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Aislamiento de los alcaloides de los extractos crudos de Sedum
oxipetalum y Sedum praealtum y estudiar la actividad antifúngica del
extracto etanólico de cultivo de células en suspensión de Fouquiera
splendens sobre hongos de importancia médica
RESUMEN
Debido al incremento inmoderado de la población se puede observar en la actualidad.
Se han iniciado una serie de proyectos científicos que plantean posibles soluciones para
el control de la sobrepoblación, tomando en cuenta la salud de los consumidores.
Debido a esto el interés principal de esta investigación es encontrar un anticonceptivo
espermicida que no produzca efectos secundarios y que tenga un 100% de efectividad,
estudiando el extracto clorofórmico de Sedum oxipetalum y el extracto etanólico de
Sedum praealtum D.C. en donde se aislo una fracción de Sedum praealtum que
presenta una actividad contra los espermatozoides del 90% en comparación a la del
testigo positivo Nonoxinol-9 que presentó una actividad del 68%. También se aislaron
dos alcaloides del extracto clorofórmico de Sedum oxipetalum, pero no se pudo probar
su actividad espermicida, debido a que no fueron solubles en solución salina.
Asimismo se estudió la actividad antifúngica del cultivo de células en suspensión de
Fouquiera splendens sobre hongos de importancia médica, en donde se encontró que los
callos obtenidos del cultivo de células en suspensión la presencia de los siguiente
metabolitos secundarios: alcaloides, flavonoides, azúcares reductores principalmente.
El extracto obtenido de cultivo de células en suspensión de Fouquiera splendens es
capaz de ejercer un efecto antifúngico en un 36% contra 17 cepas de interés médico.
INTRODUCCION
El uso de plantas para tratar enfermedades es posible que sea tan antigua
como la humanidad misma.
Desde hace muchos años atrás el hombre ha recurrido al empleo de las
plantas, con la finalidad de aliviar sus malestares, apoyándose de igual manera
del uso de sustancias de origen animal y junto a esto diversos ritos mágicos.
(7)
Conforme al paso del tiempo fueron surgiendo grandes tratamientos empíricos,
y casi al mismo tiempo la medicina tuvo avances muy importantes, naciendo un
concepto en donde se mencionaba que cuanto más drástico fuera el
tratamiento, mejores eran los efectos.
Uno de los mitos que han nacido concierne a los medicamentos, en el
momento en que la industria farmacéutica moderna empezó a fabricar
productos sintéticos, fue la idea de que solo los medicamentos de este tipo
resultan eficaces.
Esto es basado en las diferentes pruebas que se realizan a los laboratorios de
investigación (8)
Cuando hablamos de la sobre valoración de los medicamentos de patente,
hace que olvide una gran verdad, como son los remedios que proporciona la
herbolaria los cuales también son eficaces, en ocasiones mejores en
comparación de los sintetizados que se investigan en los laboratorios.
Al surgir la industria farmacéutica, se les obligo a los químicos descubrir y
aprender nuevas técnicas de aislamiento, con la finalidad de poder obtener los
principios activos de las plantas y luego poder sintetizarlos. (8,9)
De este modo la industria farmacéutica comenzó a crecer en el mercado, con el
tiempo el químico logro desarrollar la síntesis de nuevas sustancias, y por lo
tanto el aumento de nuevos medicamentos de patente, lo cual producía que
fuera menguando el interés por la herbolaria.
En la actualidad un grupo de científicos se han dado a la tarea de realizar
estudios e investigaciones sobre los efectos secundarios que llegan ha producir
los ingredientes activos purificados de algunos fármacos “nuevos”, que en
comparación a los medicamentos vetustos sin purificar no tenían, y la pregunta
de ellos es si habrán pasado por alto otras sustancias producidas por la misma
planta, que minimicen los efectos colaterales de los principios activos. (9)
Argumentan que las posibles soluciones es saber el momento adecuado para
poder recolectar la planta, sugiriendo que la actividad máxima es en el
momento de la floración, sin embargo no solo ese es uno de los puntos
principales ya que depende en la época en la que recolecta, el uso de la planta
en su estado fresco o seco, emplear distintas poblaciones de una especie o
especies relacionas alterando la eficiencia y la estabilidad de los principios
activos.
Las empresas farmacéuticas al comprender el gran provecho que se puede
obtener de la herbolaria, se han puesto a estudiar seriamente las plantas
medicinales para determinar cueles son las plantas que presentan una
actividad farmacéutica y como es que lo presentan y el por que, ya teniendo los
puntos anteriores solo queda poderlas aprovechar. Las plantas siguen
proporcionando la materia prima da gran numero de fármacos que son usados
actualmente en el tratamiento de las enfermedades. (8, 9,10)
En el campo de herbolaria, botánicos, médicos y farmacólogos trabajan juntos
con la finalidad que sea posible que esta área se transforme en un recurso mas
valioso enfocado a los miles y millones de personas que no pueden contar con
otros medios para la cura de sus males. (10, 11)
Actualmente científicos han comprobado el valor de 90 especies que sirven
como medicamentos, y los han ordenado según 62 categorías terapéuticas que
incluyen remedios para aliviar las afecciones cardiacas, la gota y la
hipertensión arterial, laxantes, descongestivos de las vías respiratorias,
analgésicas, anestésicos, sedantes, antidepresivos, anticonceptivos etc. (11).
En el futuro, se podrán utilizar nuevas tecnologías que podrán facilitar la
obtención de metabolitos secundarios que posteriormente se podrían utilizar
como fármacos (10,11).
