AnalisisdeAlimentos_FundamentosyTecnicas.pdf Unidad 4

ANLISIS DE ALIMENTOS.

FUNDAMENTOS Y

TCNICAS

INTRODUCCIN La qumica y el anlisis de los alimentos son disciplinas muy amplias que se basan en los principios de la fisicoqumica, qumica orgnica, biologa y qumica analtica. Los avances en estas ciencias realizados en los siglos XIX y XX han tenido un efecto importante en la comprensin de muchos aspectos de la ciencia y tecnologa de alimentos y han sido decisivos en el mejoramiento de la cantidad, calidad y disponibilidad del suministro de alimentos a nivel mundial. El anlisis de alimentos es la disciplina que se ocupa del desarrollo, uso y estudio de los procedimientos analticos para evaluar las caractersticas de alimentos y de sus componentes. Esta informacin es crtica para el entendimiento de los factores que determinan las propiedades de los alimentos, as como la habilidad para producir alimentos que sean consistentemente seguros, nutritivos y deseables para el consumidor. Existen un nmero considerable de tcnicas analticas para determinar una propiedad particular del alimento. De ah que es necesario seleccionar la ms apropiada para la aplicacin especfica. La tcnica seleccionada depender de la propiedad que sea medida, del tipo de alimento a analizar y la razn de llevar a cabo el anlisis. Las determinaciones que se realizan ms frecuentemente para conocer la composicin de los alimentos incluyen la determinacin de humedad, cenizas, extracto etreo (grasa cruda), protena total, fibra y carbohidratos asimilables, en un protocolo conocido como Anlisis Proximal. As mismo, dependiendo del objetivo del anlisis, resultan importantes las determinaciones relacionadas con la caracterizacin de algn grupo de nutrientes en particular, tal es el caso del anlisis de carbohidratos en el que se podra considerar la diferenciacin de los que presentan poder reductor, del contenido total. En el mismo sentido se podran analizar las protenas solubles o considerar la caracterizacin de los lpidos extrados de un alimento. El objetivo de este documento es revisar los principios bsicos de los procedimientos comnmente empleados para el anlisis de los alimentos y establecer las principales ventajas y desventajas. Este documento tiene sus inicios para el curso de laboratorio de anlisis de alimentos de la licenciatura en Qumica de Alimentos de la Facultad de Qumica, de la UNAM, con duracin de un semestre, sin embargo ha evolucionado para ser parte fundamental de la nueva asignatura Laboratorio de Alimentos I y pretende ser un apoyo para cualquier asignatura o

actividad que requiera el anlisis de los componentes de los alimentos. Se hace hincapi en la comprensin de los principios qumicos y analticos fundamentales en que se basan las relaciones entre la composicin de los alimentos y algunas de sus propiedades funcionales y nutricionales. Adems se introducen diversas tcnicas de laboratorio que son comunes en la investigacin bsica y aplicada en qumica y anlisis de alimentos. Una vez revisados los conceptos tericos de los procedimientos, en la primera parte del documento, se presentan los procedimientos detallados y por ltimo un condensado con la preparacin de algunas soluciones de importantes para el adecuado desarrollo e las experiencias experimentales. A travs de los aos en que se ha trabajado con este material, muchos estudiantes han efectuado con xito las determinaciones que se describen y continuamente sus resultados son comparados con los obtenidos, para los mismos alimentos, en laboratorios de investigacin con personal capacitado.

Agradecemos a PAPIME EN203504

por el financiamiento para el desarrollo del proyecto

Anlisis de Alimentos. Fundamentos y tcnicas

INDICE

FUNDAMENTOS ..............................................................................................................................1

1 DETERMIACI DE HUMEDAD..................................................................................1

1.1 DEFINICIN DE HUMEDAD .................................................................................................1 1.2 MTODOS DE SECADO .......................................................................................................1

1.2.1 Mtodo por secado de estufa....................................................................................2 1.2.2 Mtodo por secado en estufa de vaco .....................................................................3 1.2.3 Mtodo de secado en termobalanza .........................................................................3 1.2.4 Mtodo de destilacin azeotrpica ..........................................................................3 1.2.5 Mtodo de Karl Fischer. ..........................................................................................4

2 AALISIS DE MIERALES ...............................................................................................7

2.1 DEFINICIN DE CENIZAS ....................................................................................................7 2.2 MTODO DE CENIZAS TOTALES..........................................................................................7 2.3 DETERMINACIN DE CENIZAS EN HMEDO. .......................................................................8 2.4 DETERMINACIN DE ELEMENTOS MINERALES ...................................................................9

2.4.1 Determinacin de cloruros (Mtodo de Mohr) ........................................................9 2.4.2 Determinacin de hierro (Mtodo AOAC 944.02).................................................10 2.4.3 Determinacin de calcio (Mtodo AOAC 944.03). ................................................11 2.4.4 Determinacin de calcio (Mtodo )OM-187-SSA1/SCFI-2002)...........................11

3 AALISIS DE LPIDOS.....................................................................................................13

3.1 MTODOS DE EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN ...............................................................13 3.1.1 Mtodo de Soxhlet ..................................................................................................13 3.1.2 Mtodo de Goldfish ................................................................................................14 3.1.3 Mtodo por lotes.....................................................................................................14 3.1.4 Mtodo de Bligh-Dyer............................................................................................14 3.1.5 Mtodo de Rse-Gottlieb........................................................................................15 3.1.6 Mtodo de Gerber. .................................................................................................15 3.1.7 Mtodo de Mojonnier .............................................................................................15

3.2 CARACTERIZACIN DE LPIDOS............................................................................16 3.2.1 Peso especfico .......................................................................................................16 3.2.2 ndice de refraccin ...............................................................................................16 3.2.3 ndice de saponificacin.........................................................................................16 3.2.4 Material insaponificable ........................................................................................17 3.2.5 Colesterol ...............................................................................................................17 3.2.6 Determinacin de ndice de Yodo. (Mtodo de Wijs y Mtodo de Hanus.) ..........18

3.3 DETERIORO DE LIPIDOS. ..........................................................................................18 3.3.1 Acidez titulable.......................................................................................................18 3.3.2 Determinacin del ndice de Perxidos. (Mtodo volumtrico) ............................18 3.3.3 Determinacin de perxidos. Mtodo volumtrico-Micromtodo .........................19 3.3.4 Determinacin de ndice de Perxidos (Mtodo colorimtrico) ...........................19


3.3.5 ndice de Kreis. ......................................................................................................19 3.3.6 ndice de TBA .........................................................................................................19

4 PROTEAS.........................................................................................................................20

4.1 DETERMINACIN DE PROTENAS......................................................................................20 4.1.1 Mtodo de Kjeldahl ................................................................................................20 4.1.2 Absorcin a 280 nm................................................................................................21 4.1.3 Mtodo de Biuret ....................................................................................................22 4.1.4 Mtodo de Lowry....................................................................................................22 4.1.5 Mtodo turbidimtrico............................................................................................23 4.1.6 Unin de colorantes ...............................................................................................23

4.2 EXTRACCIN DE PROTENAS. (MTODO DE OSBORNE Y MENDEL). ..............................25 4.3 PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTENAS .............................................................25

4.3.1 Capacidad de gelificacin......................................................................................25 4.3.2 Capacidad de emulsificacin .................................................................................25 4.3.3 Capacidad de espumado ........................................................................................26 4.3.4 Capacidad de retencin de agua............................................................................26

5 AALISIS DE CARBOHIDRATOS..................................................................................28

5.1 CARBOHIDRATOS TOTALES ...................................................................................28 5.1.1 Mtodo de fenol-sulfrico ......................................................................................28

5.2 ANALISIS DE POLISACARIDOS ...............................................................................28 5.2.1 Extraccin selectiva de almidn ............................................................................28 5.2.2 Cuantificacin de almidn .....................................................................................29 5.2.3 Anlisis de pectinas................................................................................................30 5.2.4 Determinacin de Fibra diettica ..........................................................................30

5.3 AZCARES EN SOLUCIN.................................................................................................31 5.3.1 Carbohidratos solubles totales...............................................................................31 5.3.2 Determinacin de carbohidratos reductores .........................................................32

PROCEDIMIETOS...................................................................................................................34

6 DETERMIACIO DE HUMEDAD................................................................................34

6.1 MTODO POR SECADO EN ESTUFA (NIELSEN, 2003)........................................................34 6.2 MTODO POR SECADO EN ESTUFA DE VACO (NIELSEN, 2003).........................................34 6.3 MTODO DE SECADO EN TERMOBALANZA (KIRK ET AL, 1996).......................................34 6.4 MTODO DE DESTILACIN AZEOTRPICA (NIELSEN, 2003) ............................................34

7 DETERMIACIO DE MIERALES.............................................................................36

7.1 MTODO CENIZAS TOTALES (CALCINACIN) (KIRK ET AL, 1996) ....................................36 7.2 MTODO CENIZAS TOTALES (DIGESTIN HMEDA) (NOM-117-SSA1-1994) .................36 7.3 DETERMINACIN DE MINERALES .....................................................................................36

7.3.1 Determinacin de cloruros en la muestra. Mtodo de Mohr (Kirk et al, 1996) ....36 7.3.2 Determinacin de cloruros en las cenizas Mtodo de Mohr ()ielsen, 2003).......37 7.3.3 Determinacin de Fe en las cenizas ()MX-F-503-1987) ......................................37 7.3.4 Determinacin de Calcio Titulacin con EDTA (APHA, 1995) ............................37

8 ALISIS DE LPIDOS.....................................................................................................38


8.1 EXTRACCIN Y CUANTIFICACION DE LPIDOS .................................................38 8.1.1 Mtodo de Soxhlet (James, 1999) ..........................................................................38 8.1.2 Mtodo de Goldfish (Pomeranz y Meloan, 2000) ..................................................38 8.1.3 Mtodo por lotes.....................................................................................................39 8.1.4 Mtodo Mojonnier (James, 1999) ..........................................................................39 8.1.5 Mtodo Rose-Gottlieb (James, 1999).....................................................................40

