beneficios se han encontrado Isoflavonas como las 5,7-dihidorxi-8-(3,3-dimetilalil)-
[6”,6”-dimetilpirano(2”,3”:4’,3’)]-isoflavona (33), 5-hidroxi-[6”.6”-dimetilpirano(2”,3”:4’,3’)]
[6’”,6’”-dimetilpirano(2’”,3’”:7,8)]-isoflavona (34), 5-hidroxi-[6”,6”-dimetilpirano
(2”,3”:4’,3’)] [1’”,2’”-dihidro-2’”-(1””-hidroxi-1””metiletil)-furano (4’”,5’”:7,8)] isoflavona (35),
y por último la 5-hidroxi-[6”,6”-dimetilpirano (2”,3”:4’,3’)] [6’”-metil-6’”-(hidroximetil)-piran
(2’”,3’”:7,8)]-isoflavona (36) (Russell et al., 1990), alcaloides como la lupanina (1), entre
otros (Hornoy et al., 2012), alcaloides relacionados a mal formaciones en ganado que
consume especies vegetales que lo contienen en grandes concentraciones, además se
han aislado algunos carotenoides (Schon, 1936), además de ello, se han reportado
algunas chalconas presentes en las flores tales como la 4’2’4’-trihidroxichalcona donde
R=R’=H (37), se han reportado algunos glucósidos flavonólicos (Harborne, 1962) a los
cuales se les podría atribuir, la actividad antimicrobiana, como por ejemplo el 7-
glucosido, el 4’-glucosido y el 3,7-diglucosido de Quercetina (38) y 3,7,4’-
trihidroxiflavona (39). (Harborne, 1962).
OH
OH
O
OO
(33) (34)
OH
O
OO
O
32
(35)
OH
OH O
O
O
O
CH3
CH3
CH3
CH3
(36)
O
OH
OH
O
O
O
(37)
OR'O
OHRO
(38)
OH
RO
OH O
O
OR'
OR''
(39)
OH
O
O
OH
OH
33
1.5 Actividad antimicrobiana
1.5.1 Antimicrobianos
Aproximadamente desde el siglo XVIII, el hombre ha empleado sustancias químicas
con el fin de tratar y combatir enfermedades infecciosas. El reconocido Paul Ehrlich, fue
quien formuló los principios de toxicidad selectiva, reconoció las reacciones químicas
específicas entre microorganismos y medicamente, así como la aparición de la
resistencia de estos y el papel de la terapéutica combinada para combatirlos.
Posteriormente se descubrieron las sulfonamidas y se acrecentó el interés en
sustancias antibacterianas de origen microbiano, llamadas antibióticos, de ahí surgen
entonces las conocidas penicilina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol y demás.
El ataque a los microorganismos, por parte de los antimicrobianos, se pueden dar de
diferentes maneras: puede llevarse a cabo por inhibición de la síntesis de la pared
celular, de las funciones de la membrana celular, además puede darse de la traducción
de material genético y de la síntesis de ácidos nucleicos (Manrique & Mosquera, 1977).
El término antibiótico, se refiere a un producto metabólico de un organismo que es
perjudicial o inhibitorio para otros microorganismos en muy pequeñas cantidades y que
afectan en sobremanera la salud, inclusive con riesgo de muerte. Los antibióticos
pueden actuar de dos maneras:
• Como microbiocidas, es decir, que aniquilan las formas vegetativas de los
gérmenes, específicamente se denominan bactericidas, refiriéndose a bacterias
y fungicidas refiriéndose a hongos.
34
• Como microbiostático, es decir, inhibe el crecimiento de microorganismos y se
denomina entonces, bacteriostático o fungistático, refiriéndose a bacterias y
hongos, respectivamente. (Barreto, 1997)
1.5.2 Métodos de evaluación antimicrobiana
Para lograr un correcto tratamiento de las infecciones provocadas por los
microorganismos, fue necesario desarrollar técnicas apropiadas debido a que los
microorganismos eran capaces de inducir resistencia al antimicrobiano que se ha
utilizado contra él durante un periodo largo de tiempo, esta resistencia puede ser
producto de diversos mecanismos como:
• Producción de una sustancia que destruye el antibiótico.
• Adaptación del metabolismo bacteriano para inhibir el antibiótico.
• La pared celular del microorganismo se vuelve impermeable al antibiótico.
• Un fago comunica la resistencia por transducción.
• Desaparición de cepas sensibles y supervivencia de cepas resistentes por un
fenómeno de selección natural.
• Producción de cepas mutantes, ya que para ello existen varias técnicas que
permiten evaluar la actividad antimicrobiana, como lo son los métodos de
dilución, de difusión en gel y el método de bioautografía. (Arévalo & Enciso,
1996).
1.5.2.1 Método de dilución
También llamado turbidimétrico, este método consiste en hacer diluciones seriadas del
antibiótico en µg/ml en caldo de cultivo y un tubo como control de crecimiento de
microorganismo; los tubos se inoculan con una suspensión calibrada del
microorganismo y se incuban a temperatura y tiempo determinados, finalizado el
35
periodo de incubación, los tubos se examinan visualmente para comprobar la existencia
o no de turbidez. (Manrique & Mosquera, 1977).
1.5.2.2 Método de difusión en gel por perforación en placa
Este método consiste básicamente en incorporar al medio de cultivo el antibiótico o el
microorganismo en concentración conocida para que luego de solidificado el medio, se
adicione la contraparte y de esta manera observar la inhibición de crecimiento o halos
de inhibición según la técnica utilizada. Esta técnica, también es conocida como discos
de papel, en la cual el compuesto se incorpora a discos de papel absorbente en
concentración conocida, los cuales se colocan sobre la superficie de una caja de agar
sembrado masivamente con el microorganismo en estudio, luego de incubar a la
temperatura y tiempo adecuados se observan halos de inhibición de crecimiento.
(Arévalo & Enciso, 1996).
Una de las grandes ventajas de ésta técnica de evaluación de actividad antimicrobiana
es que requiere de muy pequeñas cantidades de extracto o aceite a evaluar y ofrecen la
posibilidad de ensayar varias sustancias contra un mismo microorganismo. (Arévalo &
Enciso, 1996). Con esta técnica y realizando diluciones del aceite esencial a evaluar, se
puede determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC), que se define como la
menor concentración de antibiótico en µg/ml capaz de inhibir el desarrollo in vitro del
microorganismo en estudio y la Concentración Mínima Bactericida (MBC),
considerándose como la menor concentración del antibiótico en µg/ml que mata los
microorganismos in vitro (Arévalo & Enciso, 1996).
36
1.5.2.3 Método de bioautografía
Este método consiste en incluir los cromatogramas obtenidos por cromatografías en
capa fina en un medio de cultivo. Para ello se utilizan placas cromatográficas de sílica
gel 60F 254 de MERCK o de celulosa las cuales se colocan en las cajas petri
correspondientes. Es necesario que previamente sea eliminado el disolvente, con el fin
de evitar falsas bandas de inhibición. (Manrique & Mosquera, 1977).
La bioautografía ha sido considerada como el ensayo más eficiente para la detección
de componentes bactericidas, porque esta permite la localización de la actividad en un
complejo matriz y por lo tanto permite un directo aislamiento de los constituyentes
activos. Así pues, este ensayo se puede dividir en tres grupos:
1. Bioautografía directa: Donde los microorganismos crecen directamente sobre la
capa fina cromatográfica.
2. Bioautografía de contacto: Donde los componentes bactericidas son transferidos
e la fina capa cromatográfica y son inoculados en una caja de agar a través de
contacto directo.
3. Bioautografía cubierta de agar o inmersión de bioautografía: Es donde el medio
de agar sembrado s aplicado encima de la fina capa cromatográfica. (Manrique &
Mosquera, 1977)
37
2 METODOLOGÍA
2.1 Recolección y preparación del material vegetal
Nueve especímenes del material vegetal fueron recolectados en el bosque de
Monserrate (que hace parte del páramo del Sumapaz), ubicado en el barrio la
perseverancia de Bogotá, (Coordenadas Geográficas latitud: 4°36’24.74”N y longitud:
74°3’52.27”O); en las fechas que se especifican en la tabla 3; los porcentajes de
rendimiento obtenidos fueron entre 0.0208% y 0.0258%. Los individuos recolectados
para cada extracción de aceites esenciales fueron seleccionados teniendo en cuenta
que la planta se encontrará en proceso de floración, que presentara frutos y que todas
las partes aéreas estuvieran frescas (flores, hojas, frutos). El material vegetal fue
reducido de tamaño sin discriminar los órganos de la planta para la extracción de
aceites esenciales. Por otro lado una muestra de 790g de material vegetal fue secada a
temperatura ambiente y posteriormente molida para su extracción por maceración en
frío con etanol (EtOH), y otra muestra testigo fue enviada al Herbario Nacional de
Colombia para su identificación taxonómica la cual fue clasificada como Ulex europaeus
L., bajo el número de colección COL 596977, identificada por el biólogo Carlos Alberto
Parra.
Tabla 3. Porcentaje de rendimiento calculado para cada extracción de aceite esencial de la especie Ulex europaeus.
Muestra Fecha de recolección Rendimiento (%)
1 12 de Enero de 2016 0.0208
2 15 de Marzo de 2016 0.0192
3 24 de Mayo de 2016 0.0317
4 25 de Julio de 2016 0.0384
5 15 de Agosto de 2016 0.0222
6 31 de Agosto de 2016 0.0210
7 06 de Octubre de 2016 0.0220
8 17 de Octubre de 2016 0.0333
9 28 de Octubre de 2016 0.0258
38
El porcentaje de rendimiento de cada extracción fue determinado utilizando la
ecuación 1.
Ecuación 1. Porcentaje de rendimiento de aceite esencial de U. europaeus L.
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒
𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙𝑥 100
El porcentaje se calculó teniendo en cuenta los mililitros (mL) de aceite esencial
obtenido en cada extracción con respecto a la masa de material vegetal fresco
recolectado en gramos (g).
2.2 Extracción y caracterización del aceite
2.2.1 Extracción y caracterización química de los aceites esenciales por el
método de arrastre con vapor
Los aceites esenciales fueron obtenidos a partir de plantas frescas (450g en promedio)
por arrastre con vapor, obteniéndose 0,1mL de aceite esencial con porcentajes de
rendimiento entre 0.0208% y 0.0258%. La composición química de los aceites se
determinó por CG-EM y la identificación se realizó a través del cálculo de los índices de
retención (IR) y comparación con los espectros de masas almacenados en la librería
NIST 08.
Los índices IR se calcularon teniendo en cuenta los tiempos de retención de una serie
homologa de patrones de hidrocarburos desde C9 hasta C20, analizados por CG-EM
bajo las mismas condiciones que los aceites esenciales.
Los valores fueron calculados aplicando la Ecuación 2:
𝑅 = 100𝑛 + 100 [𝑡𝑅𝑋 − 𝑡𝑅𝑛
𝑡𝑅𝑁 − 𝑡𝑅𝑛]
Ecuación 2. Fórmula matemática para la determinación de los índices de retención (IR) (Babushok et
al., 2011)
39
Dónde,
IR: Índice de retención de compuesto de interés X.
n: Número de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del compuesto de
interés X.
N: Número de átomos de carbono del n-alcano que eluye después del compuesto de
interés X.
tRX: Tiempo de retención del compuesto de interés X.
tRN: Tiempo de retención del n-alcano que eluye después del compuesto de interés X.
tRn: Tiempo de retención del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés X.
2.2.2 Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas
Para la determinación de la composición química del aceite esencial de las partes
aéreas se utilizó un cromatógrafo de gases con detector selectivo de masas
SHIMADZU QP2010 plus, ubicado en el laboratorio de Química de la Universidad
Distrital Francisco José de Caldas.
Para la separación de los compuestos presentes en el aceite esencial de las partes
aéreas de la especie vegetal Ulex europaeus L., se empleó una columna DB5 marca
Restek Rxi-5ms compuesta por 5% difenil y 95% dimetil polisiloxano de 30m de
longitud, 0.18mm de diámetro interno y 0.30μm de espesor de película, con una
inyección en modo Split (10:1), el gas de arrastre utilizado fue helio (grado 5.0) con flujo
constante de 1,2 mL/min. La programación de temperatura del horno fue de 40°C (5
min); 4°C/min hasta 160°C; 2.50°C/min hasta 220°C; 8°C/min hasta 280°C (4 min). Los
espectros de masas fueron tomados en un equipo SHIMADZU MS QP2010 dotado con
sonda de inserción directa y analizador de masas cuadrupolar. El modo de ionización
electrónica (IE) a 70eV y la temperatura de la cámara de ionización de 230°C.
40
2.2.3 Análisis multivariado de los aceites esenciales extraídos de la especie
vegetal Ulex europaeus L.
