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Antequera, 12 abril 2019
TOXOFREE
CAPRITEC
PATÓGENOS ZOONÓSICOS EN LA CADENA ALIMENTARIA DEL CERDO IBÉRICO: TOXOFREE
R.J.Astorga
‘CódigodeHammurabi’sigloXVIIIaC
‘El cerdo es también impuro porque,aunque tiene la pezuña hendida, no rumia.No podrás comer su carne ni tocar sucadáver’
QuintolibrodeMoisés‘Deuteronomio’,14:8
Descripcióndeenfermedadesanimales‘Transmisiónalhombre’
CulturaEgipcia
‘PapirodeKahun’sigloXXaC
Trichinella Spiralis(Inspección microscópica carne)
Trichinella Spiralis(Inspección microscópica carne)
ÍNDICE
q INTRODUCCIÓN. ACTUALIZACIÓN
q MODELO TRANSFERENCIA GRUPO AGR-256 (UCO)
q PROYECTOS: OBJETIVOS, RESULTADOS MÁS RELEVANTES Y DIVULGACIÓN
q PROYECTO TOXOFREE
Commission Regulation (EU) 2017/1495
Origen alimentario en brotes causados por Salmonella en 2017 (EFSA, 2018)
Pescados curados y ahumadosCarne de cerdo (no salchichas)Quesos blandos (leche cruda)
< 5 ºC
Toxinas bacterianas Norovirus Salmonella
ÍNDICE
q INTRODUCCIÓN
q MODELO INVESTIGACIÓN GRUPO AGR-256 (UCO)
q PROYECTOS: OBJETIVOS, RESULTADOS MÁS RELEVANTES Y DIVULGACIÓN
q PROYECTO TOXOFREE
Grupo investigación AGR-256
ÍNDICE
q INTRODUCCIÓN
q MODELO TRANSFERENCIA GRUPO AGR-256 (UCO)
q PROYECTOS: OBJETIVOS, RESULTADOS MÁS RELEVANTES Y DIVULGACIÓN
q PROYECTO TOXOFREE
ESTUDIO DE EVALUACIÓN Y MEJORA DE LA SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA EN EL CERDO IBÉRICO
IDI-20090414
SANIBERICO 08/222
SANIBÉRICO
0
5
10
15
20
25
ENERO
FEBRERO
MARZO
ABRIL
MAYO
JUNIO JU
LIO
AGOSTO
SEPTIEMBRE
OCTUBRE
NOVIEMBRE
DICIEM
BRE
NUM
ERO
DE A
NIM
ALES
(*10
00)
SACRIFICIOS MENSUALES EN MATADERO IBERICO
Campaña montanera: diciembre-marzo
Determinar la prevalencia de Salmonella spp. ˂ Cadena de sacrificio del cerdo Ibérico ˃
SANIBÉRICO
SANIBÉRICO
• Cultivo microbiológico
(ISO 6579:2002/Amd 1:2007, Annex D)
§ Serotipificación (Biorad)
§ Fagotipia (Colindale, UK)
§ Ensayos in vitro
(CLSI) documents M100-S15/2005 y M31-A3/2008
§ Electroforesis de Campo Pulsado (PFGE)
§ Las mayores tasas de prevalencia se observan en los meses de mayor intensificación de
sacrificios (enero, febrero, marzo).
§ Los puntos de mayor contaminación de Salmonella spp. en el matadero son: camiones
(23,21%), corrales (14,06%) y ciego (21,25%), tonsilas (17,50%), nódulos linfáticos
ileocólicos (16,25%).
§ El escaldado es un factor de protección frente a la contaminación por Salmonella spp.
(36,25% vs 8,75%) (Odds Ratio/IC95, y estimación χ2, Winepi).
§ La detección de genotipos idénticos de Salmonella spp. a través de la cadena, demuestra
contaminación cruzada, lo que supone un riesgo de contaminación de la carne en los
ambientes pre- y post-sacrificio.
