Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per...

79
Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics Ens enganya la publicitat? 2n de Batxillerat TREBALL DE RECERCA

Transcript of Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per...

Page 1: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics

Ens enganya la publicitat?

2n de Batxillerat

TREBALL DE RECERCA

Page 2: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.
Page 3: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Agraïments

A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball.

A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

A la Universitat Autònoma de Barcelona per facilitar-me material.

I especialment la meva tutora Marga per fer-me el seguiment del treball i

ajudar-me en tot moment.

Page 4: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

ÍNDEX

Pàgines

0. INTRODUCCIÓ ...............................................................................................4

1. ASPECTES TEÒRICS ....................................................................................6

1.1 Els aliments funcionals ...................................................................6

1.2 Els aliments probiòtics ....................................................................7

1.2.1 Criteris d’avaluació dels probiòtics en els aliments ...................9

1.2.2 Característiques del probiòtic perfecte.....................................10

1.3 Els bacteris probiòtics i la salut humana.....................................11

1.3.1 Els bacteris de l’home i

el sistema immunitari gastrointestinal .....................................11

1.3.2 Els principals probiòtics .................................................................14

1.3.3 Els efectes probiòtics en l’home i

les aplicacions clíniques ..........................................................16

1.3.4 Mecanismes d’acció ......................................................................22

1.4 Els aliments probiòtics comercialment disponibles ..................23

1.4.1 El iogurt ...................................................................................25

1.4.2 Un tipus de llet fermentada: el kèfir ...............................................26

2. OBJECTIUS .................................................................................................28

3. MÈTODES ...................................................................................................29

3.1 Treball al laboratori ........................................................................29

3.1.1 El material .....................................................................................29

3.1.2 Esterilització ..................................................................................30

3.1.3 Tècniques microbiològiques i anàlisi dels aliments ................30

Page 5: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

3.2 Treball als punts de venta .............................................................43

3.3 Consulta de la publicitat a Internet ...............................................44

3.4 Consultes telefòniques ..................................................................44

4. RESULTATS ................................................................................................45

4.1 Descripció dels cultius a les plaques ...........................................40

4.2 Recompte de microorganismes ....................................................48

4.3 Informació que trobem en els envasos ........................................55

4.4 Recull d’informació ........................................................................61

4.5 Publicitat en un producte probiòtic ..............................................62

4.6 Resultats de les consultes telefòniques ......................................63

5. ANÀLISI DELS RESULTATS ......................................................................64

5.1 Existència de lactobacils

vius en els probiòtics estudiats ....................................................64

5.2 Comparació de la qualitat entre marques blanques

i marques comercials del mateix producte ..................................65

5.3 Informació dels envasos dels productes .....................................66

5.4 Valoració de la publicitat en un producte

probiòtic: l’Actimel .........................................................................67

5.5 Informació que els productors transmeten als

consumidors a través del servei d’atenció

al client ............................................................................................69

Page 6: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

6. CONCLUSIONS ...........................................................................................71

BIBLIOGRAFIA ................................................................................................74

Page 7: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

4

0. INTRODUCCIÓ

Moltes vegades hem anat al supermercat i, preocupats per la nostra

alimentació, hem comprat allò que ens ha semblat més sa o més adient

senzillament per la publicitat que hem vist o pel què hem llegit, sense saber-ne

res més. Iogurts, galetes, sucs i pans efecte bífidus han entrat en la nostra

dieta amb molta publicitat i escassa informació. Aquests superaliments, s’han

posat ja a la cistella del mercat de moltes famílies que els consumeixen només

perquè, a més d’un preu més alt, compten amb l’etiqueta de saludable. Però,

com podem diferenciar entre el que no passa d’una moda i el que es converteix

en una compra encertada i saludable?

El concepte d’aliment en el món desenvolupat està canviant: en èpoques

passades s’enfocava cap a la supervivència, la satisfacció de la gana i

l’allunyar-se de les malalties causades per deficiències de certs nutrients,

mentre que en l’actualitat els aliments han de promocionar la salut i contribuir al

benestar del consumidor.

Sembla ser que la denominada dieta saludable ens protegeix davant de

malalties cardiovasculars, de diversos tipus de càncers o de l’obesitat. Dins

d’aquest marc se situen els aliments funcionals, específicament desenvolupats

per millorar la salut i per reduir el risc de contraure algunes malalties.

Així doncs, l’objectiu principal d’aquest treball ha estat descobrir què són

realment els aliments funcionals i intentar comprovar si són necessaris o

senzillament beneficiosos per a la salut. Per a fer-ho, ens hem basat

especialment en un tipus d’aliments funcionals, els probiòtics, ja que són uns

dels més habituals.

Per a dur a terme aquest treball he optat per dividir-lo en dues parts, la part

teòrica i la part pràctica.

En l’apartat 1, aspectes teòrics, hi ha l’explicació d’aquest tipus d’aliments,

amb les seves característiques i propietats. La informació ha estat extreta

majoritàriament d’Internet i de diferents llibres especialitzats, tot i que també

n’he extret d’altres fonts, com per exemple la informació que m’ha estat

Page 8: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

5

proporcionada per una nutricionista. Aquesta part està dividida en diferents

apartats depenent del tema que tracta.

L’altre gran bloc del treball és la part pràctica. Aquesta part es divideix en

diferents apartats: els objectius, els mètodes utilitzats per a l’obtenció dels

resultats, els resultats i l’anàlisi d’aquests. Per a la realització d’aquest bloc vaig

escollir tres productes basant-me en els objectius: l’Actimel de Danone,

l’Actívitas d’Eroski i el iogurt de Danone.

Tanmateix, el treball també disposad’un annex amb informació

complementària.

Els objectius varen ser cinc: Comprovar si els probiòtics que es trobaven a

l’interior dels productes estaven vius, comprovar la qualitat probiòtica entre una

marca blanca i una marca comercial, veure les característiques dels productes

a partir de la informació del seu etiquetatge, valorar la publicitat per a algun

producte probiòtic i comprovar si el servei d’atenció al client ens proporciona els

estudis que avalen la qualitat dels productes probiòtics.

Els mètodes emprats han estat tècniques de microbiologia que gràcies a la

meva tutora he après, ja que no s’ensenyen ni practiquen en els cursos de

Batxillerat.

Personalment, l’àmbit de l’alimentació sempre m’ha interessat i bàsicament és

a què em vull dedicar de cara als propers anys. Trobo molt interessant aquest

tema ja que la nostra vida n’està molt condicionada i l’alimentació és bàsica per

a nosaltres. Fins fa uns mesos jo no sabia de l’existència dels aliments

funcionals i va ser aleshores que una amiga me’n va parlar i vaig considerar

que aquest podia ser un bon tema per a un treball de recerca.

Cal dir que he après molt fent aquest treball i considero que és un pas

endavant.

Page 9: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

6

1. ASPECTES TEÒRICS

1.1. Els aliments funcionals

Un aliment funcional es defineix com aquell que, demostrat científicament,

actua beneficiosament sobre una o més funcions de l’organisme, més enllà

del seu efecte nutritiu, millorant la salut, el benestar i reduint el risc de patir

malalties. Així els defineix l’Institut de Nutrició.

Tant podem estar parlant d’un aliment natural, un aliment al qual s’hi han

afegit, eliminat o modificat algun component per vies biotecnològiques; un

aliment on s’ha modificat o substituït parcialment un ingredient amb efectes

negatius per un altre amb efectes benèfics o una combinació de qualsevol

d’aquestes possibilitats.

El millor exemple d’Aliment Funcional natural és la llet humana, que conté

gran nombre d’elements bioactius (enzims, factors de creixement, aminoàcids

lliures, immunoglobulines, oligosacàrids, etc.), ja que el seu efecte va molt

més enllà de l‘únicament nutritiu.

Altres exemples d’aliments funcionals naturals són els aliments rics en

antioxidants com els aranyons, cítrics, xocolata, que protegeixen contra

l’envelliment prematur de les cèl·lules. També els olis vegetals com el d’oliva

que conté àcids grassos insaturats (greixos líquids a temperatura ambient)

que protegeixen contra les malalties cardiovasculars.

D’aliments funcionals modificats biotecnològicament podem trobar la llet

desnatada, que se li ha eliminat el greix saturat (greix sòlid a temperatura

ambient) i en alguna se li ha afegit greix cardioprotector omega 3.

El Danacol, que conté un component que ajuda a reduir el colesterol de la

sang, l’àcid fòlic als cereals i els àcids grassos poliinsaturats de les

margarines són aliments funcionals modificats.

Cal tenir present que un excés d’antioxidant o d’àcids grassos omega 3 tenen

un efecte contrari, negatiu per l’organisme. Tot dependrà de la dosi.

Page 10: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

7

Els probiòtics són uns aliments funcionals modificats biotecnològicament, ja

que provenen de l’afegit de bacteris, normalment, a la llet.

De tots els aliments funcionals, ens centrarem amb el grup dels probiòtics.

1.2. Els probiòtics

Des de fa un segle, es coneix que la adició de gèrmens vius als productes

làctics és una forma de conservar-los. Al 1908, Metchnikoffva proposar que

l’envelliment és conseqüència de l’acció de les substàncies tòxiques

produïdes per la flora intestinal i va suggerir que la ingestió dels lactobacils

que es trobaven en els aliments làctics podia bloquejar aquestes toxines i

perllongar la vida.

Actualment, una definició generalment acceptada de què és un producte

probiòtic és la següent: suplements alimentaris, tant per l’alimentació humana

com animal, que contenen microorganismes vius que ingerits en quantitats

adequades milloren el balanç microbià de la flora intestinal del consumidor.

En la taula següent veiem com ha anat evolucionant la definició de probiòtic:

Taula 1. (Martí del Moral, et al.)

“ Suplements per a l’alimentació animal amb efectes benèfics per a la flora

intestinal”.

“ Suplements per a l’alimentació que contenen microorganismes vius amb

efecte benèfic per als animals ja que incrementa la seva flora microbiana

intestinal”.

“ Microorganismes vius o barreja de cultius de microorganismes que,

ingerits tant per l’home com pels animals, produeix una millora de les propietats

microbianes” .

“ Una preparació de microorganismes que ajuda a millorar el balanç

microbià i enzimàtic de la superfície de la mucosa o estimular els mecanismes

immunològics intestinals” .

Page 11: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

8

Uns dels bacteris probiòtics més comú és el Lactobacillus, utilitzat per a la

fermentació d’aliments, com per exemple el iogurt, i les bifidobacteries,

gèrmens predominants en la flora intestinal dels nens alimentats amb

lactància materna i possiblement la causa de la disminució de la diarrea en

ells.

Els microorganismes empleats com a probiòtics es troben disponibles

comercialment a través de laboratoris o indústries alimentaries a nivell

internacional, com per exemple, en col·leccions de cultius.

Page 12: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

9

1.2.1. Criteris d’avaluació dels probiòtics en els aliments

Per a què un microorganisme sigui considerat un probiòtic ha de tenir una sèrie

de característiques. Aquests requisits van ser denominats pels científics Castro

i De Revotto l’any 2006.

El bacteri ha de formar part de la flora intestinal dels humans.

No pot ser ni patogen ni toxigènic1.

S’ha de mantenir viu durant el pas àcid de l’estómac i en contacte amb la

bilis, situats al duodè2.

Ha de tenir capacitat d’adhesió a les cèl·lules del pas gastrointestinal.

S’ha d’adaptar a la flora sense desplaçar els organismes ja existents.

Ha de produir substàncies microbianes.

Ha d’estar comprovat científicament que té capacitat per augmentar de

forma positiva les funcions immunològiques i la capacitat metabòlica.

Diversos investigadors han avaluat aquests conceptes, i ho han fet utilitzant

diverses metodologies. Entre elles destaquen: l’adherència a les cèl·lules

gastrointestinals per a reduir o prevenir la colonització de patògens (comprovat

per Bernet el 1994, Kirjavainen el 1998, Ouwehand el 1999, entre d’altres) i la

producció de metabòlits3 que inhibeixen els microorganismes patògens (Reid i

Burton, 2002).

1Toxigènic: capaç de produir substàncies tòxiques que poden danyar els teixits.

2 Duodè: tub articulat buit que connecta l’estómac amb una part de l’intestí prim anomenada

jejú. 3 Metabòlits: qualsevol molècula utilitzada o produïda durant un procés metabòlic.

Page 13: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

10

1.2.2. Característiques del probiòtic perfecte

El probiòtic destinat al consum humà, hauria de ser, en primer lloc, d’origen

humà (Lee i Salminen,1995), ja que algunes de les accions d’aquests cultius

vius són molt específiques, també ha de ser capaç de sobreviure en el pas

gastrointestinal i ser resistent a les secrecions digestives (Mc Donald,1990 i

Marteau, 1997).

Paral·lelament, ha de posseir la capacitat d’adherir-se a l’epiteli gastrointestinal,

amb el fi d’aconseguir una colonització eficaç, i en conseqüència d’això, inhibir

el creixement de bacteris patògens. Els probiòtics poden veure’s afectats per:

La dieta

Administració de fàrmacs i antibiòtics

La contaminació mediambiental

L’estrés

Un davallament de les defenses

L’envelliment

En la taula següent podem veure els principals efectes de tres soques diferents

de Lactobacils (Marteau, 1997)

Soca Efectes beneficiosos

Lactobacillusacidophilus (els trobem

al iogurt)

Adherència a l’epiteli intestinal humà

Equilibra la flora intestinal

Millora la resposta immunològica

Lactobacillusrhamnosus GG (els

trobem en alguns tipus de iogurt)

Prevé la diarrea associada als

antibiòtics

Tractament de la diarrea per ratrovirus

Millora malalties com la de Crohn4

LactobacilluscaseiShirota (es troba en

alguns productes làctics fermentats

com el Yakult)

Prevé la alteració de la flora intestinal

Afecta positivament per a la prevenció

del càncer de bufeta urinària

Taula 2. (Martí del Moral, et al.)

