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01/11/2011 Dr. Silvio Rosell

Actualización en Inmunohematología

Fundación Hemocentro Buenos Aires

Noviembre 2011

El estudio de los antígenos y anticuerpos presentes en la sangre, tanto en condiciones normales como patológicas

Es el estudio de los marcadores antigénicos propios de los glóbulos rojos, plaquetas y leucocitos, como así también de las respuestas inmunológicas que estos provocan

Sólo los antígenos de los sistemas RH, KELL MNS y LW, son específicos de la línea eritroide


La aglutinación es la agregación, mediada por anticuerpos, de las partículas que expresan antígenos de superficie.

Tiene dos etapas

1. Sensibilización

2. Formación de puentes entre las células sensibilizadas.


La hemólisis es la destrucción de los glóbulos rojos, con liberación de la hemoglobina intracelular

La hemólisis no ocurre si los antígenos interactúan con los anticuerpos en sueros sin complemento o plasma con anticoagulante

La hemólisis constituye un resultado positivo


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Algunos antígenos de grupo sanguíneo están presentes en formas solubles en saliva, orina y plasma

Estas sustancias pueden utilizarse para inhibir la reactividad de los anticuerpos correspondientes

La inhibición también permite neutralizar anticuerpos que enmascaran la presencia de otros no neutralizables


El grado de ionización de las moléculas

Depende fundamentalmente del pH del medio

Constante de equilibrio (afinidad de los anticuerpos)

Deriva de las tasas relativas de asociación y disociación



La inhibición de la aglutinación por exceso de

anticuerpos es sumamente infrecuente


La centrifugación promueve el acercamiento físico de las células

La prueba antiglobulínica indirecta emplea suero antiglobulínico

Otros métodos actúan: reduciendo la carga negativa de las moléculas

superficiales

disminuyendo la capa de hidratación que rodea a las células

introduciendo macro moléculas con carga positiva que las agregan

Albúmina Humana

LISS (Low ionic saline solution)

PEG (Polietilenglicol)

POLYBRENE (BHDM)

Técnicas con enzimas proteolíticas


Disminuye el potencial Z, favoreciendo la 2º fase de la aglutinación.

En concentraciones de 30% o >favorece la aparición de rouleaux

En la PCI no aumenta la sensibilidad de la prueba

Por falta de ventajas objetivas está en desuso


Ante estos polímeros los GR normales exhiben agregación espontánea, que puede dispersarse con sales neutras como el citrato de sodio

El BHDM es un polícatión de amonio cuaternario que neutraliza las cargas negativas de los GR.

Favorecen la aglutinación por Ig G


El Polybrene se añade a los GR incubados con anticuerpos a baja potencia iónica y bajo pH

Si se adiciona citrato de sodio, se restablece la carga del GR

Si el aglutinado se disocia prueba negativa

Si el aglutinado persiste prueba positiva (aglutinación irreversible a los GR

sensibilizados con Acs)

Tiene sensibilidad disminuida en la detección de anticuerpos del sistema Kell


El PEG es un polímero lineal hidrosoluble que se usa como aditivo para incrementar la captación de anticuerpos

Su acción principal es eliminar el agua intercelular favoreciendo el acercamiento de los GR

No debe centrifugarse el PEG con el suero y GR

Se lavan las células con solución salina y luego se efectúa la prueba antiglobulínica


El reactivo AGH de elección en las pruebas con PEG suele ser el anti-IgG

evita las reacciones falsas positivas con algunos agentes poliespecíficos

Precipitados podrían interpretarse como reacciones positivas

Potenciador de elección para la absorción de Ac calientes


Potencia mucho la captación eritrocitaria de anticuerpos en la fase I de la aglutinación

La cantidad de iones +/- del LISS (0,03 M) es menor al de la SF (0.17M)

En la actualidad la mayoría de los profesionales usa diluyentes o aditivos LISS

Contiene macromoléculas además de sales iónicas y amortiguadores


Puede aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ags y Acs

El aumento del volumen de suero acrecienta la potencia iónica del sistema LISS – aditivo

Se deben respetar estrictamente las instrucciones del fabricante


Ventajas:

Aumenta la sensibilidad de la PCI para detectar Acs clínicamente significativos

Detecta Acs en baja concentración y los de baja afinidad que pueden perderse con los lavados