SANIBÉRICO
Rissen (TCM2)
PFP4 (16 strains); PFP5 (1); PFP6 (1); PFP7 (1)
ZOONOSIS ALIMENTARIAS EN EL CERDO IBÉRICO: PREVALENCIA Y CONTROL PARA OBTENCIÓN DE ALIMENTOS SEGUROS
SAFEPORK
SAFEPORK
§ (2013) Prevalencias inferiores
§ Intensificación protocolos (ej. Hidroalcohólicos)
Materiales faenado y despiece; superficies trabajo
Serotipos Salmonella(97 cepas)
mST (21)
Anatum (20)
Typhimurium (17)
Hessarek (15)
Derby (8)
Newport (7)
Kentucky (3)
Bredeney (1)
Infantis (1)
Rissen (1)
Veneziana (1)
Rubislaw (1)
Heidelberg (1)
AB
AB
A
B
AB
AB
FagotiposmST (21)U302 (7)193 (6) 104l (2) 138 (2) 104b (1) 120 (1) U311 (1)
Typhimurium (17)193 (11)104b (2)104l (2)U302 (1)U311 (1)
SAFEPORK
SAFEPORK
AB
AB
AB
AB
Campylobacter spp.(104 cepas)
C. coli (71)
C. jejuni (2)
Campylobacter spp. (31)
SAFEPORK
AB
AB
AB
AB
AB
Listeria monocytogenes
(68 cepas)
4b (40)
1/2a* (28)
SAFEPORK
SAFEPORK
SAFEPORK
§ Determinación de la viabilidad de patógenos zoonósicos alimentarios frente a lascondiciones de curación empleadas en los productos del cerdo Ibérico.
SAFEPORK
§ Valores de pH y aw descendieron.
§ S. Typhimurium (p 0,03) and C. coli (p 0,03) reducción significativa (3,28 y 2,14 log).
§ L. innocua reducción escasa (0,84 log unit).
§ Concentración inicial de bacteria, progresiva reducción de pH y actividad agua.
Es preciso un análisis periódico en los diferentes puntos o fases del proceso decuración de lomos para asegurar la eliminación de patógenos alimentarios en lacadena.
SISTEMA DE VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE Clostridium difficileCON IMPLICACIONES EN SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD
ALIMENTARIA
ESTUDIO DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE EN EL CERDO IBÉRICO
CLOSTRIDIUM DIFFICILE
OBJETIVO
Seguimiento de C. difficile y C. perfringens en la
cadena alimentaria del cerdo Ibérico
ESTRATEGIAS DE DIAGNÓSTICOCultivo microbiológico
(Blanco et al., 2013)
PCR - Ribotipificación // PCR multiplex
(Dr. Kuijper, Universidad de Leiden, Holanda)
(PHLS Anaerobic Reference Unit) (Dr. Wilcox, University of Leeds, UK)
AFLP (genotipado CD y CP)
CLOSTRIDIUM DIFFICILE
DISEÑO MUESTREO:• Marzo, 2016• Muestreos aleatorios (2)• 10 animales /muestreo• Transportes; Corrales; Matadero (TCM)
CLOSTRIDIUM DIFFICILE
RESULTADOS:
Prevalencias globales: CD (14,4%) y CP (12,6%)
Distribución de muestras positivas:CD: camiones (80%) y corrales (37,5%)
CP: ciego (85%) y recto (45%)
En muestras ambientales de la línea de sacrifico sólo se
detectó CD (7,1%) PCR-RT
078 (34)
CLOSTRIDIUM DIFFICILE
AFLP
95 GENOT.
El aislamiento de idénticos genotipos de CD/CP a partir
de muestras de origen animal y/o ambientales supone
un gran riesgo de contaminación en la cadena de
sacrificio del cerdo Ibérico.
CLOSTRIDIUM DIFFICILE
Actividad investigadora
CAPRITEC (Ref IDI: 12013126)Optimización de la sanidad, producción y productos de la leche de
cabra en Andalucía
27/03/2013 a 27/12/2014
ÍNDICE
q INTRODUCCIÓN
q MODELO TRANSFERENCIA GRUPO AGR-256 (UCO)
q PROYECTOS: OBJETIVOS, RESULTADOS MÁS RELEVANTES Y DIVULGACIÓN
q PROYECTO TOXOFREE
TOXOPLASMOSIS: CLASIFICACIÓN, HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS Y VIABILIDAD DEL PARÁSITO TRAS EL PROCESADO
IDI-20090414
TOXOFREE
TOX-SUFRI
TOXOFREE
TOXOFREE
https://amazingbooks.es/guia-zoonosis-animales-compañia
(12-18 meses)
TOXOFREE
(15%)
(7%)
1. Cantidad de animales testados
2. Uso de diferentes técnicas directas e indirectas, no validadas
3. Factor edad desconocido
4. No información sobre el tipo de reproducción
5. No relación entre presencia de Ac e Infección (caballos, bovinos)
6. Métodos serológicos para detección de infección en granjas y no en animales
(aves, cerdos y pequeños rumiantes)
SISTEMA DE VIGILANCIA DE TOXOPLASMA- LIMITACIONES -
SEROPREVALENCIA (UAB + CRESA):
Domésticas (gatos, perros, cerdos, caballos, rumiantes)
Silvestres (cérvidos, felinos salvajes, jabalíes, aves silvestres)
+ DELFINES MEDITERRÁNEOS
SEROPREVALENCIA EN GATOS (DOMÉSTICOS/SILVESTRES)