4Crohn: malaltia crònica en la qual el sistema immunitari ataca l’intestí provocant inflamació.

Page 14: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

11

1.3. Els bacteris probiòtics i la salut humana

Com ja he dit, els probiòtics produeixen efectes beneficiosos sobre la salut,

però aquests efectes només es poden atribuir als probiòtics específicament

estudiats per a una indicació o situació concreta. Per tant, no tots els probiòtics

es poden administrar per a la mateixa situació, ni tots els probiòtics en totes les

situacions.

S’han d’utilitzar les dosis de probiòtics recomanades per un especialista, a

dosis més baixes o més elevades pot ser que no siguin efectius, o podrien ser

nocius.

Pacients greument immunodeprimits, és a dir amb el sistema de defensa propi

de l’organisme més baix del normal, no han de prendre probiòtics sense la

recomanació d’un metge, ja que en aquestes circumstàncies, aquesta persona

és molt més propensa a que el probiòtic actuï com un agent patogen.

És important seguir d’una manera estricta les normes de conservació dels

productes probiòtics, ja que molts d’ells necessiten una temperatura

determinada per mantenir-se vius.

La ingestió d’un elevat nombre de microorganismes vius obliga a investigar

sobre la seva seguretat. Des d’un punt de vista teòric, al tractar-se

d’organismes que normalment formen part de la nostra flora intestinal, és poc

probable que causin problemes infecciosos. Tot i així, com ja hem dit, si la

persona que els ingereix té el sistema immunitari deficitari, la probabilitat de

tenir problemes augmenta si els microbis passen a la sang.

1.3.1 Els bacteris de l’home i el sistema immunitari gastrointestinal

Normalment abans de néixer tant els humans com la resta de mamífers no

tenim bacteris a l’organisme. No obstant, al passar pel canal de part, la pell ja

queda recoberta d’aquests i durant els primers dies els microorganismes

penetren a les vies respiratòries i al tracte gastrointestinal. Molts d’aquests

organismes que ara es trobaran a dins de l’individu són capaços de colonitzar

el seu hoste, construint així, la seva “biota normal”. Aquests bacteris poden

causar malalties si l’individu és immunodeprimit.

Page 15: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

12

Els microorganismes lluiten pel seu lloc dins de l’organisme impedint així que

nous bacteris els quals podrien ser patògens, també colonitzin i es

desenvolupin. Per tant, una reducció de la població de la biota normal pot

afavorir al creixement de microorganismes patògens i, per tant, augmentar les

possibilitats de patir malalties. Per exemple, el tractament amb antibiòtics

redueix la biota normal de les mucoses (intestins, vagina, boca, etc.) permetent

que, en alguns casos, agents patògens resistents als antibiòtics colonitzin

aquesta zona. Un exemple de microorganisme patogen que sota aquestes

condicions extremes pot colonitzar la boca o la vagina és Candida albicans,

fong causant malalties anomenades candidasis oral o vaginal que, tot i no

posar la vida en perill, solen ser greus.

Es denomina flora el conjunt de bacteris que viuen a l’intestí, la relació dels

quals amb l’hoste és majoritàriament per simbiosi5 i comensalisme6 i es

calcula, que l’ésser humà té al tracte gastrointestinal centenars d’espècies

bacterianes diferents.

El sistema immunitari podria ser definit com aquell sistema format per un

conjunt d’estructures i processos biològics a l’interior de l’organisme que ens

protegeix de malalties identificant i matant les cèl·lules patògenes i

cancerígenes.

El sistema immunitari de les mucoses constitueix la primera línia de defensa de

l’organisme, ja que les mucoses son la principal via d’entrada de

microorganismes, al·lèrgens i carcinògens7. La superfície més vulnerable i

extensa són els 400m2 de mucosa gastrointestinal (200 vegades més gran que

la superfície cutània). Aquest sistema protector està format per la major

col·lecció de cèl·lules immunoprotectores de l’organisme.

Segons Murphy (2007), el sistema immunitari gastrointestinal es pot dividir en

tres parts:

La flora intestinal

L’epiteli i la mucosa intestinal

La resposta immunitària específica

5 Simbiosi: tipus de relació tròfica entre dues espècies; d'aquesta interacció tots dos

organismes en resulten beneficiats. La relació és tan estreta que es necessiten mútuament per viure. 6 Comensalisme: relació tròfica en què una espècie s'alimenta a partir de l'aliment sobrer d'una

altra espècie. 7 Carcinògens: provocadors de càncer.

Page 16: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

13

1.3.1.1. La flora intestinal

Els microorganismes que pertanyen a la flora intestinal exerceixen una

important influència en el manteniment de l’equilibri de la comunitat

microbiològica (bacteris patògens/bacteris beneficiosos). La flora produeix

enzims que fan una gran quantitat de funcions metabòliques a l’intestí, que son

beneficiosos per l’hoste.

Es considera que alguns bacteris làctics tenen efectes com per exemple

l’adherència a la superfície de la mucosa, evitant o minimitzant la colonització

d’agents patògens i tots els perjudicis que aquests comporten.

Per exemple, la patogenicitat dels bacteris de la soca Enterobacteriaceaeestà

directament relacionada amb l’habilitat d’adherència dels bacteris làctics a la

mucosa intestinal.

Els microbis de la flora intestinal formen el 90% aproximadament del total de

les cèl·lules del cos humà.

1.3.1.2. L’epiteli i la mucosa intestinal

L’epiteli és un conjunt de cèl·lules que ajuden a protegir o a recobrir els òrgans i

la majoria d’elles produeixen mucositat o altres secrecions. Aquestes cèl·lules

estan organitzades en capes úniques o múltiples, depenent de l’òrgan i la

localització.

La mucosa és una capa viscosa i elàstica formada en gran part per glúcids, que

no només formen una barrera física, sinó

que també eviten que s’adhereixin bacteris

patògens a la superfície de l’intestí.

La capa epitelial de l’intestí prim, està

estructurada per una sèrie de plecs

(vellositats intestinals), que augmenten la

superfície d’absorció de les cèl·lules i la

concentració de limfòcits que es troben a

l’epiteli.

Tant la flora intestinal com l’epiteli i la mucosa intestinal actuen de manera

inespecífica contra nombrosos patògens.

Page 17: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

14

1.3.1.3. Resposta immunitària específica

El sistema immunitari comprèn una sèrie de mecanismes d’interacció molt

complicada. L’intestí humà conté més de 106 limfòcits per cada gram de teixit.

A més, el 60% de la immunoglobulina8 total produïda diàriament és segregada

al pas gastrointestinal. Les cèl·lules immunològiques intestinals estan

organitzades en diferents compartiments: a les plaques de Peyer9, i distribuïdes

entre la mucosa i l’epiteli.

Les cèl·lules immunitàries que participen en la resposta específica són els

limfòcits T i els limfòcits B. Els limfòcits reconeixen de manera específica a un

invasor concret.

Imatge 6. Esquema de la resposta immunitària específica

8La immunoglobulina o anticòs (Ig),són glicoproteïnesque es troben en la sang o altres fluids

corporals dels vertebrats. Són alliberades pels limfòcits B per a identificar i neutralitzar elements estranys (bacteris, virus, paràsits, etc.) de manera específica. 9Les plaques de Peyer són cúmuls de teixit limfàtic que cobreixen interiorment les mucoses

com les del intestí i les vies respiratòries.

Page 18: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

15

1.3.2. Els principals probiòtics

S’ha demostrat que alguns bacteris làctics tenen la propietat de reforçar la

immunitat i que ofereixen beneficis a grups determinats. Per exemple, el

científic De Vries va demostrar que Lactobacillusrhamnosus GG podia ser

utilitzat amb èxit com a suplement immunomodulador amb nens. Malgrat tot, no

s’ha pogut determinar l’habilitat de modular la immunitat en l’etapa de la

vellesa.

És necessari senyalar que tot i que algunes soques de Lactobacillusplantarum

es comercialitzin com a probiòtics, no s’ha pogut determinar fins al moment si

són capaces de potenciar la immunitat.

El japonès Nagafuchi va demostrar el 1999 que les propietats

immunomoduladores dels probiòtics i el seu comportament, depenen de les

especies bacterianes, de cada soca i de la quantitat administrada.

De cara a la salut, és d’un interès important la recerca de noves soques de

Lactobacillus que siguin capaces de causar una millora immunològica,

proporcionant nous agents amb propietats probiòtiques beneficioses i que

posseeixin propietats immunomoduladores.

El grup dels probiòtics està integrat per diverses espècies, com per exemple:

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus i

Bifidubacterium. El gènere que descriu més espècies probiòtiques és el

Lactobacillus, ja que té més propietats beneficioses per a la salut.

Seguidament es troben les espècies i gèneres més utilitzats habitualment a

nivell industrial (Martídel Moral et. al, 2005).

En el gènere Lactobacillus trobem: L.acidophilus, L. casei var. Shirota, L.

fermentum, L. casei, L. crispatus, L. reuteri, L. rhamnosus, L. plantarum, L.

bulgaricus , L. cellobiosus, L. curvatus, L. lactis cremori, L. GG.

En el gènere Bifidobacterium trobem: B. longum, B. adolescentis, B. animalis,

B. infantis, B. bifidum.

Page 19: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

16

A continuació tenim una taula amb els principals gèneres probiòtics amb els

possibles efectes que poden tenir sobre la salut del consumidor.

GÈNERE

EFECTES

Lactobacillus En cap cas són patògens tot i que s’han

trobat casos problemàtics amb

consumidors immunodeprimits.

Lactococcus En cap cas són patògens.

Bacillus Unicament el Bacillussubtilis es pot

considerar microorganisme probiòtic.

Bifidobacterium S’han donat casos en que algunes

soques han causat infeccions als

humans.

Saccharomyces Algunes soques poden ser infeccioses,

en alguns casos poden ser patògens.

Taula 3.

1.3.3 Els efectes dels probiòtics en l’home i les aplicacions clíniques

Alguns dels efectes atribuïts a les bactèries làctiques estan molt documentats,

i es coneix el seu mecanisme d’acció, com per exemple, la disminució de la

intolerància a la lactosa, mentre que altres, com les propietats antitumorals o

la disminució del colesterol, requereixen més estudis in vitro i en models

experimentals per a poder confirmar el mètode d’acció.

Page 20: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

17

1.3.3.1 Intolerància a la lactosa.

Un dels efectes probiòtics més consistents i reproduïbles és la disminució

dels símptomes associats amb la mala absorció de la lactosa, el sucre de la

llet. Els mamífers tenim un enzim anomenat β-galactosidasa (lactasa) a

l’intestí prim que la trenca i la converteix en galactosa i glucosa, per

aleshores, poder-la absorbir. Quan falta aquest enzim, la lactosa passa a

l’intestí gros i allà pot provocar dolor abdominal, espasmes, flatulència,

defecació urgent, vòmits i fins i tot febre.

Els mamífers adults, com que ja no beuen llet, deixen de fabricar l’enzim. És

una qüestió d’estalvi d’energia: per a què fabricar un element que no té

utilitat? Però la majoria dels humans adults occidentals tenim encara aquest

enzim per una mutació genètica de fa milers d’anys. Les persones que són

intolerants a la lactosa no presenten l’enzim lactasa. Generalment, les

persones que presenten intolerància a la lactosa poden prendre productes

làctics fermentats. Les bactèries que participen en la fermentació tenen

l’enzim lactasa, ja que el necessiten per trencar la lactosa en galactosa i

glucosa i així poder fer la fermentació. Per tant en un producte làctic

fermentat gairebé no hi ha lactosa, ja que els bacteris s’han encarregat de

trencar-la.

Entre un 50 i un 70% de la població humana pateix intolerància a la lactosa,

però cal diferenciar-la de l’al·lèrgia a la llet, ja que l’al·lèrgia a la llet és la

resposta immunitària exagerada, anormal, a les proteïnes presents a la llet.

Page 21: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

18

1.3.3.2 Efecte immunomodulador

Aquest efecte consisteix en que els bacteris làctics dels aliments funcionals

han de ser capaços no només d’aportar-nos una immunoestimulació a nivell

de les mucoses, sinó també de garantir l’absència d’efectes com per

exemple la translocació microbiana. És el canvi de lloc dels bacteris a través

de la mucosa intestinal cap a òrgans extra-intestinals com són per exemple

el fetge i la melsa, i l’alteració de la permeabilitat dels intestins degut a grans

inflamacions. Per aquest motiu és imprescindible avaluar l’afectivitat de les

bactèries probiòtiques per a interactuar amb l’intestí i les cèl·lules del

sistema immunitari associades a aquest.