Se realizó el Análisis de Componentes Principales (ACP) de los nueve perfiles de
aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L., empleando los software
estadísticos Minitab 17 y OriginPro 8, con el fin de optimizar los parámetros de
identificación de los compuestos más representativos en las extracciones de aceites
esenciales de la especie vegetal y organizar la composición de compuestos
representativos o relevantes al estudio de la especie Ulex europaeus L.
Se emplearon dos métodos estadísticos: Análisis Multivariado de Componentes
Principales (ACP) y Análisis de Conglomerados Jerárquicos o Clusters (ACJ), con el fin
de estandarizar un modelo interpretativo del comportamiento de los compuestos
químicos reportados por CG-EM, en cuanto a la composición de aceites esenciales de
la especie vegetal Ulex europaeus L.
2.2.3.1 Análisis de Componentes Principales (ACP)
El ACP, es una técnica estadística de síntesis de la información, donde se reduce la
dimensión del número de variables, es decir, ante un banco o matriz de datos con
muchas variables con el objetivo de reducir a un menor número de variables o
componentes principales (CP) perdiendo la menor cantidad de información posible. En
este contexto, los nuevos componentes principales o factores serán una combinación
lineal de las variables originales, y además serán independientes entre sí.
Un aspecto importante y fundamental en ACP es la interpretación de los factores, ya
que ésta no viene dada a priori, sino que será deducida tras observar la relación de los
factores con las variables iniciales, para ello se debe analizar en detalle tanto el signo
como la magnitud de las correlaciones.
41
2.2.3.1.1 Análisis de la matriz de correlaciones
Un análisis de componentes principales tiene sentido en la medida que deben existir
altas correlaciones entre las variables seleccionadas, ya que esto es indicativo de que
existe información redundante y, por tanto, pocos factores explicarán gran parte de la
variabilidad total.
2.2.3.1.2 Selección de los factores
La elección de los factores se realiza de tal forma que el primero recoja la mayor
proporción posible de la variabilidad original; el segundo factor debe recoger la máxima
variabilidad posible que no logró ser recogida en el primer factor, y así sucesivamente.
Del total de los factores proporcionados por el ACP se elegirán aquellos que recojan el
mayor porcentaje de variabilidad que se considere suficiente, éstos serán los
denominados componentes principales.
2.2.3.1.3 Análisis de la matriz factorial
Una vez seleccionados los componentes principales, se representan en forma de
matriz. Cada elemento de ésta, representa los coeficientes factoriales de las variables
(correlaciones entre cada una de las variables y los componentes principales). La matriz
tendrá tantas columnas como componentes principales y tantas filas como variables.
2.2.3.1.4 Interpretación de los factores
Para que un factor sea fácilmente interpretable debe tener unas características
específicas; en este sentido, se busca que los coeficientes factoriales deben ser
próximos a 1, pero no pueden tomar el valor de 1. Una variable debe tener coeficientes
elevados sólo con un factor y por último no deben existir factores con coeficientes
similares.
42
2.2.3.1.5 Cálculo de las puntuaciones factoriales
Para calcular las puntuaciones que tienen los componentes principales para cada caso,
se emplea la ecuación 3.
Ecuación 3. Ecuación de cálculo para determinar las puntuaciones de los componentes principales.
Fuente: (Terrádez, 2017)
Donde los a son los coeficientes y los Z son los valores estandarizados que tienen las
variables en cada uno de los sujetos de la muestra.
Para el ACP se empleó el software estadístico Minitab 17, tomando como variables
cada uno de los perfiles de los aceites esenciales, así como el porcentaje de
coincidencia de cada uno de los compuestos encontrados, comparados con el espectro
de masas proporcionado por la librería NIST 08, y los índices de retención tanto teórico
como el calculado.
43
2.2.3.2 Análisis de Conglomerados Jerárquicos o Cluster (ACJ)
El Análisis Cluster, conocido comúnmente como Análisis de Conglomerados, es una
técnica estadística multivariante cuyo fin es agrupar elementos (variables) tratando de
lograr la máxima homogeneidad en cada grupo y la mayor diferencia entre los grupos.
El ACJ es una herramienta ampliamente utilizada en muchas áreas de investigación,
pero se debe hacer claro énfasis en que la técnica ACJ es una técnica netamente
descriptiva, ateórica y no inferencial, por ende no tiene bases estadísticas
profundizadas sobre las que deducir inferencias estadísticas para una población a partir
de una muestra, ya que es un método basado en criterios geométricos y se utiliza
principalmente como exploratoria, descriptiva pero no explicativa.
En este sentido no son únicas, en la medida en que la pertenencia al conglomerado
para cualquier número de soluciones depende de muchos elementos del procedimiento
elegido. Así, la solución Cluster depende totalmente de las variables utilizadas, por
adición o destrucción de variables relevantes se puede generar un impacto substancial
sobre la solución resultante, que se verá reflejada en datos atípicos muy sobresalientes
que no aportan ninguna relación al ACJ y se mostrarán como datos independientes. (de
la Fuente, 2011)
Los algoritmos de formación de conglomerados se agrupan en dos categorías:
2.2.3.2.1 Algoritmos de partición
Se refiere al método de dividir el conjunto de observaciones en k conglomerados
(clusters), donde k lo define inicialmente el usuario.
44
2.2.3.2.2 Algoritmos jerárquicos
Es el método que entrega una jerarquía de divisiones del conjunto de elementos en
conglomerados o agrupaciones. Se parte de una situación en la que cada observación
forma un conglomerado y sucesivamente se va uniendo paso a paso, hasta que
finalmente todas las situaciones están en un único conglomerado.
2.3 Extracción con etanol y fraccionamiento del extracto etanólico de las partes
aéreas de Ulex europaeus L.
El material vegetal seco y reducido de tamaño fue sometido a una extracción con etanol
por el método de maceración en frío, obteniéndose 25.07g (3.173% de rendimiento) de
extracto total etanólico de Ulex europaeus L., (E.EtOH.Ue) el cual fue floculado con
agua, posteriormente filtrado y concentrado a presión reducida a 40°C.
Al extracto etanólico se le realizó pruebas químicas de precipitación y/o coloración
(figura 11), con el fin de conocer los posibles grupos de metabolitos secundarios
presentes en las partes aéreas de la especie vegetal y obtener un panorama más
detallado del tipo de compuestos químicos que se pueden encontrar en la especie
vegetal con el fin de relacionar algunos de estos compuestos a una posible actividad
biológica en este caso antimicrobiana.
45
Figura 11. Metodología MFP de las partes aéreas de Ulex europaeus L. Elaborado a partir de la MFP propuesta por
Álvaro Sanabria y Olga Loock De Ugaz. (Sanabria A. 1983, Loock O. 2004.)
46
Para el fraccionamiento del extracto etanólico, se empleó el método de extracción
líquido – líquido discontinuo (LLD) como se indica en la figura 12, con solventes de
polaridad creciente obteniéndose las fracciones de hexano (F.Hex.Ue), diclorometano
(F.CH2Cl2.Ue), acetato de etilo (F.AcOEt.Ue) y butanol (F.ButOH.Ue) y el residuo
hidroalcoholico.
Figura 12. Diagrama de Fraccionamiento Líquido-Líquido Discontinuo del extracto etanólico de Ulex europaeus L.
Resaltados en color amarillo se encuentran los porcentajes de rendimiento.
E.EtOH.Ue (3.173%)
L.L.D
Hexano
F.Hex (1.439%)
Rotaevaporar
R. Hidroalcohólico
Δ
(
F.CH (3.08%) 2 Cl 2 R. Hidroalcohólico
Δ
Diclorometano
F.AcOEt (2.02%)
Δ
Acetato de etilo
R. Hidroalcohólico
F.ButOH (5.94%)
Butanol
R. Hidroalcohólico
Concentrar a presión reducida
Concentrar a presión reducida
Concentrar a presión reducida
Concentrar a presión reducida
47
2.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana se realizó siguiendo el método de difusión en gel
perforación en placa (Arévalo & Enciso, 1996; Rodriguez et al., 2007), los
microorganismos se seleccionaron teniendo en cuenta su facilidad de desarrollo y
crecimiento en medios de cultivo convencionales para ensayos de susceptibilidad a
antibióticos. Cada una de las cepas se fueron conservadas bajo refrigeración a 4°C, y
fueron sembradas por estrías en placa con Agar Mueller Hinton (AMH) y posterior
incubación a 37°C por 24 horas, al cabo de las cuales se tomó una colonia y se sembró
en 5mL de caldo Mueller Hinton; incubándose a 37°C por 18 horas, se realizaron
resiembras sucesivas en el mismo caldo para asegurar que los microorganismos se
encontraban en la fase de crecimiento exponencial 107 y 108 UFC.
Se realizaron cuatro perforaciones equidistantes de 6mm de diámetro sobre cajas de
Petri con (AMH), con un hisopo se sembró el inoculo bacteriano sobre la superficie del
agar en 3 direcciones y el reborde de la placa, dejando secar por cinco minutos, luego
se agregaron las muestras para análisis: (Staphylococcus aureus y Escherichia coli) en
cajas de petri por separado, en total se obtuvieron ocho cajas de Petri distribuidas de la
siguiente manera: en las primeras cuatro se inoculó la bacteria Escherichia coli, y en las
cuatro cajas restantes se inoculó la bacteria Stahpylococcus aureus. Se prepararon
cuatro disoluciones de cada una de las fracciones; para ello se tomaron 100mg de las
fracciones a ensayar (F.Hex.Ue; F.CH2Cl2.Ue; F.AcOEt.Ue y F.ButOH.Ue) y se llevaron
a volumen final de 1 ml con (DMSO). De cada dilución se tomaron alícuotas de 20, 40,
60 y 80 µL y fueron sembradas en las perforaciones mencionadas para cada bacteria
por cada fracción, dejando en predifusión durante 30 minutos a temperatura ambiente,
incubándose a 37°C, a las 20 horas de transcurrida la difusión, se realizaron las
medidas de los diámetros de inhibición. Graficando el logaritmo natural (ln) de las
concentraciones empleadas contra el cuadrado de los diámetros de inhibición (X2), se
realizó un reajuste por mínimos cuadrados y extrapolación de la recta para hallar el
punto de intersección sobre la ordenada el cual corresponde al valor de la
concentración crítica (masa crítica) expresada en µg/µL que representa una medida de
48
la susceptibilidad de un microorganismo de prueba (Koneman, 1999). En cuanto a la
masa crítica (ecuación 3), se determinó entonces que en cada pozo se encuentra una
masa relativa de extracto de 2, 4, 6 y 8 mg para cada fracción. Cada una de las
fracciones del extracto etanólico fue probada contra las cepas de bacterias:
Staphylococcus aureus y Escherichia coli, cuyas patologías asociadas se describen en
la tabla 4.
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑎 =ln 𝐶
𝑋^2
Ecuación 4. Determinación de la masa crítica de las fracciones de Ulex europaeus frente a las cepas de bacterias.
Donde,
Ln C, es el logaritmo natural de la concentración
X^2, es el cuadrado del halo de inhibición
Tabla 4. Cepas de bacterias con las cuales se probó las fracciones del extracto etanólico de la especie vegetal Ulex
europaeus L.
Nombre de la especie Patología asociada Clasificación
(GRAM + / GRAM -) Referencia
Escherichia coli
ATCC 25922
Diarreas crónicas e
infecciones urinarias
GRAM negativo
(bacilo) (Rodríguez G. , 2002)
Staphylococcus aureus
ATCC 25923 Enfermedades cutáneas
GRAM positiva
(coco) (Kobayashi et al., 2015)
Finalmente, se realizó un análisis estadístico de varianza (ANOVA), empleando el
software estadístico Minitab 17; el análisis de los resultados de actividad antimicrobiana
permitió inferir que las fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico de la
especie vegetal presentan actividad inhibitoria de las bacterias Escherichia coli (excepto
la fracción de diclorometano con resultados negativos) y Staphylococcus aureus), sin
embargo se requieren más mediciones de concentración con el fin de ampliar el rango
de varianza de los datos.
49
3 RESULTADOS Y ANÁLISIS.
3.1 Análisis Fitoquímico Preliminar (AFP)
Los resultados obtenidos de los ensayos químicos preliminares realizados al extracto
etanólico de las partes aéreas (E.EtOH.Ue) de la especie vegetal Ulex europaeus L., se
encuentran consignados en la tabla 5, todos los ensayos químicos fueron comparados
frente a estándares como controles positivos para cada grupo de metabolitos
secundarios en particular.
Tabla 5. Resultados del Análisis Fitoquímico Preliminar de partes aéreas de la especie vegetal Ulex europaeus L.