45% (n=220) - Barcelona
32% (n=585) - Madrid y la Rioja
SEROPREVALENCIA EN MUJERES EMBARAZADAS
18,8% (n=2.929) - Salamanca
28,6 (n=16.362) - Barcelona
E. Creus. Producción Animal. Nº 272. Mayo-Junio 2012.
TOXOFREE
ESTUDIO DE SEROPREVALENCIA:
100 granjas (2970 animales)
1400 cerdas / 1570 engorde o cebo
Técnica MAT (> 1:25 POSITIVO)
RESULTADOS:
Prevalencia global = 85%
Prevalencia individual = 16,6%
Prevalencia Intragranja = 17,6%
FACTORES DE RIESGO:
1. Edad
2. Cerdas vs cebo (24,2% vs 9,7%)
3. Ausencia programas control roedores
4. Presencia de gatos
5. GESTIÓN DE CADÁVERES
(Hill et al. 2010. Zoonoses and Public Health. 57: 53-59)
García-Bocanegra I, Simon-Grifé M, Dubey JP, Casal J, Martín GE, Cabezón O, Perea A, Almería S.
(CReSA, IRTA-UAB)
TOXOFREE
ESTUDIO DE SEROPREVALENCIA:
Técnica MAT (cut off > 1:25)
DOMÉSTICOS:
Ovejas (41,2%, n=194)
Bovinos (18,6%, n=199)
Cabras (5,6%, n=89)
(FR) Gatos, Alimentación
SILVESTRES:
Ciervo (10,5%, n=1063)
Muflón (5,6%, n=216)
Cabra hispánica (5,6%, n=90)
JABALÍES (18,6%, n=666)
(FR) Especie, edad, estación de caza
Amplia diseminación y exposición a Toxoplasma gondii entre ungulados domésticos ysilvestres en el sur de España, con diferencias significativas entre especies quecomparten el mismo ecosistema.
Almería S, Cabezón O, Paniagua J, Cano-Terriza D, Jiménez-Ruiz S, Arenas-Montes A, Dubey JP, García-Bocanegra I.
OBJETIVO 1
§ Establecer un sistema de clasificación de
las explotaciones de porcino en función
de la seroprevalencia mostrada frente a
Toxoplasma gondii.
ESTRATEGIA DE DIAGNÓSTICOELISA
Priocheck® Toxoplasma AB Porcine (Prionics)
TOXOFREE
TOXOFREE
2013 2013
OBJETIVO 1
§ Establecer un sistema de clasificación de
las explotaciones de porcino en función
de la seroprevalencia mostrada frente a
Toxoplasma gondii.
ESTRATEGIA DE DIAGNÓSTICOELISA
Priocheck® Toxoplasma AB Porcine (Prionics)
TOXOFREE
OBJETIVO 2
§ Determinar la influencia de distintas dosisinfectantes de T. gondii mediante unmodelo de ensayo experimental.
ENSAYO EXPERIMENTAL ‘MODELO PORCINO’
ELISA (IDVet Toxoplasma)
qPCR; Histopatología; Inmunohistoquímica
Bioensayos felinos/murinos
TOXOFREE
6 Dosis alta(1x107 TQZ)
4 Dosis baja(1x103 TQZ)
2 Grupo control
TOXOFREE
PROTOCOLO NECROPSIAS§ Total animales = 12
6 dosis altas / 4 dosis bajas / 2 controles§ Día 30º: sedación, extracción sanguínea (3ª), necropsia reglada
§ Material (tipo de muestras): Específicas (E) / Opcionales (O) / Pool Carne (C)
• Toxoplasma gondii presenta diferente
tropismo tisular según dosis
infectante.
• En muestras de corazón, lengua y
masetero los resultados son similares
con independencia de la dosis
infectiva.
• La detección de T. gondii (DNA) fue
más frecuente en muestras de pool de
carne (jamón, paleta, lomo), a partir
de animales infectados con dosis altas.
Toxoplasma gondii continues being one of themain food safety hazards for pregnant womenand immunocompromised patients.