Un exemple (Taranto i altres, 1999) el trobem en una mescla de bacteris

utilitzats per a la elaboració del formatge fresc probiòtic que van ser capaços

d’interactuar justament en els llocs d’inducció més importants de l’intestí

prim (les plaques de Peyer) i de l’intestí gros (nòduls limfoides mesentèrics) i

de mantenir la relació entre Limfòcits T col·laboradors10 (CD4+) i LT

citotòxics11 (CD8+). Els limfòcits T col·laboradors s’activen mitjançant altres

cèl·lules immunitàries tals com els Limfòcits T citotòxics (CD8+), que són els

encarregats de neutralitzar les cèl·lules infectades per microorganismes

nocius injectant enzims tòxics que provoquen la destrucció de les cèl·lules

infectades. Els Limfòcits T citotòxics al seu torn també activen als Limfòcits

B, els quals alliberen anticossos específics. Així s’aconsegueix augmentar la

resistència de l’hoste i facilitar l’exclusió de patògens de l’intestí de manera

específica per a cada agent infecciós.

10

Els Limfòcits T col·laboradors són un subgrup de limfòcits que tenen un paper molt important en establir y maximitzar les capacitats de defensa del sistema immunitari. 11

Els Limfòcits T citotòxics neutralitzen les cèl·lules infectades por microorganismes intracel·lulars mitjançant un atac directe a les cèl·lules infectades, injectant enzims tòxics que provoquen la seva destrucció.

Page 22: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

19

A més a més, s’han dut a terme alguns experiments in vitro i in vivo amb llets

fermentades i amb diferents tipus de Lactobacils, on s’han demostrat

modificacions en alguns indicadors immunològics com per exemple en els

anticossos, en el interferó (proteïna produïda pel sistema immunitari

encarregada de respondre a agents externs com són els virus i cèl·lules

cancerígenes) i en l’activació de la fagocitosi12.

1.3.3.3 Reducció del colesterol

Un dels efectes probiòtics importants, que té una possible aplicació dins

l’àrea de la medicina i la nutrició, és la capacitat d’alguns bacteris làctics de

reduir el colesterol. Aquest compost afavoreix el desenvolupament d’àcids

biliars, d’hormones esteroides (tipus d’hormones que intervenen en el control

del metabolisme, la inflamació, funcions immunològiques, equilibris de sal i

aigua, desenvolupament corporal i tenen la capacitat de resistir a malalties i

lesions) i el trobem també en la membrana plasmàtica de les cèl·lules

eucariotes.

Tot i que el colesterol és essencial per la vida, un accés d’aquest afavoreix

malalties com l’arteriosclerosi (malaltia on es dipositen substàncies lipídiques

a les parets arterials, és a dir, greixos).

Encara es desconeix el mecanisme dels probiòtics per a reduir el colesterol

in vivo, segons estudis realitzats in vitro (en mètodes de cultiu), s’han

formulat una sèrie d’hipòtesis respecte aquest fenomen, com per exemple:

La producció de propionat13

L’assimilació del colesterol per el bacteri.

La degradació enzimàtica

12

Es denomina fagocitosi a l’acció de la cèl·lula en què rodeja amb la seva membrana citoplasmàtica un antigen, restes cel·lulars, microorganismes, etc. i l’introdueixen al interior cel·lular. 13

El propionat és una sal que evita que els microbis produeixin l’energia que necessiten.

Page 23: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

20

1.3.3.4 L’efecte gastro-protector

Una de les principals causes de la gastritis aguda, crònica i de la úlcera

pèptica14 és la presència del bacteri Helicobaterpylori. Quan aquest bacteri

entra en contacte amb la mucosa intestinal, aquesta desencadena una

reacció inflamatòria, la qual anomenem gastritis aguda. Aquesta inflamació

pot desenvolupar-se i donar lloc a una gastritis crònica, una acumulació de

limfòcits i altres cèl·lules del sistema immunitari. Aquesta infecció pot

evolucionar cap a malalties més greus com per exemple l’úlcera pèptica, el

càncer gàstric o limfoma15.

Posant un altre exemple d’alteració gastrointestinal, tot i no ser tant greu,

trobem la gastroenteritis, provocada per retrovirus16, que provoca diarrea,

vòmits i febre. El virus es transmet per aliments o aigua contaminats amb

matèria fecal.

S’aconsella el consum de probiòtics quan es pateixen alteracions digestives,

tant per la seva fàcil digestibilitat, pel seu efecte regulador de la flora

intestinal i pel seu efecte protector contra agents patògens. Dos exemples

d’aquests bacteris probiòtics, serien els Lactobacillusreuteri i els

Lactobacillusrhamnosus.

1.3.3.5 Prevenció del càncer de còlon

La mort per càncer de còlon és molt comú a occident, ja sigui per algun

factor genètic o per l’alimentació. Per exemple, quan cuinem la carn, la

convertim en amines heterocícliques17, i en la fermentació bacteriana de

proteïnes obtenim amines i amoníac, que és un toxicogènic18. Per a

contrarestar aquest efecte, alguns vegetals porten probiòtics que impedeixen

que es desenvolupi aquest tipus de càncer.

14

L’úlcera pèptica és un defecte del teixit de l’estómac o de la primera part de l’intestí prim. 15

El limfoma és un càncer a una part del sistema immunitari anomenada sistema limfàtic. 16

Els retrovirus són uns virusque el seu genoma en fase extracel·lular és d'ARN. Utilitza una transcriptasa inversa per transcriure el seu genoma d'ARN a ADN i poder integrar-lo en el genoma de l'hoste. El virus en si mateix és solament un recipient per emmagatzemar el seu ARN. 17

Quan un o més àtoms de nitrogen són components d’una estructura orgànica cíclica, la molècula es classifica com una amina heterocíclica. 18

Toxicogènic: que produeix substàncies tòxiques.

Page 24: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

21

1.3.3.6 Prevenció de reaccions al·lèrgiques

Una al·lèrgia és la resposta exagerada del sistema immunitari a una

substancia en particular. Els al·lèrgens alimentaris, com per exemple les

proteïnes de la llet de vaca, poden provocar una resposta inflamatòria a

l’intestí . És possible que els bacteris probiòtics puguin prevenir aquesta

disfunció, ja que hi ha una relació directe entre el teixit limfoide de l’intestí i la

resposta al·lèrgica. Els probiòtics actuen reduint la inflamació intestinal,

corregeixen la descompensació de limfòcits i estimulen les citoquines19.

Alguns lactobacils i altres bacteris utilitzats com a probiòtics, milloren el

processament dels antígens que arriben a les plaques de Peyer a través de

l’alimentació.

1.3.3.7 Inhibició d’agents patògens

La nostra flora intestinal ens protegeix de la possible entrada d’agents

patògens i normalment, són neutralitzats. Però un mal ús o un ús excessiu

d’antibiòtics pot fer-nos perdre aquesta flora i permetre que aquests agents

patògens que ingerim ens produeixin infeccions. Per altra banda, una

correcta ingesta de probiòtics pot prevenir la infecció per part d’un patogen,

ja que els probiòtics reforcen els bacteris intestinals.

Un exemple d’aquests probiòtics seria el Lactobacillusacidophilus, que fa

variar una mica el PH perquè els agents patògens morin i no puguin actuar.

Hi ha estudis (en podem trobar un exemple del científic Jeffrey Gordon a

l’Annex 1) sobre aliments probiòtics on els resultats demostren que ingerir

aquests bacteris de manera addicional té uns efectes mínims en l’organisme.

Per això, diferents experts en microbiologia defensen que és aviat per treure

conclusions sobre aquest tema i que s’ha d’aprofundir en la recerca.

19

Les citoquines són un tipus de molècules utilitzades en la comunicació cel·lular.

Page 25: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

22

1.3.4 Mecanismes d’acció

Els científics Isolauri (1998), Alander (1999), Isolauri (2001), Adelantado

(2006) i Collado l’any 2007 van investigar sobre el mecanisme d’acció dels

probiòtics i van arribar a aquests resultats:

Els probiòtics produeixen substàncies microbianes com per exemple

l’àcid làctic, peròxid d’hidrogen, diacetil20 i bacteriocines21. Aquests

compostos redueixen el nombre de cèl·lules patògenes vives, afecten al

metabolisme bacterià i a la producció de toxines.

Disminució del pH intestinal afavorint el creixement de microorganismes

beneficiosos.

Augment de la resistència a la colonització per a combatre contra els

patògens a l’hora de l’adhesió a l’epiteli intestinal.

Competició pels nutrients

Estimulació del sistema immunitari intestinal. Afavorint la producció de

IgA (immunoglobulina A) i activant els macròfags22.

20

Diacetil (anomenat sistemàticament butadiona) és un producte químic natural procedent de la fermentació. 21

Una bacteriocina és una toxina proteica sintetitzada per un bacteri amb el fi d’inhibir el creixement de bacteris similars o de soques properes. 22

Els macròfags són unes cèl·lules del sistema immunitari que es localitzen en els teixits procedents de la sang.

Page 26: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

23

1.4 Els aliments probiòtics comercialment disponibles

Actualment hi ha una gran varietat de productes probiòtics disponibles de cara

als consumidors. Aquests productes són: productes làctics, productes per a

nens i bebès, sucs, cereals, productes farmacèutics i aliments per a animals.

Diferents exemples serien: iogurts (Nestle, st. Ivel, Danone, Onken, Vifit), llets

fermentades (Yakult: amb el bacteriL. caseiShirota; Nestle’sLC1Go:amb el

bacteri L. johnsonii; LG21 iogurt: amb L. gasseriOLL2716), formatges probiòtics

(BioquesoIlolay Vita), entre d’altres. També ho són per exemple els làctics que

contenen Bifidobacteriumbifidum com en el cas d’Activia de Danone o el

Lactobacilluscaseid’Actimel, també de Danone. Així mateix en contenen les

marques blanques que comercialitzen aquests aliments, per exemple l’Actívitas

d’Eroski.

En alguns productes no només trobem microorganismes d’una sola espècie o

soca, sinó que podem trobar barreges d’aquests. Entre aquestes mescles

podem citar les soques de Lactobacillus i de Streptococcusque han estat

utilitzats com a bacteris fermentadors de la lactosa.

De fet, l’afegit de bacteris probiòtics per a la elaboració d’aquests aliments

funcionals, depèn per una banda, del sinergisme que s’ha d’establir entre

aquests cultius i els iniciadors de la fermentació. Per exemple, en el cas de

l’elaboració de iogurt primer creix Streptococcusthermophilusel qual allibera al

medi àcid fumàric. Això fa que pugui créixer millor el Lactobacillusbulgaricus.

Aquest, al seu torn, produeix uns aminoàcids favorables per S. Thermophilus,

és a dir, es complementen. A mida que hi va havent més concentració d’àcid

làctic augmenten les soques de L. Bulgaricus. Cal mencionar que un dels

requisit principal d’aquest tipus d’aliments funcionals és que els

microorganismes probiòtics segueixin viables i actius en l’aliment i durant el

transcurs gastrointestinal per a aportar el benefici dins l’hoste.

Dins dels factors extrínsecs més importants que afecten la viabilitat i la

supervivència de les cèl·lules hi trobem: (1) el PH, que son les condicions

d’acidesa derivades del procés de fermentació. (2) L’oxigen dissolt,

especialment per a les bifidobactèries (els lactobacils no necessiten massa

Page 27: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

24

presència d’oxigen) i (3) la pressió osmòtica23. Per les pràctiques d’inoculació24,

és important conèixer el moment adequat per a agregar el cultiu probiòtic; la

temperatura, la duració de la fermentació i les condicions d’emmagatzematge

del producte, entre d’altres.

Avui en dia, hi ha una gran diversitat de productes probiòtics al mercat. Tot i

això, els més acceptats són els derivats làctics, especialment el iogurt i les llets

fermentades, ja que són vehicles òptims per a aportar un gran nombre de

bacteris viables.

Dins d’aquestes, la llei actual diferencia entre dos tipus:

a) El iogurt, considerat com aquell que la seva fermentació es duu a terme

mitjançant la incorporació dels cultius iniciadors tradicionals

(Lactobacillusbulgaricus i Streptococcusthermophilus)

b) Les llets fermentades, que inclouen la resta de productes en què en la

seva elaboració intervenen altres cultius iniciadors (Bifidobacteriumspp.,

L. acidophilus, L. casei, etc.)

23

La pressió osmòtica és la pressió que s’ha d’aplicar en una dissolució per a aturar el flux del dissolvent en una membrana semipermeable. 24

Inoculació: introducció d’una substància en un organisme.

Page 28: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

25

1.4.1 El iogurt

El iogurt és un producte làctic,

obtingut mitjançant la fermentació

bacteriana de la llet. El gust àcid i

la textura s’aconsegueixen a partir

de la fermentació de la lactosa, el

sucre de la llet, que es transforma

en àcid làctic. Aquest àcid és el

responsable de la

desnaturalització25 de les

proteïnes de la llet fins a fer-les més assimilables. Això fa que el iogurt

presenti aquesta textura, aroma i gust característics

L’elaboració del iogurt requereix l’acció dels bacteris Lactobacillusbulgaricusi

Streptococcusthermophilus. El iogurt es pot aconseguir a partir de qualsevol

tipus de llet, com per exemple de vaca, de cabra o d’ovella; pot ser llet

totalment, parcialment desnatada o sencera i sota una temperatura i unes

condicions ambientals controlades.

L’elaboració industrial del iogurt comença a partir de la pasteurització26 de la

llet, posteriorment es manté a uns 40ºC i s’afegeix el cultiu de bacteris

(Lactobacillusbulgaricusi Streptococcusthermophilus).

Generalment, en un cultiu s’inclouen dos o més tipus de bacteris diferents per

a aconseguir una fermentació més completa, principalment

Streptococcusthermophilussubsp. salivarius, i membres del

gènereLactobacillus, tals com L. casei, L. bifidus i L. bulgaricus.