Grupo de
metabolitos
secundarios
Prueba Química Control positivo Resultados
(E.EtOH.Ue)
Flavonoides Shinoda E.EtOH Allium fistulosum L. +
Leucoantocianidinas Rosenheim E.EtOH Allium fistulosum L. -
Taninos
Cloruro Férrico
Ácido Gálico (sólido)
+
Acetato de Plomo -
Gelatina-sal -
Carotenoide NaOH 10%
Fruto seco Bixa Orellana
+
Triterpenos
Esteroides
Liebermann –
Burchard -
Cardiotónicos Baljet E.EtOH.H Digitalis purpurea -
Quinonas Borntrager Alizarina -
Alcaloides
Valser
.EtOH.F Brugmansia candida Pers.
+
Mayer +
Wagner +
Dragendorff +
Scheleiber +
Cumarinas Hidroxamato Férrico E.EtOH.Fl Calendula officinalis L. -
(+): Resultado positivo. (-): Resultado negativo. (E.EtOH): Extracto etanólico. (E.EtOH.Ue): Extracto etanólico Ulex
europaeus L. (E.EtOH.H): Extracto etanólico hojas. (E.EtOH.F): Extracto etanólico frutos. (E.EtOH.Fl): Extracto
etanólico flores.
50
Los resultados del Análisis Fitoquímico Preliminar, en comparación con estudios
realizados anteriormente a la especie, confirman la presencia de metabolitos
secundarios como flavonoides, los cuales son reportados por Spínola et al, (2016),
también fueron encontrados alcaloides confirmando los reportes de (Hornoy et al.,
2012), se logró evidenciar la presencia de carotenoides en la planta como indican
Martínez et al., en (2011) y Harborne (1962); y también se reporta que la planta puede
contener taninos, para especies vegetales pertenecientes a la familia Fabaceae y en
particular a la especie vegetal como indican Ruíz y Roque (2009).
Los grupos de metabolitos secundarios identificados, indican que la especie vegetal es
promisoria de alcaloides (todas las pruebas de alcaloides resultaron positivas), para
flavonoides y posiblemente carotenoides como se indicó en la tabla 5, metabolitos
secundarios que están relacionados con la actividad antimicrobiana y antifúngica como
menciona Harborne (1962). En los resultados de la AFP se logró determinar que la
especie vegetal no posee leucoantocianidinas y taninos (salvo para la prueba con
cloruro férrico que resultó positiva generando incertidumbre respecto a que este grupo
de metabolitos se encuentre en la planta), tampoco se encuentran triterpenos,
esteroides, compuestos cardiotónicos, quinonas ni cumarinas lo cual está de acuerdo
con lo reportado previamente en otros estudios.
3.2 Obtención del aceite esencial por el método de arrastre con vapor
Los resultados obtenidos permiten inferir que sin importar la época del año en que se
realiza la recolección (ciclos geoestacionarios, estrés metabólico), la planta no produce
una esencia fluida; las carácterísticas físicas del aceite extraído en las nueve muestras
de partes aereas de Ulex europaeus L., coincide con la descripción de un bálsamo
(sustancia de consistencia espesa, poco volátiles y propensos a polimerizarse)
(Stashenko & Combariza, 1998). Los aceites fueron almacenados en frío, para su
posterior análisis por CG-EM.
51
3.3 Identificación de los componentes volátiles de los aceites esenciales
Los constituyentes de cada uno de los aceites esenciales extraídos de las partes
aéreas de la especie Ulex europaeus, se analizaron mediante la técnica CG-EM,
siguiendo la metodología descrita en el numeral 2.2, y se encuentran reportados en la
tabla 6 teniendo en cuenta: fórmula molecular, clasificación, porcentaje de coincidencia,
índices de retención tanto teóricos como calculado en promedio y los porcentajes de
área reportados en cada perfil.
Tabla 6. Totalizado de los compuestos químicos reportados por CG-EM de los aceites esenciales de la especie
vegetal Ulex europaeus L.
Compuesto No FM C % IRt IRc
prom. P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
D-Limoneno 1 C10H16 M 92 1024 1042,8 2,13 1,74 0 0,88 0 0 0 0 0
Nonanal 2 C9H18O HA 91 1100 1111,9 0,68 0,38 0 0,26 0 0 0 0,23 0,23
Ácido Decanoico 3 C10H20O2 MO 94 1364 1378,1 0,60 33,1
9 0 0 1,27 0,80 2,77 0,62 0
α-Ilangeno 4 C15H24 S 76 1373 1373,1 0,51 0 0 0 0 0 0 0 0
α-Cubebeno 5 C15H24 S 80 1345 1355,4 0,41 0 0 0 0 0 0 0 0
Cariofileno 6 C15H24 S 91 1408 1405,1 0,44 0 0,42 0 0 0 0 0,65 0
Aristoleno 7 C15H24 S 90 0 0 1,70 2,80 0 0 0,70 0,58 0 0 0
3-metil-5-propilnonano 8 C13H28 HA 92 0 0 1,23 0,42 1,47 2,55 0 0 0 0 0
Propanoato de Geranilo 9 C13H22O2 HA 87 1476 1465,7 0,53
0,29 0 0 0 0 0 0 0
3,7-dimetilnonano 10 C11H24 HA 91 0 0 0,40 0 0 0,16 0,75 1,25 0 0 0
Butirato de Geranilo 11 C14H24O2 HA 92 1562 1553,7 0,56 0,40 0 0 0,74 1,95 0 0 0
Tridecanal 12 C13H26O HA 96 1511,6 1525,4 0,51 1,06 1,10 0 0 0
0 0 0
Guaiol 13 C15H26O S 80 1600 1585,2 0,79 0 0 0 0,96 0 0 0 0
δ-Cadinol 14 C15H26O SO 87 1644 1657,3 0,00 2,01 0 0 0 0 0 0 0
Tiglato de Geranilo 15 C14H24O2 SO 95 1700,8 1687,2 4,84 7,60 0,50 0 3,22 3,61 0 0 0
2,3,5-trimetildecano 16 C13H28 HA 91 0 0 0,35 0 0 0 0 0 0 0 0
Acetato de Nerol 17 C12H20O2 HA 90 1359 1378,0 1,28 0,95 0 0 0 0 0 0 0
Octadecanal 18 C18H36O HA 95 0 0 4,21 0 0,93 0,31 0 0 0 0 0
i-Valerato de Linalilo 19 C15H26O SO 80 0 0 0,35 1,06 0 0 0,21 0 0 0 0
Pentadecanal 20 C15H30O HA 94 1714,4 1719,8 0,91 0,32 0,59 0,41 2,81 2,69 4,89 5,34 0,40
Hexahidrofarnesil acetona 21 C18H36O HA 96 1844,4 1839,4 2,46 1,15 6,41 6,41 0,22 0 6,43 2,01 0,52
Acetato de Lavanduloilo 22 C12H20O2 HA 89 1288 1276,0 0,00 1,96 0 0 0 0 0 0 0
(Z)-7,10,13-Hexadecatrienal 23 C16H26O HA 94 0 0 0,36 0 1,63 0,24 0 0 0 0 0
Tetradecano 24 C14H30 HA 94 1400 1392,1 0,00 0 1,01 0,66 0 0 0 0 0
52
Compuesto No FM C % IRt IRc
prom. P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
Metoleno 25 C17H34O2 HA 94 0 0 5,12 0 0 0 0 0 0,68 2,31 1,11
Heptadecano 26 C17H36 HA 94 1700 1706,3 5,45 0,70 4,12 2,64 0 15,3 0,83 0 0
β-Citronelol 27 C10H20O MO 97 1223 1230,0 25,65 4,43 12,3
3 6,20 0 16,8 0 0 0
Acetato de Geranilo 28 C12H20O2 HA 86 1379 1378,5 4,26 0 0 0 1,70 0 0 0,24 0
2,6,10,15-tetrametil-heptadecano
29 C21H44 HA 94 0 0 1,11 0 1,02 0,99 1,62 1,66 0 0,36 0
Eicosano 30 C20H42 HA 96 2000 1991,4 16,92 0,47 1,76 2,40 20,9
0 34,1 1,19 0,93 0,33
Tetratetracontano 31 C44H90 HA 96 0 0 3,72 0,72 1,27 3,09 21,9
5 0 0 3,34 0,55
1-octen-3-ol 32 C8H16O HA 97 980,0 0 0 0,54 0 0 0 0 0 0 0
Linalol 33 C10H18O MO 97 1095 1107,5 0 2,49 0 0 0 0 0 0 0
Geraniol 34 C10H18O MO 95 1249 1238,2 0 7,26 0 0 0 0 0 0 0
β-Bourboneno 35 C15H24 S 92 1387 1381,0 0 0,43 0 0 0 0 0 0 0
Ácido 2-decenoico 36 C10H18O2 MO 95 0 0 0 6,43 0 0 0 0 0 0 0
α-Guaieno 37 C15H24 S 94 1437 1428,0 0 0,32 0 0 0 0 0 0 0
Germacreno D 38 C15H25 S 91 1480,6 1472,0 0 0,50 0 0 0 0 1,02 0 0
Isoledeno 39 C15H26 S 87 1374 1362,0 0 0,36 0 0 0 0 0 0 0
i-Butirato de Geranilo 40 C14H24O2 HA 91 1514,0 1506,0 0 0,75 0 0 0 0 0 0 0
Fenil etil tiglato 41 C13H16O2 HA 96 1584 1584,8 0 2,32 0 0 0 0 0 0 0
Cubenol 42 C15H26O SO 87 1636,5 1638,8 0 0,37 0 0 0 0 0 0 0
γ-Eudesmol 43 C15H26O SO 88 1630 1626,1 0 6,40 0 0 0 0,83 0 0 0
Elemol 44 C15H26O SO 83 1548 1538,3 0 0,82 0 0 0 0 0 0 0
Epiglobulol 45 C15H26O SO 82 0 0 0 0,54 0,30 0 0 0 0 0 0
epi-α-Cadinol 46 C15H26O SO 89 1638 1641,4 0,7 2,01 0 0 0 0 0 0 0
β-Eudesmol 47 C15H26O SO 94 1649 1658,8 0 0,83 0 0 0 0 0 0 0,36
Heneicosano 48 C21H44 HA 97 2100 0 0 1,99 11,9
6 15,3 11,9 0 0 3,00 6,08
Aromadendreno 49 C15H24 S 95 1439 1432 0 0 4,77 0,47 0 0 0,77 0 0
Humuleno 50 C15H25 S 87 1417 1423,6 0 0 0,49 0 0 0 0 0 0
Oxido de Cariofileno 51 C15H24O SO 86 1582 1590,5 0 0 0,68 0 0 0 0 0 0,59
Ledol 52 C15H26O SO 87 1566,8 1572,3 0 0 1,13 0 0 0 0 0 0
Viridiflorol 53 C15H26O SO 74 1592 1597,4 0 0 0,34 0 0 0 0 0 0
Ácido α-linoleico 54 C18H30O2 HA 88 2132 2144,9 0 0 1,47 0 0 0 0 0 0
Undecanol 55 C11H24O HA 90 1367 1371,0 0 0 0,80 0 0 0 0 0 0
Miristaldehído 56 C14H28O HA 95 1612,3 1593,5 0 0 5,93 4,20 0 0 0,74 0,30 0
1-tetradeceno 57 C14H28 HA 91 1388 1393,3 0 0 0,33 0 0 0 0 0 0
α-Felandreno 58 C10H16 M 80 1002 1008,9 0 0 0,40 0 0 0 0 0 0
Tetracosano 59 C24H50 HA 95 2400 0 0 0 21,8
5 2,55 0 0 0,50 7,58 3,34
Acetato de octanol 60 C10H20O2 MO 92 1211 1215,9 0 0 0 0,45 0 0 0 0 0
Nerodilol 61 C15H26O SO 88 1531 1540,8 0 0 0 0,41 0 0 0 0 0
Isopulegol 62 C10H18O MO 83 1145 0 0 0 0 0,71 0 0 0 0 0
53
Compuesto No FM C % IRt IRc
prom. P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
8-hexil-pentadecano 63 C21H44 HA 95 0 0 0 0 0 34,8
3 0 0 0 0 0,36
Pentadecanol 64 C15H32O SO 92 0 0 0 0 0 0,14 0 0 0,25 0 0
β-Mirceno 65 C10H16 M 75 989,2 1000,6 0 0 0 0 0,29 0 0 0 0
α-Copaen-8-ol 66 C15H26O SO 78 0 0 0 0 0 0 0,27 0 0 0 0
cis, cis-5,10-Pentadecadien-1-ol 67 C15H28O SO 85 0 0 0 0 0 0 2,79 0 0 0 0
1-metil-3-(2-metil-2-propenil)ciclopentano
68 C10H18 M 73 0 0 0 0 0 0 0,15 0 0 0 0
D-Isomentol 69 C10H20O MO 89 0 0 0 0 0 0 11,9
8 0
11,13
31,05 29,3
3
Tiglato de etilo 70 C13H16O2 HA 80 1584 1584,3 0 0 0 0 0 0,32 0 0 0
2-(1,1-Dimetiletil)-5-oxohexanal
71 C10H18O2 MO 82 0 0 0 0 0 0 0 1,53 0 0 0
Germacreno A 72 C15H24 S 90 1508 1501,3 0 0 0 0 0 0 0,63 0 0
Pristano 73 C19H40 HA 91 0 0 0 0 0 0 0 0 2,10 0 0
(Z)-1,5,9,9-tetrametil-1,4,7-cicloundecatrieno
74 C15H24 S 93 0 0 0 0 0 0 0 0 0,66 0 0
Elixeno 75 C15H24 S 92 0 0 0 0 0 0 0 0 0,49 0 0
γ-Muuroleno 76 C15H24 S 92 1478 1489,9 0 0 0 0 0 0 1,37 0 0
δ-Cadineno 77 C15H24 S 87 1522 1530,2 0 0 0 0 0 0 0,45 0 0
+/-.-trans-Nerolidol 78 C15H26O SO 91 1560,9 1570,4 0 0 0 0 0 0 0,32 0 0
γ-Cadineno 79 C15H24 S 87 1513 1510,2 0 0 0 0 0 0 0,39 0 0
Tetratriacontano 80 C34H70 HA 93 3400 0 0 0 0 0 0 0 1,03 14,42 2,06
Geranil-linalol 81 C20H34O DO 89 1960 0 0 0 0 0 0 0 0,47 0 0
Triacontano 82 C30H62 TT 92 3000 0 0 0 0 0 0 0 8,14 0,97 14,9
5
β-Pineno 83 C10H16 M 92 974 986,8 0 0 0 0 0 0 0 0,47 0
β-Ionona 84 C13H20O HA 95 1487 1498,5 0 0 0 0 0 0 0 0,96 0
Thujopseno 85 C15H24 S 79 1432 1441,9 0 0 0 0 0 0 0 0,26 0
Hexadecanoato de etilo 86 C18H36O2 HA 88 1992 0 0 0 0 0 0 0 0 0,28 0
Linoleato de metilo 87 C19H34O2 HA 92 2095 0 0 0 0 0 0 0 0 1,08 1,75
3-Isopropenil-2-metilciclohexanol
88 C10H18O MO 72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,46
Neo-Mentol 89 C10H20O MO 85 1167,4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5,12
Linoleato de etilo 90 C20H34O2 DO 87 2158,8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,25
(FM): Fórmula Molecular, (C): Clasificación, (%): Porcentaje de coincidencia, (IRt): Índice de Retención
teórico (Adams, 2007), (IRc prom.): Índice de Retención calculado promedio en columna DB5, (P1 a P9):
% de área de cada compuesto en los perfiles 1 a 9
De la composición química total de los nueve aceites y según el porcentaje de área
respecto al total de compuestos hallados por perfil fueron identificados como
componentes mayoritarios para el perfil 1 los compuestos: β-citronelol (25.65%),
54
eicosano (16.92%) y heptadecano (5.45%) para un perfil que reporta el 88.72% del
porcentaje total.