In this sense, the distribution of thisprotozoan within the organism and the roleof the infective dose in tissue distribution areof highly interest to understand the riskassociated to the parasite and to decipher thepathobiology of this infection.
INTRODUCTION
Cañete-Buenestado M.1,AstorgaR.J.2,Cardoso-Toset F.1,2,Rodríguez-GómezI.M.3,Martínez-MorenoÁ.2,CarrascoL.3,Gómez-LagunaJ.1,3
1 CICAP,FoodResearch,Pozoblanco,Córdoba;2AnimalHealthDepartmentand³AnatomyandComparativePathologyDepartment,UniversityofCórdoba.InternationalExcellenceAgrifood Campus‘CeiA3’
UniversityCampusofRabanales,14071Córdoba,Spain
DistributionofToxoplasmagondii inpigswithahighandalowdoseofinfection
7th - 10th June 2016 Dublin, Ireland
CONCLUSIONSOur results highlight that despite the fact that T. gondii might present different tissue tropism according to theinfective dose, target skeletal muscles are similarly affected independently of the infective dose.
Interestingly, T. gondii DNA was more frequently detected from meat pool (shoulder, loin and ham) samples of HDinfected animals, which highlights a higher risk of contamination of these pieces at higher doses of infection.Therefore, different organs should be analysed to clarify the pathogenesis of this infection.
ACKNOWLEDGEMENTSThis study was financially supported by Centre for the Development of Industrial Technology (CDTi) of Spain, project reference IDI-20120176. FCT is funded by theInternational Campus of Excellence Programme, from the Ministry of Education, Culture and Sport and by Santander Universities Global Division.
MATERIAL&METHODS
11
HighDose(HD)IMinoculatedwith1x107 tachyzoitesStrainBCRReferenceTgH 00001(PRU)
5
4
2
LowDose(LD)IMinoculatedwith1x103 tachyzoitesStrainBCRReferenceTgH 00001(PRU)
ControlgroupNoninoculated
qPCR (TOX4/TOX5) (target: 529-bp repeat element)
Fw: 5’-CACAGAAGGGACAGAAGT-3’Rv: 5’-TCGCCTTCATCTACAGTC-3’
(Gutiérrezetal.,2010)
Euthanasia and post-mortem examination at 30dpi.Samples:brain, heart, tongue, lung, liver, spleen, kidney, mesentericlymph node, masseter muscle and a pool of shoulder, loinand ham (meat pool)
Bloodsamples-7,0,15,30dpi(IDScreenToxoplasmosis,IDVet)
Table 1 HighDose Low Dose ControlBrain 4/5(80%) 1/4(25%) 0/0(0%)Heart 5/5(100%) 3/4(75%) 0/0(0%)Tongue 2/5(40%) 2/4(50%) 0/0(0%)Masseter muscle 4/5(80%) 4/4(100%) 0/0(0%)Lung 2/5(40%) 3/4(75%) 0/0(0%)Liver 2/5(40%) 3/3(100%) 0/0(0%)Spleen 2/5(40%) 3/4(75%) 0/0(0%)Mesenteric LN 5/5(100%) 3/4(75%) 0/0(0%)Meat pool 4/5(80%) 0/4(0%) 0/0(0%)Kidney 5/5(100%) 3/4(75%) 0/0(0%)
RESULTSNo changes were detected in sera from control and LD animalsthroughout the study, but HD animals presented between 3.8 and16.1 fold increase in the OD (ID Screen ToxopIasmosis, IDvet).No gross lesions were detected in control or infected animals alongthe study. T. gondii DNA was not detected in control animals. T.gondii DNA detection in HD and LD animals is showed in Table 1.
§ Muestras (necropsia): pool carne (jamón-paleta-lomo), cerebro,
corazón, lengua, masetero, pulmón, hígado, riñón, bazo y nódulo
linfático mesentérico.
§ Técnicas diagnósticas: rtPCR, histopatología e inmunohistoquímica
(Ac. Policlonal, SerotecR).
§ Bioensayo en felinos: pool de carne.
§ Bioensayo murino: pool órganos diana (cerebro, lengua, corazón).
o La qPCR mostró diferencias significativas entre diferentes
dosis (ej. cerebro y carne); mayor sensibilidad en muestras
de corazón, masetero, nódulo linfático mesentérico y
riñón.
o El examen histopatológico no detectó presencia parasitaria;
la inmunohistoquímica resultó positiva de forma variable
en algunas muestras de animales (dosis altas).
o Los bioensayos felinos y murinos sólo detectaron presencia
parasitaria en el grupo 1 (dosis altas).
