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Analizador de Elisa

1 Descripción

El analizador de ELISA es un espectrofotómetro especializado, diseñado paraefectuar la lectura de los resultados de una técnica que se utiliza para determinar la presencia de anticuerpos o antígenos específicos presentes en una muestra. Latécnica se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida,mediante anticuerpos que, directa o indirectamente, producen una reacción cuyoproducto puede ser leído por el espectrofotómetro. Se le conoce también con elnombre de Lector de ELISA. La palabraELISA es el acrónimo de las palabras en lengua inglesa Enzyme-Linked mmunosorbent   Assay .Emplea reactivos económicos, fáciles de conseguir y es utilizada en combinacióncon diferentes métodos de espectrofotometría para la posterior identificación delantígeno.

Figura 1

Fuente: http://articulo.mercadolibre.com.ve/MLV-24139913-analizador-de-micro-

elisa-marca-mindray-_JM

2 Propósito

El analizador de ELISA se utiliza para leer el resultado de las pruebas efectuadas,

utilizando la técnica de ELISA, la cual tiene aplicación directa en inmunología y enserología; permite confirmar la presencia en el organismo de anticuerpos oantígenos de un agente infeccioso, vacunal o autoanticuerpos –artritis reumatoide,por ejemplo–, entre otras aplicaciones.

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3 Principio de funcionamiento

El analizador de ELISA es un espectrofotómetro especializado. A diferencia de los espectrofotómetros convencionales que permiten efectuar lecturas en un rango amplio de longitudes de onda, este dispone de filtros o rejillas

de difracción que limitan el rango de longitudes de onda a aquellas que se utilizanen la técnica ELISA, la cual generalmente se realiza con longitudes de ondacomprendidas entre los 400 y los 750 nm –nanómetros–.

El sistema óptico utilizado por muchos fabricantes utiliza la fibra óptica para llevar la luz hasta los pozos de la placa, donde se encuentra la muestra bajo análisis.La luz que atraviesa la muestra tiene un diámetro que varía entre 1 y 3 mm. Unsistema de detección recibe la energía lumínica, proveniente de la muestra, laamplifica, determinan la absorbancia y, a través de un sistema de lectura, laconvierte en datos que permiten interpretar el resultado de la prueba.

Las muestras del ensayo de ELISA se colocan en placas de diseño especial, lascuales disponen de un número definido de pozos o vasos, en los cuales se lleva acabo el procedimiento o ensayo. Son comunes las placas de 8 columnas por 12filas, con un total de 96 pozos. También existen placas con un mayor número depozos.La ubicación de los sensores ópticos en el analizador de ELISA varía dependiendode los fabricantes. Algunos los colocan sobre la placa porta muestras, mientrasque otros los ponen directamente bajo los pozos de la placa.

4 Equipos requeridos para efectuar ensayos de ELISA

Para desarrollar la técnica de ELISA se requiere disponer al menos de lossiguientes equipos:1. Un analizador de ELISA.2. Un lavador de ELISA.3. Un sistema dispensador de líquidos. (Pueden usarse pipetas multicanal).4. Una incubadora especializada para las placas.La ilustración que se presenta a continuación da una idea de la forma en que seencuentran interrelacionados los equipos mencionados.

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Figura 2

Fuente: Manual de mantenimiento para equipo de laboratorio, OrganizaciónPanamericana de la Salud, Washington D. C., 2005

4.1 Fases mecánicas de un ensayo utilizando la técnica de ELISAUso de equiposCuando se realiza una prueba de ELISA, generalmente se siguen estos pasos:

1. Utilizando el lavador de ELISA o micro placas, se efectúa un primer lavadode la placa.

Figura 3

Fuente: http://www.zonamedicasac.com/lavadora.html

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2. Mediante el dispensador de líquidos o las pipetas multicanal, se llenan losvasos o pozos de las placas con las soluciones preparadas para ser utilizadas en el ensayo.

Figura 4

Fuente: http://www.cannabiscafe.net/foros/showthread.php?t=69381

3. A continuación, se coloca la placa en la incubadora donde, a temperaturacontrolada, se lleva a cabo un conjunto de reacciones.Las etapas 1, 2 y 3 se pueden repetir varias veces dependiendo del ensayo, hastaque se logre que las muestras colocadas en las placas hayan terminado susreacciones.

4. Finalmente, cuando se han completado las reacciones químicas, se lleva laplaca al analizador de ELISA y se efectúan las lecturas que permiten emitir undiagnóstico.

4.2 Fases químicas de la técnica de ELISASe presenta a continuación un breve resumen de cómo funciona la técnica deELISA, desde el punto de vista químico1.1. Se recubren los pozos de una placa con anticuerpos o antígenos.2. Se añaden las muestras, controles y estándares a los pozos de la placa y seincuban a temperaturas que oscilan entre la temperatura ambiente y 37 °C, por un

período de tiempo determinado, según características de la prueba. Durante laincubación, una parte del antígeno de la muestra se une al anticuerpo delrecubrimiento de la placa, o el anticuerpo de la muestra se une con el antígenoubicado en el recubrimiento de la placa, en función de su presencia y cantidad enla muestra analizada.3. Después de la incubación, las entidades no unidas –antígenos o anticuerpos–se lavan y se retiran de la placa, utilizando el lavador de ELISA que utiliza unbuffer de lavado adecuado.

