Glycosylation engineering in Glycosylation engineering in yeastyeast

Humanització del llevat per producció de Humanització del llevat per producció de proteïnes terapèutiquesproteïnes terapèutiques

Albert Font Inglès

Mercat de les proteïnes terapèutiquesMercat de les proteïnes terapèutiques

És un mercat que ha crescut ràpidament des de que va És un mercat que ha crescut ràpidament des de que va néixer fa uns 30 anys.néixer fa uns 30 anys.

Actualment estan aprovades 140 proteïnes d’ús Actualment estan aprovades 140 proteïnes d’ús farmacèutic als mercats dels EUA i Europa, i n’hi han farmacèutic als mercats dels EUA i Europa, i n’hi han 500 més en proves.500 més en proves.

En el 2003 el mercat de les proteïnes recombinants En el 2003 el mercat de les proteïnes recombinants terapèutiques estava valorat en 30 bilions de $.terapèutiques estava valorat en 30 bilions de $.

Avui en dia una quarta part dels nous fàrmacs que Avui en dia una quarta part dels nous fàrmacs que s’aproven per l’ús terapèutic estan basats en proteïnes, i s’aproven per l’ús terapèutic estan basats en proteïnes, i la majoria d’elles són glicoproteïnes (bàsicament la majoria d’elles són glicoproteïnes (bàsicament anticossos monoclonals)anticossos monoclonals)

Sources : BiotechGuide 2007

Importància de la glicosilacióImportància de la glicosilació

La N-glicosilació afecta;La N-glicosilació afecta;1.1. La vida mitja en plasmaLa vida mitja en plasma

- Degut al PM i a la càrrega neta- Degut al PM i a la càrrega neta

- Activació de sistemes de clearance lectin-mediated receptor - Activació de sistemes de clearance lectin-mediated receptor (asialoglicoproteins o proteïnes amb manoses terminals)(asialoglicoproteins o proteïnes amb manoses terminals)

- L’Eritropoietina (EPO) necessita de l’àcid siàlic per mantenir-- L’Eritropoietina (EPO) necessita de l’àcid siàlic per mantenir-se estable en plasmase estable en plasma

2.2. L’Especificitat de teixitL’Especificitat de teixit

3.3. L’Activitat biològicaL’Activitat biològica- Tenen efecte en l’eficàcia de la interacció amb els receptors- Tenen efecte en l’eficàcia de la interacció amb els receptors

- Les immunoglobulines necessiten de N-glicosilacions per la - Les immunoglobulines necessiten de N-glicosilacions per la interacció amb el receptorinteracció amb el receptor

Fonts de les glicoproteïnesFonts de les glicoproteïnes

Tradicionalment s’han derivat de fonts humanes o Tradicionalment s’han derivat de fonts humanes o animals (human serum albumin, insulin…)animals (human serum albumin, insulin…)

Problema: Contaminació viral i purificacióProblema: Contaminació viral i purificació

Sistemes recombinants clàssics Sistemes recombinants clàssics - Cèl·lules de mamífer- Cèl·lules de mamífer - -

BactèriaBactèria - Llevat- Llevat - -

Cèl·lules d’insecteCèl·lules d’insecte - Altres…- Altres…

Claus avaluadores d’un hoste d’expressió:Claus avaluadores d’un hoste d’expressió:1.1. Cost de fabricació i purificacióCost de fabricació i purificació2.2. Habilitat per controlar el producte final (incloses modificacions Habilitat per controlar el producte final (incloses modificacions

post-traduccionals)post-traduccionals)3.3. El temps de desenvolupament del gen a la proteïna purificadaEl temps de desenvolupament del gen a la proteïna purificada4.4. RoyaltiesRoyalties

Sistemes recombinantsSistemes recombinants Mammalian Cell cultures Mammalian Cell cultures

CHO cells (Chinese Hamster Ovary )CHO cells (Chinese Hamster Ovary )AvantatgesAvantatges Gran Know-how i un procés fàcilment escalableGran Know-how i un procés fàcilment escalable Capacitat inherent de glicosilar com els mamífersCapacitat inherent de glicosilar com els mamífers

DesavantatgesDesavantatges Costos molt elevats de produccióCostos molt elevats de producció Facilitat d’expansió de virus, prions …Facilitat d’expansió de virus, prions … Les seves glicoproteïnes mostren un elevat grau d’heterogeneïtat en la Les seves glicoproteïnes mostren un elevat grau d’heterogeneïtat en la

glicosilació, resultant en molta varietat del producte de lot a lot.glicosilació, resultant en molta varietat del producte de lot a lot.