CULTIVODECÉLULASENSUSPENSIÓN
Estatécnicaserealizamedianteunadisgregacióncelularpormediosmecánicos(agitacióncon
stante)enunmediodecultivolíquidoelcualposeeloselementosesenciales(macronutrientes,micronut
rientesyhormonas)disueltosenagua,loquepermitiráunaumentodelamasacelulardelcultivodurantel
aincubación.[6]
Loscultivospuedendiluirseparaobtenersub-
cultivosconunpatrónsimilardecrecimientoydarunrendimientosimilaraldelmaterialcelularsiempreyc
uandosesometaalasmismascondicionesyperiodosdeincubación.[2]
Lasíntesisdemuchosmetabolitossecundariosnoescosteableporloquelabiotecnologíaesun
abuenaalternativa.Ladecisióndeproducirunasustanciapormediosbiotecnológicosdepende,nosolo
delacuestióneconómica,sinotambiéndelacapacidadbiológicayaquedebe
elegirseadecuadamenteelsistemaproductorylascondicionesóptimasdecrecimientodelascélulasve
getales.[3]
Contodoloanteriorplanteado,sepresentandiferentesventajasenproducirsustanciaspormed
iodecélulasvegetales,encomparaciónconlasíntesisquímica;entreellastenemos:
Controlprecisoyfinodelmedioambiente. Fácilobtencióndereplicasidénticas(líneahomogénea). Costeables. Condicionesdeproducciónmenosseveras(reducciónenelusodeaparatoscostosos). Aportedelosnutrientesnecesariosparaelcrecimientoóptimodelaplanta. Evitarsobreexplotaciónderecursosnaturales,enestecasolaplantadeinterés.
Todaslasespecies,incluyendoaquellasa
únsindescubriroactualmentepercibidascomo"si
nningúnvalor",tienenelpotencialdeproporcionar
nosproductosquesalvenvidas.[4]
FouquieriasplendensCOMOALTERNATIVADEESTUDIO
Elsabertradicionalsobreelusomedicinaldelasplantasnoshallevadoalabúsquedadenuevosr
ecursosmedicinales;debidoaestosedecidiórealizarelestudioenunaplantadelafamiliadelasfouquier
aceas.
Lascactáceassonplantasperennes,suculentas;generalmenteespinosas;lasespinassonvar
iablesentamaño,forma,consistencia,colorydisposición;presentanunfrutosecoojugosoconnumero
sassemillas.Poseen
3
hermosasfloresconinteresanteanatomíadesus
estructuras,lasmodalidadesdesufisiología,indic
adorasambasdesuadmirableadaptaciónalaseq
uíayenlosúltimosañossondegraninteréscientífi
codebidoalavariedaddesustanciasquesepuede
nextraerdeellasyquetienenunampliousoenlasin
dustriasalimentaría,farmacéuticayquímica.Alg
unascactáceasproducenungrupodesustancias
químicasdeespecialinterésporsuspropiedades
farmacológicasconocidascomoflavonoides,loscualespresentanunaactividadantifúngica;u
naespeciedeFouquieraceaequepresentadichaactividadesFouquieriasplendensconocidatrivialme
ntecomoOcotillo,RotillaoAlbarda.
Fouquieriasplendens
esunarbustobajo,de2-
10mdealtura,troncobasalcorto,de(7)15a25(40)cmdediámetro,ramificadocercadelabase
en6a30(100)talloserectosorecurvados,cortezaexternaverdeacafé-
amarillenta,exfolianteenpequeñastiras,
espinasde(5)15
25(42)mmdelargo,rectasocurvas;hojasdelosbrotescortos(2)4-
11mmdeancho,agudasaredondeadasyemarginadasenelápice,cuneadasenlabase;panículaestre
chamente
de(9)1020(30)cmdelongitud,raquisdecolorpúrpuraarojizo;sépalosanaranjado-
rojizos,rosadosablancoamarillentos,ampliamenteovados,oblongosacasireniformes,de4.5-
6(9)mmdelongitud,3.55.5mmdeancho,obtusosaemarginadosenelápice;corolaanaranjado-
rojiza,rosadopurpúrea,rosadoamarillentaaamarillaclara,de10.528mmdelargo,tubode6.5-
22mmdelargo,por3.5a6mmdeanchoenlagarganta,pubescenteensuinteriorconunabandade2-
5mmdepelosunicelularescercadelabase,lóbulosfuertementereflejos,de4.5-
7mmdelongitudy3.5a5mmdeancho,ampliamenteovadosaelípticos;estambres(12)14-
16(20),filamentosde(8)12a25(34)mmdelargo,ensanchadosenlabase,conunespolóntruncadoadax
ialde1.5mmdelargo,anterasde45mmdelargo;ovariode1.52mmdealto,óvulos12-
16,estilode8.5a32mmdelargo;cápsulaslanceoladasaovadolanceoladasencontorno,de(12)14-
22mmdelongitudy57mmdediámetro;semillas513,blancas,de7a13mmdelongitud,4-
6mmdeancho,conalashastade5mmdeancho.Suaprovechamientocomoartesanal,construcciónya
grícolaseregulaporlanormaoficialmexicanaNOM005RECNAT1997
ysuaprovechamientocomocomestibleymedicinalesmásbiendeautoconsumoesreguladoporlanor
maoficialmexicanaNOM007RECNAT1997. [ 10 ]
Principalmenteesusadaenlassiguientesactividades:Agrícola:comocercasvivas.Artesanal:seusae
nlaelaboracióndeartesanías.Comestible:losfrutossoncomestibles.Construcción:comopostesyvig
as.Medicinal:untintefrescodelacortezaesútilparasíntomaspresentadosdebidoalacongestiónflúida;
otrasaplicacionesincluyenlarelevacióndelafatigabañándoseenelaguaquecontienelasfloresolasraí
cesmachacadas.Muchastribusindiasdivulganquelasfloresylasraícesdelocotillosoncomúnmentec
olocadasenlasheridasfrescasexcesivas,ayudandoasanarmásrápidamente.Ocotillotambiénseutili
zaparaaliviarlatos,lasvenasvaricosas,lasinfeccionesdelazona
urinaria,yloscrecimientosbenignosdelapróstata.[12]
MICOSISPRODUCIDASPORHONGOSDEINTERESMEDICO
Lasmicosissoninfeccionescrónicas,causadasporhongos.Puedenafectarlapiel,peloyuña
s(micosissuperficiales),asícomoinvadirtejidosyórganos(micosisprofundas)causandoenocasion
eslamuerte.Algunosgruposdehongos,deinterésmédicoson:
Dermatofitos Candidaspp. Cryptococcusspp. Hongossaprobios
MICOSISOPOTUNISTAS
• Candidosis
InfeccióncausadaporlevadurasoportunistasdelgéneroCándida,(Tabla1.)afectamucosas(
Figura5.),piel,uñasyocasionalmenteórganosinternos.Sinonimia:candidiasis,moniliasis,muget,alg
odoncillo,blastomicosisLascandidasagrupan80especies;lasdeimportanciamédicason:
Cándidaalbicans,Cándidatropicalis,Cándidaparapsilosis,Cándidakrusei,Cándidaguillliermondii,
CándidaglabratayCándidakefyr.[13]Agentesetiológicos
albicanstropicallisCándida kruseiglabrata
Tabla1.MuestrauncuadrodelasespeciesdeCandidaca
usantesdelascandidosis.