Para el perfil 2 se encontraron los compuestos mayoritarios: ácido decanoíco (33.19%),
tiglato de geranilo (7.60%) y geraniol (7.26%) para un perfil que reporta el 96.51% del
porcentaje total.
En el perfil 3 se encontraron como compuestos mayoritarios: tetracosano (21.85%), β-
citronelol (12.33%), y heneicosano (11.96%); perfil que reportó el 85.01% del porcentaje
total.
En el perfil 4 se encontraron los compuestos mayoritarios: 8-hexilpentadecano
(34.83%), heneicosano (15.3%) y hexahidrofarnesil acetona (6.41%); el porcentaje
aportado por dicho perfil es 86.32% del porcentaje total.
Para el perfil 5 se reportan como compuestos mayoritarios: tetratetracontano (21.95%),
eicosano (20.96%) y D-isomentol (11.98%); este perfil aportó el 84.49% del porcentaje
total.
En el perfil 6 se reportaron los compuestos mayoritarios: eicosano (34.1%), β-citronelol
(16.8%) y heptadecano (15.3%), perfil que aportó el 81.45% del perfil total.
El perfil 7 reportó el menor porcentaje de área total: 47.25% y en este se encontraron
los compuestos: D-isomentol (11.13%), triacontano (8.14%) y hexahidrofarnesil acetona
(6.43%) como mayoritarios.
Para el perfil 8 se reportaron como compuestos mayoritarios: D-isomentol (31.05%),
tetratriacontano (14.42%) y tetracosano (7.58%); el porcentaje aportado de este perfil
con respecto al total fue de 76.40%.
55
Por último en el perfil 9 se encontraron los compuestos mayoritarios: D-isomentol
(29.33%), triacontano (14.95%) y 3-isopropenil-2-metilciclohexanol (7.46%); perfil que
aportó un 74.79% del porcentaje total.
En los nueve perfiles de aceites esenciales se encontraron 90 compuestos de interés
los cuales se encuentran distribuidos de la siguiente manera: 2 corresponden a
compuestos de tipo Diterpeno Oxigenado (DO), 36 corresponden a Hidrocarburos
Alifáticos (HA), 5 compuestos de tipo Monoterpeno (M), 11 Monoterpenos Oxigenados
(MO), 18 Sesquiterpenos (S), 17 Sesquiterpenos Oxigenados (SO) y 1 Triterpeno (TT).
En la tabla 7 se muestra el porcentaje en términos de composición de cada uno de
estos grupos de metabolitos para cada perfil.
Tabla 7. Totalizados de los porcentajes de área aportados por los compuestos obtenidos por el análisis de CG-EM,
de los aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L.
Compuestos y cantidad
encontrada
Perfil 1 Perfil 2 Perfil 3 Perfil 4 Perfil 5 Perfil 6 Perfil 7 Perfil 8 Perfil 9
Diterpenos Oxígenados
DO (2) 0 0 0 0 0 0 0,47% 0 0,25%
Hidrocarburos Alifaticos
HA (36) 50,60% 14,42% 63,65% 77,06% 62,65% 57,28% 18,39% 42,38% 16,73%
Monoterpenos M (5) 2,13% 1,74% 0,40% 0,88% 0,44% 0 0 0,47% 0,00%
Monoterpenos Oxígenados
MO (11) 26,25% 53,80% 12,33% 7,36% 13,25% 19,16% 13,90% 31,67% 41,91%
Sesquiterpenos S (18) 3,85% 4,91% 5,68% 0,47% 1,66% 0,58% 5,78% 0,91% 0,00%
Sesquiterpenos Oxígenados
SO (17) 5,89% 21,64% 2,95% 0,55% 6,49% 4,44% 0,57% 0 0,95%
Triterpenos TT (1) 0 0 0 0 0 0 8,14% 0,97% 14,95%
TOTAL APORTE AL PORCENTAJE POR PERFIL
88,72% 96,51% 85,01% 86,32% 84,49% 81,46% 47,25% 76,40% 74,79%
En la figura 13 se observa la sobreposicion de las corrientes ionicas totales (TIC) de los
nueve perfiles cromatograficos de los aceites esenciales obtenidos, sin embargo, no es
posible apreciar un comportamiento similar entre los nueve perfiles; por el contrario
existen variaciones químicas considerables entre ellos. Estudios previos realizados de
aceites esenciales de la especie vegetal, indican la presencia de compuestos tales
como D-limoneno, β-pineno, β-mirceno, gamma-terpineno, trans-ocimeno, α-pineno,
56
canfeno y sabineno (Cao et al., 1997); de los cuales sólo los cuatro primeros
compuestos fueron hallados en algunos de los perfiles de aceites del presente estudio.
Figura 13. Cromatogramas de los nueve perfiles de aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L,
obtenido por CG-EM
Lo anteriormente expuesto, permite inferir que no existe ninguna relación directa del
tipo de compuestos que se obtienen para extracción de aceites esenciales de la
especie vegetal Ulex europaeus L.; en meses específicos del año (teniendo en cuenta
ciclos geoestacionarios, condiciones de extracción, estrés metabólico de la planta, etc.);
el estudio realizado por Cao et al., (1997), reporta compuestos de tipo terpeno; los
cuales fueron extraídos durante el mes de mayo encontrando: camfeno, sabineno, β-
pineno, mirceno, limoneno y gamma-terpineno en partes aereas, especificamente en
flores. Otro estudio de aceites esenciales de la especie vegetal realizado por Lopez-
Hortas, et al. (2016), durante los meses de abril y mayo; reporta en flores los mismos
57
compuestos mencionados anteriormente. Entre los compuestos reportados por
literatura para esos meses, ninguno de los obtenidos en el perfil 3 (recolectado y
extraído en el mes de mayo) coincide con lo mencionado en la literatura; teniendo en
cuenta que el órgano de la planta seleccionado para la extracción realizada por los
autores corresponde en su gran mayoría a flores; y para el estudio actual se realiza la
extracción empleando las partes áreas de la planta sin discriminación de los órganos de
la misma.
Si bien no se han realizado estudios de aceites esenciales de la especie cuyas
extracciones se realicen en diferentes meses del año, se podría presumir que las
extracciones de aceites de Ulex europaeus L., se ven afectadas por el mes del año en
que se realiza la recolección y extracción de los componentes volátiles de partes
aéreas, esto en relación a los compuestos químicos mayoritarios encontrados en los
perfiles del presente estudio y concretamente se podría esperar obtener β-citronelol
durante los meses de enero a julio y D-isomentol durante los meses de agosto a
diciembre. Los compuestos mencionados anteriormente se presentaron en altos
porcentajes en la composición química relativa de los aceites esenciales de la especie
vegetal Ulex europaeus L., y como demuestran estudios realizados con base en
actividades biologicas de tipo antimicrobiano (A.L. Umagiliyage et al., 2017; Fuentes et
al., 1998) y en los compuestos reportados, es altamente probable que tanto
metabolitos fijos como volátiles de la especie vegetal presenten actividad
antimicrobiana.
3.4 Análisis Multivariado
Los compuestos químicos reportados fueron analizados mediante el Análisis
multivariado de Componentes Principales (ACP) y Análisis de Conglomerados
Jerárquicos (ACJ); referentes estadísticos que aportaron información significativa para
establecer el tipo de compuestos químicos más representativos en los perfiles de
aceites; este análisis permitió organizar los compuestos encontrados en tres grupos
58
representativos de acuerdo al porcentaje de varianza de la siguiente manera: los
compuestos de tipo terpeno e hidrocarburo con valores altos en cuanto a porcentaje de
varianza y el tercer grupo de compuestos químicos (terpenos, hidrocarburos, etc.,) con
porcentajes de varianza bajos y poco representativos para el estudio.
3.4.1 Análisis de Componentes Principales (ACP)
El Scree Plot o diagrama de sedimentación (figura 14) indica la relación del número de
componentes frente a la varianza de los datos de los nueve perfiles; de este se
establece que se requieren cinco componentes principales (CP), debido a que con
estos el valor propio de la varianza converge y se estabiliza cerca de 1.05 y es allí
donde la varianza de correlaciones se reduce al máximo para explicar el modelo de
ACP que se encuentra reportado en la matriz de correlaciones (tabla 9).
Figura 14. Scree Plot de los nueve perfiles cromatográficos de los aceites esenciales de Ulex europaeus L.
1 21 11 0987654321
3,0
2,5
2,0
1 ,5
1 ,0
0,5
0,0
Número de componente
Valo
r p
rop
io
0,138580,149050,25652
0,512370,59181
0,677070,70516
1,05077
1,24517
1,38084
2,32656
2,96610
Gráfica de sedimentación
59
Tabla 8. Matriz de correlaciones ACP de aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L. Análisis de los
valores y vectores propios de la matriz de correlación.