Per a molts països el iogurt com a tal només pot contenir S.

thermophilussubsp. salivarius i Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus; si

s’hi agreguen altres bacteris, algunes legislacions no permeten denominar-lo

iogurt.

25

La desnaturalització d’una proteïna es dóna quan aquesta cambia la seva estructura i per tant perd les seves propietats com a tal. 26

La pasteurització és un procés tèrmic que es du a terme amb líquids i que té com a objectiu eliminar els agents patògens que puguin contenir (bacteris, protozous, llevats, etc.).

Page 29: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

26

En acabada la fermentació del iogurt, aquest es pot escalfar fins al punt de

matar els bacteris o no fer-ho. Si el iogurt no s’escalfa fins a matar els bacteris

després de la fermentació, es ven sota la denominació de “cultiu actiu viu”,

que alguns consideren nutricionalment superior. Pel contrari, si s’han matat

els bacteris acabada la fermentació, a Espanya aquest aliment es ven sota

l’etiqueta de “iogurt pasteuritzat”.

1.4.2 Un tipus de llet fermentada: el kèfir

El kèfir és un producte làctic fermentat de qualsevol tipus de llet. És una

combinació de bacteris probiòtics i llevats en una matriu de proteïnes, lípids i

sucres. El bacteri que trobem més habitualment en el kèfir és el

Lactobacillusacidophilus i el llevat és el Sacchoramyceskefir(fong unicel·lular),

tot i que varien segons les regions i cultures.

Existeixen tres tipus de kèfir: el de llet, el d’aigua i el de te (també anomenat

“kombucha”).

La classe més extensa és el kèfir de llet, que té una certa semblança al iogurt,

tot i que la fabricació del iogurt és molt més senzilla i rentable. No obstant

això, cada vegada hi ha més empreses que es dediquen a la seva

comercialització.

En realitat, el kèfir d’aigua i el de llet són el mateix tipus de kèfir, amb la

mateixa microflora, però adaptats a medis diferents.

Actualment, l’elaboració de kèfir es troba relativament difosa a nivell domèstic,

mitjançant persones que regalen els excedents del fong a altres, ja que

aquest creix progressivament.

La preparació del kèfir consisteix en introduir a un pot llet juntament amb el

kèfir, es tapa i es deixa a temperatura ambient durant un dia i mig

aproximadament (de 24 a 36 hores). Transcorregut aquest temps es cola el

líquid resultant i es torna a repetir el procés.

El líquid que se n’obté és una beguda alcohòlica de menys d’un 1% de volum,

carbonatada, de textura similar a la del iogurt tot i que més suau i amb un gust

lleugerament més àcid.

Page 30: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

27

La major part de les vegades el producte que es comercialitza com a kèfir no

té ni alcohol ni gas carbònic, i en realitat és més pròpiament un iogurt. La llet

kefiradatambé es pot utilitzar per fer formatges.

El kèfir d’aigua es produeix a partir d’aigua amb sucre, fruites deshidratades o

fruits secs i suc de llimona.

Tradicionalment, el kèfir ha passat d’unes mans a unes altres de forma

gratuïta. Com que aquest creix a una velocitat considerable, ens veiem

obligats a desfer-nos d’una part cada cert temps, ja que si no, la llet agafaria

un sabor massa àcid (com més kèfir hi hagi al pot, abans es farà la llet

kefirada).

El kèfir té una sèrie de propietats:

Regenera la flora intestinal

Facilita la digestió

Elimina problemes de restrenyiment.

Regenera la mucosa del’estómac

S’utilitza per a tractar problemes cutanis com els èczemes27.

Imatge 7. Kèfir Imatge 8. llet kefirada

27

Els èczemes són un grup de malalties en què existeix una inflamació de la pell.

Page 31: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

28

2. OBJECTIUS

Les hipòtesis que he volgut confirmar o desmentir són les següents:

(1) Comprovar si es troben lactobacils vius en els probiòtics estudiats

Els aliments probiòtics que he estudiat en aquest objectiu són tres: l’Actimel

de Danonel’Actívitasd’Eroski i el iogurt natural de Danone. Per tant tenim

dos tipus de productes: dues llets fermentades i un iogurt.

En tots dos tipus de productes els microorganismes han d’estar vius en el

seu interior, ja que si no ho estiguessin perdrien la seva classificació com a

aliments probiòtics.

(2) Comparar la qualitat probiòtica entre marques blanques i marques

comercials

Com sabem, les marques comercials tenen un preu més elevat que les

marques blanques. He escollit Actimel com a exemple de marca comercial i

Actívitas com a exemple d’una marca blanca.

Una forma de comprovar això és comptant el nombre de lactobacils que hi

ha en cada una de les marques.

(3) Veure les característiques nutricionals dels productes a partir de les dades

del seu etiquetatge i comparar-los.

(4) Valorar si la publicitat és enganyosa o equívoca en alguns productes

probiòtics

(5) Comprovar si el servei d’atenció al client proporciona els estudis que

pretesament avalen la qualitat del producte

Page 32: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

29

3. MÈTODES

3.1. Treball al laboratori

El treball de laboratori el vaig dur a terme en tres productes probiòtics

diferents: el iogurt (de Danone) i dos preparats de llet fermentada (Actimel de

Danone i Actívitas d’Eroski).

Per tal de comprovar els dos primers objectius vaig utilitzar tècniques de

microbiologia i anàlisi d’aliments .

3.1.1. El material

El primer pas per a qualsevol activitat a un laboratori és la preparació del

material necessari. En el meu cas, vaig necessitar:

- Tubs d’assaig

- Pipetes graduades

- Espàtula de Digralsky

- Portaobjectes

- Cobreobjectes

- Gradetes

- Nansa de Kolle

- Bec d’alcohol

- Un microscopi òptic amb objectiu d’immersió (100 x)

- Oli d’immersió

- Refrigerador comercial

- Estufa de cultiu precisa amb la capacitat de ser estabilitzada a una

temperatura de 37ºC

- Regle

- Retolador permanent

- Blau de metilè

Page 33: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

30

3.1.2. Esterilització

Una vegada vaig seleccionar el material que necessari, havia d’assegurar-me

que estigués en l’estat adequat per al seu ús. Abans de començar l’havia

d’esterilitzar per tal que no contaminés la mostra. En aquest cas, com que no

disposava de les condicions i el material necessaris per a dur a terme una

pràctica totalment estèril, només vaig poder esterilitzar una part del material.

Vaig utilitzar un mètode anomenat flamejat, que consisteix en escalfar

directament a la flama els estris utilitzats. Això ho vaig emprar pels tubs

d’assaig i les nanses de Digralski. Tot i que no vaig esterilitzar les pipetes, en

vaig agafar una de nova cada vegada que va ser necessari.

Les plaques de Petri ja estaven esterilitzades, ja que me les va facilitar de

manera gratuïta el departament de microbiologia de la Universitat Autònoma

de Barcelona. Em van poder facilitar 10 plaques de Petri, amb el medi selectiu

MRS. Les vaig guardar a la nevera del laboratori de l’institut fins que va arribar

el moment de fer-les servir.

El fet que me’n facilitessin 10 va condicionar el número de plaques que

posteriorment vaig utilitzar per a l’estudi de cada producte.

3.1.3 Tècniques microbiològiques i anàlisi d’aliments

Les tècniques utilitzades en aquesta pràctica consisteixen en sembrar els

microorganismes i aïllar-los en un medi selectiu, per tal de poder fer el

recompte de viables. És a dir, només comptar els lactobacils que han crescut

en el medi, els que estan vius.

3.1.3.1 El medi de cultiu

Els medis de cultiu utilitzats han de satisfer tots els requeriments nutritius

dels microorganismes que s’estudien. Porten bàsicament oxigen, hidrogen,

carboni, nitrogen, fòsfor i sofre en major quantitat i ferro, magnesi, etc. en

menor quantitat.

Tots els medis han de contenir fonts d’energia (carboni, nitrogen, etc.), és a

dir, cobrir les necessitats energètiques.

Page 34: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

31

El medi de cultiu pot ser líquid (aleshores parlem de caldo) o bé estar

solidificat amb agar28.

El medi que vaig utilitzar és un medi selectiu. Aquesta classe de medi

s’utilitza per a aïllar uns tipus determinats de bacteris. Contenen

substàncies que afavoreixen el desenvolupament del microorganisme que

es vol aïllar i altres que inhibeixen el creixement dels restants.

En aquesta pràctica vaig emprar el medi selectiu MRS agar. Aquest medi

va ser desenvolupat pels científics Man, Rogosa i Sharpe per a proveir un

medi que on fos evident el bon creixement de lactobacils.

Segons l’objectiu de la pràctica calia aïllar els lactobacils del iogurt i les llets

fermentades, ja que són els bacteris probiòtics que contenen. Tant en un

producte com en l’altre hi trobem una altra classe de bacteris

(Streptococcus), que si bé són indispensables per la fermentació i

l’establiment dels lactobacils, els estreptococs no són probiòtics i per tant

no ens interessa que creixin en el medi, ja que el seu creixement impediria

la correcta diferenciació i comptatge dels lactobacils.

D’altra banda, el material utilitzat no ha estat prèviament esterilitzat amb

totalitat. Per tant, la probabilitat que el medi es contaminés per bacteris o

fongs no desitjats seria molt elevada. Això es soluciona utilitzant el medi

selectiu.

Aquests medis permeten un abundant desenvolupament de totes les

espècies de lactobacils. La peptona29 i la glucosa constitueixen la font de

nitrogen, carboni i d’altres elements necessaris per al creixement bacterià.

El monooleat de sorbitan30, magnesi, manganès i acetat31, aporten

cofactors32 i poden inhibir el desenvolupament d’alguns microorganismes.

28

L’agar es un polisacàrid sense ramificacions obtingut de la paret cel·lular de vàries espècies d’algues. 29

La peptona és una barreja complexa de productes de la hidròlisi de la carn, obtinguda per acció de diversos ferments, especialment la pepsina i la pancreatina. 30

El monooleat de sorbitan és un emulsificant molt utilitzat en ceres, olis minerals i grasses. 31

L’acetat és l’éster (o sal) de l’àcid acètic. 32

Els cofactors són components no proteics, de temperatura estable i de baix pes molecular, necessaris per a l’acció d’un enzim.

Page 35: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

32

El citrat d’amoni[(NH4)2HC6H5O] actua com a agent inhibidor del creixement

de bacteris Gram negatius33.

Les instruccions i els elements necessaris per a obtenir el medi MRS són

els següents:

Elements:

Taula. 4 (Pràctiques de microbiologia)

33

En microbiologia els bacteris són denominats gram negatius quan a causa de la seva estructura es tenyeixen de color rosat per la tinció de Gram. 34

La proteosa peptona és un hidrolitzat d’alta qualitat produïda per la digestió enzimàtica dels teixits animals.

Fórmula (en g/l)

Proteosa peptona Nº 334 10.0

Extracte de carn 8.0

Extracte de llevat 4.0

Glucosa 20.0

Monooleat de sorbitan 1 ml

Fosfat dipotàssic 2.0

Acetat de sodi 5.0

Citrat d’amoni 2.0

Sulfat de magnesi 0.2

Sulfat de manganès 0.05

Agar 13.0

Page 36: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

33

Procediment de preparació del medi:

1. Afegir 64 g de medi en un litre

d’aigua destil·lada.

2. Deixar-ho reposar durant 5

minuts

3. Barrejar-ho escalfant-ho utilitzant

l’ebullició durant 1 o 2 minuts.

4. Esterilitzar-ho utilitzant l’autoclau35 durant 15 minuts a 121ºC.

El color que té el medi preparat és groc, i s’ha de conservar a una

temperatura de 2 a 8ºC.

3.1.3.2 La sembra dels microorganismes

La sembra de microorganismes és l’operació que consisteix en dipositar un

bacteri en un medi de cultiu. La cura de la manipulació és absolutament

imprescindible per mantenir els cultius purs. Existeixen diferents tècniques

de cultiu en la microbiologia actual.

Vaig utilitzar la sembra sobre un medi sòlid, la qual s’utilitza per a realitzar

recomptes, fer proves bioquímiques, etc. Dins aquest tipus vaig utilitzar

l’anomenada sembra en placa, en la qual és important només destapar la

placa l’espai necessari per a introduir-hi la nansa per així evitar

contaminacions.

Vaig esterilitzar la nansa prèviament al roig viu amb el bec d’alcohol. La vaig

deixar refredar i la vaig carregar amb els microorganismes per a sembrar-los

a la placa de Petri.

35

L’autoclau és un recipient metàl·lic de parets gruixudes amb un tancament hermètic que

permet treballar a altra pressió.

Page 37: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

34

La placa pot ser sembrada de diferents formes, les que vaig utilitzar són les

següents:

Per estria en ziga-zaga: Es passa la nansa suaument sobre

l’agar, fent un moviment en ziga-zaga que recorri tota la placa,

fins a esgotar el contingut de la nansa.

Per estria obliqua: Es fan varies línies paral·leles o en ziga-zaga i

s’esterilitza la nansa. Es gira la placa un cert angle i, sense

“carregar” la nansa, es fan varies línies més trepitjant les

anteriors. Es repeteix el procés fins a completar la placa.

Page 38: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

35

3.1.3.4 Mètodes d’aïllament de microorganismes

L’aïllament de microorganismes consisteix en la separació de dos o més

bacteris que es troben junts en una determinada mostra amb l’objectiu

d’aconseguir colònies36 separades, mitjançant les tècniques explicades en

l’apartat anterior.

