Alumno: Alejandra Giovana Gama Rios

Titulo proyecto: Prevalencia del trastorno por déficit de

atención y conducta perturbadora en escolares

veracruzanos y su asociación con metales pesados. Estudio

piloto.

Matricula: s13015113

Universidad Veracruzana

Instituto de Medicina Forense

Prevalencia del trastorno por déficit de atención y conducta

perturbadora en escolares veracruzanos y su asociación con

metales pesados. Estudio piloto.

Protocolo de tesis para obtener el grado en la Maestría de

Medicina Forense

Alumna: Alejandra Giovana Gama Ríos

Directora: Ana Laura Calderón Garcidueñas

Programa: Maestría en Medicina Forense, UV

Veracruz, 2014

1. Introducción

1.1 Generalidades.

A través de la tecnología y la industrialización, el ser humano ha facilitado su

vida diaria, sin embargo, el incremento en el desarrollo de tecnología en el

planeta generó también una serie de problemas colaterales, entre ellas la

contaminación, que afecta no solo a los recursos naturales básicos como

suelos, aire y agua, sino también la salud de la población (Kouba et al, 2010).

Los desechos liberados en las industrias como subproductos son las

principales causas de contaminación por metales. Debido a que los metales

tienden a acumularse en casi cualquier organismo y a su alta capacidad para

desplazarse físicamente en los sistemas biológicos, representan un peligro

considerable para la salud humana y animal; por lo tanto, su monitoreo es de

considerable importancia (Kouba et al, 2010)

La toxicidad de estos metales puede variar en gran medida; en algunos casos,

son utilizados en enzimas de varios organismos (por ejemplo el cobre en los

crustáceos). No obstante, siempre se tienen efectos negativos por encima de

ciertas concentraciones (Fatih et al, 2008), causando así serias alteraciones en

los sistemas estructurales, fisiológicos y metabólicos que pueden conducir a

intoxicaciones, insuficiencia de órganos blanco e incluso, enfermedades

neoplásicas (Fatih et al, 2008; Evren, 2013).

Se consideran metales pesados a cualquier elemento metálico que tiene una

densidad relativamente alta y es tóxico, incluso a baja concentración. El

término de metales pesados, se aplica al grupo de los metales y metaloides

con densidad atómica superior a 4 g/cm3. Sin embargo, en lenguaje médico, el

término hace referencia a sus propiedades químicas y su toxicidad. Los

metales pesados incluyen el plomo (Pb), cadmio (Cd), zinc (Zn), mercurio (Hg),

arsénico (As), plata (Ag), cromo (Cr), hierro (Fe) y cobre (Cu) (Duruibe et al,

2007).

Los metales considerados tóxicos por la Asociación Oficial del Control de

Alimentos de los Estados Unidos (por sus siglas en inglés AAFCO, 1996) son:

aluminio (Al), arsénico (As), cadmio (Cd), cromo hexavalente (Cr), hierro (Fe),

manganeso (Mn), mercurio (Hg), níquel (Ni), plomo (Pb), selenio (Se), talio (Tl),

vanadio (V) y zinc (Zn) (Ghaffari y Motlagh, 2011).

Su toxicidad depende de varios factores, incluyendo dosis, la vía de

exposición, tiempo de exposición, frecuencia y las especies químicas de cada

elemento, así como la edad, género, genética y estado nutricional de los

individuos expuestos. Debido a su alto grado de toxicidad, el arsénico, el

cadmio, el plomo, el mercurio y el cromo, se encuentran entre los metales de

mayor importancia para la salud pública. Estos elementos metálicos se

consideran muy tóxicos, por inducir daño múltiple a diversos órganos, incluso

en los niveles más bajos de exposición (Tchounwou et al., 2012).

Algunos metales pueden considerarse como tóxicos sistémicos, es decir, que

pueden afectar más de un órgano. (Tchounwou et al., 2012).

Los metales pesados pueden afectar al organismo directamente por

acumulación de éstos en su cuerpo o indirectamente a través de la

transferencia a nivel trófico mediante la cadena alimentaria (Evren et al., 2013).

Generalmente el plomo, mercurio y cadmio inducen la producción de radicales

libres y debido a las interacciones con los grupos sulfhidrilos de las proteínas,

alteran las actividades de éstas (Vassallo et al., 2011).

Estudios recientes han mostrado un aumento considerable con su distribución

en el mundo, así como un amplio uso de estos agentes químicos. A diferencia

de los contaminantes orgánicos, muchos de estos metales no pueden ser

degradados fácilmente y se acumulan a lo largo de la cadena alimenticia,

produciendo riesgos para la salud humana y disturbios ecológicos (Castro et

al., 2013).

De acuerdo a Martinez (2007) algunos de los daños que pueden causar estos

metales a la salud son los siguientes:

Daños/Metales

Cadmio

(Cd)

Cromo

(Cr)

Plomo

(Pb)

Arsénico

(As)

Mercurio

(Hg)

Cobalto

(Cb)

Estrés Oxidativo

Daño neurológico

Daño al DNA

Alteración de glucosa

Alteración metabolismo

del calcio

Interferir con los

elementos esenciales

1.2 Plomo

Este metal se ha utilizado por más de 8,000 años en una amplia gama de

aplicaciones. Se ha distribuido por todo el planeta debido a los procesos

antropogénicos como la adición de plomo a la gasolina, en la fabricación de

baterías, cerámica vidriada, pintura con plomo, soldadura con plomo, etc.