Valor propio 2,9661 2,3266 1,3808 1,2452 1,0508 0,7052 0,6771 0,5918 0,5124 0,2565 0,149 0,1386
Proporción 0,247 0,194 0,115 0,104 0,088 0,059 0,056 0,049 0,043 0,021 0,012 0,012
Acumulada 0,247 0,441 0,556 0,660 0,747 0,806 0,863 0,912 0,955 0,976 0,988 1,000
Variable CP1 CP2 CP3 CP4 CP5 CP6 CP7
Porcentaje de coincidencia 0,212 -0,248 -0,050 0,426 0,288 0,191 -0,711
Índice de retención teórico 0,049 -0,109 0,469 0,467 -0,416 0,027 -0,044
Índice de retención calculado -0,215 -0,164 0,554 -0,015 -0,031 0,520 0,229
Perfil 1 0,222 -0,504 0,036 -0,249 -0,034 -0,230 0,084
Perfil 2 0,029 -0,114 0,261 0,213 0,788 -0,276 0,334
Perfil 3 0,231 -0,259 -0,154 0,431 -0,305 -0,388 0,261
Perfil 4 0,155 -0,160 -0,516 0,278 0,049 0,569 0,455
Perfil 5 0,375 -0,164 -0,043 -0,338 0,072 0,258 -0,146
Perfil 6 0,226 -0,494 0,148 -0,331 -0,087 -0,005 0,025
Perfil 7 0,424 0,257 0,272 0,049 0,091 0,146 0,092
Perfil 8 0,454 0,288 0,095 -0,006 -0,054 -0,023 -0,011
Perfil 9 0,449 0,347 0,068 -0,060 -0,048 -0,037 0,130
En la figura 15 se presenta, el diagrama de puntuación de la varianza teniendo en
cuenta los porcentajes de área de los compuestos químicos encontrados en los perfiles
de aceites esenciales de la especie vegetal, se pueden apreciar los compuestos más
representativos en cuanto a terpenos e hidrocarburos cuyos porcentajes de varianza se
ven reflejados como valores atípicos en las dos componentes.
60
Figura 15. Diagrama de dispersión de datos en los componentes principales (CP1 y CP2), para cada uno de los
compuestos químicos encontrados en los aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L. Los puntos
azules indican la ubicación de cada uno de los compuestos en la representación espacial de las variable CP1 y CP2,
los puntos verdes representan compuestos de tipo hidrocarburo no tan relevantes y los puntos rojos representan
compuestos de tipo mono y sesquiterpeno.
En contraste con la matriz de correlación y expresado en la figura 15, se aprecian tres
tipos de datos, una nube de compuestos (puntos azules) cercanos a cero, que
corresponden a compuestos cuyo aporte a la varianza fue poco significativo; debido a
los porcentajes de área tan bajos que presentaron; el segundo tipo de datos,
corresponde a los hidrocarburos (resaltados en color verde), que son compuestos muy
comunes de encontrar en aceites esenciales de especies vegetales, y en letras rojas se
aprecia el tercer tipo de datos que corresponde a compuestos entre hidrocarburos y
terpenos que presentaron aportes significativos a la varianza.
61
En el plano de la CP1, se presentan valores positivos en casi todas las variables, salvo
para el Índice de Retención calculado (IRc prom), debido a que en la generalización no
se logró calcular todos los índices de retención, esto debido a que las parafinas
empleadas para la identificación y comparación de los espectros de masas,
comprendían un rango de tiempos de retención ligeramente inferiores a los que se
reportaron para algunos de los compuestos; específicamente no se logró calcular el IR
para compuestos cuyo tiempo de retención era superior a 55.16 minutos, motivo por el
cual se evidencia el sesgo de la información que establece el valor negativo de la CP1
en la variable Índices de retención calculados, sin embargo, se aprecian valores
positivos en las demás variables con un notorio sobresalto del porcentaje de varianza
en los perfiles 5, 7, 8 y 9.
Esta varianza tan significativa se debe al compuesto químico: D-isomentol;
monoterpeno oxigenado que se presentó en los perfiles mencionados con porcentajes
de área muy altos en comparación a otros compuestos de tipo terpeno reportados en
dichos perfiles, es de resaltar que el compuesto reportó los mayores porcentajes de
área en los perfiles 7, 8 y 9; de allí su aporte significativo a la varianza del ACP.
En éstos perfiles, además, se obtuvo los valores más altos y cercanos entre sí en
cuanto a varianza y correlación, puesto que allí se reportaron un número pequeño de
compuestos; con la discrepancia de ser compuestos muy similares tanto en porcentaje
de área como en porcentaje de coincidencia con el espectro de masas (mayores al
90%), como el caso de los hidrocarburos (eicosano, tetracosano, triacontano,
tetratetracontano, heneicosano, tetratriacontano, heptadecano y pentadecanal). De los
hidrocarburos mencionados; el eicosano mostró un comportamiento atípico en la CP1 y
con respecto a la CP2, se encuentra en el cuadrante de datos negativos, esto se debe
a que el aporte de este compuesto radica básicamente en el porcentaje de área
reportado en el perfil 6.
El perfil 5, difiere mucho en cuanto a la similitud de compuestos con los perfiles 7, 8 y 9,
sin embargo, sobresale con un porcentaje de varianza (aunque inferior al de estos
62
perfiles) si representativo; ya que es mayor al de las demás variables presentadas en la
matriz para el mismo perfil, esto debido a la presencia de compuestos cuyos
porcentajes de área eran considerablemente altos y el porcentaje de coincidencia de
estos compuestos estaba en promedio en un rango superior al 90% en comparación
con el espectro de masas.
Se determinan algunos compuestos de interés basados en el diagrama de la figura 16,
por ejemplo el tiglato de geranilo, compuesto que aporto en bajo porcentaje a la
varianza porque se presenta como un valor medianamente normal, ya que tuvo muchas
similitudes en cuanto a los porcentajes de área del mismo en algunos perfiles.
Un caso particular en los compuestos reportados, corresponde al β-citronelol,
monoterpeno oxigenado que presentó valores positivos en casi todas las variables de la
CP1, esto se debe a que el compuesto presentó en algunos de los perfiles, porcentajes
de área altos. Se presenta como un valor negativo en la CP2 debido a que el aporte por
porcentajes de área solo se aprecia considerablemente en uno de los cinco perfiles que
los reportó.
Si bien no se especifican en la gráfica los componentes CP3, CP4 y CP5, la matriz de
correlaciones que se presenta permite establecer algunas relaciones importantes para
el estudio de componentes principales; por ejemplo, la varianza en la CP3 está
denotada por valores positivos en cuanto a la relación proporcional que existe entre los
IRc y los IRt, debido a que estos valores numéricos no fueron estandarizados al
momento de realizar el ACP. Además se evidencia un valor atípico de la varianza en la
CP3 debido a información concerniente al perfil 4 y específicamente se debe al
porcentaje de área que presenta el compuesto 8-hexil-pentadecano el cual fue 34.8%
superando al porcentaje de cualquier otro compuesto reportado en dicho perfil.
63
En cuanto a la CP4 se obtuvo valores atípicos del porcentaje de área de algunos
hidrocarburos presentes en el perfil 3; debido a que no se pudo calcular el índice de
retención. Se presenta entonces para dicha componente, un aporte significativo en la
varianza por parte del compuesto tetracosano en la CP1 y negativo en la CP2.
Por último, la CP5 contribuye con una varianza notoria en cuanto al perfil 2 se refiere;
allí se reportaron la mayor cantidad de hidrocarburos cuyos porcentajes de área fueron
considerables, sin embargo, la información que podían brindar en cuanto a índices de
retención teóricos era muy escasa; de allí que compuestos tales como el eicosano,
pentadecanal y ácido decanoíco se hayan presentado en todos los perfiles donde el
ácido decanoíco reportó el mayor porcentaje de área para el perfil 2 pero poco
representativo para el ACP si se tiene en cuenta que solo se puede comparar
gráficamente 2 componentes principales.
La figura 16 presenta la dispersión de la varianza por cargas asociada a cada una de
las variables IRt, IRc prom, %co y los nueve perfiles.
Figura 16. Gráfica de cargas para dispersión de la varianza aportada por los componentes principales de los aceites
esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L.
64
En cuanto a la dispersión de la varianza, se evidencia, un total de cuatro grupos. El
primer grupo (amarillo) resalta el aporte de los perfiles 7, 8 y 9 con el mayor porcentaje
de la varianza para la CP1 y CP2, teniendo en cuenta los valores atípicos del
porcentaje de varianza reportado en la matriz.
El segundo grupo (verde) refleja el comportamiento de la varianza teniendo en cuenta el
porcentaje de coincidencia, los porcentajes de área reportados en los perfiles 1, 3, 4, 5
y 6; en cuanto a los compuestos allí reportados para la CP1 con aportes positivos pero
negativos en la CP2, y aportes considerables de los perfiles 1, 5 y 6, debido a que en
estos perfiles también se encontraron compuestos de tipo terpeno representativos en el
estudio.
El tercer grupo (azul) está relacionado al bajo aporte a la varianza en la CP1 por el IRt y
el perfil 2 (hidrocarburos en su mayoría) y con valores negativos bajos en la CP2, lo
cual indica que es poca la información que se puede obtener de estas variables; por
último un aporte casi nulo (en las dos componentes con valores altos negativos) del IRc
promedio, cuyos valores no aportaron suficiente información de los compuestos
químicos reportados en los componentes volátiles.
3.4.2 Análisis de Conglomerados Jerárquicos (ACJ)
Con base en los resultados de la matriz de correlación, se realizó un Análisis de
Conglomerados Jerárquicos, mostrando los conglomerados jerárquicos por similitud
(figuras 17 y 18); tomando como valores los datos de varianza reportada para los
perfiles de aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L.
El Cluster de la figura 17, indica la similitud entre los perfiles asumiendo que el ACJ se
realizó con 7 conglomerados y teniendo en cuenta el porcentaje de varianza de los
65
perfiles expresados en la matriz. Se aprecia similitud entre los perfiles 1 y 6; 7, 8 y 9; y
los perfiles 2, 3, 4 y 5 como grupos independientes.
Figura 17. Dendograma de Conglomerados Jerárquicos de los nueve perfiles de aceites esenciales teniendo en
cuenta la similitud entre los perfiles. Se asumen 7 conglomerados.
Para los perfiles 1 y 6 se presenta una similitud muy alta debido a que en dichos perfiles
sé reportan compuestos tales como el eicosano; siendo este el compuesto con el mayor
porcentaje de área. Además de ello, se reportan los compuestos: tiglato de geranilo,
ácido decanoíco, aristoleno, 3,7-dimetilnonano, guaiol, heptadecano, β-citronelol,
eicosano, pentadecanal y 2,6,10,15-tetrametilheptadecano con porcentajes de área
bastante similares.
Los perfiles 7, 8 y 9 presentan similitud debido a compuestos tales como: eicosano,
tetratriacontano, triacontano y particularmente debido a la presencia del compuesto D-
isomentol cuyos porcentajes de área en los tres perfiles fue bastante representativo
(11.13%, 31.05% y 29.33% respectivamente); además se hallan compuestos muy
Perfil 9Perfil 8Perfil 7Perfil 2Perfil 4Perfil 3Perfil 5Perfil 6Perfil 1
47,27
64,85
82,42
1 00,00
Variables
Sim
ilit
ud
Conglomerados Jerárquicos por similitud entre los perfiles cromatográficos
66
similares en cuanto al porcentaje de área reportado: nonanal, pentadecanal,
hexahidrofarnesil acetona, metoleno, eicosano, tetratetracontano, butirato de citronelilo,
tetracosano, entre otros compuestos en común que presentan porcentajes de área
similares pero son poco representativos.
Figura 18. Dendograma de Conglomerados Jerárquicos de los perfiles de aceites esenciales asumiendo 5
conglomerados de similitud.
No obstante, el Cluster presentado en la figura 18, está basado en cinco
conglomerados jerárquicos seleccionados aleatoriamente donde se representa la
similitud en cuanto a varianza si se observan los reportes de porcentaje de la matriz de
correlaciones; similitudes existentes entre los perfiles 1, 6 y 5 (representados con líneas
azules), la similitud entre los perfiles 3 y 4 (representados con líneas verdes), la
similitud de los perfiles 7,8 y 9 (representados con líneas moradas) y la independencia
del perfil 2 (representado con una línea roja).
Para el primer grupo (1, 6 y 5) se resalta una similitud debida a los compuestos
reportados con porcentajes de área bastante considerables de los hidrocarburos:
eicosano y 2,6,10,15-tetrametilheptadecano. Es de resaltar que la similitud principal en
este grupo radica en los perfiles 1 y 6 con aproximadamente un 90% y es debida a la
Perfil 9Perfil 8Perfil 7Perfil 2Perfil 4Perfil 3Perfil 5Perfil 6Perfil 1
47,27
64,85
82,42
1 00,00
Variables
Sim
ilit
ud
Dendograma de similitud (% de área de cada compuesto)
67
presencia del compuesto β-citronelol (con un porcentaje de área de 25.65% y 16.8%
respectivamente).
El segundo grupo está compuesto por los perfiles 3 y 4 (en color verde), con una
relación aproximada de 64.85% de similitud entre ellos, debida al comportamiento de
compuestos tales como el 3-metil-5-propilnonano; hidrocarburo que en los perfiles 3 y 4
fue reportado con los porcentajes de área más altos (1.47% y 2.67% respectivamente),
además de ello el compuesto: pentadecanal, se presentó en los dos perfiles con
porcentajes de área muy similares (0.59% y 0.41%), y el hidrocarburo hexahidrofarnesil
acetona cuyos porcentajes de área fueron igual para los dos perfiles (6.41%).