Víasdecontagio
Lacandidosisnoestálimitadageográficamente,porquelaenfermedadocurreprincipalmente
enpacientespropensosaunsobre-
crecimientodesupropiabiotalevaduriformeporfactorespredisponentescomoSIDA,procedimientos
quirúrgicos,iatrogeniasinmunosupresivas,catéteresintravenosos,administraciónprolongadadeag
entesantimicrobianos,quimioterapiacitoreductiva,neutropenia,enfermedadeshematológicasmalig
nasyabusodedrogasintravenosas.
Lesionescausadas
Figura5.MuestraunalesióncausadaporelgéneroCandida,conocidacomoalgodoncilloocandidosisbucalen
• Criptococosis niño.
Infecciónfúngicasubagudaocrónicacausadaporlalevaduracapsulada,oportunistaymonom
órficadenominadaCriptococcusneoformans.Lasespeciescausantesdelacriptococosissemuestran
enlaTabla2.[14]
AgentesEtiológicosneoformansvar.neoformanss.
Criptococcus neoformansvar.gattii
Tabla2.MuestralasEspeciesdeCripococcuscausantes
delascriptococósis.
Víasdecontagio
Laprincipalvíadeinfeccióneselexcrementodepalomaysueloscontaminadosconexcretasde
gallina,otrasavesyelcontactoconEucaliptoscamaldulensis.Laslesionescausadasporunameningiti
scriptococosicasemuestranenlasFiguras6y7.
Lesionescausadas
Figura6.AspectodelaafecciónencefálicaconalteraciónextensadelaestructuracorticalyFigura7
.LesionesenelPallidum,deaparienciadelasustanciablancasubcort
ical,quemucoideycontornosredondeados
adoptanunaaparienciagelatinosaen
unanítidoscorrespondientesacoloniasde
meningitiscriptococósica.Lasflechascr
iptococosenunameningitis
anexas,muestranelsitiodelalesión.criptococósica.Laflecham
uestraelsitiodelalesión.
Dadalaparticularresistenciadelasmicosisacualquiertratamiento,laprevenciónconstit
uyeunamedidaprimordialparaevitarlasdesagradablesconsecuenciasdeestetipodeenferme
dades.Muchasafeccionesfúngicassetransmitenpormediodelosanimales,enespecial,atravé
sdelosperros,peroloquesusdueñosdeberáncuidardelasaluddelanimalparaevitarcontagios.
Enlosclimastropicales,dondelascondicionesambientalessonóptimasparaeldesarrollodetod
otipodehongos,sedeberátomarlaprecaucióndedesinfectarcualquierheridaconprontitudyefic
acia.Enverano,esnecesarioextremarlasmedidashigiénicas,enparticular,allavarselospies,s
edebensecaraconciencialaszonasinterdigitales.
Encuantoaltratamiento,enelcasodeunamicosissuperficial,sellevaacabomediantelaaplicac
iónlocaldecremasylocionesfungicidas;cuandolainfecciónesextensayresistente,elmédicopuedepr
escribirlaadministracióndeantibióticos,comolagriseofulvina,entreotros.Lasmicosisinternassonde
difíciltratamiento,sibienalgunasrespondenconrelativaeficaciaalaaccióndelaanfotericinaB.[15]
Aislamiento de los flavonoides del extracto crudo de etanol de sedum
praealtum D.C. (Silvestre) con actividad eseprmicida
La planta fue recolectada en el Estado de Morelos, posteriormente se peso, se
lavo y fragmento, después se somete a una extracción, por el método de
maceración, el cual consiste en dejar a la planta sumergida en un disolvente
apropiado para que penetre bien en la estructura celular y disuelva los
metabolitos solubles, esto se efectúa durante un periodo largo, a temperatura
ambiente. Generalmente se usa la maceración cuando la planta contiene
principios activos que se perderían o quedarían modificados por acción del
calor. En este caso, la especie vegetal Sedum praealtum DC, estará en
contacto con etanol a temperatura ambiente durante un tiempo determinado,
posteriormente se evapora el disolvente por presión reducida.
Una vez obtenido el extracto etanólico, se procede a una extracción de este
con acetona, mediante evaporaciones.
ANÁLISIS FITOQUÍMICO
En la búsqueda de plantas con principios activos se requiere que el recolector
viaje varias horas a veces se conoce de antemano la especie que será
recolectada. Cuando se esta inseguro se busca material perteneciente al
genero de planta hallada. En dichas situaciones es muy útil en el campo, las
pruebas químicas sencillas, sensibles, especificas, lapidas y que requieran
equipo mínimo, económico y fácil de transportar. Para este proyecto se
realizaron pruebas químicas para la determinación de metabolitos secundarios.
(28)
PESAR Y FRAGMENTAR LA ESPECIE VEGETAL
REALIZAR EXTRACCIÓN CON AGUA, ETANOL, CLOROFORMO,
SOMETER A REFLUJO POR 30 MINUTOS
METABOLITOS
Alcaloides; compuestos principalmente nitrogenados lo cual les confiere
basicidad y por lo tanto pueden ser protonados con facilidad con acido. En las
plantas son encontrados en forma de sales orgánicas. Poseen actividad
farmacológica y son biosintetizados a partir de aminoácidos (28).
