Anticuerpos Monoclonales
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ANEXO 3 Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos generados en un animal por inmunización activa, (natural o artificial), son heterogéneos ya que tienen diferentes especificidades y afinidades. Proceden de distintos clones de linfocitos B estimulados, por lo que constituyen un conjunto policlonal de anticuerpos. Esta respuesta policlonal representa una ventaja adaptativa, permitiendo disponer de Ac capaces de unirse a una gran variedad de antígenos, de expresar diferentes funciones biológicas y de evolucionar adaptándose al curso de la respuesta inmunitaria. Por ser reactivos específicos (hacia un antígeno), los Ac pueden ser también utilizados por el hombre para diversos fines, por ejemplo, para diagnóstico, en terapéutica o para separar moléculas con fines industriales. Tradicionalmente, un Ac hacia un antígeno se obtiene inmunizando animales y obteniendo su suero, fuente principal de Ac. Los conejos y los caballos han sido y aún son muy usados como productores de sueros inmunes. Recordemos que éstos son reactivos policlonales. Para algunos usos, sin embargo, la heterogeneidad de los Ac de un suero puede ser una desventaja. Además, cada preparación de suero es diferente, aún cuando se usen animales genéticamente idénticos, inmunizados con la misma preparación de antígeno y con el mismo protocolo de inmunización. Dicho en otros términos: cada respuesta inmunitaria es única. Por lo tanto es imposible usar reactivos serológicos idénticos en una larga serie de pruebas. Estas desventajas pueden ser salvadas por los anticuerpos monoclonales, que, como su nombre lo indica, derivan de un único clon de linfocitos B y son por lo tanto específicos para un epitope determinado e idénticos entre sí, constituyendo una población homogénea. Como no es posible purificarlos a partir de un suero policlonal, G. Köhler y C. Milstein desarrollaron en 1975 un método para su preparación, que se basa en la fusión de un linfocito B normal con una célula plasmática tumoral (célula de mieloma). La célula híbrida resultante (llamada hibridoma) hereda de la célula de mieloma la capacidad de crecer indefinidamente in vitro, y del linfocito B la de secretar anticuerpos. Luego de la fusión, las células híbridas deben separarse de las que no se fusionaron y de las que se fusionaron con otra célula del mismo tipo. Esto se logra usando células de mieloma deficientes en una enzima requerida para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos por una vía alternativa que reutiliza las purinas. Por lo tanto, si luego de la fusión las células se cultivan en un medio que contiene un inhibidor de la vía de síntesis de novo de los nucleótidos (medio HAT), sólo podrán desarrollar las células que puedan utilizar la vía de síntesis alternativa (es decir, los hibridomas, porque heredan del linfocito la capacidad de utilizar esta vía). Las células de mieloma que no se fusionaron o se fusionaron entre ellas no se multiplicarán porque no poseen la vía alternativa, y a su vez, los linfocitos B que no se fusionaron o se fusionaron entre ellos tampoco se multiplicarán ya que no tienen la capacidad de crecer indefinidamente in vitro. El paso siguiente es la selección de los clones que secreten el Ac con la especificidad deseada, para lo cual se analiza el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma mediante pruebas serológicas como ELISA y RIA. Una vez detectados los hibridomas productores del Ac deseado, y controlada su clonalidad, cada clon se cultiva para producir el Ac monoclonal deseado. El cultivo puede hacerse in vitro (en medios apropiados para células) o bien in vivo, inyectando intraperitonealmente las células del hibridoma en ratones y obteniendo tiempo después el líquido ascítico acumulado, que contendrá una elevada concentración del Ac monoclonal. Los hibridomas por su parte, se conservan indefinidamente por congelación, pudiendo descongelarse y cultivarse todas las veces que se desee, obteniendo siempre el mismo Ac. Como cada hibridoma es un clon derivado de la fusión de un único linfocito B, todas las moléculas de Ac que produce son idénticas en estructura y por lo tanto tienen el mismo sitio de unión al antígeno e isotipo.
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ANEXO 3 Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos generados en un animal por inmunización activa, (natural o artificial), son heterogéneos ya que tienen diferentes especificidades y afinidades. Proceden de distintos clones de linfocitos B estimulados, por lo que constituyen un conjunto policlonal de anticuerpos. Esta respuesta policlonal representa una ventaja adaptativa, permitiendo disponer de Ac capaces de unirse a una gran variedad de antígenos, de expresar diferentes funciones biológicas y de evolucionar adaptándose al curso de la respuesta inmunitaria.
Por ser reactivos específicos (hacia un antígeno), los Ac pueden ser también utilizados por el hombre para diversos fines, por ejemplo, para diagnóstico, en terapéutica o para separar moléculas con fines industriales. Tradicionalmente, un Ac hacia un antígeno se obtiene inmunizando animales y obteniendo su suero, fuente principal de Ac. Los conejos y los caballos han sido y aún son muy usados como productores de sueros inmunes. Recordemos que éstos son reactivos policlonales.