Reduce el tiempo de incubación

Desventajas:

Debe ser sometido a estricto control de osmolaridad para evitar la fijación inespecífica de C

Los GR suspendidos el LISS deben ser procesados dentro de las 24 hs

Menor sensibilidad para anti-K. (1º fase de aglutinación)


Bromelina, ficina, papaína y tripsina (Las más usadas)

Desnaturalizan ciertos antígenos eritrocitarios, en especial M, N, S, Fya y Fyb, XG

Disminuyen la carga superficial de los GR por clivaje de las moléculas de ácido siálico de las cadenas polisacáridas

El tratamiento enzimático lleva a la formación de espículas en los GR y aumenta así el número potencial de puntos de contacto


Adherencia eritrocitaria en fase sólida (Microplacas)

Aglutinación en columna, pruebas en gel y separación por afinidad

Qimioluminiscencia

Pruebas Inmunoabsorbentes ligadas a las enzimas (ELISA)

Inmunofluorescencia

Inmovilización de Antígenos Eritrocitarios con Anticuerpos Monoclonales Específicos (IAEAM)

Radioinmunoensayo


Las reacciones se producen en microcolumnas que contienen mezclas de cuentas de vidrio o gel, amortiguadores y a veces reactivos

Se establecen barreras de densidad permiten separar el suero problema de los eritrocitos

Una de sus ventajas es que se evita el lavado con solución salina



F

e

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Existen métodos manuales, semiautomatizados y automatizados

Utilizan antígenos o anticuerpos inmovilizados

En la prueba indirecta si las células indicadoras se adhieren a las paredes de la cubeta, la reacción es positiva

Si sedimentan no se produjo reacción Ag-Ac

Ditiotreitol (DTT)

2-Mercaptoetanol (2-ME)

2-Aminoetilisotiouronio (AET)

Mecanismo de acción Clivan los puentes disulfuro que unen las

subunidades monoméricas de los pentámeros de IgM (19S en 7S)

Los puentes intercatenarios de las IgG monoméricas son bastante resistentes al clivaje


Determinación de la clase de inmunoglobulina de los Acs

Identificación de las especificidades en mezclas de Acs, IgM e IgG (desenmascarar)

Determinación del monto relativo de IgG e IgM en una especificidad dada

Disociación de aglutinatos eritrocitarios por IgM (crioglobulinas)


Destrucción de antígenos eritrocitarios seleccionados para investigación de Acs (Kell, Dombrock, Cartwright, Gerbich y LW)

Combinación con enzimas proteolíticas, para disociar los Acs IgG de GR (ZZAP) DTT + Papaína activada con cisteína

La cisteína forma puentes disulfuro que contribuyen al plegamiento de las proteínas


Principios

El tratamiento de los Acs IgM, anula las actividades aglutinante y fijadora de complemento

La visualización de la actividad de los Acs antes y después del tratamiento con sulfhidrilos es útil para determinar la clase de inmunoglobulina

El tratamiento con sulfhidrilos también se emplea para abolir la actividad de los anticuerpos IgM y permitir la detección de IgG coexistentes


Preparación Diluir 0,154 g de DTT en 100 ml de PBS a pH 7,3

Conservación 2 a 6 ºC

Los reactivos sulfhidrilos en baja concentración debilitarían los Ag del sistema Kell

Pudiera observarse gelificación de la muestra Causas Preparación incorrecta del DTT o concentración superior a

0,01 M. Incubación de suero y DTT prolongada

Las muestras gelificadas no pueden estudiarse


Para los procedimientos de adsorción no existe un procedimiento único ideal

Para incrementar la captación de anticuerpos puede aumentarse la proporción de antígenos utilizando un volumen celular mayor

La temperatura de incubación debe ser la de reactividad óptima de los anticuerpos


Las pruebas de adsorción requieren un volumen importante de GR

Los eritrocitos testigos de los paneles comerciales resultan insuficientes

las fuentes mas convenientes pueden ser unidades donadas o muestras de sangre del personal de los fenotipos deseados


Las técnicas de elución liberan las moléculas de Acs de los GR sensibilizados

Los Acs fijados pueden liberarse:

por modificación de la termodinámica de las reacciones Ag-Ac

neutralización o reversión de las fuerzas de atracción que mantienen unidos a los complejos

alteración de la concordancia estructural entre los Ag y los puntos de fijación en las moléculas de Acs


Las técnicas de elución pueden servir para:

Investigar una PAD positiva

Concentrar y purificar Acs, detectar Ag de expresión débil e identificar especificidades múltiples (junto a adsorción)

Preparar GR sin Acs para fenotipificación o estudios de adsorción autólogos.