El perfil 2, es el perfil con la mayor discrepancia, debido a que su similitud con los
demás perfiles es casi nula, como se evidenció en la matriz de correlaciones, sus
aportes a la varianza difieren de las demás variables y no puede ser relacionado con
otro perfil, el aporte de éste sería evidenciable si se pudiese graficar las cinco
componentes principales que aportan el mayor porcentaje de la varianza. Este perfil
reporta una cantidad de compuestos químicos de tipo hidrocarburo que tienen
porcentajes de área relativamente bajos, que si bien son reportados en otros perfiles,
no se evidencian grandes similitudes en los porcentajes de área.
El último grupo corresponde a la similitud de los perfiles 7, 8 y 9; como se explicó
anteriormente, la similitud radica en los porcentajes de área del compuesto D-isomentol;
los cuales fueron muy similares entre sí, además que dichos porcentajes catalogaron al
compuesto mencionado como el compuesto químico mayoritario de esos perfiles.
Lo anteriormente expuesto, permite argumentar que no es posible determinar
variedades quimiotaxonómicas de la especie vegetal, debido a que si bien hay algunos
perfiles que son similares en cuanto a composición química, los valores tan dispersos
de porcentajes de área no permiten establecer un perfil propio para catalogar e indicar
los compuestos que caracterizan el aceite esencial de la especie.
68
3.5 Actividad Antimicrobiana
Se evaluó la actividad antimicrobiana de cuatro fracciones obtenidas a partir del
extracto etanólico de la especie vegetal Ulex europaeus L., frente a las cepas de
bacterias Escherichia coli (bacilo gramnegativo) y Staphylococcus aureus (coco
grampositivo), donde la masa crítica que tiene la menor concentración de inhibición en
cada una de las fracciones se reporta en la tabla 10; se reporta la masa crítica como
parámetro de comparación frente a la concentración mínima inhibitoria CMI; como la
media de la concentración que presenta inhibición del crecimiento de una bacteria, de
cada una de las fracciones, lo cual indica desde que concentración mínima se puede
inhibir el crecimiento de cada una de las bacterias.
Tabla 9. Determinación de la masa crítica de inhibición por cada fracción frente a las cepas de bacterias Escherichia
coli y Staphylococcus aureus.
Escherichia coli
F. Hex.Ue (mm)
F.AcOEt.Ue (mm)
F.CH2Cl2.Ue (mm)
F. ButOH.Ue (mm)
pozo 2 mg 12 11 12 13
pozo 4 mg 13 13 12 15
pozo 6 mg 14 15 12 16
pozo 8 mg 14 17 12 17
masa crítica
(µg/mL) 181,6 216,59
no presentó inhibición
246,14
Staphylococcus aureus
F. Hex.Ue (mm)
F.AcOEt.Ue (mm)
F.CH2Cl2.Ue (mm) F. ButOH.Ue
(mm)
pozo 2 mg 15 9 15 13
pozo 4 mg 18 11 18 15
pozo 6 mg 19 13 20 17
pozo 8 mg 20 15 21 19
masa crítica
(µg/mL) 342,01 162,35 367,94 279,53
69
Como se observa en la tabla 10, las fracciones de polaridad creciente del extracto
etanólico (excepto la fracción de diclorometano frente a Escherichia coli) inhibieron el
crecimiento de las bacterias, confirmando la actividad antimicrobiana de las fracciones
del extracto etanólico de la especie vegetal Ulex europaeus L., para cada fracción se
evaluó la actividad antimicrobiana como se indica en las gráficas 19 y 20, de las cuales
se obtuvo la información pertinente para establecer la masa crítica de inhibición.
Es fundamental aclarar, que la masa crítica calculada hace referencia a la extrapolación
del logaritmo natural de la concentración media de cada una de las fracciones con
respecto al cuadrado del diámetro de inhibición (halo de inhibición o crecimiento
bacteriano), donde lo que se busca es determinar el menor diámetro de inhibición que
hace referencia a la mínima masa crítica o concentración con la que se logra inhibir el
crecimiento de una cepa bacteriana.
Las figura 19 describe bajo la condición que la concentración (eje Y), se presenta como
el logaritmo natural (Ln) expresada en µg/mL contra el cuadrado del diámetro o halo de
inhibición (inicialmente en mm). Se determinó la masa crítica de inhibición de
crecimiento para las fracciones de hexano, acetato de etilo, diclorometano y butanol
frente a la bacteria Escherichia coli., donde se calculó una masa crítica de 181.6 para
hexano, 216.59 para acetato de etilo, la fracción de diclorometano, no inhibió el
crecimiento de la cepa de E. coli con ninguna de las concentraciones preparadas por
ende no fue posible determinar la masa crítica, posiblemente por ser un bacilo
gramnegativo, requiere concentraciones mayores a 80 µg/mL y para butanol una masa
crítica de 246,14.
70
Figura 19. Masa crítica de las fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico frente Escherichia coli.
En cuanto a los resultados obtenidos de actividad antimicrobiana de las fracciones de
polaridad creciente procedentes del extracto etanólico de la especie vegetal Ulex
europaeus L., frente a la bacteria Escherichia coli (bacilo gramnegativo), se puede
inferir que las concentraciones empleadas para los ensayos fueron apropiadas para
inhibir el crecimiento de la bacteria; excluyendo del presente estudio la fracción de
diclorometano, cuyos resultados fueron negativos frente a inhibición de crecimiento;
además la fracción de hexano logra inhibir el crecimiento de E. coli con la menor masa
crítica comparada con las demás fracciones.
Se empleó el mismo parámetro de relación de las variables concentración y halo de
inhibición para determinar la actividad antimicrobiana frente a la cepa Staphylococcus
aureus (coco grampositivo), la figura 20 presenta los resultados obtenidos, resaltando
que todas las fracciones (hexano, acetato de etilo, diclorometano y butano) y
concentraciones empleadas en los todos los ensayos arrojaron resultados positivos en
cuanto a inhibición del crecimiento bacteriano. Se muestran allí los resultados obtenidos
de la actividad antimicrobiana de las fracciones de hexano cuya masa crítica calculada
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 50 100 150 200 250 300 350
Ln C
on
cen
trac
ión
Halo de inhibición (X2)
Masa crítica calculada de las fracciones de Ulex europaeus L., frente a Escherichia coli
F. Hex.Ue F. AcOEt.Ue F.diclorometano
F.ButOH.Ue Linear (F. Hex.Ue) Linear (F. AcOEt.Ue)
Linear (F.diclorometano) Linear (F.ButOH.Ue)
71
fue 342.015, acetato de etilo con una masa crítica de 162.35, diclorometano con una
masa crítica de 367.94 y butanol con una masa crítica de 279.53; siendo la fracción de
acetato de etilo la que menor concentración crítica requiere para inhibir el crecimiento
de S. aureus.
Figura 20. Masa crítica de las fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico frente Staphylococcus aureus..
La figura 21, presenta la distribución de los halos de inhibición medidos en mm para
cada una de las fracciones del extracto etanólico, frente a la bacteria Staphylococcus
aureus, teniendo en cuenta las concentraciones de 20, 40, 60 y 80 µg/mL que fueron
empleadas para determinar tanto la actividad antimicrobiana de cada una de las
fracciones como la concentración o masa crítica con la cual el conglomerado de
compuestos químicos presentes en la fracción realiza una efectiva inhibición de
crecimiento microbiano, se aprecia que con concentraciones altas de cada fracción del
extracto empleada, los halos de inhibición son mayores.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Ln C
on
cen
trac
ión
Halo de inhibición (X2)
Masa crítica calculada de las fracciones de Ulex europaeus L., frente a Staphylococcus aureus
F.Hex.Ue F.AcOEt.Ue F.diclorometano
F.ButOH.Ue Linear (F.Hex.Ue) Linear (F.AcOEt.Ue)
Linear (F.diclorometano) Linear (F.ButOH.Ue)
72
Figura 21. Relación entre halos de inhibición (mm) por concentración (µg/mL) de cada fracción frente a las cepas
Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Con el propósito de establecer si la diferencia entre los halos de inhibición expresados
en milímetros, propendían a ser muy variables alterando los datos obtenidos de
inhibición bacteriana, se realizó un análisis de varianza (ANOVA), estableciendo como
hipótesis nula: todas las varianzas son iguales y una hipótesis alterna: donde por lo
menos una varianza es diferente con un nivel de significancia α= 0.05, como se
presenta en la figura 22.
20
40
60
80
12 16 20
Halo de inhibicion (mm)
Co
nce
ntr
acio
n (
ug
/mL
)
F.Hex.Ue vs E.coli
F.AcOEt.Ue vs E.coli
F.Ch2Cl2.Ue vs E. coli
F.ButOH.Ue vs E. coli
F.Hex.Ue vs S. aureus
F.AcOEt.Ue vs S. aureus
F. CH2Cl2.Ue vs S. aureus
F.ButOH.Ue vs S. aureus
Halo de inhibicion por concentracion de cada fraccion frente a cada cepa de bacterias
73
Figura 22. Gráfica de varianzas iguales para las fracciones frente a cada una de las cepas ensayadas.
Dado que el valor p de la prueba de comparaciones múltiples no se superpone en
ninguno de los intervalos, se puede asumir que las desviaciones estándar de los halos
de inhibición representan valores significativos que aportan a la varianza de los
intervalos, de lo cual se puede asumir que si existe inhibición de crecimiento bacteriano
para cada una de las fracciones del extracto etanólico ensayadas frente a las cepas
Staphylococcus aureus y Escherichia coli, salvo la fracción de diclorometano frente a E.
coli, sin embargo, la hipótesis nula no puede ser descartada, debido a que los valores p
de 0.675 y 0.111 son mayores que las opciones razonables de nivel de significancia (α);
es probable que las varianzas si sean similares.
Se lograría optimizar el método realizando ensayos de actividad antimicrobiana con
más rangos de concentración de cada una de las fracciones, con sólo 4 observaciones
en cada grupo, las pruebas no tienen mucha potencia para detectar una diferencia
significativa de varianza en caso de que exista alguna; para ello convendría recolectar
más datos de concentración para aumentar la eficiencia de la prueba y probar que la
F.ButOH.Ue vs S. aureus
F. CH2Cl2.Ue vs S. aureus
F.AcOEt.Ue vs S. aureus
F.Hex.Ue vs S. aureus
F.ButOH.Ue vs E. coli
F.Ch2Cl2.Ue vs E. coli
F.AcOEt.Ue vs E.coli
F.Hex.Ue vs E.coli
1 21 086420
Valor p 0,675
Valor p 0,1 1 1
Comparaciones múltiples
Prueba de Levene
Prueba de varianzas iguales para las fracciones frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli
Múltiples intervalos de comparación para la desviación estándar, α = 0,05
Si los intervalos no se sobreponen, las Desv.Est. correspondientes son significativamente diferentes.
F.CH2Cl
2.Ue vs E. coli
F.CH2Cl
2.Ue vs S. aureus
74
varianza de los ensayos antimicrobianos si son relevantes y significativos en las
especie vegetal Ulex europaeus L., lo que no descarta que las fracciones de polaridad
creciente del extracto etanólico de la especie vegetal ensayadas, si presentan actividad
antimicrobiana.
De igual forma, se representó la mediana de los halos de inhibición de cada una de las
fracciones frente a cada cepa como se aprecia en la figura 23, donde la varianza de la
media en todos los ensayos se ven afectados por una concentración especifica donde
la fracción de hexano frente a E. coli, presenta la menor masa crítica de inhibición y
frente a S. aureus, la fracción de acetato de etilo presenta la menor masa crítica de
inhibición.
Figura 23. Varianza de la media de halos de inhibición para cada una de las fracciones frente a las cepas de
bacterias ensayadas.
F.ButOH.Ue vs S. aureus
F.Dicloro.Ue vs S. aureus
F.AcOEt.Ue vs S. aureus
F.Hex.Ue vs S. aureus
F.ButOH.Ue vs E. coli
F.Dicloro.Ue vs E. coli
F.AcOEt.Ue. vs E.coli
F.Hex.Ue vs E.coli
22201 81 61 41 21 0
Halo de inhibición (mm)
Box Plot de varianza de la media para cada fracción respecto al halo de inhbición
75
Se logra evidenciar que muchas de las fracciones ensayadas presentaron variaciones
significativas en los halos de inhibición, lo cual permite establecer como prueba
cualitativa que las fracciones empleadas a las concentraciones ya mencionadas;
efectivamente aportaron a la actividad antimicrobiana de las fracciones del extracto
etanólico de la especie vegetal Ulex europaeus L., especialmente las fracciones de
hexano y diclorometano frente a Staphylococcus aureus, donde se evidencian los
mayores halos de inhibición y los mayores desplazamientos de varianza.