8.2 CARACTERIZACION DE LPIDOS............................................................................41 8.2.1 ndice de saponificacin ()ielsen, 2003)...............................................................41 8.2.2 Material Insaponificable (AOAC Official method 972.28F) .................................41 8.2.3 ndice de yodo (Mtodo de Hanus) ()ielsen, 2003)...............................................41 8.2.4 Peso especfico (Aurand et al, 1987) .....................................................................42 8.2.5 ndice de refraccin (Aurand et al, 1987)..............................................................42 8.2.6 Vitamina A. Mtodo de Carr-Price (Aurand et al, 1987) ......................................42 8.2.7 Colesterol (Kenny, 1952) .......................................................................................43

8.3 DETERIORO DE LPIDOS...........................................................................................43 8.3.1 Acidez titulable ()ielsen, 2003) .............................................................................43 8.3.2 Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo volumtrico (AOAC Official Method 965.33) ......................................................................................................................43 8.3.3 Mtodo Volumtrico-Micromtodo (Crowe y White, 2001)...................................44 8.3.4 Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo colorimtrico (Kirk et al, 1996) 44 8.3.5 ndice de Kreis (Holm y Greenbank, 1923) ...........................................................45

9 ALISIS DE PROTEAS ..............................................................................................46

9.1 DETERMINACIN DE PROTENAS..........................................................................46 9.1.1 Protena cruda. Mtodo de Kjeldahl (AOAC Official Method 2001.11)...........46 9.1.2 Absorcin a 280 nm (Warburg y Christian, 1941)................................................48 9.1.3 Mtodo de Biuret (Gornall et al, 1949).................................................................48 9.1.4 Mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951)) .................................................................48 9.1.5 Mtodo turbidimtrico (Layne, 1957) ...................................................................49 9.1.6 Unin a colorantes Mtodo de Bradford ()ielsen, 2003) ................................49

9.2 EXTRACCION DE PROTENAS (OSBORNE Y MENDEL, 1914)...................................49 9.2.1 A. Albminas .........................................................................................................49 9.2.2 B. Globulinas..........................................................................................................50 9.2.3 C. Prolaminas.........................................................................................................50 9.2.4 D. Glutelinas ..........................................................................................................50

9.3 PROPIEDADES FUNCIONALES ................................................................................50 9.3.1 A. Capacidad de gelificacin (Avanza y An, 2001)........................................50 9.3.2 B. Capacidad de emulsificacin (Fennema, 1993) .............................................51 9.3.3 C. Capacidad de espumado (Ahmedna et al, 1999).............................................51 9.3.4 D. Capacidad de retencin de agua (Robertson et al, 2000)..............................51

10 AALISIS DE CARBOHIDRATOS..............................................................................52

10.1 CARBOHIDRATOS TOTALES ...................................................................................52 10.1.1 Mtodo del fenol-sulfrico (Dubois et al, 1956) ....................................................52

10.2 ANLISIS DE POLISACARIDOS ...............................................................................52 10.2.1 Determinacin de fibra diettica (985.29).............................................................52


10.2.2 ALMID) ..............................................................................................................53 10.2.3 A)LISIS DE PECTI)AS ()ielsen, 1998) ............................................................56

10.3 AZCARES EN SOLUCIN........................................................................................56 10.3.1 Preparacin de la muestra (Southgate, 1991) .......................................................56 10.3.2 Carbohidratos solubles totales...............................................................................57 10.3.3 Determinacin de carbohidratos reductores .........................................................57

10.4 OTRAS DETERMINACIONES....................................................................................59 10.4.1 Determinacin de densidad calrica .....................................................................59

11 BIBLIOGRAFA..............................................................................................................62

AEXO .........................................................................................................................................65

12 PREPARACIO DE SOLUCIOES.............................................................................65

12.1 REACTIVO DE HANUS ......................................................................................................65 12.2 REACTIVO DE DNS..........................................................................................................65 12.3 REACTIVO DE BIURET......................................................................................................65 12.4 REACTIVO DE LOWRY .....................................................................................................65 12.5 REACTIVO DE FEHLING (JAMES, 1999)............................................................................66 12.6 REACTIVO DE YODO (PARA DETERMINACIN CALORIMTRICA DE ALMIDN)..................66 12.7 ORTOFENANTROLINA AL 1% ...........................................................................................66 12.8 BUFFER DE ACETATOS PARA DETERMINACIN DE FE ......................................................66 12.9 ACIDO BRICO CON INDICADORES...................................................................................66 12.10 REACTIVO COLORANTE AZUL BRILLANTE...................................................................66 12.11 SOLUCIN DE CARREZ I ..............................................................................................66 12.12 SOLUCIN DE CARREZ II .............................................................................................66 12.13 SOLUCIN I/KI AL 3%.................................................................................................66 12.14 SOLUCIN DE CLORURO DE SODIO ALCOHLICA..........................................................66

Antologa de Fundamentos 1

FUNDAMENTOS

1 DETERMINACIN DE HUMEDAD

1.1 Definicin de humedad Todos los alimentos, cualquiera que sea el mtodo de industrializacin a que hayan sido sometidos, contienen agua en mayor o menor proporcin. Las cifras de contenido en agua varan entre un 60 y un 95% en los alimentos naturales. En los tejidos vegetales y animales, puede decirse que existe en dos formas generales: agua libre Y agua ligada. El agua libre o absorbida, que es la forma predominante, se libera con gran facilidad. El agua ligada se halla combinada o absorbida. Se encuentra en los alimentos como agua de cristalizacin (en los hidratos) o ligada a las protenas y a las molculas de sacridos y absorbida sobre la superficie de las partculas coloidales. (Hart, 1991) Existen varias razones por las cuales, la mayora de las industrias de alimentos determinan la humedad, las principales son las siguientes:

a) El comprador de materias primas no desea adquirir agua en exceso. b) El agua, si est presente por encima de ciertos niveles, facilita el desarrollo de los

microorganismos. c) Para la mantequilla, margarina, leche en polvo y queso est sealado el mximo

legal. d) Los materiales pulverulentos se aglomeran en presencia de agua, por ejemplo

azcar y sal. e) La humedad de trigo debe ajustarse adecuadamente para facilitar la molienda. f) La cantidad de agua presente puede afectar la textura. g) La determinacin del contenido en agua representa una va sencilla para el

control de la concentracin en las distintas etapas de la fabricacin de alimentos.

1.2 Mtodos de secado

Los mtodos de secado son los ms comunes para valorar el contenido de humedad en los alimentos; se calcula el porcentaje en agua por la perdida en peso debida a su eliminacin por calentamiento bajo condiciones normalizadas. Aunque estos mtodos dan buenos resultados que pueden interpretarse sobre bases de comparacin, es preciso tener presente que a) algunas veces es difcil eliminar por secado toda la humedad presente; b) a cierta temperatura el alimento es susceptible de descomponerse, con lo que se volatilizan otras sustancias adems de agua, y c) tambin pueden perderse otras materias voltiles aparte de agua. (Kirk et al, 1996)


1.2.1 Mtodo por secado de estufa La determinacin de secado en estufa se basa en la prdida de peso de la muestra por evaporacin del agua. Para esto se requiere que la muestra sea trmicamente estable y que no contenga una cantidad significativa de compuestos voltiles. El principio operacional del mtodo de determinacin de humedad utilizando estufa y balanza analtica, incluye la preparacin de la muestra, pesado, secado, enfriado y pesado nuevamente de la muestra. (Nollet, 1996). Notas sobre las determinaciones de humedad en estufa.

1. Los productos con un elevado contenido en azcares y las carnes con un contenido alto de grasa deben deshidratarse en estufa de vaco a temperaturas que no excedan de 70C.

2. Los mtodos de deshidratacin en estufa son inadecuados para productos, como las especias, ricas en sustancias voltiles distintas del agua.

3. La eliminacin del agua de una muestra requiere que la presin parcial de agua en la fase de vapor sea inferior a la que alcanza en la muestra; de ah que sea necesario cierto movimiento del aire; en una estufa de aire se logra abriendo parcialmente la ventilacin y en las estufas de vaco dando entrada a una lenta corriente de aire seco.

4. La temperatura no es igual en los distintos puntos de la estufa, de ah la conveniencia de colocar el bulbo del termmetro en las proximidades de la muestra. Las variaciones pueden alcanzar hasta ms de tres grados en los tipos antiguos, en los que el aire se mueve por conveccin. Las estufas ms modernas de este tipo estn equipadas con eficaces sistemas, que la temperatura no varia un grado en las distintas zonas.

5. Muchos productos son, tras su deshidratacin, bastante higroscpicos; es preciso por ello colocar la tapa de manera que ajuste tanto como sea posible inmediatamente despus de abrir la estufa y es necesario tambin pesar la cpsula tan pronto como alcance la temperatura ambiente; para esto puede precisarse hasta una hora si se utiliza un desecador de vidrio.

6. La reaccin de pardeamiento que se produce por interaccin entre los aminocidos y los azcares reductores libera agua durante la deshidratacin y se acelera a temperaturas elevadas. Los alimentos ricos en protenas y azcares reductores deben, por ello, desecarse con precaucin, de preferencia en una estufa de vaco a 60C. (Hart, 1991)


1.2.2 Mtodo por secado en estufa de vaco Se basa en el principio fisicoqumico que relaciona la presin de vapor con la presin del sistema a una temperatura dada. Si se abate la presin del sistema, se abate la presin de vapor y necesariamente se reduce su punto de ebullicin. Si se sustrae aire de una estufa por medio de vaco se incrementa la velocidad del secado. Es necesario que la estufa tenga una salida de aire constante y que la presin no exceda los 100 mm Hg. y 70C, de manera que la muestra no se descomponga y que no se evaporen los compuestos voltiles de la muestra, cuya presin de vapor tambin a sido modificada (Nollet, 1996).

1.2.3 Mtodo de secado en termobalanza Este mtodo se basa en evaporar de manera continua la humedad de la muestra y el registro continuo de la perdida de peso, hasta que la muestra se site a peso constante. El error de pesada en este mtodo se minimiza cuando la muestra no se expone constantemente al ambiente (Nollet, 1996).