Flavonoides; se encuentran ampliamente distribuidos en la planta de forma
libre o como glucósidos, son los que contribuyen a darle color a la flor y al resto
de la planta (28).
Cumarinas; son benzo- - pironas, inhiben la germinación de la semilla y en
pequeñas concentraciones favorece el crecimiento de la raíz (28).
Saponinas; son grupo de glucósidos, los cuales se disuelven en agua y
disminuyen la tensión superficial del agua (28).
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA SEPHADEX
Su fundamento se basa en la separación de sustancias puras de mezclas
complejas. Esta técnica depende del principio de absorción selectiva. En un
principio se utilizo para la separación de los pigmentos de las plantas (clorofila).
En el proyecto fue utilizado para la separación de los metabolitos que presenta
la planta en este caso la extracción de las flavonoides. En donde a medida que
se va filtrando la disolución por la columna, cada componente precipita a
diferentes velocidades, los cuales son recolectados en distintos viales ya
previamente etiquetados.
La cromatografía es un método analítica de separación de mezclas de
compuestos químicos con fines cualitativos y cuantitativos, mediante el cual los
componentes se distribuyen entre dos fases, móvil y estacionaria.
fase móvil; es el solvente o eluyente, el cual puede ser liquido o
gas.
Fase estacionaria; es absorbente o soporte del tamaño de partícula fina, generalmente se utiliza sílica gel, celulosa, alumina.
una muestra es introducida en la parte superior de la columna de resuspende
con un solvente adecuado que en este caso su utilizo metanol y se deja correr
la muestra durante un cierto tiempo determinado, se coloca la lámpara de
ultravioleta en la columna para observar que la muestra se este corriendo
adecuadamente y que la muestra salga por completo sin dejar restos en la
columna, la muestra se recolecta en viales los cuales tienen que estar ya
rotulados y por ultimo se almacena a temperaturas bajas.(29)
PRUEBAS BIOLÓGICAS.
Para la toma de la muestra biológica se debe de considerar:
Edad del donador, por lo general debe de estar entre los 20 y 24 años.
No haber tenido relaciones sexuales, 3 días antes. Se recoge la muestra en un cristalizador estéril. Todo se trabaja inmediatamente y a temperatura ambiente.
Esto según el Manual de Laboratorio de la OMS. Viabilidad de los espermatozoides.
La viabilidad espermática refleja la proporción de los espermatozoides totales
que están vivos de acuerdo al criterio de exclusión de algún colorante vital o
mediante la expresión de su capacidad osmorreguladora cunado se le somete
a condiciones hipo-osmóticas .
Después de la viabilidad se hace un conteo de espermatozoides teñidos con
eosina al 0.5% con el fin de observar a los muerto (se colorean de color rojo)
vivos e inmóviles(30).
TABLAS DE LOS RESULTADOS
DE LA CUENTA ESPERMICIDA A DISTINTAS CONCENTRACIONES EN UNA CUENTA TOTAL DE 100
ESPERMATOZOIDEZ
Concentración g/ml Concentración 3.5 g/ml
Cuenta total Cuenta total
36 42 22
25 54 21
Concentración 5 g/ml
Concentración 10 g/ml
Cuenta total
17 60 20
GRAFICA DE RESULTADOS
VIVOS INMOVILES MUERTOS
6 7 3
8 8 3
6 4 4
2 4 2
2 5 3
3 6 3
9 8 4
VIVOS INMOVILES MUERTOS
5 4 1
2 15 4
7 12 3
2 4 2
4 7 4
2 9 3
3 1 4
VIVOS INMOVILES MUERTOS
10 76 14
VIVOS INMÓVILES MUERTOS
5 16 6
3 7 2
5 14 3
3 6 1
1 17 8
0
20
40
60
80
100
% d
e la a
cti
vid
ad
esp
erm
icid
a
1 3.5 5 10
Concentracion en g
Efecto espermicida de Sedum
praealtum DC comparado con el
estandar (Nonoxinol-9)
Nonoxinol
Sedum
praealtum
GRAFICA 1:
Se muestra en la grafica el % de la actividad espermicida de los flavonoides del extracto Sedum praealtum DC en las muestras biológicas de humano (semen), comparando estos resultados con el % de actividad espermicida del estándar (Nonoxinol-9) y visualizando que los metabolitos extraídos (flavonoides) de la planta poseen una mayor y mejor efectividad espermicida por lo que satisface nuestros objetivos principales.
GRAFICA 2:
En la grafica podemos observar el incremento de espermatozoides en humano
inmóviles conforme se tiene un aumento en la concentración del extracto de
Flavonoides de Sedum praealtum D.C. en comparación del estandar
(nonoxinol-9) por lo que se cumple en uno de los objetivos planteados.
ElpresentetrabajosedesarrollaráenlasinstalacionesdeloslaboratoriosdeFisiologíaVegetal
deldepartamentodebotánica,deFitoquímicadeldepartamentodeFarmacia,deMicologíaMédicadel
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Nu
me
ro d
e e
sp
erm
ato
zo
ide
s
10 35 50 100
Concentración en g/ml
CUENTA DE LA ACTIVIDAD ESPERMICIDA A
DISTINTAS CONCENTRACIONES DEL EXTRACTO
Sedum praealtum D.C.
VIVOS
INMOVILES
MUERTOS
departamentodemicrobiologíayenlacentraldeinstrumentacióndeespectroscopiadelaENCB,siguie
ndolasiguientemetodología:
MetodologíarealizadaenellaboratoriodeFisiologíavegetal.
• PreparacióndeagarysolucionesparaelmediodecultivoymediodecultivoMS.
• MACRONUTRIENTES
Composición:(NH4)NO3(16.5g),KNO3(19.0g),CaCL2⋅2H2O(4.4g),MgSO4⋅7H2O(3.7g)
,KH2PO4(1.70g),NaH2PO4⋅H2O(0.85g).
Procedimiento:Pesarcadaunodelosreactivosmencionados,ydisolverlosenunvolumen
deaguaaproximadode100ml,aforarhastaunvolumende250ml.