Per a aïllar microorganismes es poden utilitzar diversos procediments. A

continuació explico quin vaig utilitzar en aquest estudi.

Aïllament per dilució

S’efectuen una sèrie de dissolucions de la mostra original. Es

necessiten diversos tubs amb 9 ml de sèrum fisiològic37 i es traspassa

d’un tub al següent sempre 1 ml de la solució anterior, per la qual cosa

es dissol a la desena part.

El nombre de dissolucions que es realitzin dependrà de la concentració

inicial.

36

Colònies: conjunt de bacteris (de la mateixa espècie) que s’han desenvolupat a partir d’un de sol (unitat formadora de colònies). 37

El sèrum fisiològic és un líquid que impedeix tant la mort de les cèl·lules com la seva reproducció.

Page 39: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

36

Acabat aquest procés, es sembra la solució resultant per estria en una

placa.

3.1.3.4 Recompte de microorganismes

Les tècniques que vaig utilitzar per fer el recompte de microorganismes van

ser dues: (1) el recompte viable, amb el qual es compta el nombre de

microorganismes que poden desenvolupar-se en un determinat medi de

cultiu formant colònies visibles, i (2) el recompte directe, amb el qual es

compta el nombre de cèl·lules o agrupacions d’aquestes que es poden

observar dins la mostra a través d’un microscopi. En aquest cas seran els

microorganismes totals (viables i morts).

1. El recompte viable, mitjançant la tècnica de dissolucions successives.

Es dissol el producte successivament en sèrum fisiològic. De l’última

dissolució realitzada es sembren 0.1 ml a la placa distribuint-los amb

l’ajuda de la nansa de Digralsky. Es col·loquen les plaques a incubar a la

temperatura òptima (37ºC en el medi MRS agar) i una vegada

transcorregut el temps necessari (72 hores) es fa un recompte de les

colònies.

Per a obtenir el nombre inicial de bacteris, s’ha de multiplicar el nombre

de colònies per la inversa de la dissolució i per 10 (ja que s’han col·locat

0.1 ml a les plaques). Els resultats s’expressen en unitats formadores de

colònies per mil·lilitre (cfu/ml).

Page 40: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

37

Les dissolucions que vaig fer en el cas de l’Actimeles poden apreciar en la

imatge següent:

Tres de les deu plaques que la UAB em va facilitar les vaig utilitzar per a

dur a terme la sembra dels lactobacils de l’Actimel. En una gradeta vaig

col·locar nou tubs d’assaig (ja que vaig repetir el procés 3 vegades). Per a

cada cultiu que es vulgui fer necessitem tres tubs d’assaig, ja que hem de

fer una sèrie de dissolucions abans de fer la sembra (si no seria

impossible el recompte de les UFC).

Els passos que calia seguir abans de sembrar els bacteris d’Actimelsón

els següents:

1. Omplir el primer i el segon tub d’assaig amb 9.9 ml de sèrum

fisiològic, el tercer omplir-lo fins a 9 ml.

2. Agafar 0.1 ml de la mostra inicial (directament de l’envàs de

d’Actimel) i afegir-los al primer tub d’assaig. Per tant, ara tindríem 10 ml

de solució en aquest tub. Conseqüentment barrejar suaument la solució.

3. Agafar 0.1 ml del tub d’assaig anterior i col·locar-los al següent

tub d’assaig, obtenint 10 ml en el segon tub.

4. Agafar 1 ml del segon tub i afegir aquest volum al tercer tub,

obtenint, també, 10 ml també en aquest tub.

5. A partir de la dissolució de l’últim tub fer el cultiu a la placa de

Petri. És a dir, agafar 0.1 ml d’aquest tub i els repartir-los a la placa, sobre

el medi MRS agar, amb l’espàtula de Digralsky per estria en ziga-zaga.

Page 41: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

38

Vaig fer-ne tres rèpliques per tal d’observar si s’obtenia el mateix resultat.

Quan havia repetit el procés tres vegades (una vegada per a cada placa)

vaig introduir les plaques cultivades al forn laboratori a una temperatura

de 37ºC durant 72 hores.

Les dissolucions en el cas d’Actívitas les trobem en l’esquema següent:

Tres plaques més amb medi MRS van ser emprades per al cultiu dels

bacteris d’Actívitas. Repetint el procés utilitzat per a la sembra d’Actimel,

vaig utilitzar una altra gradeta i nou tubs d’assaig més (tres per a cada

placa). El mètode de cultiu fou el mateix, amb les mateixes dissolucions,

com es veu en l’esquema anterior.

Page 42: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

39

Les dissolucions que vaig fer abans de cultivar els bacteris del iogurt són

les següents:

Com es veu en l’esquema anterior, novament es repeteix la mateixa sèrie

de dissolucions. Aquesta vegada només vaig utilitzar dues plaques per als

cultius del iogurt. La placa restant (recordem que en teníem 10) estava

contaminada, ja que hi va créixer un fong mentre estava a la nevera a

l’espera de ser utilitzada (imatge. 6 de l’annex). Segurament quan me la

van donar ja estava contaminada, ja que en les altres plaques, al cap

d’uns dies d’estar a la nevera, no hi havia crescut res.

La placa restant va ser utilitzada com a control. També va ser introduïda

amb les altres plaques al forn a 37ºC durant 72 h, però sense sembrar-hi

res. D’aquesta manera es veuria si les plaques estaven realment

esterilitzades.

Aquesta pràctica va ser realitzada el dilluns 20 de juny de 2011.

Vaig marcar cada placa amb un símbol o lletra per saber de quina

substància es tractava.

Page 43: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

40

2. El recompte directe o total (mètode de Breed)

L’altra tècnica utilitzada en aquest estudi per a comptar el nombre de

microorganismes que hi ha en un medi determinat és la següent :

Vaig dibuixar en un portaobjectes un quadrat d’1 cm per costat de manera

que ens queda una superfície delimitada d’1 cm2.

Amb una pipeta vaig agafar una mostra, prèviament dissolta, de 0.01 ml i

la vaig escampar sobre el quadre dibuixat. Vaig assecar-la, fixar-la per

calor i la vaig cobrir amb blau de metilè. La vaig deixar reposar durant 10

minuts i després vaig rentar-la amb aigua, la vaig assecar i hi vaig posar

una gota d’oli d’immersió per tal de poder-la observar a 1000 augments.

A continuació havia de comptar el nombre de microorganismes en varis

camps de visió38 (el nombre dels quals és variable, segons els bacteris

que es compten en el 1r camp, veure taula 4). Primer vaig calcular la mitja

de bacteris per camp. Després, considerant que en 1000 augments el

diàmetre del camp del microscopi es de 0,2 mm (0,02 cm de diàmetre) i

sabent que el camp del microscopi té una àrea = π · r 2 , substituint i fent

les operacions em va donar que cada camp del microscopi té una àrea de

0,000314 cm2.

Per determinar el Nº de camps del microscopi que hi ha en la preparació:

1 cm2 / 0,000314 cm2 = Nº de camps

Nº de camps = 3184,7

38

Els camps de visió en un microscopi és l’espai que veiem sense moure la l’objectiu o el portaobjectes.

Page 44: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

41

Per trobar el Nº de bacteris per cultiu:

Mitjana de Nº de bacteris/camp · Nº de camps del microscopi =

Nº de bacteris en la preparació

Nº de bacteris en la preparació · 100 = Nº de bacteris / ml de producte

Es multiplica per 100 pels 0,01 ml de la mostra que es va posar al cm2

El nombre de camps que s’han de comptar dependrà dels bacteris que es

compten en el primer camp, per exemple si en el primer camp es compten

8 Lactobacils s’han de comptar 16 camps i fer la mitjana de tots ells.

Nº de bacteris/camp Nº de camps que s’han de

comptar

0-3 64

4-6 32

7-12 16

13-25 8

26-50 4

51-100 2

>100 1

Taula. 5 (Pràctiques de microbiologia)

Page 45: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

42

3.1.2.5 Observació de microorganismes

Quan observem un microorganisme pel microscopi sovint apareix sense

color i és difícil d’apreciar-ne la forma, la grandària i, a vegades, la manera

com s’agrupen entre ells. És per això que en microbiologia s’utilitzen les

tincions per a poder concretar les característiques dels microorganismes i

fer-ne visibles les estructures.

La denominada tinció simple més utilitzada és la tinció amb blau de metilè,

amb la qual podem observar ràpidament la forma, la mida i l’agrupació dels

bacteris més corrents. Els passos per a seguir aquest procés correctament

son els següents:

1. Preparar un frotis39 i fixar-lo al portaobjectes amb la flama.

2. Tenyir-la amb blau de metilè durant

10-20 segons.

3. Aclarir-ho amb aigua.

4. Eixugar la mostra.

5. Afegir oli d’immersió i observar a 1000

augments Imatge 18. Dibuix d’un frotis

39

Un frotis és una tècnica científica en què s’escampa una gota d’alguna substància sobre el portaobjectes o el cobreobjectes amb el fi d’analitzar-la posteriorment.

Page 46: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

43

3.2 Treball als punts de venta

Per a assolir l’objectiu 2.3 vaig extreure informació a partir de l’etiquetatge

que porten els productes en el seu envàs.

Per això, vaig desplaçar-me a un supermercat Eroskii vaig observar la

secció dels làctics i postres. Per a distribuir la informació i ordenar-la, vaig

utilitzar una taula com la representada a continuació (taula 6).

Nom

comercial

Fabricant Probiòtic Quantitat Preu/unitat És anunciat a

la TV?

Actimel Danone

Actívitas Eroski

Iogurt Danone

Iogurt Eroski

Bio Danone

Bio Eroski

Taula 6.

Aquesta part del treball permetrà valorar, també, la diferència de preu i de

publicitat entre els diferents productes, sempre tenint en compte que estem

parlant d’una marca comercial i d’una marca blanca.

Per a assolir aquest objectiu, també vaig comparar les informacions

completes que ens donaven els productors en els envasos d’un mateix

producte però de diferent marca: l’Actimel i l’Actívitas.

Page 47: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

44

3.3 Consulta de la publicitat a Internet

Vaig cercar a Internet alguns anuncis sobre els làctics probiòtics.

Concretament considerarem la publicitat que s’ha fet i es fa sobre

Actimel de Danone.

3.4 Consultes telefòniques

Vaig trucar al servei d’atenció al client d’Actimel i d’Actívitas i es va

demanar informació sobre els diferents estudis efectuats sobre aquests

dos productes, ja que, suposadament, avalen la seva qualitat.

Page 48: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

45

4. RESULTATS

4.1 Descripció dels cultius de les plaques

A les plaques on havia cultivat els bacteris de l’Actimeli l’Actívitas hi havia

una sèrie de punts blancs. A la zona on hi havia més solució concentrada,

aquests punts eren més abundants i estaven més junts i a mesura que

l’havia escampat anaven disminuint.

Aquests punts blancs dels quals parlem són les colònies de bacteris que

s’han desenvolupat a partir d’una unitat formadora de colònies (UFC), és a

dir, un bacteri que es va col·locar en aquell punt i a partir d’aquí es va anar

reproduint fins a formar una colònia.

Com que els bacteris són uns éssers que es reprodueixen molt ràpidament i

a més, les seves condicions de vida a la placa van estar molt bones a causa

de trobar-se en el medi MRS agar i a una temperatura òptima, durant les

últimes 72 hores vaig obtenir els resultats següents, observables a les

fotografies que trobem a continuació.

Imatge 19. Resultats de les plaques emprades per l’Actimel. El color blanquinós

correspon a les colònies de Lactobacils que han estat seleccionats pel medi.

Page 49: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

46

Imatge 20. Resultats de les plaques pel que fa als bacteris de l’Actívitas. El color

blanquinós correspon a les colònies de Lactobacils.

Pel què fa les dues plaques on vaig sembrar els bacteris del iogurt, no hi

havia crescut res. Tampoc va créixer res a la placa de control.

Imatge 21. Resultats de la placa de control.

Imatge 22. Resultats de les plaques on havíem

sembrat els bacteris del iogurt

Page 50: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

47

Morfologia de les colònies:

Les colònies que havien crescut a les plaques de l’Actimel i de l’Actívitas

tenien les mateixes característiques: forma rodona, d’un blanc intens una

mica brillant. Aquestes colònies corresponen a les dels lactobacils,

per tant, sabem que hi havia lactobacils vius.

4.1.1 Observació de les colònies al microscopi

A l’observar les colònies al microscopi es poden distingir els bacteris

que les formen, en aquest cas els lactobacils. Els lactobacils tenen

forma de bastonet, com els assenyalats per les fletxes en la fotografia

següent (imatge 23):

Imatge 23. Fotografia de la observació de les colònies de lactobacils al

microscopi òptic a 1000 augments. Realitzada amb el programa

Mòticplus del laboratori de l’institut.

Page 51: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

48

4.2 Recompte de microorganismes

4.2.1. Recompte de viables

o Pel que fa al nombre de viables de l’Actimel:

En dues de les plaques vaig comptar gairebé aproximadament 700

colònies, en l’altre 900.