1.2.4 Mtodo de destilacin azeotrpica El mtodo se basa en la destilacin simultnea del agua con un lquido inmiscible en proporciones constantes. El agua es destilada en un lquido inmiscible de alto punto de ebullicin, como son tolueno y xileno. El agua destilada y condensada se recolecta en una trampa Bidwell para medir el volumen (ver Fig. 1) (Nollet, 1996).

Fig. 1. Diagrama de destilacin azeotrpica


Notas sobre los procedimientos de destilacin con disolvente. 1. Se recomienda emplear los siguientes disolventes:

Disolventes P. ebullicin (C)

Tetracloruro de carbono 77 Benceno 80

Metil ciclohexano 100 Tolueno 111

Tetracloroetileno 121 Xileno 137-140

2. La Asociacin Americana de Comercio Especias, en sus mtodos oficiales analticos, recomienda el uso de benceno en lugar de tolueno, con productos tales como pimientos rojos, cebollas deshidratadas, ajos deshidratados, etc., que son ricos en azcares y otras sustancias que pueden descomponerse, liberando agua, a la temperatura de ebullicin de tolueno. 3. Es preciso limpiar la totalidad del aparato, cada vez que se utilice, con cido sulfrico-dicromato, enjuagarlo primero con agua y luego con alcohol y, finalmente, secarlo. 4. Debe calibrarse el colector por sucesivas destilaciones con tolueno de cantidades de agua medidas con precisin. Las lecturas deben aproximarse en centsimas de mililitro. 5. La eleccin del colector depende del volumen de agua que se espera recoger, del grado de precisin requerido y de la facilidad con que el disolvente refluya. (Hart, 1991)

1.2.5 Mtodo de Karl Fischer. Es el nico mtodo qumico comnmente usado para la determinacin de agua en alimentos que precisamente se basa en su reactivo. Este reactivo fue descubierto en 1936 y consta de yodo, dixido de azufre, una amina (originalmente se empleaba piridina sin embargo por cuestiones de seguridad y toxicidad se est reemplazando por imidazol) en un alcohol (ejemplo metanol).


Inicialmente, el dixido de azufre reacciona con el metanol para formar el ster el cual es neutralizado por la base (1). El ster es oxidado por el yodo a metil sulfato en una reaccin que involucra al agua (2). Las reacciones son las siguientes: (James, 1999) CH3OH + SO2 + RN [RNH]SO3CH3 (1) H2O + I2 + [RNH]SO3CH3 +2RN [RNH] (SO4)CH3 + 2[RNH]I (2) Habitualmente se utiliza un exceso de dixido de azufre, piridina y metanol de manera que la fuerza del reactivo venga determinada por la concentracin de yodo. Este reactivo es un poderoso deshidratante, por lo que tanto la muestra como el reactivo deben protegerse contra la humedad del aire, cualquiera que sea la tcnica usada. Se hace por titulacin y estas pueden ser visuales o potenciomtricas. En su forma mas simple el mismo reactivo funciona como indicados. La disolucin muestra mantiene un color amarillo canario mientras haya agua, que cambia luego a amarillo cromato y despus a pardo en el momento del vire. En su forma mas simple el mtodo potenciomtrico consta de una fuente de corriente directa, un restato, un galvanmetro o microampermetro y electrodos de platino, dos cosas son necesarias para la determinacin: una diferencia de potencial que nos de una corriente y el contacto del titulante con el analito. (Hart, 1991) Este mtodo se aplica a alimentos con bajo contenido de humedad por ejemplo frutas y vegetales deshidratados, aceite y caf tostado, no es recomendable para alimentos con alto contenido de humedad. (James, 1999)


Tabla 1. Comparacin entre los mtodos para determinar humedad

Mtodo Ventajas Desventajas

Secado en estufa

Es un mtodo convencional Es conveniente Es rpido y preciso Se pueden acomodar varias muestras Se llega a la temperatura deseada mas rpidamente

La temperatura va fluctuar debido al tamao de la partcula, peso de la muestra, posicin de la muestra en el horno, etc. Prdida de sustancias voltiles durante el secado Descomposicin de la muestra, ejemplo: azcar.

Secado en estufa de vaco

Se calienta a baja temperatura y por lo tanto se previene la descomposicin de la muestra

Es recomendable para muestras que contengan compuestos voltiles orgnicos

Calentamiento y evaporacin constante y uniforme

La eficiencia es baja para alimentos con alta humedad

Destilacin azeotrpica

Determina el agua directamente y no por prdida de peso

El dispositivo es sencillo de manejar Toma poco tiempo Se previene la oxidacin de la muestra

No se afecta la humedad del ambiente

Baja precisin del dispositivo para medir volumen de agua Los disolventes inmiscibles como tolueno son inflamables Se puede registrar altos residuos debido a la destilacin de componentes solubles en agua, como glicerol y alcohol Cualquier impureza puede generar resultados errneos

Secado en termobalanza

Es un mtodo semiautomtico y automtico

La muestra no es removida por lo tanto el error de pesada es mnimo

Es excelente para investigacin pero no es prctico

Karl Fischer

Es un mtodo estndar para ensayos de humedad

Precisin y exactitud ms altos que otros mtodos

Es til para determinar agua en grasas y aceites previniendo que la muestra se oxide

Una vez que el dispositivo se monta la determinacin toma pocos minutos

Los reactivos deben ser RA para preparar el reactivo de Fischer El punto de equivalencia de titulacin puede ser difcil de determinar El reactivo de Fischer es inestable y debe estandarizarse in situ. El dispositivo de la titulacin debe protegerse de la humedad atmosfrica debido a la excesiva sensibilidad del reactivo a la humedad. El uso de la piridina que es muy reactiva.

(Nollet, 1996)


2 ANALISIS DE MINERALES

2.1 Definicin de cenizas Las cenizas de un alimento son un trmino analtico equivalente al residuo inorgnico que queda despus de calcinar la materia orgnica. Las cenizas normalmente, no son las mismas sustancias inorgnicas presentes en el alimento original, debido a las perdidas por volatilizacin o a las interacciones qumicas entre los constituyentes. El valor principal de la determinacin de cenizas (y tambin de las cenizas solubles en agua, la alcalinidad de las cenizas y las cenizas insolubles en cido) es que supone un mtodo sencillo para determinar la calidad de ciertos alimentos, por ejemplo en las especias y en la gelatina es un inconveniente un alto contenido en cenizas. Las cenizas de los alimentos debern estar comprendidas entre ciertos valores, lo cual facilitar en parte su identificacin. (Kirk et al, 1996) En los vegetales predominan los derivados de potasio y en las cenizas animales los del sodio. El carbonato potsico se volatiliza apreciablemente a 700C y se pierde casi por completo a 900C. El carbonato sdico permanece inalterado a 700C, pero sufre prdidas considerables a 900C. Los fosfatos y carbonatos reaccionan adems entre s. (Hart, 1991) Notas:

a) Los productos que contienen mucha agua se secan primero sobre un plato elctrico caliente o al bao Mara.

b) La consideracin principal es que el producto no desprenda humos. c) En general, la temperatura adecuada de la mufla son 500C. Sin embargo, los

cloruros, pueden volatilizarse a esta temperatura. d) Las cenizas se utilizan muchas veces para la determinacin de constituyentes

individuales, por ejemplo cloruros, fosfatos, calcio y hierro. (Kirk et al, 1996) Para la determinacin de cenizas se siguen principalmente 2 mtodos, en seco y va hmeda.

2.2 Mtodo de cenizas totales La determinacin en seco es el mtodo ms comn para cuantificar la totalidad de

minerales en alimentos y se basa en la descomposicin de la materia orgnica quedando solamente materia inorgnica en la muestra, es eficiente ya que determina tanto cenizas solubles en agua, insolubles y solubles en medio cido.


En este mtodo toda la materia orgnica se oxida en ausencia de flama a una temperatura que flucta entre los 550 -600C; el material inorgnico que no se volatiliza a esta temperatura se conoce como ceniza. (Nollet, 1996)

2.3 Determinacin de cenizas en hmedo.

La determinacin hmeda se basa en la descomposicin de la materia orgnica en medio cido por lo que la materia inorgnica puede ser determinada por gravimetra de las sales que precipiten, y tambin por algn otro mtodo analtico para las sales que permanezcan en disolucin acuosa o cida. Para la determinacin hmeda se dan cenizas alcalinas, cidas y neutras y esto se basa en el tipo de anin o catin ya sea metlico o complejo de tal forma hay minerales como tartratos, citratos que producirn cenizas con un carcter alcalino. Es necesario tomar en cuenta que tambin un ndice de alcalinidad de cenizas es muestra del contenido de carbonatos en disolucin acuosa.

Las ventajas y desventajas de estos mtodos se muestran en la tabla 2. (Nollet, 1996) Tabla2. Comparacin entre mtodos para determinar cenizas totales Mtodo Ventaja Desventaja

1. Simple 1. Se requiere alta temperatura 2. No se requiere atencin durante la generacin de cenizas

2. El equipo es caro

3. No se requieren reactivos 3. Hay prdidas por volatilizacin 4. Se pueden manejar muchas muestras

4. Hay interacciones entre minerales y recipientes.

5. Es un mtodo estndar para la determinacin de cenizas

5. Hay absorcin de elementos traza por recipientes de porcelana o slice

6. Se puede determinar cualquier tipo de materia inorgnica

6. Poca utilidad para anlisis de Hg, As, P y Se

7. Calentamiento excesivo puede hacer ciertos componentes insolubles.

Seco

8. Hay una dificultad de manejo de cenizas por ser higroscpicas, sensibles a la luz, etc.

1. Relativamente no se requiere alta temperatura

1. Se requieren altas cantidades de materiales corrosivos.

2. El dispositivo es simple 2. Se requieren cidos explosivos 3. La oxidacin es rpida 3. Se requiere estandarizar los reactivos 4. Se mantiene la disolucin acuosa lo cual es bueno para anlisis mineral.