• SOLUCIONEDTA
Composición:Na2EDTA⋅2H2O(0.744g),FeSO4⋅7H2O(0.556g)
Procedimiento:Pesarcadaunodelosreactivosmencionados,ydisolverlosenunvolume
ndeaguaaproximadode50ml,aforarhastaunvolumende100ml.
• MICRONUTRIENTES
Composición:MnSO4⋅4H2O(2.23g),ZnSO4⋅7H2O(0.86g),H3BO3(0.62g),KI(0.083g),N
a2MoO4⋅2H2O(0.025g),CuSO4⋅5H2O(0.0025g),CoCl2⋅6H2O(0.0025g)
.
Procedimiento:Pesarcadaunodelosreactivosmencionados,ydisolverlosenunvolumen
deaguaaproximadode100ml,aforarhastaunvolumende250ml.
• AGAR
Composición:Macronutrientes(12.5ml),Micronutrientes(0.625ml),EDTA(1.25ml),Soluciónde
Vitaminas(0.25ml),Mioinositolsólido(0.1g),Sacarosasólida(15.0g),ANA(1.0ml)
,BAP(25ml).
Procedimiento:Medirypesarcadaunodelosreactivosmencionados,disolverlosenunvolumend
eaguaaproximadode500ml,ajustarelpHa5.7conayudadeunasolucióndeH2SO4
concentradoparadisminuirloyunasolucióndeNaOHparaaumentarlo,aforarhast
aunvolumende1L.Enunmatrazerlenmeyerdisolver8gdeagarenlasoluciónanter
ior,calentarhastaebulliciónsinquesesubalaespuma.Ambientarsindejarenfriar.
• MEDIODECULTIVOSÓLIDO
Composición:Macronutrientes(12.5ml),Micronutrientes(0.625ml),EDTA(1.25ml),Soluciónde
Vitaminas(0.25ml),Mioinositolsólido(0.1g),Sacarosasólida(15.0g),ANA(1.0ml)
,BAP(25ml)yagar.
Procedimiento:Verterenvasosdegerberaprox.2.5mldelagarpreparado,taparconpapelalumini
oyesterilizar.
•
Obtencióndematerialfoliarparamétododemaceracióneidentificacióndemetabolitospresentesenelextracto. SeleccióndelaespecieFouquieriasplendens. Desprenderlashojasdeltalloquenopresentaranunaaparienciaóptima(lasdemejoraparienciasemantieneneneltallo). Cortarlashojasen3partes. Pesarlashojasobtenidas. Lavarlasconaguadestilada. Colocarlashojasenunmatrázerlenmeyercon100mldeetanoldetalmaneraquesecubranporcompleto. Dejarreposardurante1mes.
• ObtencióndetejidocallosodeFouquieriasplendens. Separardelaramalashojasquefueronseleccionadasdemejorapariencia. Lavarlascondetergenteyenjuagarlasconaguacorriente. Prepararlazonaestéril(campana). Yaenlacampana,colocarlashojasenunvasoconhipocloritoestérilconelfindedesinfectarlos. Realizar3lavadosconaguadestiladaestéril. Realizarcortesdelosextremosalashojasysembrarlazonacentral. Colocar6hojasencadarecipienteconmediodecultivo. Etiquetarelmaterial. Colocarlosrecipientessembradosencondicionesdetemperaturayluzóptimosparasucrecimiento.
Figura8.Muestraladistribucióndelashojasdentrodelosrecipientesconmediosólido.Siembraenmediosólido.
Figura9.Muestraelcrecimientodelcultivocelularenmediosólido.
• CultivodecélulasenSuspensión. Prepararmatracesconaprox.25ml.demediodecultivolíquido(sinagar). Cubrirlosconpapelaluminioyesterilizar. Seleccionarloscallosquepresentenmejorcrecimiento(quenoencuentrenoxidadosnipodridos)ypesarlacantidaddecallopresenteenéstos. Transferirloscallosalosmatracesantespreparadosencondicionesdeesterilidad. Cubrirlosmatracesconpapelaluminioycolocarlosenagitaciónconstanteybajocondicionesdefotoperiodo(24x24luzsombra)parasuóptimocrecimiento.
• VerificacióndeCrecimientodelascélulasensuspensión. Seleccionar3delosmatracesconmediolíquidosembrados TransferiramatracesNefelométricos. Medirladensidadópticaportriplicado. Incubarenlasmismascondicionesparaobtenerlaproliferacióndelacélulasensuspensión Tomar3lecturascadatercerdíaportresocasionesparaverificarelcrecimiento.
Metodología realizadaenellaboratorio de Fitoquímica.
PruebasfitoquímicaspreliminaresdelextractoetanólicodelmaterialfoliardeFouquieriasplendens Filtrarelmaterialfoliarcontenidoenetanolconayudadeunalgodón Realizar3lavadosconetanalalmaterialfoliaryvolverafiltrar Conayudadeunrotavapor,evaporareletanolhastaunvolumenaproximadode5ml Realizarlasiguientespruebasfitoquímicaspreliminares: Alcaloides FlavonoidesGlucósidoscianogenéticosSaponinasTaninosQuinonasCumarinas-
GlucósidoscardiacosSesquiterpenlactonas
• Obtencióndelabiomasadelextractodelcultivodecélulasensuspensión. Filtrarelcultivodecélulasensuspensióndetodoslosmatracessembradosconayudadepapelfiltromillipore Realizar1lavadosconetanolalmaterialcelularyfiltrar. Conayudadeunrotavapor,evaporareletanolhastaunvolumenaproximadode5ml. Secarcompletamenteeletanolcongasdenitrógeno Pesarlabiomasaobtenidadecadamatraz. Mantenerenrefrigeraciónlabiomasaobtenida.
MetodologíarealizadaenellaboratoriodeMicologíamédica.
• Determinacióndelacapacidadantifúngicadelextractoetanólicodelascélulasen
suspensióndeFouquieriasplendens.Lapruebadesusceptibilidadaantifúngicosserealizasiguie
ndoelprotocolodeldocumentoM27-
ATheNacionalComitéforClinicalLaboratoryStandards,porelmétododelamicrodilución(CLSIM27-
A2,1997;EUCASTFungi,1999;IVCursoHispanoArgentino,2001).