Insect Cell linesInsect Cell lines S’han utilitzat per l’expressió de varies glicoproteïnesS’han utilitzat per l’expressió de varies glicoproteïnes No fan N-glicosilacions de tipus complexaNo fan N-glicosilacions de tipus complexa

Alguns residus de paucimannose, mannose etc … fan baixar la vida Alguns residus de paucimannose, mannose etc … fan baixar la vida mitjamitja

Algunes línies cel·lulars afegeixen Algunes línies cel·lulars afegeixen α-1,3-fucose glicans, altament α-1,3-fucose glicans, altament immunogèniquesimmunogèniques

Sistemes recombinantsSistemes recombinants Plantes TransgèniquesPlantes Transgèniques

Bàsicament tenen el problema de la falta de galactosa i àcid siàlic, i la Bàsicament tenen el problema de la falta de galactosa i àcid siàlic, i la presència d’alguns sucres immunogènics com xilosa o presència d’alguns sucres immunogènics com xilosa o α-1,3-fucosa.α-1,3-fucosa.

Animals TransgènicsAnimals Transgènics S’han expressat diferents glicoproteïnes (inclosos anticossos S’han expressat diferents glicoproteïnes (inclosos anticossos

monoclonals)monoclonals) Les N-glicosilacions tenen moltes manoses i amb baix contingut Les N-glicosilacions tenen moltes manoses i amb baix contingut

d’àcid siàlic (comparat amb humans)d’àcid siàlic (comparat amb humans)

Llevat (Llevat (S. cerevisiae, P. pastorisS. cerevisiae, P. pastoris …) …) Sistema robust i en el qual es disposen d’innumerable eines Sistema robust i en el qual es disposen d’innumerable eines

genètiquesgenètiques Escalable fins a 100 mEscalable fins a 100 m33

Fan N-glycosilació, però afegint moltes manoses Fan N-glycosilació, però afegint moltes manoses (Hypermannosylation)(Hypermannosylation)

Comparativa entre les rutes de glicosilació Comparativa entre les rutes de glicosilació humana i de llevathumana i de llevat

Humanització del llevatHumanització del llevatPrimeres temptativesPrimeres temptatives

Així doncs, humanitzar la maquinària de glicosilació de Pichia Pastoris requerirà;

1. Knockout de diferents gens implicats en les vies endògenes del llevat (manosiltransferases)

2. Recreació de la seqüència natural de glicosilació en humans (manosidases, glicosiltransferases…)

Humanització del Humanització del llevatllevat

L’Any 2000 Tillman Gerngross es proposa;a. Desenvolupar mètodes per localitzar en orgànuls específics enzims

d’altres especies relacionats en la glicosilaciób. Desenvolupar mètodes per veure si aquests enzims són actius en la seva

nova localitzacióc. Desenvolupar tècniques fiables d’screening per identificar les soques que

hagin adquirit la habilitat

En aquest article desenvolupen dues eines bàsiques per sobrepassar els reptes anteriors;

1. Una llibreria genètica, generant centenars de constructes de fusió2. Screening d’alt rendiment, permetent analitzar un gran nombre de soques

en paral·lel

Les llibreries consistien en arrays de diferents proteïnes de fusió, on cadascuna estava formada per un pèptid senyal de localització i un domini catalític

Humanització del Humanització del llevatllevat

1.1. Knockout del gen Knockout del gen och1 och1 ((α-1,6-manosiltransferasa)α-1,6-manosiltransferasa)• És l’enzim encarregat d’iniciar la hipermanosilació.És l’enzim encarregat d’iniciar la hipermanosilació.• La proteïna K3 secretada com a reporter protein.La proteïna K3 secretada com a reporter protein.