Si el eluato reacciona con todas las células

Alta probabilidad de que se deba a autoanticuerpos

Si el paciente no fue transfundido en fecha reciente y no existen Acs séricos inesperados no se requieren estudios serológicos adicionales


Calor (56ºC) Calor suave (45ºC) Congelación-descongelación Frío-ácido Digitonina-ácido Diclorometano (DCM) Glicina-HCl / EDTA CLOROFORMO XILENO ETER


Ventajas

Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO

Rápido y fácil

Desventajas

Recuperación escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguíneo


Ventajas

Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO

Rápido y fácil

Requiere un volumen celular reducido

Desventajas

Recuperación escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguíneo


Ventajas

Rápido y fácil

Sensibilidad comparable a digitonina-ácido

Desventajas

Menos sensible para auto y aloanticuerpos reactivos en caliente


Ventajas

Adecuado para anti-K

No inflamable

Desventajas

Tóxico

Recuperación escasa de anti-Fyb


Ventajas

Método de acción rápida

Líquido no inflamable

Recuperación de la mayoría de los anticuerpos significativos

Desventajas

Sustancia reconocida como carcinogénica

Altamente tóxico

Efecto narcótico inhalatorio


Ventajas

Buena recuperación de la mayoría de los Acs significativos

Desventajas

Carcinogénico

Tóxico

Narcótico

Provoca hemólisis


Ventajas

Excelente recuperación de la mayoría de los Acs de grupo sanguíneos

Desventajas

Narcótico

Tóxico

Explosivo

Muy inflamable

Poca recuperación de anti-S-s


Ventajas

No peligroso

Recuperación adecuada de la mayoría de los Acs significativos

Kit comercial

Desventajas

El lavado del estroma es lento

Baja sensibilidad sistema Kidd


Ventajas

Apropiado para preparar eluatos y obtener células PAD negativas

No destruye las células tratadas

Sensibilidad comparable a digitonina-ácido

Desventajas

Desnaturaliza los Ag del sistema Kell


Los GR con PAD positiva no pueden tipificarse con reactivos que requieran una técnica de AGH

En condiciones controladas, el difosfato de cloroquina disocia la IgG de la membrana de los GR sin afectar su integridad.

Esto permite la fenotipificación completa de los GR recubiertos con autoanticuerpos reactivos en caliente


Solución de difosfato de cloroquina preparada disolviendo 20 g en 100 ml de SF

Ajustar el pH a 5,1 con OH-Na 1 N

Conservación 2 a 6º C

Se necesitan GR de control portadores de una dosis simple de los antígenos a fenotipificar

Se utiliza reactivo anti-IgG monoespecífico


No disocia el complemento de la membrana celular

Incubación no > de 2 hs. causa hemólisis y/o pérdida de reactividad antigénica

Los Ag del sistema Rh podrían experimentar cierta desnaturalización.

Pudieran no eliminarse por completo los Acs de los GR sensibilizados

sólo atenuar la intensidad de la PAD

La cloroquina atenúa la expresión de Ag HLA de Clase I eritrocitarios


Principios

Es un método semicuantitativo que se emplea para determinar la concentración de Acs en muestras de suero o comparar la intensidad de la expresión antigénica en distintas muestras de GR


Aplicaciones Estimar actividad de Acs en embarazadas

alosensibilizadas Definir la especificidad relativa de los

autoanticuerpos Caracterizar Acs de título alto baja avidez (TABA)

Ejemplo Knops y Chido-Rodgers, Csa y JMH

Observar el efecto de los reactivos sulfhidrilo sobre el comportamiento de los Acs (IgG o IgM)

Monitoreo de IgG en embarazadas


Interpretación

Observar la mayor dilución que produce aglutinación 1+

El título es la inversa de la dilución

Si se advierte aglutinación en el tubo que contiene el suero mas diluido no se alcanzó el punto final

En los estudios comparativos la diferencia significativa en los títulos es de 3 diluciones

Los títulos solos sin la evaluación adicional de la intensidad de la aglutinación pueden ser engañosos