(Squadrone et al, 2012; Pottier et al, 2013).

Debido a que el plomo no es biodegradable y se distribuye rápidamente,

históricamente ha sido un importante contaminante ambiental en el aire, agua y

suelos. Se ha estimado que la producción de plomo se ha incrementado de 10

a 1,000,000 toneladas por año, las cuales van acompañadas por un

crecimiento poblacional y económico (Sams et al, 2007).

1.2.1 Características Físicas y Químicas

Es un elemento abundante en la corteza terrestre, con un promedio en la

concentración entre 10 y 20 mg/kg en el suelo (Vasallo et al, 2011). Se

encuentra en el grupo 14 de la tabla periódica, tiene un peso atómico de

207.19 g/mol, posee un color gris azulado, brilloso, suave, maleable y flexible;

forma aleaciones con otros metales, especialmente con antimonio y estaño. Se

funde a 327.4° C y hierve a 1,725°C. Relativamente resistente a la corrosión,

dúctil, maleable y denso. Las valencias químicas normales son 2 y 4. El plomo

(Pb) es anfótero, ya que forma sales de plomo de los ácidos, así como sales

metálicas del ácido plúmbico; forma sales, óxidos y compuestos órgano-

metálicos. Industrialmente, sus compuestos más importantes son los óxidos de

plomo y el tetraetilo de plomo (Agency for Toxic Substance and Disease

Registry, 2005).

1.2.2 Toxicidad

La principal vía de exposición para la población general es por la ingesta de

comida y aire, mientras que la exposición ocupacional a plomo ocurre en las

plantas industriales, refinerías, manufactura de baterías, plásticos, pinturas y

esmaltado (Hou et al., 2013).

Este metal no tiene una función biológica en los seres humanos; su alta

electronegatividad interacciona con las proteínas, en particular los que tienen

sitios de unión de metales (rica en oxígeno y azufre) (Hou et al., 2013).

El plomo entra al cuerpo a través de la absorción intestinal por medio de la

ingestión; a los pulmones ingresa a través de la inhalación y en la piel por

absorción; el plomo que ha ingresado al organismo es transportado por medio

del torrente sanguíneo a todos los órganos y tejidos. Una vez que ha sido

absorbido puede acumularse en huesos, dientes, hígado, pulmón, riñón,

cerebro y bazo; asimismo, es capaz de atravesar la barrera hematoencéfalica y

placenta. Se ha sugerido que durante el embarazo y la lactancia este metal

presenta transferencia activa entre el hueso y el sistema sanguíneo

(Gwalteney et al, 2002).

La vida media del plomo en sangre tiene una vida estimada de 35 días,

mientras que en tejidos blandos es de 40 días y en hueso de 20 a 30 años

(Papanikolaou et al., 2005). Los órganos más sensibles al daño por la toxicidad

en exposiciones agudas del plomo son el sistema nervioso central en

desarrollo y maduro, sistema hematológico y cardiovascular; mientras que en

las exposiciones crónicas el plomo afecta los sistemas gastrointestinal, renal,

neuromuscular y hematopoyético (Flora et al, 2008; Agency for Toxic

Substance and Disease Registry, 2005). Los niveles de plomo en sangre

indican una exposición reciente, mientras que los niveles de plomo en hueso

indican una exposición crónica: el depósito óseo constituye el 90 a 95 % de

plomo concentrado en adultos y 80 a 95% del total en niños (Kakkar y Jaffery,

2005). Además el plomo almacenado en el hueso puede permanecer allí

durante diez años y se encuentra en activa transferencia en sangre

especialmente en el embarazo y lactancia. (Castro et al, 2013)

El Pb ejerce sus efectos a través de su unión con grupos sulfhidrilos de

proteínas, por competición con el calcio, inhibición de enzimas asociadas a

membranas y alteración en el metabolismo de la vitamina D; la calmodulina es

una proteína importante para la regulación intracelular del calcio, y su

funcionamiento es alterado por el plomo, inhibe la síntesis y por consecuencia

la actividad de la sintasa del óxido nítrico (SON) que en sus isoformas I y III

son dependientes de calcio (Toscano y Guilarte, 2005; Nava et al., 2010)

Se sabe que la exposición crónica a plomo afecta el desarrollo neuronal. Es importante destacar que un umbral más bajo para los efectos del plomo en el sistema nervioso no ha sido determinado (Pottier et al, 2013). 1.2.3 Patologías asociadas

El plomo tiene múltiples efectos hematológicos induciendo anemia, glóbulos

rojos microcitícos e hipocrómicos, deficiencia de hierro e inusual incremento en

el número de reticulocitos. La anemia resulta de dos defectos básicos:

disminución del tiempo de vida del eritrocito y daño en la síntesis del grupo

hemo (Papanikolaou et al., 2005). El plomo que tiene una alta afinidad por los

grupos sulfhidrilos, puede inactivar enzimas en especial las que están

involucradas en la síntesis del grupo hemo, tal como la inhibición de acido

aminolevulino dehidratasa (ALA-D) por medio de la competición y

desplazamiento del calcio (Flora et al., 2008).

