INGENIERIA AMBIENTAL “B” – IV ciclo

“AÑO DE LA PROMOCIÓN DE LA INDUSTRIA RESPONSABLE Y COMPROMISO CLIMÁTICO”

INVESTIGACION DE COLIFORMES EN EL AGUA

Docente : Jhon García López

ALUMNA : Lucía Guadalupe Núñez Dávila

INTRODUCCIÓNUno de los principales requisitos para que el agua sea apta para consumo es que esté libre de bacterias patógenas para el hombre.Generalmente, los análisis de rutina no están dirigidos a la búsqueda directa de microorganismos causantes de enfermedades que se transmiten a través del agua (ejemplo: fiebre tifoidea, cólera, etc.).En el análisis microbiológico se busca detectar la presencia de microorganismos característicos del intestino de mamíferos. La presencia de éstos indicaría contaminación fecal en las fuentes de agua utilizadasEl método que usaremos en del número más probable, en el cual consiste en hacer diluciones seriadas de cada muestra de agua recolectada. Asimismo se utiliza como indicador de contaminación el recuento de bacterias totales.

MATERIALES: Vasos estériles

Medio de cultivo Agar Endo

Caldo verde brillante

Método NMP(número más probable)

Diluciones seriadas

50 Tubos de ensayo estéril

Bureta estéril

Fiola

Agua destilada estéril

Matraz estéril

Campana de Durham estéril

Pipeta de 1mm,5mm y 10 mm estéril

Cocina

Balanza

Autoclave

Viales

MÉTODO é IdentificacionesMÉTODO DEL NUMERO MÁS PROBABLEEl método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes.

TINCION GRAM

PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS:

Las muestras de agua tienen una duración de 48 horas, pasando las 48 horas el agua ya no es útil.El método que usamos para detectar coliformes es el NMP (número más probable), para realizar el análisis se tiene que realizar las diluciones en medio caldo verde brillante.

1- CALCULOS PARA PREPARAR CALDO VERDE BRILLANTE

40 gr 1000 mlX 270 ml

X=10,8 gr

Pesar 10,8 gr de caldo verde brillante, echar en un matraz estéril, agregar agua estéril y disolverlo, colocarlo en el calentador en máxima potencia (370°), enfriar y colocarlo en autoclave para esterilizar. PH del caldo verde brillante es 6,75.

DILUCIONES

Recogimos 10 muestras de agua, cada muestra va a contar con 5 diluciones por lo tanto habrá 50 diluciones. Usamos tubos de ensayo estériles y en cada tubo pequeño debe tener 4.5ml de agua estéril y 0,5 de muestra de agua recolectada. Siendo: 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5 De cada muestra usamos 10-3,10-4, 10-5para inocularlas en caldo verde brillante.

En todas las muestras se siguen los siguientes pasos: flamear el tubo antes y después de haber agregado 4,5 ml de agar caldo verde brillante y 0,5 ml de muestra de agua, repitiendo con cada dilución, teniendo 30 tubos de ensayo con caldo verde brillante y muestra. Por ultimo flamear antes y después de agregar la campana invertida.

Colocar en la estufa a 37 °C por 48 horas. Ya pasando las 48 horas sacar de la estufa y ver qué cambios se muestran.

amarillo 1Amarillo claro y turbidez ½Igual color 0

DILUCIONES CAMBIOS

10-3 10-4 10-5

M1 ½ ½ ½M2 ½ ½ ½M3 ½ 1 0M4 ½ 0 0M5 ½ ½ 0M6 0 1 0M7 0 0 ½M8 1 ½ ½M9 ½ 1 0M10 0 0 1

Agar Endo

Cálculos:

51 gr 1000ml

X 100

X= 51 x 100/1000

X=5,1 gr

Pesar 5,1 gr de agar Endo, agregar en un matraz 100 ml de agua estéril, disolverlo y colocarlo en el calentador a máxima potencia 370° luego enfriarlo y colocarlo en autoclave. Usamos 20 viales que son el número de muestras que cambiaron su color. Los viales deben estar esterilizados, flamear y vaciar en cada vial el agar hasta la mitad, se tapa y se inclina.

Ya seleccionados los tubos que han cambiado que son 20 se pasa a sembrar en los viales.

Flamear la hace bacteriológica y la boquilla del vial antes y después de sembrar las muestras con caldo verde brillante que cambiaron de color.

Dejar en la estufa por 48 horas. Pasando las 48 horas.