Por ser un método semicuantitavo la variabilidad técnica puede desviar los resultados

Score de Mars

Asignar un valor numérico a la intensidad de la aglutinación

4 + = 12

3 + = 10

2 + = 8

1 + = 5

La suma correspondiente a todos los tubos representa el score

El umbral significativo arbitrario para comparar los puntajes es de 10 ó más


Claves Técnicas Calidad de las pipetas y su utilización

Respetar tiempo y temperatura de incubación

Duración y potencia de centrifugación

La antigüedad, el fenotipo y la concentración de las células influyen en los resultados

Es casi imposible lograr resultados reproducibles en su totalidad Las comparaciones son válidas con análisis

simultáneos

Se disminuye la variabilidad con la utilización de mayores volúmenes


Nomenclatura

SISTEMA GENES ANTIGENOS FENOTIPOS

MNS M N S s M N S s M+ N+ S-s+

Duffy FYa FYb Fy a y Fy b Fy (a+b-)Fy (a+b+)Fy (a-b+)Fy (a-b-)

Kell K k Kpa Jsa K k Kpa Jsa K+k+ Kp(a+b-) Js (a+b-)

Kidd Jka Jkb Jka Jkb Jk (a+b+)


Referentes históricos:

Issit, Daniels, Garratty, Pineda


Hibridomas

La fusión de células plasmáticas normales, productoras de anticuerpos, con células plasmáticas neoplásicas permite obtener líneas celulares con capacidad reproductiva infinita.


Una célula B estimulada da origen a una progenie clonal que produce Acs específicos para un epítopo

El sobrenadante del cultivo de un clon de células B contiene Acs de especificidad única

Los eventos posteriores a la activación pueden inducir diferencias en el isotipo de las cadenas pesadas

la especificidad idiotípica codificada en las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas no se modifica

Siempre comenzar por verificar la existencia de antecedentes transfusionales recientes

Puede tratarse de:

Autoanticuerpos reactivos en frío

Autoanticuerpos reactivos en caliente


Macroscópica

BI

Haptoglobina

LDH

Hemoglobina libre en plasma y orina

Si no hay clínica ni laboratorio de hemólisis no se justifican estudios adicionales


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La reactividad de la mayoría de los autoanticuerpos reactivos en caliente aumenta con el uso de PEG y enzimas

Es conveniente realizar la DAI sin los medios potenciadores habituales

Si los resultados son negativos puede emplearse el mismo procedimiento para la prueba de compatibilidad sin necesidad de adsorciones


Si el autocontrol es positivo en la fase AGH, podría haber células recubiertas con Acs que determinan una PAD positiva con campo mixto

La elución podría ser útil en especial cuando las pruebas séricas no son concluyentes

En el paciente con PAD positiva transfundido en fecha reciente o no, podría ser difícil obtener el fenotipo exacto de los GR Muchos reactivos monoclonales pueden proporcionar

resultados válidos a pesar de la PAD positiva


En nuestro país, además de los laboratorios de investigación y los que realizan pruebas de compatibilidad para transplantes de médula ósea y órganos sólidos, los bancos de sangre están realizando en forma rutinaria pruebas de biología molecular con amplificación de ácidos nucleicos

01/11/2011 Dr. Silvio R. Rosell

46

57 21 34 6

21

7

7

9

9

15 9

4

12p12.3

6p21.3

A, B, AB, A1

6

3

Sistemas antigénicos eritrocitarios


01/11/2011 Dr. Silvio R. Rosell

Thermophilus aquaticus, es una bacteria termófila que vive en la proximidad de las fuentes de agua caliente Vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 °C, debido a que su cóctel enzimático resiste tales condiciones Normalmente, a esas temperaturas, las proteínas constitutivas de la mayoría de los seres vivos se desnaturalizan y no vuelven a ser funcionales

En la PCR se separan las cadenas de la doble hélice del ADN mediante desnaturalización térmica

Taq DNA Polimerasa

Una enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de

la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra

Un fluorocromo, es un componente de una molécula que hace que ésta sea fluorescente Un grupo funcional de la molécula absorberá energía

de una longitud de onda específica y la volverá a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda

La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias

Se requieren oligonucleótidos alelo esoecíficos complementarios a la secuencia a analizar

Gracias por vuestra amable atención


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