El plomo afecta esencialmente todos los sistemas orgánicos del cuerpo,

incluyendo el hematopoyético, cardiovascular, renal y esquelético, sin

embargo, el sistema nervioso central es particularmente sensible a los efectos

de este metal (Pottier et al, 2013). El plomo se almacena principalmente en la

mitocondria produciendo daños en su metabolismo energético, induciendo la

producción de radicales libres, inhibiendo la captura del calcio mitocondrial a la

vez que favorece su liberación; este desarreglo en la actividad de la

mitocondria lleva a una apertura del poro mitocondrial con subsecuente

liberación del citocromo C y posible activación de caspasas 9 y 3 favoreciendo

la presencia de apoptosis (Flora et al., 2008).

Los efectos neurotóxicos son complejos, en los últimos años se ha reportado

que el plomo interfiere con receptores acoplados a segundos mensajeros como

la proteína cinasa C, que interfiere también con la liberación de

neurotransmisores tales como acetilcolina, dopamina, noradrenalina y GABA.

En recientes investigaciones se ha detectado que cuando los niveles de plomo

en la sangre llegan alrededor de 50 mg/L en el cuerpo de los niños, puede

afectar el crecimiento, la memoria, inteligencia, y el comportamiento, incluso

cuando no hay ninguna manifestación clínica evidente. El efecto adverso más

importante de la exposición al plomo en los niños es el deterioro de la

inteligencia, habilidades de aprendizaje y la memoria. La evidencia de varios

estudios prospectivos sugiere que los efectos adversos de la exposición del

plomo en la primera etapa de desarrollo neurológico del infante persisten en la

segunda década de la vida (Costa et al, 2004; NourEddine et al, 2005).

La contaminación por plomo ha sido relacionada con un gran número de

problemas en la salud, retraso en el crecimiento fisicomotor en los niños,

alteraciones en la audición, en el sistema nervioso periférico y central, en los

sistemas urinarios, gastrontestinales, cardiovasculares y endocrinos en

adultos. Además de ser un carcinógeno, produce daños neurológicos y

provoca alteraciones cognitivas y conductuales. Durante el embarazo se ha

mostrado que la exposición a plomo ha incrementa el riesgo de aborto, de

nacimientos prematuros y muertes prenatales y alteraciones en el peso, talla y

circunferencia de la cabeza en recién nacidos (Castro et al, 2013).

1.5 Cadmio

El cadmio es un metal pesado que se refiere a menudo como el metal del siglo

20. Es ampliamente utilizado en la industria, principalmente en la

galvanización, en la fabricación de pilas, en conductores eléctricos, en la

fabricación de aleaciones, pigmentos y plásticos y en la estabilización de los

fertilizantes de fosfato. Como un subproducto de las fundiciones, el cadmio es

un contaminante del medio ambiente. En la población general, la exposición al

cadmio se produce principalmente a través de fuentes de la dieta, el

tabaquismo y en menor grado, de agua potable (Byrne et al, 2009).

1.5.1 Características Físico Químicas

El Cadmio (Cd) es un metal que se encuentra en la corteza terrestre en

aproximadamente 0,1 partes por millón: por lo general se encuentra como

impureza en depósitos de plomo o zinc o bien como un subproducto de la

fundición de estos mismos metales (Bernhoft, 2013). Se encuentra como una

sal inorgánica (óxido de cadmio (CdO), cloruro de cadmio (CdCl2) o sulfato de

cadmio (CdSO4). Aunque este metal puede cambiar de formas químicas, el

propio ion metálico no se elimina del entorno (Zalups et al., 2003).

Es un metal que pertenece a la familia IIB, es dúctil, de color blanco con un

ligero matiz azulado. Es más blando y maleable que el zinc, pero poco más

duro que el estaño. Peso atómico de 112.40 g/mol y densidad relativa de 8.65

a 20ºC. Su punto de fusión es de 320.9ºC, de ebullición de 765ºC. Hay ocho

isótopos estables en la naturaleza y se han descrito once radioisótopos

inestables de tipo artificial. El cadmio es miembro del grupo II B (zinc, cadmio y

mercurio) en la tabla periódica, y presenta propiedades químicas intermedias

entre las del zinc metálico en soluciones ácidas de sulfato. Generalmente

existe como un catión divalente y su ion es incoloro (Bernhoft, 2013).

El cadmio no se encuentra en estado libre en la naturaleza, y la greenockita

(sulfuro de cadmio), único mineral de cadmio, no es una fuente comercial de

metal. Casi todo el que se produce es obtenido como subproducto de la

fundición y refinamiento de los minerales de zinc, los cuales por lo general

contienen de 0.2 a 0.4%. Hay estimaciones que cerca de 25.000 a 30.000

toneladas de Cd se liberan en el medio ambiente cada año, con las mayores

contribuciones provenientes de las actividades humanas (entre 4.000 y 13.000

toneladas por año), como la minería y la quema de combustibles fósiles

(Zalups et al., 2003).

