Ancestría común y reconstrucción filogenética
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INTRODUCCIÓN
La clasificación de los seres vivos ha sido una actividad fundamental del humano
seguramente desde que tuvo uso de razón. Por ejemplo, el poder identificar un
grupo de hongos venenosos de un grupo de hongos comestibles hubiera sido
una técnica de sobrevivencia muy útil. Sin querer, estos humanos primitivos
estaban usando un sistema de clasificación basado primariamente en
características morfológicas y posiblemente etológicas. Este tipo de clasificación
de seres vivos se conoce ahora como sistemática, o taxonomía (CITA).
Así como a los primeros seres humanos, la sistemática nos permite
almacenar mucha información acerca de lo que nos rodea, y acceder a ella con
facilidad. Pero la sistemática actual no es una sólo método si no que se
compone de varios como la fenética, la cladística y la sistemática filogenética,
con la finalidad de obtener una clasificación más objetiva de los seres vivos. La
fenética se basa en la idea de agrupar taxones por su similitud a nivel global,
comparando todos los caracteres posibles de forma matemática, pero este
método ahora es casi obsoleto a causa de los inconvenientes que presenta su
forma de analizar datos. En cambio, la cladística trabaja con clados, organizando
a los organismos en grupos que comparten caracteres que han sido
determinados objetivamente como evolutivamente significantes. De la cladística
deriva la sistemática filogénica que usa los criterios cladísticos para establecer
grupos de organismos monofiléticos (descendidos de un solo ancestro común)
en base a su genealogía (Brown, 2008 y Morrone, 2001).
Hoy en día se hace uso de la disciplina de la filogenética molecular, que
usa secuencias de proteínas del ADN como marcadores en los análisis. Es
conveniente usar esos marcadores moleculares porque la información contenida
en las secuencias de nucleótidos es sumamente detallada y pueden decirnos
hasta tiempos de divergencia entre especies, basados en la tasa de mutación de
las bases nucleotídicas (Brown, 2008). A la acumulación de estas mutaciones, o
cambios en las frecuencias de las bases, se le conoce como reloj molecular.
Este varía su velocidad de cambio según la importancia de la proteína, y que
parte de la proteína, en cuestión (Curtis et al., 2006).
Se usan distintos marcadores (ribosomales, mitocondriales, etc.) de
acuerdo al propósito del estudio y del nivel taxonómico estudiado. Para estudiar
taxones menores, por ejemplo en el caso de mamíferos, se usarían marcadores
más variables como la región control o displacement loop (D-loop) porque es la
región con la mayor tasa de mutación del genoma mitocondrial con dos regiones
de rápida evolución y una más conservada (Larizzaet al., 2001; Silva et al.,
2011). Otro marcador con la misma utilidad es el Citocromo C oxidasa
subunidad I (COI), se usa principalmente porque los nucleótidos de la tercera
base mutan a una velocidad tan alta que su taza de evolución molecular es casi
tres veces la de ADN ribosomal (Herbert et al., 2003), y es la subunidad más
larga del citocromo oxidasa (Luntet al., 1996) La subunidad II del Citocromo c
oxidasa, es utilizada por razones similares a la primera y, aunque es más corta,
tiene una señal filogenética fuerte proveniente de la segunda posición (más
conservada) cuando se consideran muchos taxones en el estudio, y de la tercera
posición (más variable) cuando se analizan a nivel genérico (Ascunceet al.,
2002). Para una comparación a nivel de género, familia y orden se usan
marcadores con menos variabilidad como el citocromo b (cyt b) (Hernández et
al. 2001).
Hay varios métodos de reconstrucción filogenética que se emplean para
generar resultados gráficos (árboles filogenéticos). Dos de los más son el
método de Máxima Verosimilotud y el método de Neighbor-Joining. El de
primero encuentra árboles filogenéticos que tiene una probabilidad muy alta de
explicar los datos analizados. Es un método relativamente sencillo, como buen
modelo estadístico que sólo se aproxima a la realidad, al que no poder asumir
dependencia de los datos, porque de ser así sería demasiado complicado para
funcionar adecuadamente (Felsenstein, 1981). El método de Neighbor-Joining
es más fácil de emplear por el usuario común gracias a su alta velocidad de
computo y es especialmente acertado cuando se emplean secuencias de
evolución lenta, o en procesos evolutivos cortos, ya que asume que los procesos
evolutivos dentro de los linajes han permanecido constantes a través de la
historia evolutiva (Kumar y Gadagkar, 2000).