4. Las reacciones son fumantes

5. El equipo no es caro 5. Manejar sistemticamente varias muestras no es sencillo

Hmedo

6. No hay volatilizacin de minerales 6. El procedimiento es tedioso y gasta mucho tiempo.


2.4 Determinacin de elementos minerales El trmino elementos minerales es poco preciso porque en los minerales se encuentran elementos orgnicos como carbono, hidrgeno, nitrgeno, oxgeno y azufre. Sirve para agrupar a aquellos elementos, en su mayora metlicos, que se presentan en cantidades minoritarias en los alimentos, y que suelen determinarse como elementos ms que como compuestos especficos o grupos de compuestos. El nmero de estos elementos que se encuentran en los alimentos es muy considerable incluyndose en el: silicio, calcio, magnesio, sodio, potasio, fsforo, azufre, cloro, hierro, aluminio, manganeso, flor, arsnico, cobalto, cobre, mercurio, molibdeno, plomo, selenio, estroncio, zinc, yodo, mercurio y boro. En algunos casos estos elementos son naturales en los alimentos mientras que en otros casos son producto de la contaminacin. Los mtodos de determinacin ms comunes se basan en la titulacin complejomtrica con EDTA o algn otro quelante y por gravimetra (para cationes metlicos). Hay variantes para elementos con sodio y potasio que no se pueden titular con EDTA, este mtodo es el mtodo de cloroplatinato de Lindo-Gladding. Este mtodo se basa en la insolubilidad del perclorato en alcohol y en otros disolventes orgnicos. Si la determinacin es cuidadosa el mtodo de cloroplatinato rinde resultados muy precisos pero en la actualidad tienen a sustituirse por mtodos basados en el descubrimiento reciente de la insolubilidad del tetrafenilborato de potasio o en la fotometra de llama. Para la determinacin de fsforo se realiza su conversin a fosfomolibdato. Separado por filtracin el fosfomolibdato amnico puede disolverse en un exceso de lcali patrn que es luego titulado por retroceso con cido o en un exceso de amoniaco para precipitar luego el fsforo como fosfato amnico magnsico, que se incinera y se pesa como pirofosfato magnsico. Cuando se trata de trazas de fsforo se puede reducir el fosfomolibdato a azul de molibdeno y determinar colorimtricamente. Para determinar azufre libre se necesita su oxidacin antes de la incineracin con objeto de determinar azufre como sulfato de bario y para ello se utiliza comnmente perxido de sodio, nitrato de magnesio y cido perclrico (Hart, 1991).

2.4.1 Determinacin de cloruros (Mtodo de Mohr) El mtodo se utiliza para determinar iones cloruro y bromuro de metales alcalinos, magnesio y amonio. La valoracin se hace con solucin patrn de nitrato de plata.


El mtodo se basa en la formacin de un precipitado ladrillo proveniente del cromato de plata formado a partir del precipitado de cloruro de plata, una vez que todo el Cl- haya reaccionado con el nitrato de plata. (Nielsen, 1998)

Cl-+ Ag+ AgCl (Precipitado blanco)

2 Ag+ +CrO4= AgCrO4 (Precipitado rojo ladrillo)

La solucin debe tener un pH neutro o cercano a la neutralidad. Un pH de 8.3 es adecuado para la determinacin.

2.4.2 Determinacin de hierro (Mtodo AOAC 944.02) La ortofenantrolina reacciona con el Fe 2+, originando un complejo de color rojo caracterstico (ferrona) que absorbe notablemente en las regiones del espectro visible de alrededor de 505 nm. El Fe 3+ no presenta absorcin a esa longitud de onda y debe ser reducido a Fe 2+ mediante un agente reductor apropiado, como la hidroxilamina, (en forma de clorato para incrementar su solubilidad). (Boumans et al, 1997)

La reduccin cuantitativa de Fe 3+ a Fe 2+ ocurre en pocos minutos en un medio cido (pH 3-4) de acuerdo a la siguiente ecuacin:

4 Fe 3+ + 2 NH2OH 4 Fe 2+ +N2O + 4 H+ + H2O

Despus de la reduccin del Fe 3+ a Fe 2+, se da la formacin de un complejo con la adicin de ortofenantrolina. En un medio acido la ortofenantrolina se encuentra en su forma protonada como ion 1,10-fenantrolin (FenH+).

La reaccin de complejacin puede ser descrita por la siguiente ecuacin: (La estructura qumica del complejo se muestra en la figura 2)

Fe 2+ + 3 FenH+ Fe(Fen)3 3+ + 3 H+


Fig. 2. Estructura qumica de la ferrona. Consiste en 3 molculas de OP (ortofenantrolina) alrededor de un tomo central de Fe. Los tomos de carbono de la ferrona estn representados con sombras grises. Los tomos de N estn representados en blanco

2.4.3 Determinacin de calcio (Mtodo AOAC 944.03). Titulacin con permanganato El Calcio se precipita a pH 4 como oxalato (si hay fosfato presente se puede

eliminar con cido actico), posteriormente el oxalato se disuelve en cido sulfrico liberando cido oxlico el cual se titula con una solucin valorada de permanganato de potasio. (James, 1999)

Las reacciones involucradas son: 1. Precipitacin del Calcio con Oxalato de Amonio.

CaCl2 + (NH4)2C2O4 2NH4Cl + CaC2O4

2. Liberacin del cido oxlico por la accin del cido sulfrico sobre el oxalato

de calcio CaC2O4 + H2SO4 CaSO4 + H2C2O4

3. Titulacin del cido oxlico con permanganato de potasio

5H2C2O4 + 2KmnO4 + 3H2SO4 K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 10CO2

2.4.4 Determinacin de calcio (Mtodo NOM-187-SSA1/SCFI-2002). Formacin de complejo con EDTA.

Cuando se aade a una muestra conteniendo Calcio (o Magnesio), cido etilendiaminotetractico (EDTA) o su sal, los iones se combinan con el EDTA. Se puede determinar Calcio en forma directa, aadiendo NaOH para elevar el pH de la muestra


entre 12 y 13 unidades, para que el magnesio precipite como hidrxido y no interfiera, se usa adems, un indicador que se combine solamente con el calcio (azul de hidroxinaftol).

En el anlisis de Calcio la muestra es tratada con NaOH 4N para obtener un pH de entre 12 y 13, lo que produce la precipitacin del magnesio en forma de Mg(OH)2. Enseguida se agrega el indicador azul de hidroxinaftol que forma un complejo de color rosa con el ion calcio y se procede a titular con solucin de EDTA hasta la aparicin de un complejo color prpura:

Reacciones :

Ca+2 + Mg+2 + NaOH (4N) --------->Mg (OH)2 + Ca+2

Ca+2 + Indicador (azul hidroxinaftol) ------> [azul hidroxinaftol- Ca++] (color rosa)

[azul hidroxinaftol - Ca++] + EDTA --------> [ EDTA - Ca+2 ] + azul hidroxinaftol (color prpura)


3 ANALISIS DE LPIDOS Los lpidos, junto con las protenas y carbohidratos, constituyen los principales componentes estructurales de los alimentos. (Nielsen, 1998). Los lpidos se definen como un grupo heterogneo de compuestos que son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgnicos tales como ter, cloroformo, benceno o acetona. Todos los lpidos contienen carbn, hidrgeno y oxigeno, y algunos tambin contienen fsforo y nitrgeno (Aurand et al, 1987). Los lpidos comprenden un grupo de sustancias que tienen propiedades comunes y similitudes en la composicin, sin embargo algunos, tales como los triacilgliceroles son muy hidrofbicos. Otros, tales como los di y monoacilgliceroles tienen movilidad hidrofbica e hidroflica en su molcula por lo que pueden ser solubles en disolventes relativamente polares (Nielsen, 1998)

3.1 Mtodos de extraccin y cuantificacin

El contenido total de lpidos se determina comnmente por mtodos de extraccin con disolventes orgnicos (por ejemplo Soxhlet, Goldfish, Mojonnier), sin embargo tambin puede cuantificarse por mtodos de extraccin que no incluyen disolventes (por ejemplo, Babcock, Gerber) y por mtodos instrumentales que se basan en propiedades fsicas o qumicas de los lpidos (por ejemplo, infrarrojo, densidad y absorcin es rayos X) (Nielsen, 2003).

3.1.1 Mtodo de Soxhlet

Es una extraccin semicontinua con un disolvente orgnico. En este mtodo el disolvente se calienta, se volatiliza y condensa goteando sobre la muestra la cual queda sumergida en el disolvente. Posteriormente ste es sifoneado al matraz de calentamiento para empezar de nuevo el proceso. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso (Nielsen, 2003)

Fig. 3. Esquema de extraccin Soxhlet.


3.1.2 Mtodo de Goldfish

Es una extraccin continua con un disolvente orgnico. ste se calienta, volatiliza para posteriormente condensarse sobre la muestra. El disolvente gotea continuamente a travs de la muestra para extraer la grasa. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso entre la muestra o la grasa removida (Nielsen, 2003)

Fig. 4. Equipo de extraccin Goldfish

3.1.3 Mtodo por lotes

Este mtodo hace uso de la solubilidad intrnseca de la sustancia a separar; es claro que un compuesto no polar es soluble en un disolvente no polar (Hoffman, 1989). La extraccin se realiza en fro para evitar el dao del material lipdico y por lotes para incrementar la eficiencia.