De manera que si fem el càlcul per a cada una d’elles:

Placa 1 700/ (0,0001· 0,1) = 7·108 cfu/ml

Placa 2 700/ (0,0001· 0,1) = 7·108cfu/ml

Placa 3 900/ (0,0001· 0,1) = 9·108cfu/ml

La mitjana dels tres resultats és: 7.7·108cfu/ml

o Respecte al nombre de viables de l’Actívitas:

En un placa vaig comptar aproximadament 600 colònies, en una altra

800 i en una tercera 900, de manera que:

Placa 1 600/ (0,0001· 0,1) = 6·108cfu/ml

Placa 2 800/ (0,0001· 0,1) = 8·108cfu/ml

Placa 3 900/ (0,0001· 0,1) = 9·108cfu/ml

La mitjana dels tres resultats és: 7.7·108cfu/ml

Veiem que totes dues mitjanes són de l’ordre de 108 i per tant, tenint en

compte el marge d’error que hi pugui haver en aquest recompte, el

nombre de bacteris entre un producte i l’altre són molt semblants (uns 100

milions de bacteris per mil·lilitre).

Page 52: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

49

En el gràfic següent apreciem els resultats del recompte de viables de

totes les plaques:

Gràfic 1. Nombre de CFU per a cada placa, on la variable dependent (y)= Nº

Lactobacils/ml i la variable independent (x)= tipus de producte làctic.

En el gràfic següent podem veure la mitjana d’unitats formadores de

colònies de les tres plaques per cada producte:

Gràfic 2. Mitjana de CFU de cada producte, on (y)= Nº Lactobacils/ml i (x)=tipus de

producte làctic.

Page 53: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

50

4.2.2. Recompte directe o total (mètode de Breeds)

Els resultats del recompte directe de l’Actimelvan ser els següents:

En el primer camp vaig comptar 8 lactobacils, per tant, el total de camps

que havia d’observar van ser 16:

Camp Nº Nombre de

Lactobacils

Camp Nº Nombre de

Lactobacils

1 8 9 5

2 7 10 4

3 5 11 3

4 2 12 8

5 8 13 7

6 7 14 6

7 8 15 4

8 9 16 6

Taula 7.

La mitjana d’aquests resultats és: 6.06 Lactobacils/camp

En aplicar els passos explicats en el mètode el resultat és:

Page 54: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

51

Imatge 24. Fotografia feta amb el programa Mòticplus del microscopi òptic del laboratori de

l’institut a 100 augments, on s’observen els microorganismes de l’Actimel.

Els resultats del recompte directe de l’Actívitasvan ser els següents:

En el primer camp vaig comptar 7 Lactobacils, per la qual cosa, vaig haver

de comptar els lactobacils de 16 camps:

Camp Nº Nombre de

Lactobacils

Camp Nº Nombre de

Lactobacils

1 7 9 9

2 4 10 5

3 3 11 3

4 3 12 8

5 3 13 6

6 13 14 10

7 18 15 2

8 10 16 4

Taula 8.

Lactobacil

Estreptococs

Page 55: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

52

La mitjana d’aquests resultats és: 6.75 Lactobacils/camp

En aplicar els passos explicats en el mètode el resultat és:

Imatge 25.Fotografia feta amb el programa Mòticplus del microscopi òptic del laboratori de

l’institut a 100 augments, on s’observen els microorganismes de l’Actívitas.

Lactobacil

Estreptococs

Page 56: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

53

Els resultats del recompte directe del iogurt van ser els següents:

En el primer camp vaig comptar 4 Lactobacils, és a dir, vaig haver de

comptar els lactobacils de 32 camps:

Camp Nº Nombre de

Lactobacils

Camp Nº Nombre de

Lactobacils

1 5 17 0

2 1 18 3

3 1 19 2

4 0 20 2

5 0 21 1

6 0 22 2

7 2 23 4

8 0 24 5

9 0 25 2

10 0 26 3

11 2 27 0

12 4 28 2

13 5 29 0

14 1 30 1

15 3 31 0

16 0 32 0

Taula 9.

La mitjana d’aquests resultats és: 1.59 Lactobacils/camp

En aplicar els passos explicats en el mètode el resultat és:

Page 57: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

54

Imatge 26. Fotografia feta amb el microscopi òptic de l’institut amb el programa Mòticplus,

on s’observen els microorganismes del iogurt.

En el gràfic següent apreciem la mitjana dels resultats del recompte directe

dels tres productes probiòtics:

Gràfic 3 . Mitjana dels resultats del recompte directe, on la variable dependent (y)= Nº

Lactobacils/ml i la variable independent (x)= tipus de producte làctic.

Lactobacil

Estreptococs

Page 58: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

55

4.3 Informació que trobem en els envasos

o Informació de l’envàs de l’Actimel

Si observem la part superior, veiem que és la cara més gran del cartró

amb diferència. El que ocupa més espai és el logotip d’Actimelde

Danone, col·locat al centre i bastant gran en comparació amb la resta

d’elements de la cara. A la part superior a la dreta es troba la quantitat

de producte (566.4 ml o 600 g, 94.4 ml multiplicat per 6), la data de

caducitat i la frase “Agitar antes de abrir” escrit amb una lletra més

petita que l’anterior. A la part inferior dreta es troba el logotip de

“Barcelona worldrace”. A la part superior esquerra hi ha les calories per

a cada unitat de 100 g (71 kcal, 4%) i amb lletra petita una descripció

breu del producte: “Leche fermentada azucarada para beber”. En la

part inferior dreta s’observa amb uns colors vistosos i amb lletra

majúscula i gran: “nueva fórmula con su sabor de siempre”.

Seguidament l’explicació d’aquesta nova fórmula: “En su 15

aniversario, Actimel te presenta sunueva fórmula. Ahoraademás de

suexclusivoL.Casei, incorpora las vitaminas E y B6. Se ha demostrado

que la vitamina B6 contribuye al normal funcionamiento del sistema

inmunitario”. Al costat hi ha el logotip de l’Institut Pasteur40.

Imatge 27.Cara superior de l’envàs de l’Actimelde sis unitats

40

L’entitat Institut Pasteur és una fundació francesa sense ànim de lucre la qual es dedica a

contribuir en la prevenció i el tractament de les malalties infeccioses a través de la investigació, l’ensenyament i accions de la salut pública. L’empresa Danone i aquesta entitat col·laboren juntes en una investigació del sistema immunitari.

Page 59: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

56

En una de les parts laterals hi ha exactament la informació de la nova

fórmula, però ara en una mida més petita. Tenint en compte la

diferència de la dimensió de les dues cares, en aquest cas es destaca

amb una lletra molt més gran en comparació de la resta que ajuda al

sistema immunitari.

Imatge 28. Una de les cares laterals de l’envàs de l’Actimel

Si ens fixem ara en l’altra cara lateral es llegeixen, a la dreta, els

ingredients: “Leche desnatada rehidratada pasteurizada,

lecheparcialmente desnatada pasteurizada, azúcar (7.3%), glucosa,

fermentoslácticos (fermentos del yoghourt yLactobacilluscaseiDN-

114001exclusivo de Danone) y vitaminas (E y B6)”; també hi ha, a la

part superior, la direcció: “Danone S.A. Buenos Aires, 21 Barcelona” i

que el producte és sense gluten.

Taula 10.

Composició Nutricional Per a cada unitat de 100g

% Quantitat diaria orientativa per a un adult en cada unitat de 100g

Valor energètic (kcal/kJ) 71/301 4

Proteïnes (g) 2.8 6

Hidrats de carboni (g) dels quals sucres (g)

10.5 10.5

4 12

Grasses (g) de les quals saturades (g)

1.6 1.1

2 5

Fibra alimentària 0 0

Sodi (g) 0.04 2

Per a cada unitat de 100g

% cuantitatdiariarecomenada per la C.E. per cada unitat de 100g

Vitamina E (mg) 1.8 15

Vitamina B6 (mg) 0.2 15

Page 60: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

57

A la part esquerra hi ha el codi de barres del producte i seguidament la

composició nutricional:

Imatge 29. Una de les cares laterals de l’envàs de l’Actimel

Pel que fa a la cara inferior de l’envàs, només s’hi troba el telèfon

d’atenció al client (902 180 957), la pàgina web de Danone

(www.danone.es) i una recomanació sota el logotip de Danone:

“Danone recomienda una dieta variada y equilibrada y un estilo de vida

saludable”

o Informació de l’envàs d’Actívitas

Al centre de la cara superior hi ha un dibuix d’una ampolleta del

producte i a sobre el logotip del supermercat Eroski. A la part inferior

dreta la quantitat (600g, 6 multiplicat per 100g) i a la part superior

esquerra la data de caducitat i la informació de què és un producte

natural amb sucre (en quatre idiomes diferents).

Imatge 30.Cara superior de l’envàs de l’Actívitas de 6 unitats

Page 61: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

58

En aquest producte les dues cares més grans de l’envàs són les

laterals. En una s’hi troba altra vegada el mateix dibuix però a més a

més hi ha el contingut d’una unitat de 100g:

Taula 11.

Imatge 31. Una de les cares laterals de l’envàs de l’Actívitas

En l’altra cara lateral hi ha consells per a una vida més sana, de part de

la cadena Eroski, a la part superior: “La

alimentacióninfluyeconsiderablemente en el bienestar personal. Te

invitamos a seguir estos sencillosconsejos para una vida sana y una

alimentación equilibrada: haz 5 comidas al día, empezando con un

desayuno completo; come de todo te asegurarás una alimentación

equilibrada; consume al menos 5 raciones de frutas y verduras al día;

aumenta el consumo de alimentos con fibra; reduce el consumo de

Calories Sucre Grassa grassa

saturada

Sal

75 10.9g 1.4g 0.9g 0.1g

4% 12% 2% 5% 2%

De la Quantitat Diària Orientativa (CDO) per a un adult

Page 62: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

59

grasassaturadas; modera la ingesta de sal y azúcar; bebe entre 1.5 y 2

litros de agua al día; mantentefísicamente activo”.

Al centre hi trobem una explicació del producte en quatre idiomes: “A

més dels bacteris propis del iogurt, EROSKI Actívitas conté milions de

Lactobacilluscasei que tenen efectes probiòtics en l’organisme. El

Lactobacilluscasei contribueix a reforçar-te les defenses naturals.

Prendre una ampolla d’ACTIVITAS cada dia ajuda les teves defenses.

Amb ACTIVITAS, activa’t el cos!” i informació necessària per al seu

consum i conserva: Ingredients: “llet parcialment desnatada, sucre

(9%), aroma, colorant (E150d), ferments làctics (amb L.casei)”;

Conservació: “conservar-se en fred, entre 1ºC i 8ºC; sacsejar abans

d’obrir”. A més inclou informació per a consumidors al·lèrgics: “Conté

llet i pot contenir trossos de gluten”.

A la part inferior d’aquesta cara hi ha l’explicació del sistema que té

Eroski per a informar-nos dels components del seu producte i on ens

explica què és la “CantidadDiaria Orientativa (CDO)”. Per últim, a la

dreta inferior tenim la informació nutricional:

Taula 12.

Valors mitjos per 100g (una unitat)

Valor energètic 75 kcal (315 kJ)

Proteïnes 2.8 g

Hidrats de carboni

Dels quals sucres

12.7 g

10.9 g

Grasses

De les quals saturades

1.4 g

0.9 g

Fibra alimentaria 0 g

Sodi 0.04 g

Page 63: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

60

Imatge 32. Una de les cares laterals de l’envàs de l’Actívitas

Per últim, a la cara inferior, s’hi troba el codi de barres i les garanties del

producte, amb el telèfon d’atenció al client.

Imatge 33. Part de la cara inferior: quadre de garanties

Page 64: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

61

4.4 Recull d’informació

Podem observar les característiques de tres tipus de productes de dues

marques diferents a la taula següent:

Nom

comercial

Fabricant Probiòtic Quantitat Preu/unitat És

anunciat

a la TV?

Actimel Danone LactobacillusCasei 100 g 0.4983 € Si

Actívitas Eroski LactobacillusCasei 100 g 0.25 € No

Iogurt Danone LactobacillusBulgaricus 125 g 0.375 € actualment

no

Iogurt Eroski LactobacillusBulgaricus 125 g 0.12 € No

Bio Danone BifidobacteriumBifidus 125 g 0.4275 € Si

Bio Eroski BifidobacteriumBifidus 125 g 0.25 € No

Taula 13.

4.5 Publicitat en un producte probiòtic

Els resultats obtinguts de la recerca d’anuncis i informació publicitària sobre

Actimelsón els següents:

1. Vaig trobar un anunci presentat per la periodista Susana Griso. Tot i

no ser científica ens la presenten com a tal, vestida amb una bata

blanca i explicant el funcionament que el producte fa dins el nostre

cos. A més, destaca que està comprovat científicament i explica, que

ella, com a mare, cada dia pren Actimel, i més encara a l’hivern ja que

ajuda a les nostres defenses de l’intestí.

http://www.youtube.com/watch?v=jvzVIcraIhg

Page 65: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

62

2. El següent és presentat per l’actriu Lola Herrera, que recomana

prendre Actimel cada dia, ja que ella se sent més enèrgica des de que

ho fa. Explica que sempre ha estat en forma, però ha notat el pas dels

anys i assegura que gràcies a prendre aquest producte diàriament

“costa seguir-la”.

http://www.youtube.com/watch?NR=1&v=o_39Ny8Xzh0

3. Aquest últim anunci és presentat pel famós jugador del F. C.

Barcelona Pedro Rodríguez. Pedro explica que quan era petit ell

sempre jugava al carrer, i per això havia de tenir una gran quantitat de

defenses. Diu que els seus dos amics inseparables eren la pilota i

l’Actimel. A l’anunci, per a ell, l’Actimel és un aliment fonamental, ja

que millora el seu rendiment i l’ha ajudat a arribar a ser un bon

futbolista.

http://www.youtube.com/watch?v=aR1p02hbPo8

4. En un altre moment, Susana Griso torna a aparèixer a la pantalla

treballant per Danone. Aquesta vegada ho fa acceptant una proposta

de la mateixa companyia per a desmentir una “falsa” informació que

alguns consumidors han llegit: “Algunos consumidores han leído que

el consumo prolongado de Actimelpuede ser perjudicial para la

saludporquehace que el organismo se olvide de fabricar defensas”

La periodista diu que com a tal ja s’havia interessat per a contrastar

aquesta informació i així, va descobrir que era totalment falsa, tal i

com molts diaris espanyols van anunciar. Sobretot, assegura que això

no ho diu ella, ho diuen més de trenta estudis que ho han demostrat.