Con la información apropiada se pueden generar diagramas en forma de
árboles que muestran la filogenia de un grupo de organismos del ‘punto de vista’
de distintos marcadores. Se pueden comparar diferentes árboles para tener una
imagen más acertada de la historia evolutiva del sujeto de estudio. En este se
analiza la filogenia de los cetáceos misticetos, ballenas barbadas, comparando
los árboles filogenéticos resultantes y, principalmente, evaluar que método y que
gen son los más apropiados en el estudio evolutivo de estos organismos.
OBJETIVOS
General
Verificar el poder del análisis filogenético molecular, usando secuencias de ADN
mitocondrial de misticetos.
Particular
Identificar y ejecutar los pasos de un análisis filogenético molecular, aplicando
algoritmos de optimización robustos como: Neighbor-Joining y Máxima
Verosimmilitud.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se estimaron las relaciones filogenéticas existentes entre las 14 especies de
cetáceos del suborden Mysticetii utilizando cuatro diferentes secuencias del
genoma mitocondrial: Citocromo C Oxidasa I (COI), Citocromo C oxidasa II
(COII), Citocromo B (Cyt b) y la región control (D-loop). También se usaron las
secuencias del Jabalí para utilizarlo como especie fuera. Todas las secuencias
fueron obtenidas de la base de datos en línea National Centerfor Biotechnology
Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Las alineaciones de las secuencias se
realizaron mediante el programa Clustal X versión 2.0 y para las estimaciones
filogenéticas se utilizó MEGA 5. Dentro de éste se obtuvo el modelo de
sustitución nucleotídica que se ajustara mejor a cada secuencia para después
crear los árboles filogenéticos en base a dichos modelos. Para cada región
mitocondrial analizada se creó un árbol mediante el método de Máxima
Verosimilitud (MV) y otro mediante el de Neighbor-Joinig (NJ). En todas las
ocasiones los árboles se sometieron a una prueba bootstrap de 1000
replicaciones.
RESULTADOS
El modelo de sustitución de ADN que tuvo un mayor ajuste para cada una de las
secuencias fue el de Hasegawa-Kishino-Yano (HKY). En el caso de los modelos
resultantes para los genes mitocondriales COI, COII y CYT B se registró la
presencia de una tasa de sustitución gama (+G) y sitios invariantes (+I) mientras
que para la secuencia de la región control (D- loop) sólo registró una tasa de
sustitución gama sin sitios invariantes. Sin embargo, el modelo HKY no está
disponible en el software MEGA 5 para la creación de árboles filogenéticos
utilizando el método de NJ; su realización sólo es posible mediante el método de
MV. Por tal razón se opto por usar el modelo Tamura-Nei que fue el mejor se
ajustó a las secuencias después del HKY. Los parámetros de sustitución gama y
sitios invariantes fueron similares para ambos tipos de modelos de sustitución de
ADN.
Los dos árboles filogenéticos obtenidos mediante el análisis del gen COI
fueron estructuralmente muy similares entre sí. La diferencia más marcada
radica en el grupo formado por Eubalaena japonica, Eubalaena australis,
Balaenoptera mysticetus y Caperea marginata que está presente en el método
de NJ pero parcialmente ausente en el modelo MV donde C. marginata se
encuentra muy separada del grupo que forman las primeras tres especies (figura
1). En cuanto a tiempos de divergencia se observa que en el segundo árbol las
especies más cercanas son E. australis y E. japónica, seguidas por la mayoría
de las baleonopteras. La divergencia más temprana aparenta haberse dado
entre el grupo de los eubalaenidos (incluyendo B. mysticetus y C. marginata) y el
resto de las especies (figura 1, izq.).
Figura 1. Árbol filogenético realizado a partir de la secuencia del gen mitocondrial Citocromo C oxidasa subunidad I mediante en el modelo de Tamura-Nei y utilizando el método MV (izquierda) y NJ (derecha).El número indicado en cada rama es número de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Bamu, Balaenoptera musculus; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabalí Sus Scrofa.
Al igual que en el caso de los árboles filogenéticos del gen COI, los
obtenidos mediante el análisis de COII también fueron muy similares entre sí. En
ambos casos C. marginata aparece fuera del grupo formado por E. japonica,
E.australis, B.mysticetus tal y como se muestra en el árbol de COI y MV. Sin
embargo, difieren en la posición del grupo formado por Megaptera novaeangliae
y Balaenoptera physalus (figura 2). En el árbol de NJ se nota que los grupos que
divergieron primero (observado en la longitud de las ramas) fueron los
eubalaenidos (con B. mysticetus) del resto, seguido por C. marginata del resto,
mientras que los más cercanos en tiempo son Balaenoptera edeni con
Balaenoptera brydeiy por otro lado E. australis con E. japonica (figura 2, izq.).