3.1.4 Mtodo de Bligh-Dyer El mtodo de Bligh-Dyer as como su modificacin por Hanson y Olley proporciona un mtodo rpido para la extraccin de lpidos de tejidos y productos alimenticios que contienen una cantidad significativa de agua. El mtodo se basa en la homogenizacin


de la muestra con cloroformo, metanol y agua en proporciones tales que se forme una sola fase miscible con el agua de la muestra. Al aadir alcuotas de cloroformo y agua se logra la separacin de fases. El material lipdico se encuentra en la fase no acuosa, mientras que el material no lipdico se encuentra en la fase acuosa. Los lpidos se pueden extraer de dos gramos de muestra seca hasta veinte gramos de muestra hmeda. El contenido de agua de la muestra se ajusta a diecisis mililitros para conservar la proporcin de cloroformo, metanol y agua la cual es esencial si se pretende una separacin de fases y una extraccin cuantitativa de lpidos. La ventaja de este procedimiento es que las etapas de filtrado y lavado son eliminadas. Sin embargo no es un mtodo muy cuantitativo y tiene un elevado margen de error para muestras secas de cereales (Rossell y Pritchard, 1991)

3.1.5 Mtodo de Rse-Gottlieb. De acuerdo a este mtodo, la separacin de la grasa es lograda por amoniaco y etanol con un posterior efecto de deshidratacin sobre los fosfolpidos. La grasa es disuelta en ter recin destilado y se aade algo de petrleo de tal suerte que se separen algunos compuestos no lipdicos que se puedan encontrar en la fase etrea. Esta mezcla es completamente inmiscible en agua de manera que mediante una extraccin adecuada es simple dejar la grasa en la fase etrea y el residuo graso es pesado. Este mtodo es particular para leche fresca que no contiene cidos grasos libres, los cuales en disolucin alcalina forman sales de amonio y esto es insoluble en ter. Esta es la razn por la cual esto no se aplica a quesos, los cuales si tienen cidos grasos libres. (Boekenoogen, 1964)

3.1.6 Mtodo de Gerber. ste, as como los dems mtodos volumtricos presentan un carcter un tanto cuanto emprico ya que varios factores afectan la gravedad especfica de la grasa separada, variaciones propias de la grasa, cidos grasos presentes, solubilidad de la grasa en los disolventes, etc. Con estos mtodos volumtricos la muestra se sita en un butirmetro y se descompone utilizando cidos o lcalis de manera que la grasa es liberada, esta se separa por mtodos mecnicos (centrifuga) y se colecta en el cuello calibrado. (Boekenoogen, 1964)

3.1.7 Mtodo de Mojonnier

La grasa es extrada con una mezcla de ter etlico y ter de petrleo en un matraz de Mojonnier, la grasa extrada se pone a peso constante y es expresada en porcentaje de grasa por peso. La prueba de Mojonnier es un ejemplo de extraccin discontinua con


disolvente. Esta extraccin no requiere remover previamente la humedad de la muestra. (Nielsen, 1998)

Fig. 5. Matraz de extraccin Mojonnier

3.2 CARACTERIZACIN DE LPIDOS

3.2.1 Peso especfico

Es una determinacin gravimtrica en donde un picnmetro se llena con la muestra de aceite y permanece en un bao a 25C por 30 min, se seca y pesa. Se expresa el peso especifico como la relacin del peso del aceite con respecto al agua (g de aceite/g agua). (Aurand et al, 1987)

3.2.2 ndice de refraccin

Se define como la relacin de la velocidad de la luz en el aire (tcnicamente un vaco) con respecto a la velocidad de la luz en el aceite. Se obtiene midiendo directamente en un refractmetro a 20-25C para los aceites y a 40C para las grasas. (Nielsen, 1998)

3.2.3 ndice de saponificacin

El ndice de saponificacin denota el peso de hidrxido potsico en mg que se requieren para saponificar un gramo del aceite o grasa.

El aceite se saponifica calentndolo con un exceso de lcali custico alcohlico. La cantidad de lcali consumida se calcula valorando por retroceso con cido clorhdrico. El ndice de saponificacin es inversamente proporcional a la medida de los pesos moleculares de los cidos grasos de los glicridos presentes en el aceite o grasa. Como muchos aceites dan ndices similares, el ndice de saponificacin es menos valioso que el


ndice de yodo cuando se trata de identificar un aceite desconocido. Notables excepciones son los altos ndices del aceite de coco y el aceite de almendra de palma (ambos utilizados en la margarina) y de la grasa de mantequilla. (Pearson, 1993)

CH2-OOC-R - CH-OOC-R - CH2-OOC-R + 3 KOH

CH2-OH -CH-OH - CH2-OH (glicerol) + 3 R-CO2-K

3.2.4 Material insaponificable

La materia insaponificable consta de aquellas sustancias contenidas en los aceites comerciales y grasas (diferentes a las de bajo p. de ebullicin a los cidos libres y a la materia mineral) que, despus de saponificar y extraer con ter dietlico, quedan sin volatilizarse luego de secar a 80C. Incluyen hidrocarburos y alcoholes de alto peso molecular. L/a mayora de los aceites y grasas contienen una pequea parte de materia insaponificable (normalmente menos del 2 %). (Pearson, 1993)

3.2.5 Colesterol

El mtodo qumico de Liebermann-Burchard para la determinacin de colesterol en una muestra lipdica se basa en el desarrollo de una coloracin verde en presencia de anhdrido actico y cido sulfrico concentrado con temperatura, despus de 30 min de reaccin (Nollet, 1996). La intensidad de la coloracin es medida por absorcin en el espectrofotmetro a 620 nm. La intensidad tiene una relacin lineal con la concentracin de colesterol entre 100 y 600g, se debe realizar una solucin control de colesterol de diferentes concentraciones para realizar una comparacin ( Kenny, 1952)

Fig. 6. Mecanismo de reaccin del colesterol con anhdrido actico en medio cido (Reaccin Liebermann-Burchard). El compuesto formado absorbe de 600-620 nm (Burke et al, 1974)


3.2.6 Determinacin de ndice de Yodo. (Mtodo de Wijs y Mtodo de Hanus.)

El ndice de yodo de los lpidos depende de su grado de instauracin. La grasa disuelta se hace reaccionar con monobromuro de yodo en exceso. La cantidad de monobromuro de yodo que no se adiciona a los dobles enlaces oxida una disolucin de yoduro a yodo, y ste se determina por valoracin con una disolucin de tiosulfato de sodio. La reaccin de adicin se lleva a cabo en oscuridad para evitar que se produzcan reacciones laterales de radicales inducidos por la luz (y con ello un gasto aparente de halgeno mayor). Dado que el reactivo halogenante va preparado en actico glacial y es de concentracin aproximada y variable deber hacerse siempre un ensayo en blanco para calcular su equivalencia en yodo (Nielsen, 2003). Se expresa convencionalmente por el peso de yodo absorbido por cien partes en peso de materia grasa. La diferencia entre ambos mtodos es el agente halogenado, en el Mtodo de Hanus el agente es IBr, preparado de la mezcla de I2 con Br2 en cido actico y en el Mtodo de Wijs el agente es ICl preparado de la mezcla de ICl3 con I2 en medio de cido actico. (Pearson, 1993)

3.3 DETERIORO DE LIPIDOS.

3.3.1 Acidez titulable La acidez titulable es una medida del contenido de cidos grasos libres en una muestra. Su clculo se basa en la masa molar de un cido graso o una mezcla de cidos grasos. Normalmente se mide por titulacin directa en la disolucin y con indicador visual. (Boekenoogen, 1964)

R-COOH + KOH R-COOK + H2O

3.3.2 Determinacin del ndice de Perxidos. (Mtodo volumtrico) Se define como los miliequivalentes (mEq) de perxido por kilogramo de grasa. Es una determinacin volumtrica de la cantidad de grupos perxidos e hidroperxidos. La cuantificacin se basa en la reaccin del yoduro de potasio con los perxidos para liberar yodo, el cual es titulado con tiosulfato de sodio, empleando almidn como indicador (Nielsen, 1998).


Las reacciones que se llevan a cabo son:

ROOH + KI (exceso) ROH + KOH + I2

I2 + almidn + Na2S2O3 2NaI + almidn + Na2S4O6 (azul) (incoloro)

3.3.3 Determinacin de perxidos. Mtodo volumtrico-Micromtodo Tiene el mismo principio que el mtodo volumtrico descrito en el AOAC, es

propuesto por Crowe y White en 2001, donde demuestran que tiene una relacin lineal (r2= 0.998) adems de sensibilidad y precisin adecuadas empleando solo el 10% de los reactivos qumicos necesarios para el mtodo oficial.

3.3.4 Determinacin de ndice de Perxidos (Mtodo colorimtrico) Este es un mtodo colorimtrico indirecto. Se basa en que a una muestra que

contenga perxidos se adiciona un reactivo de hierro (II); en la muestra se llevar a cabo la oxidacin electroqumica de hierro (II) a hierro (III) (Jiang et al, 1992)y ste ltimo ser cuantificado por su reaccin de complejacin con tiocianato mostrando un color rojo caracterstico. (Kirk, 1991).

Fe2+ + ROOH + Fe3+ Fe3+ + SCN- -----> [FeSCN]2+

3.3.5 ndice de Kreis.

La floroglucina reacciona en medio cido con las grasas oxidadas, dando una coloracin roja, cuya intensidad aumenta con el deterioro, debido probablemente a la presencia de de aldehdo malnico o de aldehdo epihidrnico. (Aurand et al, 1987))

3.3.6 ndice de TBA

El cido tiobarbitrico (TBA por sus siglas en ingls) reacciona con productos de oxidacin secundaria de los lpidos. El malonaldehdo reacciona con TBA para producir un compuesto colorido se puede medir espectofotomtricamente. Debido a que no es especfica para el malonaldehdo algunas veces el resultado se reporta como sustancias reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS).


4 PROTENAS 4.1 Determinacin de protenas

4.1.1 Mtodo de Kjeldahl

En el trabajo de rutina se determina mucho ms frecuentemente la protena total que las protenas o aminocidos individuales. En general, el procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no protenas como las protenas verdaderas (Aurand et al, 1987) El mtodo se basa en la determinacin de la cantidad de Nitrgeno orgnico contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos:

a) La descomposicin de la materia orgnica bajo calentamiento en presencia de cido sulfrico concentrado.

b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra Durante el proceso de descomposicin ocurre la deshidratacin y carbonizacin de la materia orgnica combinada con la oxidacin de carbono a dixido de carbono. El nitrgeno orgnico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolucin como sulfato de amonio. La recuperacin del nitrgeno y velocidad del proceso pueden ser incrementados adicionando sales que abaten la temperatura de descomposicin (sulfato de potasio) o por la adicin de oxidantes (perxido de hidrgeno, tetracloruro, persulfatos o cido crmico) y por la adicin de un catalizador. (Nollet, 1996) El mtodo de Kjeldahl consta de las siguientes etapas:

a) Digestin Protena + H2SO4 CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

b) Destilacin (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + NH3 + H2O

(recibiendo en HCl)

(recibiendo en H3BO3) NH3 + H3BO3 NH4H2BO3

c) Titulacin

(si se recibi en HCl) NH4Cl + HCl + NaOH NH4Cl + NaCl + H2O

(si se recibi en H3BO3) NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4Cl

En la mezcla de digestin se incluye sulfato sdico para aumentar el punto de ebullicin y un catalizador para acelerar la reaccin, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el


destilado se retiene o bien por un cido normalizado y se valora por retroceso, o en cido brico y valora directamente. El mtodo Kjeldahl no determina, sin embargo, todas las formas de nitrgeno a menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. (Pearson, 1993) Para convertir el nitrgeno a protena se emplea el factor de 6.25 el cual proviene de la consideracin de que la mayora de las protenas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrgeno.