Para algunos usos, sin embargo, la heterogeneidad de los Ac de un suero puede ser una desventaja. Además, cada preparación de suero es diferente, aún cuando se usen animales genéticamente idénticos, inmunizados con la misma preparación de antígeno y con el mismo protocolo de inmunización. Dicho en otros términos: cada respuesta inmunitaria es única. Por lo tanto es imposible usar reactivos serológicos idénticos en una larga serie de pruebas.
Estas desventajas pueden ser salvadas por los anticuerpos monoclonales, que, como su nombre lo indica, derivan de un único clon de linfocitos B y son por lo tanto específicos para un epitope determinado e idénticos entre sí, constituyendo una población homogénea.
Como no es posible purificarlos a partir de un suero policlonal, G. Köhler y C. Milstein desarrollaron en 1975 un método para su preparación, que se basa en la fusión de un linfocito B normal con una célula plasmática tumoral (célula de mieloma). La célula híbrida resultante (llamada hibridoma) hereda de la célula de mieloma la capacidad de crecer indefinidamente in vitro, y del linfocito B la de secretar anticuerpos.
Luego de la fusión, las células híbridas deben separarse de las que no se fusionaron y de las que se fusionaron con otra célula del mismo tipo. Esto se logra usando células de mieloma deficientes en una enzima requerida para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos por una vía alternativa que reutiliza las purinas. Por lo tanto, si luego de la fusión las células se cultivan en un medio que contiene un inhibidor de la vía de síntesis de novo de los nucleótidos (medio HAT), sólo podrán desarrollar las células que puedan utilizar la vía de síntesis alternativa (es decir, los hibridomas, porque heredan del linfocito la capacidad de utilizar esta vía). Las células de mieloma que no se fusionaron o se fusionaron entre ellas no se multiplicarán porque no poseen la vía alternativa, y a su vez, los linfocitos B que no se fusionaron o se fusionaron entre ellos tampoco se multiplicarán ya que no tienen la capacidad de crecer indefinidamente in vitro.
El paso siguiente es la selección de los clones que secreten el Ac con la especificidad deseada, para lo cual se analiza el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma mediante pruebas serológicas como ELISA y RIA. Una vez detectados los hibridomas productores del Ac deseado, y controlada su clonalidad, cada clon se cultiva para producir el Ac monoclonal deseado. El cultivo puede hacerse in vitro (en medios apropiados para células) o bien in vivo, inyectando intraperitonealmente las células del hibridoma en ratones y obteniendo tiempo después el líquido ascítico acumulado, que contendrá una elevada concentración del Ac monoclonal. Los hibridomas por su parte, se conservan indefinidamente por congelación, pudiendo descongelarse y cultivarse todas las veces que se desee, obteniendo siempre el mismo Ac.
Como cada hibridoma es un clon derivado de la fusión de un único linfocito B, todas las moléculas de Ac que produce son idénticas en estructura y por lo tanto tienen el mismo sitio de unión al antígeno e isotipo.
Aislarcélulas
del bazo
Antígeno
Suero
Linfoblastos Cél. de mieloma Hibridomas
Fusión Selección
Anticuerpos monoclonales
Ac1 Ac4Ac3Ac2
Ac2
Ac1
Ac4
Ac3Ac1
Ac2Ac3Ac4
Anticuerpos policlonales
Aislarcélulas
del bazo
Antígeno
Suero
Linfoblastos Cél. de mieloma Hibridomas
Fusión Selección
Anticuerpos monoclonales
Ac1 Ac4Ac3Ac2
Ac2
Ac1
Ac4
Ac3Ac1
Ac2Ac3Ac4
Anticuerpos policlonales
Diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales
Ac policlonales (suero) Ac monoclonales Epitopes que
reconocen Varios * Unico
Especificidad Varía entre animales y entre
sangrías.
No varía. Alta especificidad.
Afinidad Variable entre sangrías. Fija
Rendimiento Concentración media 1 mg/ml Volumen variable (según especie)
Bajo en cultivo de tejidos. Alto (hasta 20 mg/ml) en
líquido ascítico)
Costo relativo Bajo Alto
*Sin embargo, cada uno de los Ac presentes en el suero reconoce un único epitope.
Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales - Investigación (purificación y detección de antígenos) - Diagnóstico in vitro (de preñez, microorganismos patógenos, medición del nivel de ciertas
drogas en sangre, estudios de histocompatibilidad, detección de antígenos tumorales) e in vivo (detección de antígenos tumorales).
- Fines terapéuticos (inmunotoxinas compuestas por Ac monoclonales específicos de células tumorales unidos a una toxina letal).
Bibliografía:
- Kuby, J. 1997. Immunology. 3rd. ed. W. H. Freeman and Company, New York. p. 131-135. - Campbell, A. M. 1984. Monoclonal antibody technology. 1st. ed. Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam. p. 1-30. - Janeway, C. A. and Travers, P. 1997. Immunobiology. The immune system in health and disease. 3rd. ed. Current Biology Ltd. and Garland Publishing Inc., London. p. 2:17-2:18.