Figura 2. Arboles filogenéticos realizados a partir de la secuencia del gen mitocondrial Citocromo C oxidasa subunidad II mediante el modelo de Tamura-Nei y utilizando el método de MV (izquierda) y NJ (derecha). El número indicado en cada rama es número de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Bamu, Balaenoptera musculus; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabalí Sus Scrofa.
Por otro lado, los árboles filogenéticos resultantes del análisis del
Citocromo B difieren notoriamente en la estructuras de grupos de tres o más
organismos. Sin embargo, los principales ramas del árbol creado por medio del
método de MV presenta valores bootstrap muy bajos (36, 42 y 19) en sus
primeras ramas, que agrupan a un número grande de especies, por lo que no
pueden tomarse en cuenta. Los valores bootstrap del árbol creado por el método
de NJ también muestra muchos valores bajos en muchas de sus ramas pero en
las primeras presenta valores más grandes que el de MV. Aún así, cercana
relación entre dos ó tres especies está muy clara en algunos casos para ambos
árboles, como E. australis con E. japonica y B. mysticetus, y Balaenoptera
acutorostrata con B. edeni (figura 3). Similar a los dos árboles de NJ anteriores,
los tiempos de divergencia más recientes se observan entre E. australis y E.
japonica por un lado, pero difiere en que entre los balaenopteridos muestra una
cercanía mayor entre B. edeni y Balaenoptera borealis que entre B. edeni y B.
brydei (aunque esto se corrige con un valor relativamente bajo de bootstrap de
56). También excluye a C. marginata como la más diversificada de todas las
demás pero con un bootstrap de solo 56 (figura 3, izq.).
Figura 3. Árbol filogenético realizado a partir de la secuencia del gen mitocondrial Citocromo B mediante en el modelo de Tamura-Nei y utilizando el método de MV (izquierda) NJ (derecha). El número indicado en cada rama es número de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Bamu, Balaenoptera musculus; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabalí Sus Scrofa.
En un caso más particular, ambos árboles creados mediante la región
control presentan valores bootsrap bajos para la mayoría de sus ramas, en su
gran mayoría menores a 60. Un caso notorio es el de E. australis y E. japonica
que siempre se mantuvieron juntas en los anteriores análisis con un buen calor
bootstrap (76, 89 y 100) sólo se mantienen así en el árbol de MV con un valor
bootstrap más bajo, 72 (figura 4). En este último árbol de NJ no se observa
divergencia génica contundente porque todas las ramas son demasiado cortas a
excepción de la del grupo fuera (figura 4, izq.).
Figura 4. Árbol filogenético realizado a partir de la secuencia de la región control mitocondrial mediante en el modelo de Tamura-Nei y utilizando el método de MV (izquierda) y NJ (derecha). El número indicado en cada rama es número de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabalí Sus Scrofa.
DISCUSIÓN
Las relaciones filogenéticas entre las especies de misticetos difirieron en cierto
grado según modelos utilizados, métodos aplicados y genes analizados. El
modelo de sustitución nucleotídica que más cerca estuvo de explicar los
diferentes cambios en las secuencias de todas regiones mitocondriales
analizadas fue Hasegawa-Kishino-Yano pero la imposibilidad de aplicarlo para
construir los árboles filogenéticos mediante los métodos de MV y NJ resultó en
el desuso del mismo. Tamura-Nei fue aplicado en su lugar, obteniendo dos
árboles filogenéticos para cada región mitocondrial.
Se observa que el análisis de la región control mitocondrial presenta
notable una menor confianza de emparentar las especies, pues presenta los
valores bootstrap bastante bajos y una elevada sustitución gama (+G), tanto al
comparar grupos de varios organismos así como parejas de ellos. Esto puede
ser el resultado de que el D-loop presenta una elevada tasa de mutación (Scotto,
2006) y estas mutaciones, al no ser codificantes, son heredadas lo que explica la
gran variedad del segmento y los valores bajos obtenidos en nuestros resultados
(Gardner et al., 2002). También cabe la posibilidad que al tomar la secuencia
completa se hayan establecido relaciones de bloques de secuencias
conservadas o repetidas que relacionan a organismos distancialmente
emparentados en lugar de relacionar organismos cercanamente emparentados,
por lo que se le considera un mal marcador filogenético (Larizzaet al., 2001). Lo
que se ha hecho en otros análisis con el D-loop es tomar fragmentos que no
contienen demasiadas variaciones o demasiadas replicaciones y así se
establecen relaciones más certeras (Árnason y Gullberg, 1994; Larizzaet al.,
2001), pero en el presente estudio se tomó en cuenta la totalidad de la
secuencia de la región control. Sin embargo también se han realizado trabajos
filogenéticos con la región control que emparentan muy bien a las especies de
una familia; quizá la diferencia es sus resultados con los nuestros esté en que
ellos solo se enfocaron a una familia de misticetos mientras que nuestro trabajo
abarcó a todas las especies de misticetos (Wadaet al., 2003).