TINCION GRAM Limpiamos el portaobjetos con algodón y ron de quemar, es un hecho que se debe limpiar porque si no la muestra sale encima de otro

La secamos y añadimos una gota de agua destilada, extender y después se fija en el mechero que contiene ron de quemar, también se fija el ansa de siembra en el mechero y se deja que enfrié unos segundos y se introduce en cada caja preti, donde se encuentra el agar con las dos muestrasDespués de este proceso, se vuelve a fijar en el mechero; y consecutivamente se pasa a la tinción en el siguiente orden

PROCESO DE TINCIÒN

1. Se le agrega VIOLETA DE GENCIANA (2 minutos) - se enjuaga con agua destilada

2. Se le agrega LUGOL (2 minutos) - se enjuaga con agua destilada 3. Se le agrega ALCOHOL (2 minutos) – se enjuaga con agua destilada – se le

agrega SAFRANINA (2 minutos) – se enjuaga con agua destilada – se fija cada muestra –

4. se le agrega una gota de ACEITE DE INMENCION (para poder tener una mejor visión de la muestra )

Y finalmente se posa en el MICROSCOPIO para poder observar claramente cada muestra.Los tiempos para aplicar cada colorante son orientativos. En la tinción, las Gram positivas se observarán de color azul-violeta, y las Gram negativas de color rosa.

RESULTADOS:

BACTERIAS

MUESTRAS 10-3 10-4 10-5

M1 Escherichia coli Pseudomona Pseudomona

M2 Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli

M3 Escherichia coli Escherichiacoli y

Pseudomona

contaminada

M4 Escherichia coli

M5 Escherichia coli Pseudomona

M6 Escherichiacoli

M7 Escherichia coli

M8 Escherichia coli Escherichia coli Pseudomona

M9 Pseudomona Pseudomona

M10 Escherichia coli

E. COLI:

La Escherichia coli (pronunciado /eske'rikia 'koli/), también conocida por la abreviación de su nombre, E. coli, es quizás el organismo procariota más estudiado por el ser humano. Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo. Esta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, además de producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram (gramnegativo), es anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++--.Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biología molecular.

PSEUDOMONA:

Pseudomonas es un género de bacilos rectos o ligeramente curvados, Gram negativos, oxidasa positivos, aeróbicos estrictos aunque en algunos casos pueden utilizar el nitrato como aceptor de electrones. El catabolismo de los glúcidos se realiza por laruta de Etner-Doudoroff y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Algunos miembros del género son psicrófilos, mientras que otros

sintetizan sideróforos fluorescentes de color amarillo-verdoso con gran valor taxonómico. Es común la presencia de plásmidos y no forman esporas.

CUESTIONARIO:1. ¿Qué es un organismo indicador, y que propiedades debería tener?

Un indicador microbiológico es un microorganismo que su presencia permite determinar la existencia de un patógeno. Este indicador se usa mayoritariamente en la determinación de contaminación de las aguas.

No encontrarse en agua no contaminada.

Estar presente en el agua contaminada manteniendo una correlación con los patógenos.

Ser más abundante que los patógenos. Sobrevivir en el agua más tiempo que los patógenos. No multiplicarse en el agua. Ser detectado, de la forma, más rápida, fácil y económica. En lo posible tener criterios microbiológicos comunes

internacionalmente.

2. ¿Cómo se define a un coliformes? ¿Cómo se relaciona esta definición con las pruebas presuntivas, de confirmación y finales?

 Coliforme designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos Grupo de bacterias cuyo representante más importante, desde el punto de vista sanitario, es la echerichia coli

3. ¿Cómo se diferencia entre coliformes y coliformes fecales laboratorio?Los coliformes son un grupo de bacterias cuyo representante más importante, desde el punto de vista sanitario, es la echerichia coli

Los coliformes fecales son microorganismos con una estructura parecida a la de una bacteria común que se llama echerichia coli y se transmiten por medio de los excrementos. La echerichia es una bacteria que se encuentra normalmente en el intestino del hombre y en otros animales.Hay diversos tipos de echerichia, algunos no causan daños en condiciones normales y otros pueden causar hasta la muerte

4. ¿En que tipo de medio es mejor usar enterococos que coliformes fecales como organismos indicadores?El agar BARNES 

CONCLUSIONES La metodología utilizada para realizar el análisis del suelo, fue fácil de ejecutar, sencilla, muy didáctica.

Los suelos con escasa biomasa, muestran una baja capacidad de infiltración como consecuencia de su bajo contenidos en materia orgánica, siendo altamente susceptibles a los procesos erosión hídrica. Esto es lo que sucede con la muestra que estudiamos, ya que la parcela fue tomada en una zona afectada seriamente por procesos erosivos.

RECOMENDACIONES Se recomienda orden y tener el material adecuado y usar siempre el

mandil y los guantes y para el uso de cultivo, en el proceso es necesario una mascarilla, para evitar algún tipo de contaminación

Se recomienda esterilizar todos los materiales a usar, debido que existe contaminación en la atmosfera y esto puede alterar los resultados requeridos, una forma de una buena esterilización al 100% es usando el autoclave vertical.

Antes de todo procedimiento a realizar en el laboratorio se debe desinfectar correctamente las mesas, con algodón y ron de quemar, para así evitar algún tipo de contaminación en los resultados esperados.

Se recomienda que después de cada uso del material o instrumento de laboratorio se lave correctamente y se colocó en el lugar respectivo.

ANEXOS

LINCOGRAFÍA http://tagaragunche.com/Chijere/index.php?mod=conclusiones

http://es.wikipedia.org/wiki/Indicador_microbiol%C3%B3gico

http://es.slideshare.net/lucasburchard/coliformes