25.616

Pr100==

g)itrgeno

otenagfactor

Tabla 3. Factores de conversin de nitrgeno a protena para algunos alimentos

Alimento % N en protena Factor Huevo o carne 16.0 6.25 Leche 15.7 6.38 Trigo 18.76 5.33 Maz 17.70 5.65 Avena 18.66 5.36 Soya 18.12 5.52 Arroz 19.34 5.17

(Nielsen, 1998)

4.1.2 Absorcin a 280 nm. La mayora de las protenas muestran una absorcin a 280 nm., la cual se atribuye al grupo fenlico de la tirosina y al grupo indlico del triptofano. La cuantificacin de protenas basada en la absorcin en la regin de UV, tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daa o destruye durante la determinacin. Se toma en cuenta la absorcin del disolvente, ya que este puede absorber en la misma regin. Este mtodo sufre interferencias de compuestos que contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una comparacin con una protena estndar, de la que se debe conocer su composicin. (Nollet, 1996)

Fig. 6. Estructura qumica de los aminocidos aromticos


4.1.3 Mtodo de Biuret El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la formacin de un complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta caracterstico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El complejo se basa en la desprotonacin de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los tomos de oxigeno y de nitrgeno del pptido (Ver Figura 7). Despus de la adicin del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloracin de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminocidos libres que forman buffer en configuracin tris y amoniaco. (Nollet, 1996)

N

NH

H

O

O

R

R

N

N H

H

O

O

R

R2+Cu

Fig. 7. Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptdicos

4.1.4 Mtodo de Lowry El mtodo de Lowry et al, 1951 combina la reaccin de Biuret con la reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu (cidos fosfomolbdico y fosfotngstico) por la oxidacin de tirosina, triptofano, cistena, cistina de las cadenas polipeptdicas (Nielsen, 1988). El proceso de oxido-reduccin se acompaa de la formacin de un color azul caracterstico. Los quelatos de cobre en la estructura del pptido facilitan la transferencia de electrones de los grupos funcionales amino al cromforo cido. Este mtodo es til para determinar pequeas cantidades de protena en una disolucin. El desarrollo de color es


dependiente en gran cantidad del pH, que se debe mantener entre 10 y 10.5. (Nollet, 1996)

Fig. 8. Esquema general de las reacciones que se llevan a cabo en el mtodo de Lowry

4.1.5 Mtodo turbidimtrico La turbidez producida cuando una protena se mezcla con alguno de los precipitantes comunes (cido tricloroactico 3-10%, cido sulfosaliclico y ferrocianuro de potasio en cido actico) para protenas en bajas concentraciones se puede utilizar como un ndice de la concentracin de protenas. Las tcnicas turbidimtricas son rpidas y convenientes, sin embargo las principales desventajas que presentan es que las protenas difieren en la velocidad de precipitacin as como no permiten diferenciar entre protenas y compuestos insolubles en cidos tales como cidos nucleicos. (Layne, 1957)

4.1.6 Unin de colorantes

Controlando el pH y la fuerza inica del medio los grupos funcionales cidos y bsicos de las protenas pueden interactuar con grupos orgnicos de carga opuesta. Al realizarse la unin se presenta coloracin o bien un cambio de sta. Comnmente se usan colorantes sulfonados los cuales reaccionan a pH cido con el grupo -amino de la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un nmero limitado de -amino terminales. (Nollet, 1996)


Tabla 4. Comparacin entre los mtodos usados para determinacin de protenas

Mtodo Ventajas Desventajas

Kjeldahl

Es apropiado para varios tipos de productos

Su alta confiabilidad y disponibilidad

Esta incluido en los mtodos aprobados por las organizaciones internacionales

Llega haber interferencia de compuestos nitrogenados no proteicos

Durante la digestin se produce demasiado humo

Uso de catalizadores caros o txicos

Baja sensibilidad Tarda demasiado tiempo

Absorcin a 280nm

Rpida y no destructiva No se necesitan reactivos Alta sensibilidad Baja dependencia de la

respuesta de la seal a la composicin del aminocido

Baja interferencia de cidos nucleicos y nucletidos

La interferencia de otros compuestos que absorban en UV

Se necesita usar muestras limpias y lmparas relativamente nuevas

Biuret

No hay interferencia de aminocidos libres

Pequea influencia de la composicin del aminocido en el desarrollo de color

La operacin es simple y se puede manejar nmero grande de muestras

Interferencia de amoniaco, buffer, detergentes

Baja sensibilidad

Lowry Alta sensibilidad Fcil de operar Fcil de manejar un gran

numero de muestras

Dependencia del color con la composicin del aminocido

Interfieren un buen nmero de compuestos

Inestabilidad del reactivo Folin-Ciocalteau a pH alcalino

La curva estndar no es lineal para altas concentraciones de protenas por lo tanto es necesario diluir mucho antes de medir

(Nollet, 1996)


4.2 Extraccin de protenas. (Mtodo de Osborne y Mendel).

El mtodo se fundamenta en la relacin estructura-solubilidad de las protenas. Por ejemplo, se sabe que la zena que es soluble en un alcohol fuerte o en disoluciones alcalinas diluidas, pero es insoluble en agua o en soluciones neutras inorgnicas. Las glutelinas por ejemplo es insoluble en agua, en soluciones salinas y en alcohol, y bastante soluble en sosa y potasa.

Es importante notar que la mayora de nitrgeno proveniente de protenas es soluble en alcohol y en disoluciones alcalinas. Las globulinas, albminas y prolinas son solubles en disoluciones alcalinas diluidas. (Osborne, 1914)

4.3 Propiedades funcionales de las protenas

4.3.1 Capacidad de gelificacin

Cuando las protenas desnaturalizadas se agregan para formar una red proteica ordenada, al proceso se le denomina gelificacin.

La gelificacin es una propiedad funcional muy importante de algunas protenas, se utiliza, no slo para formar geles slidos viscoelsticos, sino tambin para mejorar la absorcin de agua, los efectos espesantes, la fijacin de partculas (adhesin) y pata estabilizar emulsiones y espumas.

Los mecanismos y las interacciones responsables de la formacin de las redes tridimensionales proteicas son el despliegue y se desnaturaliza antes de la interaccin y agregacin ordenada protena-protena. La formacin de las redes proteicas se considera el resultado de un balance entre las interacciones protena-protena y protena-disolvente (agua) y entre las fuerzas atractivas y repulsivas entre cadenas polipeptdicas adyacentes. Entre las fuerzas atractivas implicadas se encuentran las interacciones hidrofbicas (potenciadas por las temperaturas elevadas) electrostticas (como los puentes de calcio (II) y otros cationes divalentes), los puentes de hidrgeno (potenciados por el enfriamiento) y los enlaces disulfuro. (Fennema, 1993)

4.3.2 Capacidad de emulsificacin

La Capacidad de emulsificacin es el volumen de aceite que puede ser emulsificado por cada gramo de protena, antes de que se produzca la inversin de fases.

Las caractersticas de una emulsin y los resultados obtenidos en los dos tipos de ensayos mencionados se ven influidos por mltiples factores: tipo y geometra del equipo utilizado, intensidad del input de energa, velocidad de adicin del aceite,


volumen de la fase grasa, temperatura, pH, fuerza inica, presencia de azcares y agentes de superficie de bajo peso molecular, exposicin al oxgeno, tipo de grasa, concentracin de las protenas solubles. (Fennema, 1993)

4.3.3 Capacidad de espumado

Las espumas suelen ser dispersiones de burbujas de gas en una fase continua, lquida o semislida, que contiene un agente con actividad de superficie, soluble. En muchos casos, el gas es aire (y en ocasiones dixido de carbono) y la fase continua una disolucin o suspensin acuosa de protenas.

Se puede producir espuma batiendo o agitando una disolucin proteica en presencia de abundante fase gaseosa.

La formacin de espuma requiere la difusin de las protenas solubles hacia la interfase aire/ agua, donde deben desplegarse, concentrarse y extenderse rpidamente, para rebajar la tensin interfasial. El desplegamiento previo de las protenas globulares, a travs de un calentamiento moderado, la exposicin a agentes desnaturalizantes, como sustancias reductoras de los grupos disulfuro, o la proteolisis parcial, mejoran la orientacin en la interfase y proporcionan a las protenas una mayor capacidad de formacin de espuma.

Para estabilizar una espuma es preciso formar una pelcula proteica, impermeable al aire, gruesa, elstica, cohesiva y continua en torno a cada burbuja.

La capacidad de espumado se define como los mililitros de espuma por mililitro de lquido. (Fennema, 1993)

4.3.4 Capacidad de retencin de agua

Se determina la cantidad de agua necesaria para lograr un estado de saturacin de la protena (cantidad mxima de agua retenida, medida por centrifugacin). En este mtodo se mide tanto el agua ligada (agua de hidratacin, no congelable) como el agua capilar, retenida fsicamente entre las molculas proteicas.

La concentracin proteica, el pH, la temperatura, el tiempo, la fuerza inica y la presencia de otros componentes afectan a las fuerzas que toman parte en las interacciones protena-protena y protena-agua.

La absorcin total de agua aumenta con la concentracin proteica.