Los genes mitocondriales, a pesar de mostrar algunos nodos débiles,
tienen muchas ramificaciones muy fuertes y constantes. Por ejemplo, el caso del
grupo formado por B. mysticetus, E. australis y E. japonica es muy notorio pues
está presente en todos los análisis realizados tanto por MV como por NJ
(Arnason y Gullberg, 1994, Arnason y Gullberg, 1996; Milinkovitch, et al., 1993).
Esta similitud genética se ve reflejada en la morfología de estas especies como
en la cabeza y boca arqueada, el cuerpo robusto, la ausencia de aleta dorsal,
etc. Y en el mismo tema es interesante notar que a pesar de su nombre común,
la ballena franca pigmea (C. marginata) no es incluida en la mayoría de los
análisis dentro del grupo de balaenidos, salvo en el realizado con Cyt b por MV.
Según Sasaki y colaboradores (2005), C. marginata presenta una divergencia
en un tiempo intermedio entre los (eu) balaenidos y los balaenoptéridos,
emparentándolo igualmente con los dos grupos. El análisis mostrado en el
trabajo refleja un emparentado al 95 con los balenoptéridos (similar a los
mostrados por Arnason y Gullberg en 1994 y 1996, con una resolución de 35 y
54, respectivamente) y menciona que sólo caracteres morfológicos
emparentaban antes a la ballena franca pigmea con las demás ballenas francas.
Otro grupo bien diferenciado en el análisis de los tres genes
mitocondriales fue el formado por B. edeni, B. brydei y B. borealis. Estas
especies (y Baleanoptera omurai, que casi siempre se encuentra cerca)
muestran un cierto grado de separación de caracteres y de distancia génica muy
corta. Incluso en años anteriores se pensaba que B. edeni y B. brydei eran la
misma especie, por similitudes morfológicas (Best, 2001) y no fue hasta el
descubrimiento de B. omurai que se separaron definitivamente como dos
especies mediante análisis filogenéticos (Wada et al., 2003).
Así mismo todos los análisis moleculares muestran la relación entre las
dos formas de ballena Minke, la común que vive en el Hemisferio Norte (B.
acutorostrata) y la forma del Antártico (B. bonaerensis), remarcando así su
cercano parentesco. Una asociación muy interesante fue la de M.
novaeangliae y B. physalus pues se observa que están más emparentadas entre
ellas que entre las demás especies de su propio género (en el caso deB.
physalus). Incluso, se sabe de la existencia de híbridos entre ésta y B. musculus,
pero no con M. novaeangliae (Bérubé y Aguilar, 1998). Esto nos lleva a creer
que M. novaeangliae podría estar más relacionada al género Balaenoptera de lo
que se pensaba y una reclasificación podría ser necesaria. Así mismo, E.
robustus apareció más relacionado con los rorcuales que con las ballenas
verdaderas, aunque su forma de alimentación y su falta de numerosos pliegues
gulares sugieren lo contrario, lo que indica que podría ser un espécimen
intermedio entre ambos linajes de misticetos.
En retrospectiva se observa que el gen que aparenta ser más confiable
(múltiples altas resoluciones de bootstrap) es el Cyt b, y también es uno de los
más usados en filogenias para cetáceos. Por otro lado los dos genes del CO
contienen menos resoluciones altas y aunque en este trabajo salieron acertados,
no se usan para hacer filogenias. Esto se puede deber a que, cuando se trata de
separar especies muy cercanas, el Cyt b consistentemente funciona mejor que
las CO y por tanto investigadores prefieren usar lo que se ha probado ser más
seguro (Amaral et al., 2007). A diferencia de los anteriores los árboles del D-loop
salieron con resoluciones muy bajas, muchas por debajo del nivel aceptable
(60). Esto pudiera deberse a que como muta muy rápido es apropiado para
hacer distinciones inter-específicos o inter-génicos pero cuando se trata de
análisis de taxones mayores pierde resolución (Larizza et al., 2001). Finalmente
se observó que los dos árboles de cada gen se asemejaban mucho entre sí,
indicando la validez de los dos métodos de reconstrucción filogenética.
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