ParaéstapruebaseutilizacomocepasdecontrolC.kruseiATCC,C.albicansATCC,C.parapsilosisAT
CC,C.dubliniensisUNAM;estoconlafinalidaddetenercertezaenlosresultadosobtenidos,lapruebade
scritaacontinuaciónserealizóporduplicado:
1. PREPARACIONDELMEDIORPMI
Composición:NaHCO3(2.0g),RPMI1640(10.4g),MOPS(Ácidomorfolinopropanosulfónico)(34
.53g),Glucosa(2.0g)
Procedimiento:Disolveren900mldeaguadestiladaestérilelmedioRPMI,añadirelMOPSparaalc
anzarunaconcentraciónde0.165mol/L,agitarhastadisolverse,ajustarelpHa7au
natemperaturaambienteusandoNaOH1mol/L;esterilizarporfiltraciónalvacío.Al
macenara4ºCantesdeusarlo.
2. PREPARACIONDELEXTRACTO
Pesar64/mgdebiomasaobtenidadeFouquieriasplendenseneltuboeppendorf. Encondicionesestériles;disolverelextractoen1mldeetanol(disolventedelextracto). Adicionar4mldeaguaparaobtenerunadilución1:5,[]=128000g/ml Filtrarpormediodeunamembranamilliporede0.22m(soluciónmadre). Realizarunaseriededilucioneshorizontales1:2delextractoconeldisolvente(agua),partiendodelasoluciónmadrehastaobteneruna[]=25g/ml(10dilucioneshorizontales). Apartirdelasdilucionesrealizadasenelpasoanterior,realizarunaseriededilucionesverticalesdecadatubo1:50conmedioRPMI(5ml),obteniendoconéstasconcentracionesde256g/mlhasta0.5g/ml.Detalmaneraqueeldiagramadeflujoeselsiguiente:
TECNICACLSIM27A2DIAGRAMA
ClinicalandLaboratorystandardInternational
PreparacióndeExtracto
Filtraciónpormembranamillipore
etanol4mlagua [12800g/ml]
[6400g/ml][25g/ml]
Diluciones1:50
128,64,32,16,8,4,2,1g/mlDiagrama1Muestraeldiagramadeflujodel
ametodologíarealizadaparalatécnicaCLSIM27A2paralasdilucionesdelfluconazolydelextracto. 3. PREPARACIONDELINOCULO
Teneruncultivode24hrs.delascepasincubadasa35ºC.Asegurándosedesupureza.Lacepasesembrarápor24hrsantesenmedioPDAparapromoversucrecimiento. PrepararunasuspensióndelevadurasenmedioRPMI,ajustandolaturbideza0.5;estoselograrápreparandoconanterioridaduntubode0.5unidadesdeMcFarlanda530nm,demaneraqueseusecomopuntodecomparaciónparaobtenerlaturbidezdeseadaconelfindeahorrartiempo,yaqueelextractopodríaperdersuefecto. Unavezobtenidalaturbidezdeseada,agitarvigorosamentedurante15seg.Estasuspensiónc
ontieneentre1–5x106
UFC/ml. Realizarlospasosanterioreshastaprepararlascepasdesignadas,lascualessonlassiguientes:
C E P A S E M P L E A D A S
Cándidaalbicans9aisladoclínico Cándidaglabrataaisladoclínico
Cándidaalbicans5aisladoclínico CándidadubliniensisUNAM
Cándidaalbicans8aisladoclínico CándidaalbicansATCC
Cándidaalbicans3aisladoclínico Cándidatropicalisaisladoclínico
Cándidadubliniensis2aisladoclínico CándidakruseiATCC
Cándidadubliniensis4aisladoclínico Geotrichums.p.aisladoambiental
Cándidadubliniensis9aisladoclínico Cryptococcus.gattii
Cándidadubliniensis8aisladoclínico Cryptococcusneoformansvar.neoformans
CándidaparapsilosisATCC
Tabla3.Muestralascepasempleadasduranteeltrabajodeinvestigación.
DIAGRAMA
Cepa
D.O.0.5RPMI
Diagrama2MuestraeldiagramadeflujodelametodologíarealizadaparalatécnicaCLSIM7-
A2paralapreparacióndelinóculo. 4. LLENADODEMICROPLACAS
Paraelmicrométodoutilizarmicroplacasde96pozos,fondoplanoyestériles.Sellenaránlasmicroplacasporcolumnasyseusaránpipetasmulticanaldemodoqueseaposiblellenarlas8filasdelasqueconstaunacolumnasimultáneamente.Parausarlaspipetasmulticanalesnecesariocolocarlassolucionesaunrecipientedereactivos,demaneraquetodaslaspuntasdelapipetapuedancargaralmismotiempo.
• Enlacolumna1secolocarán100ldeextractoconlamayorconcentración,enlacolumna2elextractoconlaconcentración128g/ml,yasíconsecutivamentehastallegaralaconcentraciónmásbajaenlacolumna 10. Lacolumna11seráelblancodereactivosocontroldeesterilidad,porlotantosolosecolocarámedioRPMI(200l),lacolumna12seránuestrocontroldecrecimientodelmicroorganismoporloqueúnicamenteseinocularálacepaempleadaenesafila(200l) Enlas2primerasfilas(A,B)secolocaráelinóculodeunacepa,yasísucesivamente,detalmaneraquelas17cepaspreparadasanteriormentequedeninoculadasporduplicado.Detalmaneraquelaplacaquedecomoseveenelsiguienteesquema:
Figura11.Muestraunesquemadelamicroplacaespecificandoelno.decolumnasyfilas,asícomolama
neraenquesesembróelextractoylacepa.
METODOLOGÍAINTEGRAL
Diagrama3.Muestraeldiagramadeflujodelametodologíaintegraldelproyecto.
.
RESULTADOS
Resultadosobtenidoseneldepartamentodebotánica.