Las fracciones del extracto etanólico de polaridad creciente si presentan actividad
antimicrobiana puesto que la varianza en los datos infiere que existe una relación
directa entre los halos de inhibición y la actividad bactericida. Puesto que no se logra
descartar la hipótesis nula, se aprecian varianzas similares en los datos obtenidos de la
actividad antimicrobiana salvo por la fracción de diclorometano frente a Escherichia coli
que no presentó actividad antimicrobiana, los resultados obtenidos son significativos
para el estudio de actividad antimicrobiana de la especie vegetal Ulex europaeus L.
Los datos reportados de la actividad antimicrobiana de la especie vegetal Ulex
europaeus L., concuerdan con los reportes de actividad antimicrobiana realizados a
diferentes especies vegetales pertenecientes a la familia Fabaceae (Teyeb et al, 2009;
Fuentes et al., 1998; Beltrán et al., 2013), particularmente en ensayos frente a la cepa
E. coli, se confirma la actividad antimicrobiana como lo mencionan Martínez et al., en
2011.
Los estudios previos realizados a especies vegetales pertenecientes a la familia
confirman la actividad antimicrobiana, que para la especie vegetal Ulex europaeus L.,
puede estar relacionada a compuestos tales como el linalol, pentadecanal y β-ionona.
El presente estudio presentó la caracterización y composición química de los aceites
esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L., y la actividad biológica
antimicrobiana de las fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico de la
misma, sin embargo no se hizo para metabolitos fijos un estudio que permita conocer la
76
composición química de estos y poder establecer variedades quimiotaxonómicas entre
género y especie.
77
4 CONCLUSIONES
• El estudio de la composición química volátil de aceites esenciales de la especie
vegetal Ulex europaeus L., confirmo la presencia de monoterpenos,
monoterpenoides, sesquiterpenos, sesquiterpenoides e hidrocarburos alifáticos
siendo estos últimos los compuestos más mayoritarios en las nueve muestras
analizadas.
• El Análisis Fitoquímico Preliminar, reveló la presencia de metabolitos secundarios
de tipo flavonoide y alcaloide lo cual está de acuerdo con estudios previos
reportados para esta especie.
• El Análisis de Componentes Principales permitió identificar tres grupos de
compuestos, un grupo conformado por los monoterpenos β-citronelol (25.65%) y
D-isomentol (31.05%), compuestos representativos para el estudio de aceites
esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L., ya que son reportados por
primera vez para la especie vegetal y para el género Ulex, un segundo grupo
conformado por los hidrocarburos eicosano (34.11%), ácido decanoíco (33.19%) y
8-hexil-pentadecano (34.83%), el tercer y último grupo comprende compuestos
entre hidrocarburos y terpenos cuyos porcentajes de área relativos y reporte por
perfiles son muy bajos. El Análisis de Conglomerados Jerárquicos, permitió
agrupar los nueve perfiles en cinco conglomerados, por similitud entre los perfiles
1, 6 y 5; perfiles 3 y 4; perfil 2 y perfiles 7, 8 y 9 debido a los compuestos y
porcentajes de área reportados, lo que sugiere que pueden existir diferentes
quimiotipos para la especie vegetal Ulex europaeus L.
78
• Los resultados de la actividad antimicrobiana de las fracciones de polaridad
creciente del extracto etanólico presentaron actividad inhibitoria frente a las cepas
de bacterias Staphylococcus aureus donde la fracción de acetato de etilo presento
la menor concentración crítica para inhibición de esta bacteria y frente a
Escherichia coli la fracción que presentó la menor concentración crítica fue la
fracción de acetato de etilo, con una masa crítica de 162.35 y fracción de hexano
con una masa crítica de 181.60 respectivamente; la fracción de diclorometano no
inhibió el crecimiento de la bacteria E. coli; estos resultados contribuyen y aportan
nuevas fuentes de conocimiento de la especie vegetal Ulex europaeus L.
79
5 RECOMENDACIONES
• Realizar un estudio de componentes volátiles de partes aéreas (sin discriminar
ningún órgano de la planta) de la especie vegetal Ulex europaeus L., con
individuos recolectados en otras ciudades de Colombia, con el propósito de
comparar con el presente estudio y poder establecer variedades
quimiotaxonómicas de la especie.
• Realizar el estudio de metabolitos fijos con el fin de aislar, purificar e identificar
los compuestos presentes en la especie vegetal Ulex europaeus L., ya que en
Colombia no existen reportes acerca de la composición química de metabolitos
fijos de Ulex europaeus L.
• Evaluar otros modelos de actividad antimicrobiana que permitan ampliar el
conocimiento biológico de la especie vegetal Ulex europaeus, así como evaluar
otro tipo de actividades biológicas que contribuyan al propósito de fortalecer los
estudios químicos y biológicos de la especie.
80
6 BIBLIOGRAFÍA.
A.L. Umagiliyage et al. (2017). Antimicrobial efficacy of liposomes containing D-
limonene and its effect on the storage life of blueberries. Postharvest Biol.
Technol.
ABC de las Plantas Medicinales. (2013). Recuperado el 11 de Agosto de 2015, de
http://abcplantasmedicinales.com/fabaceae/
Aboutabl, E. A., Hashem, F. A., Sleem, A. A., & Maamoon, A. A. (2008). Flavonoids,
Anti-Inflammatory Activity and Cytotoxicity of Macfadyena Unguis-Cati L. African
Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines: AJTCAM , 18-
26.
Acuña, A. (2011). Especies vegetales invasoras. Bogotá.
Adams, R. P. (2007). Identification of Essential oil components by gas
chromatography/mass spectrometry 4th Edition. Illinois: Allured Publishing
Corporation.
Aizpuru, I., Asegionalaza, C., & Catalán, P. &. (1993). Catálogo florístico de Navarra.
Pamplona: Departamento de Medio Ambiente. Obtenido de sitio web de la
Universidad de Navarra.
Almeida, E. (2008). Caracterização farmacognóstica da espécie Erythrina falcata
Benth., Fabaceae. Revista Brasilera de Farmacognosia.
Álvaro Itaúna Schalcher Pereira, A. d. (2014). Atividade antimicrobiana no combate as
larvas do mosquito Aedes aegypti: Homogeneização dos óleos essenciais do
linalol e eugenol. Educación Química vol 25, issue 4, 446–449.
Arévalo, M., & Enciso, A. (1996). Determinación de la actividad antimicrobiana
(bacterias, hongos y levaduras) de algunas especies de Espeletias encontradas
en el páramo de Guasca. . Bogota.
Ayala, S., Moreno, R., Araguas, J., Caprotta, G., & Roberto, P. (2006). Shock séptico
por Shigella flexneri. Arch Argent Pediatr , 351-353.
Babushok, V. I., Linstrom, P. J., & Zenkevich, I. G. (2011). Retention Indices for
Frequently Reported Compounds of Plant Essential Oils. Journal of Physical
Chemistry vol 40 No. 4, 1-47.
81
Barreto, J. F. (1997). Efectos Antimicrobianos del diente de león (Taxaxacum officinale)
y el gualanday (Jacaranda obtusifolia) sobre Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa causantes de enfermedades de la piel. . Bogotá.
Beltrán, C., Díaz, F., & Gómez, H. (2013). Tamizaje fitoquímico preliminar de especies
de plantas promisorias de la costa atlántica colombiana. Revista Cubana de
Plantas Medicinales.
Bonifacino, M. e. (2013). Laboratorio de Sistemática de Plantas Vasculares .
Recuperado el 30 de Abril de 2015, de thecompositaehut.com:
http://www.thecompositaehut.com/www_tch/webcurso_spv/familias_pv/leguminos
ae_faboideae.html
Borie, C., Zurita, P., Sánchez, M., Rojas, V., Santander, J., & Robeson, J. (2008).
Prevención de la infección por Salmonella enterica subespecie enterica serotipo
Enteritidis (Salmonella Enteritidis) en pollos mediante un bacteriófago. Arch Med
Vet vol. 40 , 197-201.
Cao, X.-L., Boissard, C., Juan, A. J., & Hewitt, C. N. (1997). Biogenic emissions of
volatile organic compounds from gorse (Ulex europaeus): Diurnal emission fluxes
at Kelling Heath, England. JOURNAL OF GEOPHYSICAL RESEARCH, VOL.
102, NO. D15, 18,903-18,91.
CAR. (18 de Junio de 2010). acuerdo 009 de 2010, Corporación Autonoma Regional de
Cundinamarca. Recuperado el 1 de Mayo de 2015, de sitio web de Secretaría
General de la Alcaldía Mayor de Bogotá D.C:
http://www.alcaldiabogota.gov.co/sisjur/normas/Norma1.jsp?i=39959
CAR. (18 de Junio de 2010). Alcaldia de Bogotá. Recuperado el 28 de Enero de 2015,
de Alcaldia de Bogotá:
http://www.alcaldiabogota.gov.co/sisjur/normas/Norma1.jsp?i=39959
Carrió, E., & Vallès, J. (2012). Ethnobotany of medicinal plants used in Eastern Mallorca
(Balearic Islands, Mediterranean Sea). Journal of Ethnopharmacology 141,
1021–1040.
Casellas, J. M. (2008). Etiología (etiopatogenia) de las infecciones urinarias. Rosario:
Anuario FUndación Dr. J. R. Villavicencio .
82
Castañeda, R., Gutiérrez, H., Carillo, É., & Sotelo, A. (2017). Leguminosas (Fabaceae)
silvestres de uso medicinal del distrito de Lircay, provincia de Angaraes
(Huancavelica, Perú). Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas
Medicinales y Aromáticas 16, 136-149.
Céspedes, M. (1996). Enzimas que participan como barreras fisiológicas para eliminar
radicales libres. Revista Cubana InvBiomed.
Chaverri, C., & Cicció, J. (2015). Leaf and flower essential oil compositions of Gliciricida
sepium (Fabaceae) from Costa Rica. American Journal of Essential Oils and
Natural Products, 18-23.
Dabbah, R., Edwards, V. M., & Moats, W. A. (1970). Antimicrobial Action of Some Citrus
Fruits Oils on Selected Food-Borne Bacteria. Applied Microbiology , 27-31.
de la Fuente, S. (2011). Facultad de Ciencias Económicas y Empresariales Universidad
Autonoma de México. Obtenido de ANALISIS CONGLOMERADOS:
http://www.fuenterrebollo.com/Economicas/ECONOMETRIA/SEGMENTACION/C
ONGLOMERADOS/conglomerados.pdf
Económico, S. d. (2008). Ubikate. Recuperado el 12 de Diciembre de 2014, de sitio web
de Ubikate.gov.co: http://ubikate.gov.co/sites/default/files/farmacia.pdf
Espirito Santo, M., Cubas, P., Lousa, M., Pardo, C., & Costa, J. C. (1997). Ulex
Parviflorus sensu lato (genisteae, Leguminoseae) en la zona Centro de Portugal.
Recuperado el 30 de Abril de 2015, de sitio web de Anales de Jardín Botánico de
Madrid: file:///D:/Mis%20Documentos/Descargas/Dialnet-
UlexParviflorusSensuLatoGenisteaeLeguminosaeEnLaZo-70482.pdf
Fuentes, C., Roque, M., & Maribel, T. (1998). FLAVONOIDES Y ALCALOIDES DE
LUPINUS BALLIANUS C.P. SMITH CON ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y
ANTIFÚNGICA. Ciencia e Investigación Vol 1.
Gao, T., Yao, H., Song, J., Liu, C., Zhu, Y., Ma, X., . . . Chen, S. (2010). Identification of
medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2.
Journal of Ethnopharmacology, 116-121.
Garcia, L. (2001). Plantas con propiedades antioxidantes. Instituto superior de ciencias
básicas y pre clínicas. Revista cubana de investigación biomédica, 231-235.
83
Garza, R., Hernández, K., & Mejía, A. (s.f.). Los factores de virulencia y la actual
importancia clínica de Enterococcus faecalis. Departamento de Biología,
Facultad de Química, UNAM.
Gilma S. Chitarra, T. A. (2005). 1-Octen-3-ol inhibits conidia germination of Penicillium
paneum despite of mild effects on membrane permeability, respiration,
intracellular pH, and changes the protein composition. FEMS Microbiology
Ecology 54, 67–75.
Gil-Pavas, E., & Sáez-V., A. (2000). Obtención del aceite esencial de Cardamomo.
Revista Universidad EAFIT, 15-21.
Gómez, P., Sotes, G., & Hahn, S. B. (2013). Chemical composition of the essential oil
from the leaves of Adesmia bijuga Phil., Fabaceae, one critically endangered
species in Central Chile. Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas
Medicinales y Aromáticas, 622-623.
Harborne, J. B. (1962). PLANT POLYPHENOLS. VIII. CHALCONE AND FLAVONOL
GLYCOSIDES OF GORSE FLOWERS* . Phytochemistry, vol. 1, 203-207.