1.5.2 Toxicidad.

El cadmio es un metal pesado tóxico para el medio ambiente. La deposición de

Cd en los organismos vivos es frecuentemente por ingestión e inhalación. El

hígado es el sitio principal de metabolismo y acumulación/deposición de la

exposición de Cd aguda, resultante en los tejidos hepáticos que son más

susceptibles a las lesiones hepáticas y necrosis. Mientras tanto, los riñones

son el órgano crítico después de la exposición crónica ocupacional o ambiental

al Cd. Dado que los riñones son los principales órganos diana de la toxicidad

crónica Cd, efectos cardiovasculares indirectos podrían surgir secundariamente

a una lesión renal (Kukongviriyapan et al., 2014).

La exposición humana a cadmio se produce principalmente a través de la

inhalación o ingestión. Aproximadamente del 10 al 50% del cadmio inhalado es

absorbido, dependiendo del tamaño de partícula. A través de la ingesta, cerca

del 5 al 10% de cadmio es ingerido, dependiendo del tamaño de la partícula.

La absorción intestinal es mayor en personas con deficiencia en calcio, hierro o

zinc. Después de la absorción, el cadmio es transportado por todo el cuerpo,

usualmente se une a los grupos sulfidrilos que contienen proteínas como

metalotioneinas. Cerca del 30% se deposita e hígado y 30% en riñones, el

resto se distribuye en todo el cuerpo, con una esperanza de vida de 25 años.

La vida media del cadmio ha sido estimada de 75 a 128 días.

Consecuentemente los niveles bajos de cadmio en sangre, orina y pelo reflejan

una exposición reciente (Bernhoft, 2013).

1.5.3 Patologías asociadas

Una vez absorbido el cadmio suele acumularse en varios tejidos,

principalmente en riñones e hígado, lo que puede causar efectos adversos

como disfunción renal, edema pulmonar, cáncer y enfermedades

cardiovasculares. Además, varios estudios experimentales y clínicos han

asociado al cadmio con presión arterial alta, así mismo, los informes han

puesto de manifiesto que el daño endotelial podría ser un proceso importante

para el desarrollo de la hipertensión arterial inducida por el cadmio (Almenara

et al., 2013).

1.5.4 Epidemiologia

Muchos estudios epidemiológicos han sugerido que la exposición crónica al

cadmio aumenta el riesgo de hipertensión y enfermedad cardiovascular en la

población general. Además, un gran número de estudios en animales han

demostrado que la exposición crónica a cadmio puede llevar a la elevación de

la presión arterial. Los mecanismos biológicos exactos que vinculan la

exposición al cadmio y la hipertensión no son claras, sin embargo, existen

muchas evidencias de que el efecto hipertensivo de la exposición Cd resulta de

acciones complejas tanto en el endotelio vascular y células de músculo liso

vascular. Un factor identificable que juega un papel central en la

hepatotoxicidad inducida por Cd (aguda), nefrotoxicidad (crónica) y

complicaciones cardiovasculares en los organismos, que ha sido el foco de

muchas investigaciones es la excesiva generación de especies reactivas de

oxígeno (ROS) y nitrógeno reactivo especies (RNS). La exposición crónica a

Cd no sólo ayuda a la generación de ROS / RNS, sino que también agota los

niveles de antioxidantes, dando como resultado un estado de

oxidante/desequilibrio antioxidante (Kukongviriyapan et al., 2014).

El humo de cigarrillo es considerado la más significativa exposición de cadmio

para el humano. Niveles en sangre y riñón son consistentemente más altos en

fumadores que en no fumadores. La inhalación por exposición industrial puede

ser significativa en lugares de trabajo, por ejemplo en soldaduras, el cual

puede producir neumonitis química (Bernhoft, 2013)

Los fumadores de tabaco tienen aproximadamente tres veces más contenido

de cadmio en sangre que los no fumadores (1.58 μg.L-1 para fumadores contra

0.47 μg.L-1 para no fumadores). Este contenido de cadmio se ha asociado con

un mayor riesgo de hipertensión (Almenara et al., 2013).

MAO

La actividad de la monoamina oxidasa A (MAOA) es alterada en muchos

desordenes y su baja actividad es asociado con un comportamiento agresivo.

Este gen tiene un polimorfismo funcional con un número variable de

repeticiones en tándem (VNTR) en la región regulatoria upstream (MAOA-

Uvntr).

La monoamina oxidasa (MAO), como una enzima catalítica que regula los

niveles de transmisión de la monoamina en el sistema nervioso central. La

actividad de la enzima es en parte regulada genéticamente. Los genes

codifican las formas A y B de la enzima monoamina oxidasa humana (MAOA y

MAOB) y están localizadas junto a un brazo corto del cromosoma X, entre las

bandas Xp11.23 y Xp11.4. El gen MAOA tiene varios polimorfismos comunes:

1) Un polimorfismo de un dinucleotido repetido (MAOA-CA) cerca del

exón 2.

2) Un número variable de repeticiones en tándem de 23 pares de bases

(bp) cerca del exón 1 (MAOA-VNTR).

3) 2 fragmentos de restricción funcionales lenght de polimorfismo.