Altra vegada ens repeteix que com a mare dóna cada dia Actimelals

seus fills, que per a ella són el més important.

http://www.youtube.com/watch?v=hSS3PWs4TgM

Page 66: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

63

4.6 Resultats de les consultes telefòniques

o Els resultats de la recerca d’estudis que garantissin la qualitat

d’Actimel els vaig aconseguir a través de la pàgina web del producte,

després que el servei d’atenció al client me n’informés. Els estudis

mencionats es troben a l’annex del treball.

o Pel que fa als resultats de la recerca d’estudis que garantissin la

qualitat d’Actívitas, els productors només em van facilitar, a través del

correu electrònic, els factors que periòdicament s’avaluen en el

producte, és a dir, un control de qualitat d’Actívitas. Tal i com en

l’Actimel hi ha desenes d’estudis que poden confirmar la seva qualitat,

en l’Actívitas no hi ha cap dada que confirmi que cada any aquest hagi

passat el control ja que aquesta informació no me l’han facilitat.

Page 67: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

64

5. ANÀLISI DELS RESULTATS

Procedint a analitzar els resultats, organitzarem aquest anàlisi segons els 5

objectius:

5.1 Existència de lactobacils vius en els probiòtics estudiats

Segons els resultats de la pràctica en què es van sembrar els bacteris del

iogurt, l’Actimel(Danone) i l’Actívitas (Eroski), a les plaques de Petri amb medi

MRS (recordem que en aquest medi només poden créixer els lactobacils),

hem pogut comprovar que hi havia lactobacils vius tant en l’Actívitas i com en

l’Actimel, però no vaig poder comprovar-ho en el iogurt.

En el cas de l’ Actimel i l’Actívitas: El nombre de colònies que van créixer a les

plaques de les llets fermentades és molt gran. Unes 700 colònies per placa

tant en el cas de l’Actimelcom en l’Activitas. Aquest fet, va complicar molt el

seu comptatge. Però el fet que els resultats, 7,7·10 8 tant de l’Actimelcom de

l’Actívitas, siguin els que esperàvem ens fa pensar que es va realitzar

correctament tot el procés, tant el banc de dilucions com la sembra. En les

plaques de control no es va obtenir cap creixement, això fa pensar que les

plaques estaven en bones condicions per al creixement dels lactobacils.

Pel que fa al iogurt, en les dues plaques on vaig sembrar-lo no hi va créixer

res. Pel fet que el iogurt utilitzat no era pasteuritzat, es fa estrany que no

creixessin lactobacils en les plaques de Petri. Possiblement, el que va passar

és que el vaig diluir massa i no va arribar cap lactobacil a la placa.

Pel que fa a la morfologia de les colònies es correspon a la dels lactobacils.

L’observació de les colònies al microscopi al principi em va sorprendre (veure

Imatge. 27) ja que esperava veure tots els lactobacils en forma de bastonet,

tal i com podríem trobar en una fotografia ideal. En l’observació al microscopi

a 1000 augments es pot veure com la majoria de cèl·lules no tenen aquesta

forma de bastonet característica dels lactobacils. Però, vaig trucar al

departament d’alimentació de la facultat de Veterirària de la Universitat

Autònoma de Barcelona, on em van assegurar que es tractava de lactobacils.

Page 68: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

65

Em van dir que aquests poden adoptar formes diferents segons el medi, les

condicions de vida i el temps de creixement.

Vaig pensar que aquesta forma que presentaven era a causa de que feia

poques hores que s’acabaven de formar les colònies i de que totes elles

estaven força atapeïdes en el medi.

La forma de bastó dels lactobacils, a l’hora de ser observada pel microscopi,

sovint és seccionada per un altre pla que no sigui el longitudinal. Això farà que

el lactobacil tingui forma des de més aviat ovalada fins a rodona. Cal destacar

que en la imatge 27 no s’hi detecta cap estreptococ, ja que aquests tenen una

forma clarament arrodonida i s’agrupen en forma de rosari.

5.2 Comparació de la qualitat entre marques blanques i

marques comercials del mateix producte

Pel que fa a la quantitat de lactobacils de les llets fermentades,fixem-nos en

els resultats:

o La mitjana d’unitats formadores de colònies per un ml respecte els

resultats del recompte de viables de l’Actimel (de Danone) és de 7.7·108

cfu/ml i el resultat que hem obtingut en el recompte directe o total del

mateix producte és de 1.9·106 cèl·lules/ml.

o Pel que fa a la mitjana dels resultats del recompte de viables de

l’Actívitas (d’Eroski) és de 7.7·108 cfu/ml i el resultat obtingut en el

recompte directe o total és de 2.2·106 cèl·lules/ml.

Veiem que els lactobacils viables tenen una quantitat de 108 i els

microorganismes totals una quantitat de 106. Ens ha donat un resultat més

gran el recompte de viables que el recompte de microorganismes totals (els

vius i els morts). Per lògica hi hauria d’haver més bacteris en el recompte total

(vius i morts) que en el recompte de viables (només els vius).

El fet de que els resultats siguin aquests pot ser atribuït a què el recompte

total on es realitza el comptatge dels bacteris d’un en un en diversos camps

del microscopi pot induir més fàcilment a errors en el comptatge, ja que en un

camp es troben 2 tipus de bacteris : els estreptococs i els lactobacils

Page 69: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

66

(recordem que només cal comptar els Lactobacils). A més, sovint, com hem

vist en el cultiu de les plaques, poden presentar formes que no siguin ben bé

de bastonet. En canvi en el banc de dilucions els errors no han estat tant

grans ja que és una tècnica més precisa.

En el cas del iogurt només disposem de les dades del recompte total que són

de 5.07·105 cèl·lules/ml.El recompte de viables no es va poder dur a terme ja

que no va créixer res a les plaques.

Encara que sigui una tècnica menys precisa, la de recompte de totals, cal

considerar les dades, ja que el comptatge ha estat fet per una mateixa

persona en tots els casos i per tant s’han comptat segons un mateix criteri. Ha

donat més quantitat de lactobacils en els productes de llet fermentada

(Actimel i Activitas) que en el cas del iogurt, que en té menys.

5.3 Informació dels envasos dels productes

L’anàlisi que dels resultats del punt 4.2 és que, bàsicament, el tipus

d’informacions que ens donen en els envasos de tots dos productes són

pràcticament les mateixes.

Pel que fa al disseny de l’etiqueta, l’envàs d’Actimel té uns colors més

vistosos i destaca frases o paraules que criden l’atenció al consumidor (com

comprovem en les fotografies 27 i 28 ) i en canvi els colors de l’envàs

d’Actívitas passen molt més desapercebuts (com podem comprovar en la

fotografia 31).

A més en l’envàs d’Actimel hi trobem elements que, ni que possiblement

alguns consumidors no sàpiguen què signifiquen els criden l’atenció de

manera que el producte dóna confiança ( per exemple el logotip de l’Institut

Pasteur), cosa que en l’envàs d’Actívitas no trobem.

També hem comprovat que realment hi ha diferència en el preu i en la

publicitat entre marques blanques i marques comercials (com podem apreciar

a la taula 13). Els productes de la marca Danone valen el doble que la marca

Eroski. Això pot ser degut a que la marca Eroski no fa propaganda mentre que

la Danone si.

Page 70: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

67

Pel que fa la informació nutricional, en els dos productes hi ha taules on es

donen en detall els percentatges de nutrients. Comparant les taules 10 i 12

veiem que hi ha els mateixos nutrients i en gairebé les mateixes proporcions,

amb excepció de les vitamines E i B6 que aporta Actimel i Actívitas no. Per

altra banda també cal destacar que Actimel és sense gluten i Actívitas si que

en porta.

5.4 Valoració de la publicitat en un producte probiòtic:

l’Actimel

Danone utilitza persones de gran influència o d’estatus superior promocionant

el producte a través de les seves vivències personals. Intenta abraçar

diferents àmbits i marges d’edat per a evitar estancar la seva venta. Vaig

analitzar anuncis on apareixen personatges en els àmbits de: maternitat,

tercera edat i esport; amb les seves finalitats respectives: vetllar per la salut

dels fills, benestar i salut i energia.

En el primer anunci, la periodista Susana Griso ens explica d’una manera

molt senzilla la funció que fa l’Actimeldins el nostre organisme. Mentre ens fa

aquesta explicació veiem com en la pantalla apareix la pregunta “¿Para

quésirven las defensas?” sense parlar de res més que no sigui l’aparell

digestiu fent que pensem per un moment que totes es troben en aquest punt i

que l’única manera de beneficiar-les és prenent un Actimelal dia. Com ja he

dit anteriorment ens pinten a la periodista com si fos científica de manera que

ens dóna una falsa credibilitat. En la part inferior, l’anunci ens informa de que

la Susana Griso es dedica al periodisme i que a més és mare, de manera que

ens fan creure que ella no només ens informa pel fet de ser la seva feina sinó

que a més aconsella a les mares a donar Actimelals seus fills per tal que

creixin sans.

Al final de l’espot publicitari, ens asseguren que això està demostrat

científicament i es parla d’uns estudis els quals no sabem si són certs o si

realment existeixen.

És evident que l’empresa Danone ha aprofitat la imatge de la periodista per a

anunciar el producte perquè la gent cregui, d’alguna manera, que si ella ens

ho diu és perquè és cert.

Page 71: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

68

El que ens pot semblar que és un consell per la nostra salut és, en realitat,

una tàctica de persuasió de cara als consumidors.

En el segon anunci apareix l’actriu Lola Herrera dient que ella ens recomana

Actimel perquè la fa sentir plena d’energia. En aquest cas, Danone es dirigeix

a la gent de la tercera edat. Ella recomanaActimelcom a reforç energètic i

immunològic sense tenir-ne coneixements científics. Diu que cada matí es

pren un Actimel, cosa que li dóna l’energia que necessita per a les seves

activitats quotidianes.

Danone utilitza la imatge de la famosa Lola Herrera perquè la capacitat

d’influència és molt més elevada, sobretot en el sector de la tercera edat, sent

ella una dona sana i coneguda.

En el tercer anunci apareix Pedro Rodríguez. Clarament és un recurs per

influir a la gent jove i als esportistes en general, sense marge d’edat. Ell

explica que des de petit ja prenia Actimel i que gràcies a això ha arribat a ser

un bon futbolista.

El futbolista defensa Actimel com a suplement energètic necessari per el dia a

dia i que gràcies a aquest ell de petit no es posava malalt i podia jugar al

carrer en qualsevol època de l’any. D’alguna manera ens diu que amb

l’absència d’Actimel ell no hauria arribat a ser un home sa i fort i un bon

jugador.

Altra vegada, Danone utilitza la imatge d’un personatge famós per a incentivar

als consumidors a consumir el producte per a poder créixer sans.

Finalment, l’últim vídeo que podem observar tracta sobre informació (“Algunos

consumidores han leído que el consumo prolongado de Actimelpuede ser

perjudicial para la saludporquehace que el organismo se olvide de fabricar

defensas”) que sembla ser que algú va escampar interessadament. Susana

Griso ens desmenteix aquesta informació explicant-nos el funcionament de

les defenses i l’important que és l’Actimel per a nosaltres. En un moment

donat aquest anunci va arribar a les nostres pantalles però va ser denunciat

Page 72: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

69

per l’Associació d’Usuaris de la Comunicació41 (AUC) ja que vulnerava l’article

2 del Codi sobre publicitat i promoció comercial de productes42. Autocontrol va

confirmar que l’afirmació “ajuda les teves defenses” és una “afirmació de

salut”, de manera que ha considerat que en el context concret d’aquesta

publicitat el missatge en conjunt presenta el producte Actimel com a apte per

a prevenir patologies que poden derivar-se de l’entrada al cos d’agents

externs, i per tant, passa a ser una afirmació de caràcter preventiu o sanitari,

fet que està prohibit.

5.5 Informació que els productors transmeten als

consumidors a través d’atenció al client

Ni l’atenció al consumidor de Danone ni la d’Eroski em van facilitar una

informació completa del que vaig demanar com a clienta que estava fent una

recerca sobre els aliments probiòtics.

Com hem vist en els resultats, no podem valorar del tot els estudis que avalen

la qualitat d’Actimel ja que hi ha la possibilitat que no hi siguin tots, sinó

només els que als productors els interessa per a vendre Actimel. Per a poder

valorar exactament aquests resultats hauríem de tenir tots els estudis que

s’han fet sobre el producte i fer un balanç entre els resultats “pro-probiòtics”,

els resultats “anti-probiòtics” i els resultats neutres. M’ha resultat

completament impossible reunir tots els estudis que s’han fet sobre Actimel ja

que, després de tot, en tinc una informació mínima.