• ObtencióndetejidocallosodeFouquieriasplendens.
Elcrecimientodeltejidocallosodelmaterialvegetalempleadotuvounrendimientodel76.92%,
estodebidoaquedelos13frascossembradosdelespécimen1frascodeellosfuecontaminado,tresfras
costuvieronpocoonulocrecimientoy10fueronlosfrascoscrecidosenóptimascondiciones(Grafica1),
porloqueseprocedióatrabajarconelmaterialcallosoobtenidosdeéstos10frascos
CRECIMIENTODECALLOS
14
12
10
10
8
6
4
2
2 1
0
TOTAL DE FRASCOS
FRASCOSCONC1
FRASCOS
CONTAMINADOSFRASCOSCON
SEMBRADOSPOCOONULO
CALLOOBTENIDOSCRECIMIENTO
Gráfica1.Muestraelcrecimientodecallosobtenidosdeltotalinicialdefrascossembradosconmaterialf
oliar.
CRECIMIENTODECALLO
Delos10frascosmencionadosanteriormenteseretiróelmaterialcallosoysepesó,obteniendol
osresultadosmostradosenlaTabla4.Lospesosreportadossondematerialcallosohúmedo.
No.DEFRASCO MASAOBTENIDA(g)
TOTAL
Tabla4.Muestraeltotaldemasadematerialcallosoobtenidadelosdiezfrascoscrecidaencondicionesóptimas.
•
ObtencióndebiomasaobtenidaapartirdelCultivodecélulasenSuspensión.Lo
sdatosdelabiomasaobtenidaencadaunodelos10frascosobtenidoscontejidocal
losoóptimoseobservanenlaTabla5.Lospesosreportadoscorrespondenalabiom
asasecadaconnitrógeno.
BIOMASAOBTENIDA
No.DEFRASCO BIOMASAOBTENIDA(mg)
TOTALDEBIOMASA
Tabla5.Muestraeltotaldebiomasaobtenidadelosfrascosempleadosconmaterialcalloso.
• Verificacióndelaproliferacióndelcultivodecélulasensuspensión.
PRUEBANEFFELOMÉTRICA
Alos3matracesNefelométricosempleadosselesmidióladensidadóptica,al1º
,3ºy5ºdíadesusiembra,observandoquealpasodelosdíasladensidadópticaibaenau
mento.TeniendolosresultadosmostradosenlaTabla6.
MATRAZ
PRIMERDIAD.O TERCERDIAD.O QUINTODIAD.O.
1 34 35 45
2 40 42 50
3 38 40 44
Tabla6.Muestralosdatosobtenidosdedensidadópticadelastreslecturasrealizadas
alosmatracesNefelométricosconcélulasensuspensión.
50 D E 45
N S 40 I D 35 A D 30
25 O P 20
T I
15 C A 10
5
0
DIA
MATRAZMATRAZMATRAZNEFELOMETRICONEFELOMETRICONEFELOMETRICO123
Gráfica2.Evidencíaelcrecimientodelascélulasensuspensiónamedidaquetranscurreeltiempomedi
antelatendenciadeunapruebaNefelométrica.
ResultadosobtenidosenellaboratoriodeFitoquímica
•
PruebasfitoquímicaspreliminaresdelextractoetanólicodelmaterialfoliardeFouquieriasplen
densobtenidoporelmétododemaceración.
Aplicandolastécnicascorrespondientesparalaidentificacióndelosmetabolitospresentesen
elmaterialfoliardelespécimenvegetalanalizadoseobtuvieronlosresultadosmostradosenlatabla7.
METABOLITOANALIZADO RESULTADO
OBTENIDO
ALCALOIDES
FLAVONOIDES +(Flavonasyxantonas)
GLUCOSIDOSCIANOGENETICOS
SAPONINAS
TANINOS +(Compuestosfenólicos)
QUINONAS
CUMARINAS
GLUCOSIDOSCARDIACOS +
SESQUITERPELACTONAS
Tabla7.Muestralosresultadosdelaspruebasfitoquímicasrealizadasalextractoetan
ólicodelmaterialfoliardeFouquieriasplendens.
• Pruebasfitoquímicasdelextractoetanólicodelcultivodecélulasensuspensiónde
Fouquieriasplendens.
Aplicandolastécnicascorrespondientesparalaidentificacióndelosmetabolito
spresentesenelextractoetanólicodelcultivodecélulasensuspensiónseobtuvieronlo
sresultadosmostradosenlatabla8.
METABOLITOANALIZADO RESULTADO
OBTENIDO
ALCALOIDES
FLAVONOIDES +(Flavonasyxantonas)
GLUCOSIDOSCIANOGENETICOS
SAPONINAS
TANINOS +(Compuestosfenólicos)
QUINONAS
CUMARINAS
GLUCOSIDOSCARDIACOS +
SESQUITERPELACTONAS
Tabla8.Muestralosresultadosdelaspruebasfitoquímicasrealizadasalextractoetan
ólicodelcultivodecélulasenuspensióndeFouquieriasplendens.
Resultadosobtenidosenellaboratoriodemicologíamédica
•
Determinacióndelacapacidadantifúngicadelextractoetanólico
delascélulasensuspensióndeFouquieriasplendens.
Laactividadpresentadadecadacepafueconsideradaenbasealospuntosdec
ortedelFluconazolparalevadurasdeCandidayaestablecidosloscualesson:
PUNTOSDECORTE
≤8g/mLS16-
32g/mLSDD64–128g/mLR
Detalmaneraqueúnicamenteserealizóunacomparacióndelosporcentajesdeinhibiciónpres
entadosdecadacepatratadaconelextractocontralamismacepatratadaconelantifúngicoFluconazolp
araobservardemaneracomparativalaacciónelespécimenenestudio.