4) 30 pb funcionales del polimorfismo VNTR (MAOA u VNTR).

Se ha reportado que el polimorfismo funcional en la región promotora del gen

MAOA, el cual consiste de repeticiones de 30 bp con 3, 3.5, 4 y 5 copias. Alelos

con 3.5 o 4 repeticiones transcriben de 2 a 10 veces más eficientemente en líneas

celulares humanas comparadas con alelos con 3 o 5 copias de repetición. Los

alelos con 5 repeticiones fueron asociados con una alta actividad transcripcional.

Sin embargo, las variantes con 3 o 4 copias son más comunes en diferentes etnias

de la población.

El gen no promotor del polimorfismo MAOA ha sido implicado en muchos

desordenes, agresión y suicidio. Algunos estudios han encontrado que los

polimorfismos MAOA CA y VNTR fueron asociados con desordenes de bipolaridad

afectivos.

Estudios de MAOA-uVNTR observaron que hombres con baja expresión den las

variantes de este polimorfismo marcan significativamente una baja en una

composite measure de agresiones e impulsibilidad y muestra una respuesta

serotonergica mas pronunciada comparada con hombres con una alta expresión

de variantes. Individuos quienes poseen el genotipo MAOA-uVNTR confieren una

alta expresión de MAOA, y quienes reportan una historia de abuso en la niñez

(edades de 3-11 años) han sido encontrados con un menor manifiesto de

psicopatología antisocial. Alta actividad de MAOA reduce los efectos de

vulnerabilidad a los efectos de experiencias abusivas en la niñez en el

comportamiento adulto. En adición, la baja expresión de variantes de este

polimorfismo ha sido asociado con un comportamiento antisocial en pacientes

varones dependientes al alcohol.

Estudios con animales han implicado al MAOA en comportamientos agresivos. La

agresión se ha intensificado en el ratón Knockout y en la inhibición de MAO

durante el desarrollo inducido de la agresión patológica en ratón. Una sola familia

de extenso pedigree en Holanda encontró una mutación en el gen MAOA que

resulta en una pérdida de la actividad enzimática asociado con la impulsivilidad,

agresión y retardo mental en varones. Más recientemente, una alta expresión de

de alelos de este polimorfismo fueron reportados siendo asociados con una alta

impulsivilidad y el desorden de déficit de atención e hiperactividad (ADHD).

Se ha encontrado una alta actividad de MAOA en el hipotálamo de individuos que

se han suicidado con una historia de depresión, pero no se han observado

diferencias en la actividad de la corteza frontal o corteza cingulante.

El polimorfismo MAOA-uVNTR ha sido asociado con attemps suicidio en pacientes

bipolares, particularmente en pacientes mujeres con bipolaridad y con suicidio en

hombres con depresión.

Un polimorfismo funcional en la región regulatoria del gen monoamina oxidasa A (monoamina

oxidasa A untranlsates: sobretrasladada nucleótidos repetidos en tándem, MAOA-U vntr) puede

moderar el degree de riesgo conferido por un trauma temprano. Factores de experiencia pueden

mitigar o exacerbar los efectos de trauma en individuos con riesgo genético.

Factores genéticos pueden jugar una rol moderado en conferir riesgos por un

estrés temprano.

En particular, la baja expresión de alelos de la monoamina oxidasa A (MAOA)

unida al cromosoma X sobre traslada un número variable de repeticiones en

tándem de nucleótidos (MAO-uVNTR) upstream promotor del polimorfismo

asociado con la reducción de la transcripción del gen MAOA. Este alelo ha sido

asociado con una reducción en la transcripción del gen MAOA. Este alelo es

asociado con una alta propensity para desarrollar conductas antisociales e

impulsibilidad en hombres quienes han tenido experiencias tempranas al estrés.

Los genes por efecto del medio ambiente pueden extender a desordenes

mentales, incluyendo un desorden en la conducta, desregularización en

emociones y agresividad.

Los genes interaccionan con el medio ambiente involucrando la baja expresión de

los alelos MAOA-uVNTR se han replicada en la presencia de varios tipos de niños

estresados. Estos tienen típicamente 2 estrategias para definir la adversidad

temprana. En contraste, la experiencia de un estrés temprano en el contexto de

una familia o medio ambiente social positivo puede ser asociado con un bajo

riesgo de outcomes adversosn en la salud mental. El impacto de factores

protectivos puede may vary as una variación genética de la función, paralelo a

reportes tempranos de sensitividad diferencial a experiencias negativas.

La Catecol-O-metiltransferasa (COMT) es una enzima que metaboliza las

catecolaminas como la dopamina, noradrenalina y adrenalina.

2. Justificación.

Una oportuna detección de psicopatologías en niños mexicanos a través de factores

genéticos y ambientales son importantes no solo en ámbito educativo, sino también en el

área forense para la prevención de conductas delictivas y evaluando el nivel de

agresividad e impulsos que puedan llegar a desarrollar los niños.

Por tanto, si se quieren implementar medidas funcionales de prevención de trastornos

neuro-psiquiátricos en general y de conductas delictivas en particular, deben de iniciarse

con un diagnóstico integral del problema, con un equipo multidisciplinario y determinar la

participación de factores ya predispuestos como el material genético y la presencia de

tóxicos ambientales.