Los cambios de pH, a travs de su influencia sobre la ionizacin y la magnitud de la carga neta de la molcula proteica, alteran las fuerzas interactivas, atractivas o repulsivas, de la protena y modifican su aptitud para asociarse con el agua.


La fijacin de agua por las protenas desciende generalmente a medida que se eleva la temperatura, debido a la disminucin de los puentes de hidrgeno. El calentamiento provoca la desnaturalizacin y la agregacin, pudiendo esta ltima reducir el rea superficial y el nmero de grupos amino polares disponibles para fijar agua. Por otro lado, cuando se calientan protenas con una estructura muy compacta, la disociacin y el desplegamiento ocasionados pueden exponer enlaces peptdicos y cadenas laterales polares previamente ocultos, lo que aumenta la fijacin.

El tipo y la concentracin de iones ejercen un considerable efecto sobre la absorcin de agua. Generalmente, se establece una competencia en la interaccin entre el agua, la sal y las cadenas laterales de los aminocidos. (Fennema, 1993)


5 ANALISIS DE CARBOHIDRATOS

5.1 CARBOHIDRATOS TOTALES

5.1.1 Mtodo de fenol-sulfrico

Este mtodo propuesto por Dubois et al en 1956 se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensible a cidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratacin simple, si se contina el calentamiento y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensacin de compuestos fenlicos y con heterociclos con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms comn es con fenol. Este mtodo es fcil, eficaz y rpido.

Todos los azcares como oligosacridos y polisacridos pueden ser determinados, recordando que stos bajo hidrlisis cida producen monosacridos.

La forma en que procede la reaccin no es estequiomtrica y depende de la estructura del azcar, por lo tanto se realiza una curva patrn. (Nielsen, 1998)

5.2 ANALISIS DE POLISACARIDOS

5.2.1 Extraccin selectiva de almidn Los dos tipos de molculas que se pueden encontrar en el almidn difieren apreciablemente en sus solubilidades en disolventes acuosos, por ejemplo, la extraccin en agua caliente remover una parte considerable de amilosa y dextrinas, dejando una parte de amilopectina. (Southgate, 1991)

5.2.1.1 Con cloruro de calcio

La extraccin con cloruro de calcio ha sido utilizada ampliamente en el anlisis de almidones en cereales por mtodos polarimetritos, dando resultados reproducibles. Otros polisacridos son solubles en este reactivo y es necesario tener cuidado en la aplicacin de este mtodo a otros tipos de alimentos. (Southgate, 1991)

5.2.1.2 Con cido perclrico

El almidn se extrae de una muestra seca con cido perclrico y se precipita como complejo yodurado el cual, se descompone antes de que se hidrolice el almidn. (Southgate, 1991)


5.2.1.3 Con etanol y cido perclrico

El mtodo se diseo originalmente para cereales y envuelve la extraccin de azucares libres con etanol acuoso y la extraccin del almidn con cido perclrico del residuo, con mtodos como el de antrona. (Southgate, 1991)

5.2.1.4 Con dimetil sulfxido (DMSO)

El almidn se dispersa en DMSO y luego se convierte cuantitativamente en D-glucosa con -amilasa termoestable, llevando a cabo la polimerizacin y de polimerizacin del almidn.

Una glucoamilasa completa la accin de la -amilasa para determinar la D-glucosa usando un reactivo contiene una parte incolora que se oxida a un compuesto colorido por medio del peroxido de hidrogeno proveniente de la glucosa. (Nielsen, 1998)

5.2.2 Cuantificacin de almidn

5.2.2.1 Por hidrlisis cida directa

La hidrlisis cida del almidn da un rendimiento casi terico de glucosa y este proceso ha sido el principio de varios mtodos analticos.

La fuerza del cido utilizado para la hidrlisis puede variar pero se sabe que una disolucin 0.2 M de cido sulfrico por 4 horas en reflujo convierte el almidn en glucosa de tal suerte que el uso de cidos ms fuertes es innecesario. La limitante del proceso es el contenido de protenas y cidos grasos en el alimento ya que dan productos de condensacin en estas condiciones. (Southgate, 1991)

5.2.2.2 Por reaccin colorida con yodo

La configuracin de la molcula de almidn parece ser helicoidal con un ncleo relativamente largo. La molcula tiene dos tipos de molculas: amilosa y amilopectina, las amilosas son molculas lineales, en las cuales la glucosa esta unida por enlaces -1,4, la amilosa se dispersa rpidamente en agua pero las cadenas se recombinan y sufren un proceso de retrogradacin. La amilosa forma complejos con el yodo y es responsable del color azul caracterstico del complejo almidn-yodo. El complejo con yodo es del tipo de inclusin.

La molcula de amilopectina ha dado evidencia de no formar complejos estables con yodo pero dan un color rojo plido en su presencia. La proporcin de amilosa y


amilopectina en el almidn tiene efectos importantes en las propiedades fsicas del almidn.

La determinacin de amilosa en el almidn normalmente envuelve la formacin de complejos con yodo y la titulacin potenciomtrica de yoduro. (Southgate, 1991)

Fig. 9. Complejo de inclusin del yodo con la amilosa

5.2.2.3 Por precipitacin de complejos con yodo

El almidn se extrae de una muestra seca con cido perclrico y se precipita como complejo yodurado el cual, se descompone antes de que se hidrolice el almidn. (Southgate, 1991).

5.2.3 Anlisis de pectinas

Las soluciones pcticas son solubles en agua con una alta proporcin de galacturonanos o galacturonorhamnanos, aunque tambin arabinanos, galactanos y arabinogalactanos han sido aislados de la fraccin pctica de varias plantas.

Las soluciones pcticas incluyen polisacridos que pueden ser extrados con agua caliente. Es usual aadir un agente quelante como EDTA u oxalato de amonio al medio de extraccin para liberar aquellas pectinas que estn presentes como sales de calcio. (Southgate, 1991)

5.2.4 Determinacin de Fibra diettica La fibra diettica se define como los polisacridos y lignina que no son digeridos por enzimas humanas (Lee y Prosky, 1995). Los mtodos (AOAC 985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se fundamentan en aislar la fraccin del inters con la precipitacin selectiva y despus determinar su peso. Una muestra


gelatinizada de alimento seco, desengrasado se digiere enzimticamente con alfa-amilasa, amiloglucosidasa y proteasa para hidrolizar al almidn y la protena. El contenido total de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95% a la solucin para precipitar toda la fibra. La solucin entonces se filtra, se recupera, se seca y se pesa, el residuo se reporta como fibra. (Prosky et al, 1984, Prosky et al, 1985) Alternativamente, los componentes solubles e insolubles en agua de la fibra pueden ser determinados filtrando la muestra enzimtico-digerida (Mtodo 991.43, Horwitz, 2005). La fibra soluble se encuentra en la solucin del lquido filtrado, y la fibra insoluble en el residuo. El componente insoluble se recoge del filtro, se seca y se pesa. El componente soluble es precipitado de la solucin agregando el alcohol del 95% al lquido filtrado, y entonces recuperado por la filtracin, secado y pesado. Ambas metodologas se corrigen determinando protena y de ceniza de las fracciones. Estos mtodos han sido reportados oficialmente por el AOAC y son ampliamente utilizados en la industria alimentaria para determinar el contenido de la fibra de una variedad de alimentos. Su desventaja principal es que tiende a sobrestimar el contenido de la fibra de los alimentos que contienen altas concentraciones de azcares simples, por ejemplo, frutas deshidratadas, posiblemente porque estos carbohidratos son atrapados en los precipitados formados cuando se agrega el etanol

5.3 Azcares en solucin

Se requiere que al tratar estas muestras se remuevan sustancias que puedan interferir. Los pigmentos y otras sustancias coloridas interfieren con procedimientos colorimtricos y otros mtodos, particularmente con los mtodos de reduccin. Para decolorar se han utilizado una gran variedad de mtodos como el uso carbn activado y tratamientos con sales de plomo.

Cuando se usan sales de plomo se debe de evitar el uso de acetato de plomo bsico para medidas polarimtricas, en cuyo caso se prefiere acetato de plomo neutro, este se usa con una solucin acuosa saturada y el exceso se elimina con oxalato de plomo u oxalato de sodio. (Southgate, 1991)

5.3.1 Carbohidratos solubles totales

5.3.1.1 ndice de refraccin

Cuando la radiacin electromagntica pasa de un medio a otro, cambia de direccin, se dobla o se refracta. La relacin entre el ngulo de incidencia al seno del ngulo de refraccin se llama ndice de refraccin (RI).


El RI vara con la naturaleza del compuesto, la temperatura, la longitud de onda de la luz y la concentracin del compuesto. Si las tres primeras variables se hacen constantes la concentracin del compuesto se puede determinar midiendo el RI, de tal forma que el RI se utiliza para determinar slidos totales en disolucin. El uso del RI para determinar concentraciones es preciso solamente para sacarosa pura u otras disoluciones puras, tambin se utiliza para obtener concentraciones aproximadas de azucares para productos lquidos en cuyo caso la solucin debe ser clara. Los refractmetros pueden leer directamente en unidades de sacarosa. (Nielsen, 1998)

5.3.2 Determinacin de carbohidratos reductores

5.3.2.1 Mtodo cido dinitrosaliclico (DS)

En disolucin alcalina el azcar se hidroliza produciendo un compuesto que se reduce a un grupo nitro del DNS, para dar el producto monoamino correspondiente. Esta reaccin da un producto colorido en solucin alcalina. El original procedimiento de Dahlquist ha sido modificado en un proceso automatizado para anlisis de azucares totales producidos por la hidrlisis de polisacridos que no contengan almidn. Para este se requiere tener estndares similares a la muestra. (Southgate, 1991) La reaccin que se lleva acabo es la siguiente:

CHO

OHH

HHO

OHH

OHH

CH2OH

COO-Na+

OH

NO2O2N

+ + 3 OH-

2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal

sodium 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoate

COO-

OHH

HHO

OHH

OHH

CH2OH

COO-Na+

OH

NH2O2Nsodium 3-amino-2-hydroxy-5-nitrobenzoate

3

3

(Nielsen, 1998)

5.3.2.2 Mtodo de Fehling

Cuando un azcar reductor se calienta en condiciones bsicas se degrada y algunos de los productos de degradacin reducen los iones cpricos para formar oxido cuproso. (Pomeranz y Meloan, 2000)


Una amplia variedad de mtodos se han utilizado para determinar azucares reductores, todos estos han sido variaciones del mtodo de Fehling. Estas variaciones han sido para cada tipo de alimento, en cualquier caso el principal logro de modificaciones ha sido mejorar la precisin de reduccin y eliminar cualquier factor que interfiera con la produccin de oxido de cobre, de los factores estudiados, la alcalinidad del reactivo, la proporcin, el tiempo de calentamiento, la concentracin del azcar, parecen ser los mas importantes.

