Aislamiento de Inmunoglobulinas de Suero Porcino, Mediante Cromatografía de Interacción Hidrofóbica: Comparación

de Dos Matrices Cromatográficas

Vega-Fernández, M.R, Vázquez-Moreno, L y Ramos-Clamont, G. Trabajo de tesis de licenciatura de la primera autora, realizada

en el Área de Ciencia de los Alimentos

Las inmunoglobulinas (Ig´s) son los elementos básicos de la respuesta inmunitaria humoral de los organismos vertebrados. Estas glicoproteínas se encuentran en el suero y tejidos tisulares y son producidas por los linfocitos B estimulados (células plasmáticas) como respuesta a la presencia de un agente extraño específico. Por lo anterior, las Ig´s son un componente importante dentro de los mecanismos de defensa contra las enfermedades de origen infeccioso que presentan los animales.

En los cerdos, las etapas de mayor susceptibilidad a las infecciones, son las inmediatamente posteriores al

nacimiento y el periodo de destete. En porcicultura, el uso de concentrados de Ig´s para prevenir enfermedades diarréicas representa una alternativa al uso de antibióticos.

Las preparaciones comerciales de inmunoglobulinas, se aíslan a partir de sus fuentes originales a nivel analítico o a escala industrial. En la industria pecuaria se utiliza mucho el calostro deshidratado como fuente de inmunoglobulinas exógenas. Pero los intentos de emplear Ig´s de la sangre de animales para fortificar alimentos pecuarios son muy pocos.

El aislamiento en grandes cantidades de anticuerpos de suero humano o de otros vertebrados se ha venido realizando por métodos de precipitación salina o alcohólica o bien por secado del suero o plasma. Ambos métodos son inespecíficos. Los métodos cromatográficos tienen la ventaja de ser altamente específicos y las condiciones de operación se pueden ajustar para evitar la disminución de la actividad biológica y para lograr el aislamiento en el menor número de pasos posibles. Algunos de los métodos cromatográficos utilizados en el CIAD para la purificación de inmunoglobulinas son: la cromatografía de afinidad, la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) y la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Esta última promueve la separación de proteínas en base a las interacciones hidrofóbicas que se establecen entre ligandos hidrofóbicos inmovilizados en una matriz cromatográfica y las regiones no polares de las superficies proteicas. La adsorción de las proteínas se promueve en presencia de sales en la fase móvil y la elusión se favorece al disminuir o eliminar dicha presencia.

Con el fin de purificar inmunoglobulinas a partir de suero porcino por cromatografía de interacción hidrofóbica, se comparó la eficiencia de las matrices cromatográficas: Sefarosa altamente acetilada (Sefarosa HA) y Novarosa altamente acetilada (Novarosa HA), ambas sintetizadas en el Laboratorio de Bioquímica de proteínas de Ciencia de los Alimentos.

El suero se obtuvo a partir de la coagulación de sangre porcina proveniente de la línea de sacrificio de un Rastro Tipo Inspección Federal (TIF) de la ciudad de Hermosillo, Sonora, separándose por decantación y conservándose a -40 oC hasta su uso. Para la purificación se empacaron en columnas abiertas 9 ml y 2.6 ml de Sefarosa HA y Novarosa HA respectivamente. Se utilizó el esquema de purificación establecido en el laboratorio de Bioquímica de Proteínas del CIAD. Las columnas se equilibraron con tres volúmenes de Na2SO4 pH 7.6 . El suero se aplicó a la columna igualando su molaridad a la solución de equilibrio. La proteína no adsorbida se removió con la solución de equilibrio hasta una lectura espectrofométrica de 0.020 unidades de adsorbancia a 280 nm. En ambas matrices se probaron concentraciones de sulfato de sodio de 0.5 y 1M. La proteína adsorbida se eluyó con MOPS 10 mM, pH 7.2. La regeneración y remoción de material remanente adsorbido a la columna incluyó la aplicación de tres volúmenes de guanidina 4M, pH 7.6, 5 volúmenes de agua bidestilada y reequilibrio con tres volúmenes de sulfato. La capacidad de las matrices se estimó aplicando concentraciones discontinuas crecientes de suero a las columnas.

Se realizaron 12 corridas para cada tratamiento determinándose que la capacidad de adsorción de las matrices se vio influenciada por el tipo de matriz y la concentración de sal utilizada. Sefarosa HA presentó capacidades de 1.43 y 4 Mg. de proteína adsorbida/mg de matriz a concentraciones de 0.5 y 1.0 M de Na2SO4 respectivamente. Mientras que los valores encontrados para Novarosa HA a las mismas condiciones fueron de 2.5 y 1.9 mg de proteína/ml de matriz respectivamente.

Debido a que los patrones electroforéticos de las fracciones de elusión obtenidas en los esquemas de purificación con Na2SO4 1.0 M muestran contaminación con albúmina, se concluye que la concentración más adecuada para promover la adsorción de Ig´s es la de 0.5 M. A pesar de que Novarosa HA observó una mayor capacidad de adsorción, la recuperación de proteína aplicada a las columnas fue mayor al utilizar Sefarosa HA por lo que esta matriz resulta más idónea para la purificación de inmunoglobulinas séricas porcinas.