2. Objetivos.

2.1. Objetivo general.

Caracterizar los problemas de conducta en un grupo piloto de niños escolares de primaria

en la ciudad de Veracruz y determinar la asociación con factores ambientales tóxicos (Pb

y Cd).

2.2. Objetivos específicos.

1. Determinar en la muestra estudiada, la prevalencia de tres desórdenes, el TDAH,

el TND y el TD que cursan o pueden estar asociados, anteceder o escalar a

conductas inadecuadas e incluso delictivas.

2. En los casos diagnosticados con estos 3 problemas, y en el grupo control

determinar los niveles de plomo (Pb) y cadmio (Cd) en sangre y cabellos y realizar

una biometría hemática completa y una química sanguínea básica.

3. Determinar si existe relación entre los trastornos de conducta y las

concentraciones de Pb y Cd en sangre y pelo.

3. Metodología.

3.1. Tipo de estudio.

Dado que se cuenta con tres objetivos, la primera fase comprende un estudio de

prevalencia. En la segunda fase se buscará la relación de los factores biométricos

mediante un estudio de caso-control.

3.2. Selección del grupo piloto y de la muestra.

Se trata de un estudio transversal, comparativo, de asociación, de casos y controles. En

la ciudad de Veracruz existen 284 primarias con un total de 60776 alumnos de todos los

grados. Las diferentes primarias se ubicarán de acuerdo a su localización física dentro del

área de Veracruz. Se realizará en este mapa la división de cuadrantes 3x3 (n=9), con el

siguiente diseño: A B C/ D E F/ G H I. Con la división del área metropolitana, se

determinarán que escuelas corresponden a cada cuadrante y se enumerarán en forma

seriada. Con el programa MINITAB se seleccionará una escuela por cuadrante en forma

aleatoria.

Norte

Oeste

A B C

Este D E F

G H I

Sur

De las escuelas seleccionadas se seleccionará aleatoriamente una escuela que

constituirá el grupo piloto. En esta escuela se invitará a participar a todos los niños

inscritos de I a VI grado. Los niños y sus padres o tutores que acepten participar y firmen

una carta de consentimiento informado serán los componentes de la muestra. Los niños

que presenten trastornos de conducta constituirán el grupo problema y los niños sin estos

problemas, el grupo control.

3.3. Trabajo de campo.

El trabajo de campo incluye las entrevistas con el directivo de la escuela seleccionada y

con sus maestros. Sesiones de encuadre con presentación del panorama de la

investigación y sus alcances, al menos una sesión con los maestros para sensibilizar

acerca de la problemática a tratar y exponer los criterios diagnósticos. Sesiones de

sensibilización con los padres de familia y solicitud de su participación voluntaria. Con los

padres y/o tutores que acepten participar se procederá a firmar la carta de consentimiento

informado y a realizar las entrevistas correspondientes y las tomas de muestras

respectivas.

3.3.1. Pruebas psicológicas de investigación de trastornos de conducta.

Se aplicará un cuestionario de filtro inicial grueso a los maestros para identificar los niños

con problema de conducta. A todos los niños participantes se les aplicará el cuestionario

de conducta de Conners para padres y maestros. Posteriormente, con los alumnos

participantes se realizará entrevista clínica psiquiátrica y entrevista diagnóstica (12). Se

aplicará a cada niño en presencia de sus padres la entrevista estructurada para niños y

adolescentes M.I.N.I.KID (MINI INTERNATIONAL NEUROPSYCHIATRIC INTERVIEW).

En esa entrevista se obtendrá también la muestra de pelo. Si se detecta algún trastorno

de conducta o psicológico en general, se canalizarán estos niños y sus padres a una

consulta especializada para confirmación del diagnóstico y orientación terapéutica sin

costo para los participantes.

3.4. Pruebas de laboratorio.

3.4.1. Química sanguínea y biometría hemática.

Se realizará biometría hemática y química sanguínea de los casos y controles como

parámetros para evaluar la presencia de anemia o alteraciones en urea y creatinina en

relación a toxicidad.

Los niños y sus padres acudirán previa cita, al laboratorio de Bioanálisis de la Universidad

Veracruzana para la extracción de la muestra de sangre (10 ml).

En el laboratorio de bioanálisis se realizarán las pruebas de biometría hemática (BH) y

química sanguínea (QS) y se expedirá un reporte oficial con los resultados obtenidos.

Dichos resultados se comunicarán a los padres en el reporte final. Se determinarán

hemoglobina, hematocrito, número de eritrocitos, concentración media de hemoglobina

corpuscular, volumen globular medio. Se utilizará un analizador hematológico

automatizado Mindray BC 2300. Para la QS se determinará glucosa, urea y creatinina. Se

utilizará un sistema de análisis químico- clínico automatizado DyaSis, Holzheim,

Alemania.

3.4.2. Determinación de niveles de Pb y Cd.

Para la determinación de los metales pesados se utilizará sangre total con EDTA

(exposición aguda/reciente) y pelo (exposición crónica). La medición de estos metales se

realizará por absorción atómica mediante espectrofotometría de flama en un equipo

Thermo Cientific Modelo Ice 3500 AA System (Thermo Cientific®, China), conforme a las

especificaciones de la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-117-SSA1-1994.