2.2. Expressió del constructe de fusió α-1,2-manosidasa Expressió del constructe de fusió α-1,2-manosidasa (MNS I) en una soca Δ (MNS I) en una soca Δ och1och1

• Obtenció d’un N-glicà amb pes consistent amb Obtenció d’un N-glicà amb pes consistent amb ManMan55GlcNAcGlcNAc22

• El clon que millor rendiment donava era aquell amb el El clon que millor rendiment donava era aquell amb el domini catalític de domini catalític de C. elegansC. elegans fusionada amb MNS1 de fusionada amb MNS1 de S. cerevisiaeS. cerevisiae

3.3. Expressió del constructe d’expressió GnTI en una Expressió del constructe d’expressió GnTI en una soca Δ soca Δ och1och1 amb activitat α-1,2-manosidasa amb activitat α-1,2-manosidasa

• La fusió de GnTI humana permetia el pas de La fusió de GnTI humana permetia el pas de ManMan55GlcNAcGlcNAc22 a GlcNAcMan a GlcNAcMan55GlcNAcGlcNAc22

• En aquesta reacció es requereix de UDP-GlcNAc com En aquesta reacció es requereix de UDP-GlcNAc com a substrat en el golgi, i per assegurar nivells suficients a substrat en el golgi, i per assegurar nivells suficients es va clonar un transportador de UDP-GlcNAc de es va clonar un transportador de UDP-GlcNAc de Kluyveromyces lactisKluyveromyces lactis

Humanització del llevatHumanització del llevatPresentacióPresentació

En aquest treball es presenta una alternativa a l’ús de la manosidasa II, En aquest treball es presenta una alternativa a l’ús de la manosidasa II, interferint en l’assemblatge de l’oligosacàrid en el pas d’unió al grup interferint en l’assemblatge de l’oligosacàrid en el pas d’unió al grup dolicholdolichol

ALG3 és l’enzim encarregat d’addicionar la sisena manosa al precursor ALG3 és l’enzim encarregat d’addicionar la sisena manosa al precursor durant l’assemblatge de l’oligosacàrid al RE. durant l’assemblatge de l’oligosacàrid al RE.

La deleció de La deleció de alg3alg3 en en P. pastorisP. pastoris juntament amb l’expressió localitzada juntament amb l’expressió localitzada de α-1,2 manosidasa hauria de generar Mande α-1,2 manosidasa hauria de generar Man33GlcNAcGlcNAc22, un intermediari , un intermediari

sintètic ideal per construir una ruta de glicosilació artificial. sintètic ideal per construir una ruta de glicosilació artificial. Schachter and Schachter and co-workersco-workers ja varen demostrar que aquesta forma serveix com a substrat ja varen demostrar que aquesta forma serveix com a substrat per la GnTI.per la GnTI.

Knockout del gen Knockout del gen alg3alg3 en una en una soca soca Δ Δ och1och1 amb activitat α-1,2- amb activitat α-1,2-manosidasa (MNS I) i N-manosidasa (MNS I) i N-acetilglucosaminotransferasa acetilglucosaminotransferasa (GnTI)(GnTI)

En mamífers el pas de En mamífers el pas de GlcNAcManGlcNAcMan5 5 a GlcNAcMana GlcNAcMan33 es fa es fa

mitjançant la manosidasa IImitjançant la manosidasa II En aquest cas al tenir un KO En aquest cas al tenir un KO

sobre sobre alg3alg3 els oligosacàrids del els oligosacàrids del RE tan sols contindrien 5 RE tan sols contindrien 5 manoses, que amb l’acció de α-manoses, que amb l’acció de α-1,2-manosidasa en el golgi es 1,2-manosidasa en el golgi es quedaria amb 3 manosesquedaria amb 3 manoses

Humanització del llevatHumanització del llevatProcediment IProcediment I

Humanització del llevatHumanització del llevatProcediment IIProcediment II

Producció de glicans complexes: Producció de glicans complexes: Expressió funcional de GnTIIExpressió funcional de GnTII

En mamífers l’estructura generada per la En mamífers l’estructura generada per la MnsII serveix com a substrat per la GnTIIMnsII serveix com a substrat per la GnTII

Expressant el domini catalític de GnTII Expressant el domini catalític de GnTII en els primers passos del Golgi en els primers passos del Golgi s’aconsegueix eliminar l’addició d’s’aconsegueix eliminar l’addició d’α-1,2-α-1,2-manoses, permetent assolir manoses, permetent assolir GlcNAcGlcNAc22ManMan33GlcNAcGlcNAc22