A partir de esto, diferentes tcnicas han sido utilizadas para determinar el oxido cuproso que se forma y se han obtenido datos de calibracin; de estos mtodos los mas usados son el mtodo de Lane-Eynon y el mtodo Munson y Walker.

En el mtodo Lane-Eynon se titula con el reactivo de Fehling caliente en dos etapas, primero se aade una cantidad de reactivo de Fehling tal que se lleve a cabo la total reduccin y despus se determina el punto final con azul de metileno por goteo, es necesario un control de la temperatura y se sugieren dos titulaciones. (Pomeranz y Meloan 2000)

Tcnicas de anlisis de alimentos 34

PROCEDIMIENTOS

6 DETERMINACION DE HUMEDAD

6.1 Mtodo por secado en estufa (Nielsen, 2003) Pesar de 2 a 3 g de muestra en un pesafiltro con tapa (previamente pesado despus de tenerlo a peso constante 2 hrs. a 130C aprox.). Secar la muestra en la estufa 2 hrs. a 100-110C. Retirar de la estufa, tapar, dejar enfriar en el desecador y pesar tan pronto como se equilibre con la temperatura ambiente. Repetir hasta peso constante. Calcular el porcentaje de humedad, reportndolo como prdida por secado a 100-110C.

6.2 Mtodo por secado en estufa de vaco (Nielsen, 2003) Pesar de 2 a 3 g de muestra en un pesafiltro con tapa (previamente pesado despus de tenerlo a peso constante 2 hrs. a 130C aprox.). Secar la muestra al menos por 24 hrs. en la estufa conectada a vaco a una temperatura de 70C como mximo. Retirar de la estufa, tapar, dejar enfriar en desecador y pesar tan pronto como se equilibre con la temperatura ambiente. Repetir la operacin hasta peso constante. Calcular el porcentaje de humedad, reportndolo como prdida por secado en estufa de vaco a 701C.

6.3 Mtodo de secado en Termobalanza (Kirk et al, 1996) Pesar de 8 a 10 g de muestra y colocarlos en una charola de aluminio formando una capa lo ms homognea posible. Colocar la charola con muestra en el espacio destinado para ello en la termobalanza y encender el equipo. Registrar la prdida de peso o en su caso, el porcentaje de humedad (segn el equipo) despus de 10-15 min o bien cuando ya no haya variacin en la lectura. Calcular el porcentaje de humedad. Nota: Dependiendo del equipo, es necesario regular la intensidad de la lmpara para evitar que la muestra se queme y el resultado sea errneo.

6.4 Mtodo de destilacin azeotrpica (Nielsen, 2003) Pesar 10-25 g de muestra en un matraz bola de 500 mL con junta esmerilada. Cubrir la muestra con tolueno (100 mL aprox.). Acople al matraz un colector para destilacin azeotrpica y un refrigerante a este ltimo en posicin de reflujo conectado al flujo de agua. Llene el vstago graduado del colector con el mismo solvente desde la parte


superior del refrigerante. Destile lentamente al principio e incrementando la velocidad hasta que toda el agua haya sido destilada. Poco antes del final de la destilacin, lave el refrigerante con un poco de solvente desde la parte superior. Contine la destilacin hasta que ya no vare la cantidad de agua destilada en el tubo colector. Lea el volumen directamente del tubo colector y calcule el porcentaje de humedad considerando la densidad del agua.


7 DETERMINACION DE MINERALES

7.1 Mtodo cenizas totales (calcinacin) (Kirk et al, 1996) Colocar a peso constante un crisol 2 hrs. aproximadamente en la mufla a 600C. Pesar de 3 a 5 g de muestra en el crisol (la muestra no debe sobrepasar la mitad del crisol) previamente pesado. Calcinar la muestra, primeramente con un mechero en la campana hasta que no se desprendan humos y posteriormente meter a la mufla 2 hrs. cuidando que la temperatura no pase de 550C. Repetir la operacin anterior si es necesario, hasta conseguir unas cenizas blancas o ligeramente grises, homogneas. Enfriar en desecador y pesar. NOTA. No colocar los crisoles calientes en la mesa de la mufla. Calcular el porcentaje de cenizas.

7.2 Mtodo cenizas totales (digestin hmeda) (NOM-117-SSA1-1994) Pesar 5 g de muestra en un vaso de precipitados, adicionar 10 mL de cido ntrico concentrado, calentar durante una hora hasta la obtencin de color traslcido, enfriar, recuperar, filtrar en matraz aforado de 100 mL, aforar con agua. Tomar una alcuota de 10 mL y colocarlo en un vaso de precipitados de 250 mL a peso constante, evaporar a sequedad, colocar en estufa hasta peso constante. Calcular por diferencia de peso la cantidad de minerales en la alcuota y relacionarlo con el aforo total.

7.3 Determinacin de minerales

7.3.1 Determinacin de cloruros en la muestra. Mtodo de Mohr (Kirk et al, 1996) Medir 10 mL de una solucin al 1% de su muestra en un matraz Erlenmeyer de 150 mL, adicionar 15 mL de agua destilada y 1 mL de cromato de potasio al 5%, posteriormente titular con una solucin patrn de nitrato de plata 0.1N hasta que aparezca un precipitado seguido de un color rojo ladrillo que permanezca por lo menos 30 segundos. NOTA. En caso de que la solucin problema presente slidos en suspensin filtre antes de realizar la determinacin.


7.3.2 Determinacin de cloruros en las cenizas Mtodo de Mohr (Nielsen, 2003) Obtener por calcinacin a 500-550C las cenizas. En un matraz cnico o en crisol de porcelana blanca lavar las cenizas con un mnimo de agua. Agregar 1 mL de solucin de cromato de potasio al 5% y titular con solucin 0.1M de nitrato de plata hasta que aparezca un color naranja. Calcular el porcentaje de cloruros en las cenizas

7.3.3 Determinacin de Fe en las cenizas (NMX-F-503-1987)

Dilucin de las cenizas: Al crisol fro aadir con pipeta y en la campana 2mL de HCl concentrado para disolver las cenizas. Evaporar en la campana, enfriar aadir 1 mL de HCl conc. y 3.5 mL de agua destilada, con un agitador de vidrio tratar de disolver las cenizas en su totalidad. Pasar cuantitativamente el lquido en un matraz aforado de 50 mL. Volver a lavar el crisol con agua por dos o tres veces ms, pasando los lquidos de lavado al matraz y despus aforar.

Cuantificacin de hierro: Filtrar la solucin de cenizas y tomar alcuotas de 10 mL. Desarrollar el color aadiendo en el siguiente orden: 1 mL de solucin clorhidrato de hidroxilamina (al 10%) y agitar, 5 mL de buffer de acetatos y agitar y 1 mL ortofenantrolina al 1% y agitar. Dejar en reposo entre 10 y 15 min. Leer a 530 nm frente a un blanco preparado con agua tratada de la misma manera. Es muy importante aadir los reactivos en el orden descrito.

La concentracin de hierro se obtiene interpolando en una curva patrn preparada a partir de una solucin de sulfato ferroso amoniacal tratada de la misma forma, en concentraciones de 0.01 a 0.1 mg/mL de hierro.

7.3.4 Determinacin de Calcio Titulacin con EDTA (APHA, 1995) A 50 mL de muestra se aaden 2 mL de solucin de hidrxido de sodio 1N o un volumen suficiente para obtener un pH de 12-13 y una punta de esptula de indicador, y se valora con solucin de EDTA 0,01M hasta viraje de rosa a prpura.


8 ANLISIS DE LPIDOS

8.1 EXTRACCIN Y CUANTIFICACION DE LPIDOS

8.1.1 Mtodo de Soxhlet (James, 1999) Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o piedras de ebullicin en la estufa a 100C, aproximadamente 2 hrs. Pesar de 4 a 5 g de muestra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de celulosa, tapar con un algodn (No apretar el algodn contra la muestra) y colocar el cartucho en el extractor. Conectar el matraz al extractor, en el que se debe encontrar el cartucho con la muestra, y posteriormente conectar ste al refrigerante. (No poner grasa en las juntas). Agregar dos cargas del disolvente (generalmente ter etlico) por el refrigerante y calentar el matraz con parrilla a ebullicin suave. Para verificar que se ha extrado toda la grasa, dejar caer una gota de la descarga sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa. Una vez extrada toda la grasa, quitar el cartucho con la muestra desengrasada, seguir calentando hasta la casi total eliminacin del disolvente, recuperndolo antes de que se descargue. Quitar el matraz y secar el extracto en la estufa a 100C por 30 min., enfriar y pesar. Calcular el porcentaje de grasa.

8.1.2 Mtodo de Goldfish (Pomeranz y Meloan, 2000) Colocar un vaso para Goldfish en la estufa a 100C hasta peso constante, aproximadamente 2 hrs. Pesar de 4 a 5 g de muestra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de celulosa, tapar con un algodn. Situar el cartucho en un recipiente con el fondo perforado y colocarlo en el sostenedor del equipo. Adicionar en el vaso para Goldfish aproximadamente 40 mL del disolvente ter etlico) y colocarlo en el equipo mediante un anillo de hierro con empaque de hule. Subir la parrilla girando hacia un lado y al contrario. Calentar hasta la extraccin completa de la grasa. Para verificar que se ha extrado toda la grasa, dejar caer una gota de la descarga sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa

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