En pelo.

Se tomarán muestras de cabello de la nuca (10 cabellos,1 g), lo más cerca posible del

cuero cabelludo en la línea de crecimiento del pelo, con al menos 10-30 mm de

crecimiento total que representan pelos con un crecimiento entre 30-60 días. La muestra

se guarda en viales libres de Cd hasta su procesamiento. Por cada cabello, 1 cm se lava

con 10 ml de hexano, alcohol y agua desionizada. La muestra se seca, se incinera con

ácido nítrico concentrado. El residuo se diluye con agua desionizada previamente al

análisis del metal, con espectrofotómetro de absorción atómica, conforme a las

especificaciones de la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-117-SSA1-1994.

En sangre.

Para la determinación de los metales pesados se utilizará sangre total con anticoagulante

EDTA. La medición de estos metales se realizará conforme a las especificaciones de la

NOM-199-SSA1-2000 (Pb) y NOM-117-SSA1-1994 (Pb y Cd). Se utilizarán los valores de

corte para la concentración de Pb y Cd de acuerdo a la NOM-199-SSA1-2000 y los

criterios de la OMS.

3.4.3. Análisis genético

Extracción de ADN genómico.

Se obtendrá ADN mediante el uso del kit de Promega Wizard® Genomic DNA purification

Kit.

1. Se trabajará con una muestra de 5ml de sangre periférica con anticoagulante

EDTA, el cual será agitado cautelosamente (invertirlo en su totalidad) durante 2-3

minutos aproximadamente.

2. Posteriormente se centrifugará a una velocidad de 2,000 rpm durante 10 minutos

mediante un equipo de marca Eppendorf modelo 5810 R.

3. Una vez que se han separado las dos fases de la sangre (suero y sangre) entre

estas dos se encontrará una fina capa blanca, la cual corresponde a los linfocitos

de la muestra.

4. Con una pipeta de transferencia se retirarán los linfocitos de la muestra (tratando

de evitar tomar sangre y suero) y se colocarán en un tubo de plástico de 1.5 ml.

5. Se agregará solución de lisis celular hasta alcanzar un volumen final de 1.5 ml.

6. La muestra se llevará a vortex para que se mezcle totalmente con la solución de

lisis celular, posteriormente se llevará a centrifugar mediante un equipo Eppendorf

Centrifuge 5415 C durante 20 segundos a 14,000 rpm.

7. Se observará un botón celular de color blanquecino y se removerá y desechará el

sobrenadante teniendo un especial cuidado en no perder el botón celular el cual

será visible.

8. Para limpiar las impurezas que puedan quedar en la muestra se repetirá de 1 a 2

veces más los pasos 5 a 7. El botón celular de preferencia debe quedar de un

color blanco

9. Se agregarán 400 μl de solución de precipitación de proteínas y se llevará a vortex

vigorosamente durante 20 segundos.

10. Posteriormente se llevara a centrifugar durante 3 minutos a 14,000 rpm.

11. La muestra se incubará durante una hora a 37° C, durante este periodo los grumos

que hay en la muestra se deberán disolver, si no es así, se dejará la muestra a

temperatura ambiente durante 1 día, en este periodo la muestra debe de

disolverse por completo.

3.5 Cuantificación de ADN

Para determinar la concentración de ADN de las muestras se utilizo el espectofotometro

de la marca Thermo Scientific modelo Nanodrop 2000. A través de este equipo la muestra

fue estandarizada a 500ng/ml.

3.6 Análisis de los polimorfismos.

MAOA/uVNTR

Primers: MAO-A F: ACA GCC TGA CCG TGG AGA AG

MAO-A R: GAA CGG ACG ACG CTC CAT TCG GA

Mediante la reacción en cadena de la polimerasa en punto se llevo a cabo la

ampliación del polimorfismo MAO-A/uVNTR. El volumen final de la reacción fue de

11.5 μl el cual contenía: 1.25 μl de buffer, 1.25 de dNTPs, 8.7 μl de agua para

PCR, 1.75 μl de cada primer, Dream Taq polimerasa 5 U/ μl (Thermo Scientific) y

100 ng de DNA genómico.

Se programo un método de desnaturalización de 95°C durante 10 minutos,

seguido de 35 ciclos de amplificación (95oC por 1 minuto, 62°C por 1 minuto, 72oC

por 1 minuto) con un tiempo de extensión final de 4 minutos a 72oC.

5HTT LPR

Primers: 5 HTT F: ATG CCA GCA CCT AAC CCC TAA TGT

5 HTT R: GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC

Mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en punto, se llevo a cabo la

amplificación del polimorfismo 5-HTTLPR en un volumen de reacción de 11.5 µl

conteniendo 6.250 μl de enzima Kapa HiFi (Kapa Biosystem), 1.25 μl de DMS, 3.375 µl

de agua para PCR, 0.375 µl de primer sentido, 0.375 µl anti-sentido y 150ng/ml de DNA.