Humans P. pastoris

Transferència Transferència in vivoin vivo de Galactosa de Galactosa En estudis previs es demostra que En estudis previs es demostra que P. pastorisP. pastoris és és

incapaç no tan sols de transferir galactosa, sinó de incapaç no tan sols de transferir galactosa, sinó de generar UDP-galactosa com a substratgenerar UDP-galactosa com a substrat

Dissenyen una proteïna de fusió de 3 subunitats Dissenyen una proteïna de fusió de 3 subunitats diferents sota control del promotor GAP;diferents sota control del promotor GAP;

36 aa de ScMnn2 com a pèptid senyal36 aa de ScMnn2 com a pèptid senyal La UDP-galactosa 4-epimerasa sencera (S. La UDP-galactosa 4-epimerasa sencera (S.

pombe)pombe) GalT I humana sense els primers 43 aaGalT I humana sense els primers 43 aa

Humanització del llevatHumanització del llevatProcediment IIIProcediment III

Per tant, sembla que l’eliminació del gen Per tant, sembla que l’eliminació del gen alg3alg3, en combinació , en combinació amb l’adequada localització de MNS I, GnTI, GnTII i la triple amb l’adequada localització de MNS I, GnTI, GnTII i la triple proteïna de fusió per l’addició de galactosa ens dóna uns sucres proteïna de fusió per l’addició de galactosa ens dóna uns sucres de tipus complex que en molts casos són iguals que els d’humans de tipus complex que en molts casos són iguals que els d’humans excepte per aquelles glicoproteïnes que requereixen d’àcid siàlic.excepte per aquelles glicoproteïnes que requereixen d’àcid siàlic.

La sialització final de la glicosilació representava el repte més important; P. pastoris és incapaç de produir cytidine monophosphate (CMP)-sialic acid P. pastoris no té el transportador perquè CMP-sialic entri al Golgi P. pastoris li manca la sialyl-transferasa per transferir el siàlic al residu de

galactosa Per assolir la sialització es va partir de les soques capaces d’incorporar

galactosa als residus i s’hi van clonar 5 enzims amb l’ús de codó optimitzat en un sol vector;

1. UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase (GNE) H. sapiens2. N-acetylneuraminate-9-phosphate synthase (SPS) H. sapiens3. CMP-sialic acid synthase (CSS) H. sapiens4. CMP-sialic acid transporter (CST) M. musculus5. Llibreria de sialiltransferases quimèriques unides a un domini transmembrana de llevat (ST)

Amb aquesta estratègia aconseguien que el 90,5% de la EPO recombinant portes a estructures de glicosilació amb àcid siàlic.

Humanització del llevatHumanització del llevatPas final: SialitzacióPas final: Sialització

BibliografiaBibliografia Challenges in therapauric glycoprotein productionChallenges in therapauric glycoprotein production Natarajan Natarajan

Sethuraman Current Opinion in Biotechnology 2006Sethuraman Current Opinion in Biotechnology 2006 Advances in the production of human therapeutic proteins in Advances in the production of human therapeutic proteins in

yeasts and filamentous fungi yeasts and filamentous fungi Tillman U Gerngross Nature Tillman U Gerngross Nature BiotechnologyBiotechnology

Engineering of an artificial glycosylation pathway blocked in Engineering of an artificial glycosylation pathway blocked in core oligosaccharide assembly in the yeast core oligosaccharide assembly in the yeast Pichia PastorisPichia Pastoris: : production of complex humanized glycoproteins with terminal production of complex humanized glycoproteins with terminal galactosegalactose P. Bobrowicz et al., Glycobiology 2004P. Bobrowicz et al., Glycobiology 2004

Use of combinatorial genetic libraries to humanize N-linked Use of combinatorial genetic libraries to humanize N-linked glycosylation in the yeast glycosylation in the yeast Pichia pastorisPichia pastoris Choi et al., PNAS 2003 Choi et al., PNAS 2003

Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteinsglycoproteins Hamilton et al., Science 2006Hamilton et al., Science 2006

Glycosylation engineering in yeast: the advent of fully Glycosylation engineering in yeast: the advent of fully humanized yeasthumanized yeast Hamilton et al., Current opinion in Biotechnology Hamilton et al., Current opinion in Biotechnology 20072007