Per altra banda, el departament de control de qualitat d’Eroski em va facilitar

una informació gairebé nul·la per al treball. El que van fer va ser enviar-me un

document on hi havia els requeriments del producte Actívitas que s’avaluen

periòdicament, però no hi havia cap resultat. També és veritat que en cap

moment el producte ha estat enunciat i per tant no han de confirmar o

41

L’AUC és una organització sense ànim de lucre, dedicada a defensar els drets dels ciutadans

com a usuaris dels diferents medis i sistemes de comunicació; com a destinataris dels

missatges que a través d’ells es difonen i com a possible protagonistes dels seus continguts.

42

En l’article queda prohibida la publicitat i promoció comercial de productes, activitats o serveis amb pretesa finalitat sanitària.

Page 73: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

70

desmentir cap efecte que Actívitas pugui tenir sobre l’organisme. Vaig insistir

una segona vegada amb el departament de control de qualitat però em van dir

que això era tot, que no em podien facilitar res més.

Page 74: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

71

6. CONCLUSIONS

Recordem les hipòtesis que amb aquest treball vaig voler confirmar o

desmentir: (1) els microorganismes que continguin els aliments probiòtics han

d’estar vius;(2) la marca més cara ha de tenir una major qualitat probiòtica i per

tant un major nombre de bacteris probiòtics; (3) tota la informació que hem de

saber sobre els productes que prenem ha d’estar present en el seu

etiquetatge;(4) comprovar la diferència de publicitat entre l’un i l’altre i valorar

aquesta després de fer la recerca;(5) per últim vaig voler comprovar si el servei

d’atenció al client proporcionava informació sobre els estudis que demostren

que aquests productes són probiòtics.

Els microorganismes probiòtics que es troben a l’interior de l’Actimel i de

l’Actívitas estan vius. Pel que fa al iogurt no sé exactament el motiu pel qual no

va créixer res en cap de les dues plaques, però penso que la causa podria ser

que en el iogurt hi ha una concentració més baixa de probiòtics. He arribat a

aquesta conclusió pel fet que mitjançant el recompte directe o total vaig

comprovar que hi ha molta més quantitat de probiòtics en l’Actimel i l’Actívitas

(resultats de l’ordre de 106) que en el iogurt (resultats de l’ordre de 105).

Com ja he dit, vaig comprovar si hi havia diferència en la qualitat probiòtica

entre els tres aliments (les dues llets fermentades i el iogurt) , de manera que,

per una banda, mitjançant el recompte de viables, vaig desmentir la segona

hipòtesi. La diferència entre les quantitats de lactobacils que van sortir per a

l’Actimel i l’Actívitas és inapreciable: cada un conté una quantitat de 7.7·108

lactobacils.

En observar els lactobacils d’una colònia al microscopi, alguns es poden veure

en la forma de bacil, però la majoria es veuen com si no haguessin acabat de

créixer i no presenten aquesta forma de bastonet allargat. penso que és perquè

les colònies estaven molt juntes en el medi i els nutrients estaven limitats. Per

això les cèl·lules van adoptar una forma més petita.

La seva forma arrodonida també pot ser deguda a la disposició que han agafat

en el pla d’observació en el portaobjectes.

Page 75: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

72

La tècnica de recompte de viables, que es fa per dilucions, és molt més

precisa que el recompte de totals. En el recompte de totals (mètode de Breed)

s’ha de comptar cèl·lula per cèl·lula a través del microscopi. Tal i com sé ara,

els lactobacils poden agafar formes diferents segons el medi on es troben i

segons el pla en què s’observen. En el comptatge, les cèl·lules que hagin

presentat una altra forma que no sigui ben bé la de bacil no s’hauran comptat

com a tals. Penso que és per això que els resultats del recompte directe o total

són més petits que els del recompte de viables.

Els dos productes ens donen la mateixa informació nutricional a l’etiqueta.

Encara que difereixin en algunes vitamines afegides i el gluten, això no afectarà

als lactobacils. Els mil·lilitres envasats o grams de producte atén a la normativa

actual i a la demanda de la societat per a saber exactament les quantitats de

cada aliment que es pren. Cal dir, que l’envàs d’un i l’envàs de l’altre són

lleugerament diferents a causa dels colors vistosos i la crida d’atenció.

L’Actimel, producte de marca comercial, té un envàs més vistós que no pas el

de l’Actívitas, producte de marca blanca, que passa totalment desapercebut.

Per tant, pel que fa a la hipòtesi que afirma que tota la informació necessària

està present en l’etiquetatge dels productes és certa.

He comprovat que hi ha diferència de preu, la marca de Danone (Actimel) val el

doble que la marca blanca, i també hi ha diferència de publicitat, Danone fa

publicitat i la marca blanca no.

He arribat a la conclusió que la publicitat és exagerada en alguns casos i que

intenta vendre el producte donant una informació certa, conté milions de

lactobacils, però enganyosa, fent veure que el producte és completament

necessari per a les nostres defenses, gairebé com un medicament preventiu.

Com hem vist, la llei estableix uns límits per a la publicitat per tal de no

confondre la població. Danone, comparant Actimel amb un medicament ha

sobrepassat aquests límits i en algun cas (com en un dels exemples d’aquest

treball) s’ha prohibit la retransmissió d’algun anunci.

Veiem que la publicitat d’Actimel arriba als límits de la legalitat per inflar al

Page 76: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

Anàlisimicrobiològic de probiòticslàctics

73

màxim el valor dels seus productes i abraçar el màxim possible d’edats i

condicions socials.

El centre comercial Eroski ven productes amb probiòtics de marques

conegudes que s’anuncien a la televisió i altres que no, amb un preu que es

redueix a la meitat. Per a ells és interessant mantenir-los a tots dos, ja que és

una estratègia comercial i d’aquesta manera arriben a diferents tipus de

consumidors.

Finalment, pel que fa a l’Actimel, no sé si els estudis que m’han proporcionat

són fets per laboratoris propis o independents, de manera que no puc saber si

hi ha algun contra estudi que no conegui. D’altra banda en el cas d’Actívitas, no

he aconseguit cap estudi que avalés la seva qualitat, ja que vaig preguntar per

aquests i vaig demanar si me’ls podien facilitar, però els productors em van

enviar una informació que no era la que necessitava.

Les conclusions més importants d'aquest treball són:

- L'efecte probiòtic d’Actimel (de Danone) i d’Activitas (marca blanca

d'Eroski) és exactament el mateix.

- La publicitat, per una banda, diu la veritat pel que fa a la quantitat de

lactobacils presents en el producte, però per l'altra, enganya la població

intentant comparar els efectes d’aquest producte amb els d'un

medicament.

- També cal dir que no hi ha transparència pel que fa als estudis

mencionats en l'efecte real dels làctics probiòtics.

Durant el temps que he dut a terme el treball de recerca no he tingut cap

problema a destacar i a més m’ho he passat molt be fent-lo. L’única cosa que

ha estat una mica difícil és la recerca d’informació, ja que aquest és un tema

molt estudiat però amb incerteses. Això m’ha portat dificultats a l’hora

d’esbrinar si la informació extreta d’Internet era certa i si estava comprovada

científicament ja que en alguns casos era contradictòria. Els llibres

especialitzats m’han ajudat molt a fer una bona selecció d’aquesta informació.

Ara, encara més, m’he adonat que m’agrada molt l’àmbit de l’alimentació i que

realment és a què em vull dedicar.

Page 77: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

74

BIBLIOGRAFIA

V.CARRASCOSA, Alfonso. ¿Quésabemos de? Los microbios que comemos.

Madrid: Catarata, 2011.

MARTI DEL MORAL, Amelia; MARTÍNEZ, J. Alfredo.

¿Sabemosrealmentequécomemos? Alimentostransgénicos, ecológicos y

funcionales. Pamplona: Ediciones Universidad de Navarra, S.A. (EUNSA),

2005.

ARIAS, Matilde; BARRACHINA, Jordi; CLOSAS, M. Carme; FERRER, Ramon.

Biologia 2. Barcelona: Castellnou, 2009.

SAZ, Pablo. Equilibra tu flora intestinal dinsCuerpoMente 232. P. 20-25.

STANIER,R. et al. Microbiologia. Madrid: Reverté, 1888.

FACULTAT DE CIÈNCIES. Departament de Microbiologia UAB. Tècnica

microbiològica. 1888-89.

FERRER LORENTE, B; DALMAU SERRA, J. Alimentos funcionales:

probióticos. Valencia: Centro de atención primária, sección de nutrición. [en

línia] < http://www.gastroinf.com/SecciNutri/ALIMENTOS.pdf >

EROSKI CONSUMER. Aliments prebiòtics i probiòtics. Realment són

necessaris? [en línia]

<http://revista.consumer.es/web/ca/20060701/alimentacion/70636.php>

[consulta: 16.9.2011]

EROSKI CONSUMER. Alimentos funcionales. Alimentos probióticos: yogur y

leches fermentadas. [en línia] <http://www.consumer.es/alimentacion/aprender-

a-comer-bien/alimentos-funcionales/tipos/lacteos/04-07.php> [consulta:

22.9.2011]

TARANTO, Maria Pia; MÉDICI, Marta; FONT DE VALDEZ, Graciela. Alimentos

funcionals probióticos. Argentina: Tucamán, Chacabuco. Laboratorio de

tecnologia y Genética. [en línia]

<http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v4n1/taranto.htm> [consulta: 25.9.2011]

Page 78: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

75

Coordinadora d’Usuaris de la Sanitat. Aliments i salut. [enlínia] <http://www.cus-

usuaris.org/ais/temadelmes/tema02.html>[consulta: 19.10.2011]

Generalitat de Catalunya. CedimCat. Paperdelsprobiòtics en la salut. [enlínia]

<http://www.cedimcat.info/html/ca/dir2450/doc26749.html> [consulta:

27.10.2011 i 28.10.2011]

Europa Press. Las bacterias de la flora intestinal, reservorio para la resistencia

de antibióticos. [enlínia] <http://www.europapress.es/salud/noticia-bacterias-

flora-intestinal-reservorio-resistencia-antibioticos-20101119110719.html>

[consulta: 19.11.2011]

Biblioteca Internacional de Medicina dels EE.UU. Epitelio. [enlínia]

<http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002363.htm>

[consulta: 14.11.2011]

PÉREZ, Christian. Natursan. Benefícios y propiedades del iogur. [enlínia]

<http://www.natursan.net/beneficios-y-propiedades-del-yogur/>[consulta:

30.11.2011]

DANONE RESEARCH. Danone Researchmakes publications of clinicalstudies

on the effects of dairyproductsactivia and actimel, public. [enlínia]

<http://www.studies.danone.com/>[consulta : 4.12.2011]

Actimel de Danone.¿ Porque utilizarlo ? [enlínia]

<http://www.actimel.es/actimel/porque-utilizarlo/> [consulta: 4.12.2011]

M.R.S. Agar [en línia]

<http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mrsagar.htm> [consulta:

5.12.2011]

OSBORN DA, SINN JK. Próbioticos para la prevención la enfermedad alérgica

y la intolerancia alimentaria en neonatos. La Biblioteca Cochrane Plus, 2008.

[enlínia] <http://www.update-

software.com/BCP/BCPGetDocument.asp?DocumentID=CD006475> [consulta:

6.12.2011]

Page 79: Anàlisi microbiològic de probiòtics làctics - fub.edu · Agraïments A les meves amigues per animar-me i donar-me la idea del treball. A la meva familia per recolzar-me i ajudar-me.

76

R. Amores; A. Calvo; J.R. Maestre, D. Martínez-Hernández. Probióticos.

Madrid: Universidad de Complutense de Madrid, Facultad de Medicina,

Departamento de Microbiologia. [enlínia] <http://www.seq.es/seq/0214-

3429/17/2/131.pdf > [consulta: 6.12.2011]

NATURE. Friendly bacteria move in mysterious ways. [en línia]

<http://www.nature.com/news/friendly-bacteria-move-in-mysterious-ways-

1.9251> [consulta: 7.12.2011]

WIKIPEDIA. La enciclopedia libre. [en línia]

- <http://es.wikipedia.org/wiki/Toxigenicidad>

- <http://es.wikipedia.org/wiki/Duodeno>

- <http://es.wikipedia.org/wiki/Crohn>

- <http://es.wikipedia.org/wiki/Carcin%C3%B3geno>

- <http://es.wikipedia.org/wiki/Linfocito_T>

- <http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%9Alcera_p%C3%A9ptica>

- <http://es.wikipedia.org/wiki/Linfoma#Clasificaci.C3.B3n_de_los_linfoma

s>

- <http://es.wikipedia.org/wiki/Retrovirus>

- <http://es.wikipedia.org/wiki/Agar-agar>

- <http://es.wikipedia.org/wiki/Frotis>

YOUTUBE. Anuncio Spot Danone - Actimel y Pedro, un gran equipo. [enlínia]

<http://www.youtube.com/watch?v=aR1p02hbPo8>Febrer 2011. 0.37 min.

- Actimel L. casei. [en línia]

<http://www.youtube.com/watch?v=c7cJm0lY6o4&feature=related>Sete

mbre 2009. 1.01 min.

- Actimel Susana Griso. [en línia]

<http://www.youtube.com/watch?v=jvzVIcraIhg&feature=related>Març

2009. 1.01 min.

- Spot Cadena de Recomendación Actimel 2011- Lola Herrera.[en

línia]<http://www.youtube.com/watch?v=o_39Ny8Xzh0&feature=related>

Març 2011. 0.31 min.