TEJIDO ESTUDIADO Y DOSIS INFECTIVA DIAGNÓSTICO TOXOPLASMOSIS TEMPRANA EN PORCINOS IBÉRICOS
TOXOFREE
TOXOFREE Toxoplasmosis: clasificación, herramientas diagnósticas y viabilidad del parásito tras el procesado
TOXOFREE: INFORME FINAL
OBJETIVO 3
§ Determinar la supervivencia y capacidad
infectiva de T. gondii en piezas cárnicas
de origen porcino y en las distintas fases de
su proceso de curación.
ESTRATEGIA DE DIAGNÓSTICO
DIEFRENTES PCRs
§ CARNE FRESCA (+) // CONGELACIÓN (96 h.) (-)
Jamones / Paletas / Lomos
§ EMBUTIDOS (+) (60 días)
§ PALETAS Y JAMONES
Fase intermedia (3-4 meses) / Fase final (18-19 meses)
Loncheado (tras congelación 48 h)
Fases intermedias (3-4 m) / (18-19 meses)
Fase final (24 meses)
Loncheado (tras congelación 48 h)
Pool carne distintas zonas
• BIOENSAYO EN RATONES (cerebro) / PCR
TOXOFREE: INFORME FINAL
TOXOFREE: INFORME FINAL
Bayarri et al. (2010) FAVE Zaragoza. Ensayo infección natural - Cerdos infectados (+IFA)
Muestras de tejido y carne con bradizoitosBioensayo en ratones (IFA, histopatología y PCR)
No se detectaron formas viables en el producto curado (7-14 meses)
TOXOFREE: INFORME FINAL
Genchi et al. (2017) Italia – Prosciuto di ParmaEnsayo de viabilidad de quistes tidulares de Toxoplasma gondii
Seroconversión 21 días PIPCR + (sacrificio / piezas cárnicas curadas 12, 14 y 16 meses)Bioensayos en ratones inoculados negativos (+ paletas frescas)
TOXOFREE: INFORME FINAL
Protocolo de digestión
TOXOFREE: INFORME FINAL
BIOENSAYO EN RATONES (cerebro) // PCR
qPCR, TOXOGONDII-VK(VACUNEK)
qPCR IN-HOUSETOX4-TOX5
3. Determinación supervivencia y capacidad infec5va de T. gondii en piezas cárnicas origen porcino y dis5ntas fases proceso curación
Tabla 1. Procesado de piezas cárnicas objeto de estudio para PCR.(PI, punto intermedio; PF, punto final; AD, alta dosis; BD, baja dosis; C, controles)
TOXOFREE: INFORME FINAL
TOXOFREE: INFORME FINAL
3. Determinación supervivencia y capacidad infectiva de T. gondii en piezas cárnicas origen porcino y distintas fases proceso curación
§ qPCR (Toxogondii VK, Vacunek®) à TODOS resultados negativos
§ PCR in-house (TOX4/TOX5) à Resultados positivos evidentes (71,4%)
TOXOFREE Toxoplasmosis: clasificación, herramientas diagnósticas y viabilidad del parásito tras el procesado
TOXOFREE
¿?
TOXOFREE: INFORME FINAL
q El consumo de jamón como alimento cardiosaludable no debe desecharse
durante el embarazo cuando no existen estudios concluyentes que establezcan
que su ingesta aumenta las posibilidades de contagiarse por toxoplasmosis.
q A partir de los 18 meses de curación, y cuando se superan los
controles de calidad que así lo certifiquen, sí se puede comer
jamón durante el embarazo, por tanto, el jamón con
denominación de origen con 24 meses de curación (fase de
finalización), asegura la no supervivencia del parásito.
q Por todo ello, es muy recomendable que se refleje en el
etiquetado del producto el tiempo de curación.
TOXOFREE: INFORME FINAL
3. Determinación supervivencia y capacidad infectiva de T. gondii en piezas cárnicas origen porcino y distintas fases proceso curación
Nuevos ensayos añadiendo sondas “Taqman” a la técnica PCR
Aumentar ESPECIFICIDADTOXOFREE Toxoplasmosis: clasificación, herramientas diagnósticas y
viabilidad del parásito tras el procesado
TOXOFREE
DIFUSIÓN DE RESULTADOS Y TRANSFERENCIA A EMPRESAS
R.J.Astorga
GRACIAS POR SU ATENCIÓN