Herrera, J. (19 de Julio de 2008). iiap.org.pe. Recuperado el 10 de Agosto de 2015, de
http://www.iiap.org.pe/cursobotanica/Tema%202.%20Morfologia%20de%20plant
as.pdf
Hornoy, B., Atlan, A., Tarayre, M., Dugravot, S., & Wink, M. (2012). Alkaloid
concentration of the invasive plant species Ulex europaeus in relation to
geographic origin and herbivory. Naturwissenschaften, 99, 883–892.
Ireson, J., Gourlay, A., Sagliocco, J., Holloway, R., Chatterton, W., & Corkrey, R. (2013).
Host testing, establishment and biology of the gorse soft shoot moth, Agonopterix
umbellana (Fabricius) (Lepidoptera: Oecophoridae), a potential biological control
agent for gorse, Ulex europaeus L. (Fabaceae), in Australia. Elsevier, Biological
Control, 67 , 451-461.
Jurado, R., Arenas, C., DOblas, A., Rivero, A., & Torre-Cisneros, J. (2010). Fiebre
tifoidea y otras infecciones por salmonellas. Medicine vol. 10 No. 52, 3497-3501.
Kamatou, G. P., Vermaak, I., Viljoen, A. M., & Lawrence, B. M. (2013). Menthol: A
simple monoterpene with remarkable biological properties. Phytochemistry 96,
15–25.
84
Khallouki, F., Younos, C. S., & Bessiere, J. M. (2002). Chemical Composition of the
Essential Oil of Ononis natrix L. Fabaceae. Journal or Essential Oil Research,
431-432.
Kobayashi, S. D., Malachowa, N., & DeLeo, F. R. ( 2015,). Pathogenesis of
Staphylococcus aureus Abscesses . The American Journal of Pathology Volume
185, Issue 6, 1518–1527.
Koneman, E. (1999). Diagnostico Microbiológico. Argentina: Editorial Médica
Panamericana.
Kubicek, C., & Druzhinina, I. (2007). The Mycota, Environmental and Microbial
Relationships. Heidelberg.
Ligero, P., de Vega, A., van der Kolk, J. C., & van Damb, J. E. (2011). Gorse (Ulex
europæus) as a possible source of xylans by hydrothermal treatment. Industrial
Crops and Products 33, 205–210.
Lock De Ugaz, O. (2004). Análisis fitoquimico y metabolitos secundarios. Analisis
Fitoquímico Preliminar. Pontifica Universidad Javeriana. Bogotá: Editorial Reverte
no. 4.
López, J., & Echeverri, L. (2010). K. pneumoniae: ¿la nueva "superbactera"?
Patogenicidad, epidemiología y mecanismos de resistencia. LATREIA Vol. 23
No. 2, 157-165.
Lopez-Hortas, L., Conde, E., Falque, E., & Domínguez, H. (2016 ). Flowers of Ulex
europaeus L. Comparing two extraction techniques (MHG and distillation).
Comptes Rendus Chimie 19, 718-725.
M.I. de Oliveira Lima, A. A. (2017). Investigation of the antifungal potential of linalool
against clinical isolates of fluconazole resistant Trichophyton rubrum. Journal de
Mycologie Médicale / Journal of Medical Mycology , 1-8.
Maguna, F. P., Romero, A. M., Garro, O., & Okulik, N. B. (2006). Actividad
Antimicrobiana de un grupo de terpenoides. C o m u n i c a c i o n e s C i e n t í f i
c a s y T e c n o l ó g i c a s.
Manrique, E., & Mosquera, O. (1977). Evaluación de la actividad antimicrobiana de los
extractos y fracciones obtenidas a partir de Espeletia murilloii cuatr. Y
espeletopsis guacharaca. Bogotá .
85
Mariscal, D., & Vallés, J. (2005). Neumonía por Pseudomonas aeruginosa. 30-36.
Martínez, M., Ocampo, D., Galvis, J., & Valencia, A. (2011). Actividad antibacteriana y
citotoxicidad in vivo de extractos etanólicos de Bauhinia variegata L. (Fabaceae).
Revista Cubana de Plantas Medicinales.
Máryury, F., Haydelba, D., & Hernando, H. (2007). Identificación de algunos
constituyentes químicos de las hojas de Chromolaena laevigata mediante
cromatografía de gas-espectrometría de masas. Parte II . Ciencia v.15 n.3, 421-
432.
Matthei, O. (1995). Manual de malezas que crecen en Chile. Santiago de Chile: Alfabeta
Impresiones.
Matulevich-Pelaez, J. A., & Gil-Archila, E. (2014). Composición Química del Aceite
Esencial de Hojas de Bejaria resinosa (Ericaceae). Revista Facultad de Ciencias
Básicas Universidad Militar Nueva Granada Vol 10, No. 2, 204-209.
Máximo, P., & Lourenco, A. (1998). A pterocarpan from Ulex parviflorus. Phytochemistry
48, 359-362.
Máximo, P., & Lourenco, A. (1998). A pterocarpan from Ulex Parviflorus. Phytochemistry
vol 48 No. 2, 359-362.
Máximo, P., Lourenco, A., Tei, A., & Wink, M. (2006). Chemotaxonomy of Portuguese
Ulex: Quinolizidine alkaloids as taxonomical markers. Phytochemistry 67, 1943-
1949.
Menendéz Valderrey, J. L. (07 de Enero de 2007). Asturnatura.com Num. 114.
Recuperado el 13 de Abril de 2015, de Asturnatura.com Num. 114:
http://www.asturnatura.com/especie/ulex-europaeus.html
Micol. (2002). Candida albicans (Robin) Berkhout. Revista Iberoamericana Micol , 25-
26.
Molyneus, P. (2004). The Use Of Stable Radical DyphenylPycrilHydracil DPPH For
Stimating Antioxydant Activity. Revista Sci And Tech vol. 26, 211-219.
Morales, R. ( 2009). Labiadas Americanas y Del Viejo Mundo. V Congreso Internacional
De Etnobotánica. Argentina: Ediciones Bariloche.
86
Moreno, B., Sanchez, A., Quevedo, R., & Carulla, J. (2007). ESTUDIO QUIMICO
PRELIMINAR DE LOS FENOLES Y POLIFENOLES DE DOS ACCESIONES DE
Calliandra calothyrsus (MIMOSACEEAE). Scientia et Technica , 47-50.
Muñoz, E. (2009). EL ESPINILLO (Ulex europaeus L. 1753) UN INVASOR BIOLÓGICO
EN EL SUR DE CHILE: ESTADO DE SU CONOCIMIENTO Y ALTERNATIVAS
DE CONTROL. Chile.
Normabuena, H., & Escobar, S. R. (2000). The Biocontrol of Gorse, Ulex europaeus, in
Chile: A Progress Report. Proceedings of the X International Sympossium on
Biological Control of Weeds (págs. 955-961). Montana: Neal R. Spencer.
O'Connor, A. (2009). 2008-2009 Salmonella Typhimurium Outbreak Response. Atlanta,
Georgia.
Pabón, L. (2013). PRODUCTO 5. PROPUESTA PARA EL MANEJO,
TRANSFORMACIÓN Y APROVECHAMIENTO INTEGRAL Y BIOSEGURA DE
LOS RESIDUOS VEGETALES DEL RETAMO ESPINOSO (Ulex europaeus) Y
RETAMO LISO (Genista monspessulana) PARA LA REGIÓN CAPITAL. Bogotá.
Pestean, A., Krizbai, I., Böttcher, H., Párducz, Á., Joo, F., & Wolftn, J. R. (1995).
Identification of the Ulex europaeus agglutinin-I-binding protein as a unique
glycoform of the neural cell adhesion molecule in the olfactory sensory axons of
adult rats. Neuroscience letters, 195. Elsevier, 117-120.
Pokorny, J. (2001). Antioxidantes De Los Alimentos, Aplicaciones Prácticas. . Revista
AcribiaZaragoza.
Quiroz, C., Pauchard, A., Marticorena, A., & Cavieres, L. (Diciembre de 2009). Manual
de Plantas Invasoras del Centro-Sur de Chile. Recuperado el 01 de Mayo de
2015, de sitio web de Laboratorio de Investigaciones Biológicas de la
Universidad de Concepción:
http://www.lib.udec.cl/archivos_descargas_pdf/Manual_de_Plantas_Invasoras_d
el_Centro-Sur_de_Chile.pdf
Research Institute for Fragrance Materials, Inc. (1979). Monographs on Fragrance Raw
Materials. New Jersey: Pergamon Press Ltd.
Rodríguez, G. (2002). Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos
de Escherichia coli. Salud pública de méxico vol. 44 NO. 5, 464-475.
87
Rodriguez, O., Torrenegra, R., & Bustos, D. (2007). Actividad antimicrobiana de Cuphea
ciliata Ruiz & Pav. (Lythraceae). Scientia et Technica Año XIII, No 33, 259-260.
Rodríguez, R. (2007). Evaluación de la Actividad Antioxidante En Poli fenoles De algas
Marinas. . Dialnet. no. 122006.
Ruiz, J., & Roque, M. (2009). ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE CUATRO PLANTAS
DEL NOR-ORIENTE PERUANO. CIENCIA E INVESTIGACIÓN, 41-47.
Russell, G., Sirat, H., & Sutherland, O. (1990). ISOFLAVONES FROM ROOT BARK OF
GORSE. Phytochemistry Vol. 29, 1287-1291.
Sanabria, G. A. (1983). Análisis Fitoquímico Preliminar. Metodología y su aplicación en
Colombia. Universidad Nacional ISBN.
Schon, K. (1936). AN ISOMERIDE OF LUTEIN ISOLATED FROM THE FURZE (ULEX
EUROPAEUS). Coimbra, Portugal.
Shi, H., Noguchi, N., & Niki, y. (2001). Antioxidantes de los alimentos, aplicaciones
prácticas. En J. Pokorny, N. Yanishlieva, & M. Gordon, Introducción a los
antioxidantes naturales. (págs. 141-149). Zaragoza: Editorial Acribia S.A.
Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., & Gouveia-Figueirac, S. (2016). Ulex europaeus:
from noxious weed to source of valuable isoflavones and flavanones. Industrial
Crops and Products 90, 9-27.
Stashenko, E., & Combariza, Y. (1998). "Aceites esenciales : Técnicas de extracción y
análisis". Bucaramanga.
Stashenko, E., Jaramillo, E., & Martinez-Barricarte, R. (2003). Comparación de la
composición y de la actividad antioxidante in vitro de los metabolitos secundarios
volátiles de las plantas de la familia Verbenaceae. Revista de la Academia de
Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, 224. Vol. XXVII No. 105, 579-596.
Terrádez, M. (2017). www.uoc.edu. Obtenido de Análisis de Componentes Principales:
https://www.uoc.edu/in3/emath/docs/Componentes_principales.pdf
Teyeb, H., Zouari, S., Douki, W., Najjar, M., & Neffati, M. (2009). Essential Oils of
Leaves, Flowers and Fruits of Astragalus gombiformis Pomel (Fabaceae).
International Symposium on Medicinal and Aromatic Plants - SIPAM2009, 263-
268.
88
tropicos. (2015). tropicos.org. Recuperado el 12 de Agosto de 2015, de
http://tropicos.org/Name/40021405?tab=maps
Tropicos.org. (28 de Septiembre de 2015). Recuperado el 28 de Septiembre de 2015,
de Missouri Botanical Garden: http://www.tropicos.org/Name/40021405
Tropicos.org. (28 de Septiembre de 2015). tropicos.org. Recuperado el 28 de
Septiembre de 2015, de Missouri Botanical Garden:
http://www.tropicos.org/Name/42000184
Uribarren, T., & Molina, J. (07 de Agosto de 2015). INFECCIONES POR SHIGELLA
SPP. Recuperado el 13 de Agosto de 2015, de Universidad Nacional Autonoma
de Mexico, Departamento de Microbología y Parasitología:
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/shigella.html
Zambrano-Intriago, L., Buenaño-Allauca, M., Mancera-Rodríguez, N., & Jiménez-
Romero, E. (2015). Estudio etnobotánico de plantas medicinales utilizadas por
los habitantes delárea rural de la Parroquia San Carlos, Quevedo, Ecuador.
Ethnobotanical study of medicinal plants used by rural inhabitants of the parish
San Carlos Quevedo in Ecuador, 97-111.
Zamora, F., García, P., Ruiz, M., & Salcedo, E. (2008). Composición de alcaloides en
semillas de Lupinus mexicanus (fabaceae) y evaluación antifúngica y alelopática
del extracto alcaloideo. Agrociencia.
Zeppa, S. G. (2004). Determination of specific volatile organic compounds synthesised
during Tuber borchii fruit body development by solid-phase microextraction and
gas chromatography/mass spectrometry. Rapid Communications in Mass
Spectrometry, 18, 199–205.