El método de la PCR consiste de un paso inicial de desnaturalización de 5 minutos a

95°C, seguido por ___ ciclos constituidos por 20 segundos a 98°C, 15 segundos a 65°C y

15 segundos a 72°C con un paso final de 5 min. A 72°C.

3.6 Genotipicación.

3 l del producto amplificado es mezclado con 2 l de colorante de electroforesis y

cargado en un gel de agarosa al 2.5% (Agarosa I™ de la marca Biotechnology Grade al

1% y Agarosa MetaPhor™ de la marca Lonza al 1%) en TBE 1X a 110 volts y teñido con

bromurio de etidio para visualizarse a través de un equipo transiluminador UV modelo

M20 de 20x20cm.

COMT/rs4680 (ensayo C_25746809_50)

La genotipificación de la región se realizará mediante el método de discriminación alélica

con sondas TaqMan. El volumen final de la reacción será de 7 ul y contendrá las

siguientes condiciones de reacción: 100 ng/ml de DNA, 2.5 μL de TaqMan Master Mix (de

Applied Biosystem), 0.125 μL de 20x de las sondas “Assay made to order” y 2.367 μL de

agua para PCR. La amplificación será llevada a cabo con el equipo 7500 real time PCR

system with SDS v2.1 software (Applied Biosystems). El análisis de discriminación alélica

será realizará a través de la identificación estandarizada de cada uno de los genotipos

para cada región analizada.

3.7. Análisis estadísticos.

Para ver si existe similitud en la prevalencia en la muestra de los tres trastornos de forma

independiente y conjunta, se utilizará estadística descriptiva para evaluar porcentajes y

posteriormente realizar Tablas de Contingencia (X2)

Para los valores de Pb y Cd se realizarán dos pruebas de ANOVA Multifactorial. Las

determinaciones se harían: Factor A (casos y controles), Factor B (Sexo) y Factor C

(grado escolar).

SOFTWARE libre HWE.exe CALCULAR equilibrio de poblaciones

Equilibrio Hardy Weinberg

COMT X2=0.51 1 gl p=0.471

5HTT X2=0.72 1 gl p=0.395

MAO-AuVNTR X2=1.10 1 gl p=0.294

Frecuencias

El gen de Catecol-O-metiltransferasa (COMT) se encuentra localizado en el

cromosoma 22 (22q11), se ha reportado que este gen COMT, sufre un

polimorfismo funcional también conocido como Val158Met o rs4680, en donde hay

una sustitución de una Valina (Val) por una Metionina (Met) en la posición 158 del

aminoácido, el cual resulta en la reducción de la actividad de la enzima COMT.

X2 =0.30 2gl p=0.860 genotipos

X2 =0.08 1gl p=0.772 alelos

El gen de la monoamina oxidasa (MAO) se encuentra ubicado en el cromosoma X

(Xp11.23) entre las bandas Xp11.23 y Xp11.4 y cuenta con 15 exones con idéntica

organización intrón-exón. Se ha determinado que este gen sufre un polimorfismo

funcional del tipo VNTR (número variable de repeticiones en tándem) localizado

en la región promotora del gen de la MAO-A (MAO-A-uVNTR) y caracterizado por

una repetición de la secuencia de 30 pares de bases que impacta en la eficiencia

de la transcripción del gen.

Frecuencia alelica

2 3 4

1(0.013) 25(0.38) 48(0.65)

El gen del transportador de serotonina está localizado en el cromosoma 17, el cual sufre

un polimorfismo funcional (5-HTTLPR). Inicialmente una variante corta (alelo S) del

polimorfismo fue encontrado y tuvo una baja eficiencia transcripcional y una menor expresión en

COMT (rs4680) GENOTIPOS ALELOS

G/G G/A A/A G A

GRUPO 1 (42) 12 (0.285) 23 (0.547) 7 (0.166) 47 (0.56) 37(0.44)

Control Torilla 72 (0.32) 112(0.51) 38(0.17) 256 (.58) 188 (0.42)

Genotipo de MAOAuVNTR

3 4 23 33 34

GRUPO 1 (42) 3 (0.071) 7 (0.166) 1 (0.023) 7 (0.166) 7 (0.166)

el transportadorEn este caso, hay un cambio en el código del ADN de A por una G.

5HTTLPR

LL SS SL S L

GRUPO 1 (41) 11 (0.26) 7 (0.166) 22 (0.52) 37(0.45) 45 (0.55)

Camarena et al 74 (0.22) 101 (0.30) 162(0.48) 364 (0.54) 310 (0.46)

4. Cronograma.

Actividad Enero-

Marzo

Abril- Junio Julio-

Septiembre

Octubre-

Diciembre

Gestiones SEP, y escuelas

participantes.

Impresión de material para

encuestas y escalas de

evaluación

Ya

realizadas

Ya

realizadas

Implementación de estudio Ya

realizadas

Trabajo de campo con niños,

padres y maestros

Ya

realizadas

Ya

realizadas

Implementación y optimización

de las técnicas de laboratorio

Ya

realizadas

Recolección de muestras Ya

realizadas

Ya

realizadas

Procesamiento de muestras Ya

realizadas

Ya

realizadas

Ya

realizadas

Concentración y análisis de

resultados

x X

Publicación de resultados X