Enbasealosresultadosdelporcentajedeinhibiciónpresentadoenlasgráficasanterioreslosre
sultadosobtenidosdelapruebaantifúngicarealizadaconsiderandolaactividadquepresentacadacep
aeslasiguiente:
CEPAEMPLEADA RESPUESTAALFLUCONA
ZOL
FLUCONAZOLCMI
50%
CMIEXTRACTOFouquierasplendensAL50%
g/ml
%DEINHIBICIONDELCRECIMIEN
TO
Cándidaalbicans9 S 1 mg/ml 1mg/ml32–1mg/ml
36,24
Cándidaalbicans5 R 128mg/ml 8 mg/ml 24,06
Cándidaalbicans8 R 128mg/ml 1mg/ml32–0.5mg/ml
17,37
Cándidaalbicans3 S 1 mg/ml 1 mg/ml 26,51
Cándidadubliniensis2
SDD 16 mg/ml 0.5mg/ml 32,75
Cándidadubliniensis4 R 128mg/ml
8mg/ml328mg/ml 36,02
Cándidadubliniensis9
S 8 mg/ml 32 mg/ml 36,21
Cándidadubliniensis8 R 128mg/ml 8 mg/ml 27,63
CándidaparapsilosisATCC S 8 mg/ml 64 mg/ml 12,2
Cándidaglabrata SDD 16 mg/ml 32 mg/ml 10,28
CándidadubliniensisUNAM S 4 mg/ml 64 mg/ml 18,66
CándidaalbicansATCC S 0,5mg/ml 0.5mg/ml 9,32
Cándidatropicalis R 64 mg/ml 64 mg/ml 12,21
CándidakruseiATCC R 64 mg/ml 2 mg/ml 21,68
Geotrichums.p. 4 mg/ml 25,18
Cryptococcusneoformansvar.gattii S 4 mg/ml 32 mg/ml 33,91
Cryptococcusneoformansvar.neoformans
S 4 mg/ml 0,25mg/ml 34,84
Tabla9.Muestralosresultadosobtenidosduranteladeterminacióndelaactividadantif
úngicadel extractoenlas17cepasempleadas.S=SensibleR=ResistenteSDD=Sensible
DependientedelaDosisCMI=Concentraciónmínimainhibitoria RESPUESTADELASCEPASALANTIMICÓTICODEREFERENCIA
Losresultadosobtenidosdelarespuestadelas17cepasempleadasalantifúngi
codereferencia(Fluconazol),considerandoqueelantibióticomencionadopresentai
nhibicióndel50%delcrecimientocomosemuestraenlagrafica20.
RESPUESTADELASCEPASALFLUCONAZOL
Gráfica20.Muestralarespuestadelas17cepasempleadasantelapresenciadelfluconazol,elcualfueelantifúngicodereferencia.Indicandoque:el38%delascepasempleadasmostraronresistenciaanteelantimicótico,el13%fuerencepassusceptiblesdependientesdeladosisyel49%deéstas,resultaronsersusceptiblesanteelfármacoempleado
PORCENTAJEDEINHIBICIÓNPRESENTADOCONELEXTRACTOETANOLICODEL CULTIVODECELULASENSUSPENSION
ElporcentajedeinhibiciónqueprodujoelextractodelcultivodecélulasensuspensióndeFouqui
erasplendenssemuestraacontinuaciónenlagráfica;sinembargocabemencionarquesepartióderefer
enciadelospuntosdecorteyaestablecidos,loscualesson:
%DEINHIBICIONDELCRECIMIENTOCONEXTRACTODEFou
quierasplendens
6% 29%
>30% 2029%
1019% 19%
Gráfica21.Muestralosporcentajesdeinhibicióndadasenlas17cepasempleadas,detalmaneraque:el36%delascepasmostróunporcentajedeinhibicióndemenordel30%;el29%delascepasmostródel20–29%deinhibición;el29%delascepasmostróunporcentajedeinhibicióndel10al19%yporúltimoel6%delascepasmostródel1al9%deinhibición.
Aislamiento y posible actividad espermicida de los
alcaloidesde Sedum oxipetalum
Se pesaron 100 g de extracto crudo etanólico y se disolvió en una mezcla de etanol-
agua, se adiciona cloroformo y ácido clorhídrico hasta un PH de 2 : la mezcla se dejó
agitar durante una hora. Posteriormente se le adicionó a la mezcla una solución de
hidróxido de amonio hasta un PH de 8. la mezcla se extrajo 3 veces con cloroformo y se
evaporó el cloroformo a presión reducida y de este modo se obtuvieron los alcaloides de
la plante,
Al extracto crudo se le efectuaron pruebas químicas preliminares, pruebas espermicidas
y se le practicó una cromatografía en columna para aislar los alcaloides.
Resultados
Se identificaron alcaloides del extracto crudo cloroformico. En la cromatografía en
columna se obtuvieron 249 fracciones de las cuales la fracción 1-19 y 170-229 se
aislaron 2 alcaloides.
Las pruebas farmacológicas del extracto crudo cloroformico a las siguientes
concentraciones presentaron los siguientes resultados: 10 µg/mL se observó 62% de
espermatozoides vivos y 37.1 de espermatozoides vivos a 35 µg/mL se observó 57.6 %
de espermatozoides vivos y 42.3 de espermatozoides muertos a 50 µg/mL se observó
57.5% de espermatozoides vivos y 42.0 % de espermatozoides vivos a 100 µg/mL se
observó 52.5% de espermatozoides vivos y 47.5% de espermatozoides muertos.
IMPACTO
Es importante haber identificado la fracción del extracto crudo etanólico de Sedum
praealtum D.C. que tiene una actividad espermicida del 90% en comparación al testigo
positivo Nonoxinol-9 que presentó una actividad espermicida del 68%.
También haber aislado dos alcaloides del extracto crudo de cloroformo de Sedum
oxipetalum, las cuales se enviaron al Depto. de Química del CINVESTAV para su
análisis de resonancia magnética nuclear y poder elucidar sus estructura químicas.
Asimismo, el extracto obtenido de cultivo de células en suspensión de Fouquiera
splendens es capaz de ejercer un efecto antifúngico en un 36% contra 17 cepas de
interés médico, estos resultados son muy importantes ya que no todas las plantas se
pueden obtener cayos y que éstos tengan actividad farmacológica.