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4. A continuación, se añade un anticuerpo secundario, denominado el conjugado,el cual tiene una enzima que reaccionará con un sustrato para producir un cambiode color.5. Se inicia entonces un segundo período de incubación, durante el cual elconjugado se unirá al complejo antígeno-anticuerpo en los pozos de la placa.

6. Después de la incubación, se realiza un nuevo lavado para retirar de los pozosde la placa cualquier vestigio del conjugado no unido.7. Se añade un sustrato. La enzima reaccionará con el sustrato y causará uncambio de color en la solución, brindando un medio para medir la cantidad deconjugado que a la vez dirá cuánto complejo antígeno- anticuerpo está presente.Otro período de incubación permitirá que esta reacción tenga lugar.8. Cumplido el tiempo de incubación, se añade un reactivo para detener lareacciónsustrato-enzima y prevenir cambios adicionales de color. Generalmente estereactivo es un ácido diluido.9. Finalmente, se efectúa la lectura de la placa en el analizador de ELISA. Losvalores de los resultados se usan para determinar las cantidades de antígeno oanticuerpo específico presentes en la muestra.

 Algunos de los pozos en la placa se destinan para colocar estándares y controles.Los estándares permiten definir los puntos de corte (cut off ).Los controles son cantidades conocidas que se usan para medir el éxito delensayo, evaluando los datos recibidos contra las concentraciones establecidaspara cada control. El proceso antes descrito es común, aunque muchas pruebasde ELISA tienen variantes.5 LecturaLa placa puede ser leída visualmente o con un lector de placas manual oautomático.5.1 Lectura inmediata en forma visual.Los pocillos correspondientes a muestras positivas serán de color amarillo ypodrán ser fácilmente diferenciados de los pocillos negativos, los que seránincoloros o presentarán una leve coloración amarilla.5.2 Lectura con un Lector de placas de ELISA.Lea la placa con un lector manual o automático para placas de ELISA usando unfiltro de 450 nm. Se recomienda un lector de placas con capacidad de lectura de2 o más unidades de absorbancia.6 Cálculos del cut off Cut Off = Promedio Control Negativo + 0,260Ejemplo de cálculo:1) Promedio de Control Negativo (n=3) = 0,0862) Promedio de Control Positivo (n=3) = 2,7003) Cut Off = 0,086 + 0,260 = 0,3466.1 Interpretaciones de resultadosSi la razón Control Positivo/Control Negativo es menor que 10, se invalida elensayo.Una muestra será positiva cuando su absorbancia sea mayor que el valor delCut Off.

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Una muestra será negativa cuando su absorbancia sea menor que el valor deCut Off. Si la absorbancia de una muestra está en el valor del Cut Off ± 10%,repita el ensayo en duplicado. Si la lectura persiste en esta zona, considere lamuestra como sospechosa para BKD.7 Servicios requeridos

Para que el analizador de ELISA opere correctamente, es necesario verificar lossiguientes puntos:1. Un ambiente limpio, libre de polvo.2. Una mesa de trabajo estable. Lo recomendable es que la misma esté alejada deequipos que generen vibraciones –centrífugas, agitadores–, que tenga un tamañoadecuado que permita ubicar, al lado del analizador de ELISA, los equiposcomplementarios requeridos para efectuar la técnica en mención: lavadores,incubadora, dispensador y computador con periféricos.3. Una fuente de suministro eléctrico de acuerdo con las normas y estándaresimplementados en el país. En los países americanos se utilizan por lo generalvoltajes de 110 V y frecuencias de 60 Hz.

8 Mantenimiento preventivoFrecuencia: Trimestral1. Verificar la estabilidad de la lámpara. Usar el filtro de calibración, efectuandolecturas con intervalos de 30 minutos o una misma placa. Comparar las lecturas.No deben existir diferencias.2. Limpiar los sistemas ópticos de los detectores y los sistemas de iluminación.3. Limpiar el mecanismo de avance de la placa.4. Verificar la alineación de cada pozo con los sistemas emisores y detectores deluz.

9 BibliografíaManual de mantenimiento para equipo de laboratorio, Organización Panamericanade la Salud, Washington D. C., 2005ELISA Automation, Hudson Control Group, AB104A, 2002.(www.hudsoncontrol.com)Solid Phase Guide, NUNC™, Brand Products, Introduction to Solid PhaseTechniques. (http://www.nuncbrand.com/PDF/Guides%20and%20Manuals/Guide%20to%20Solid%20P hase.pdf)Universal Medical Device Nomenclature System™ (UMDNS), Product CategoriesThesaurus, ECRI, 5200 Butler Pike, Plymouth Meeting, PA, USA, 2000. Zoon,Kathryn, Recommendations to users of medical devices that test for infectiousdisease  markers by enzyme immunoassay (EIA) test systems, Division of Blood

 Applications, Bethesda, MD. (http://www.fda.gov/cber/bldmem/122094.txt)