Unidad 1

INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE LAMO TEMAPACHE TUXPAN-VER

NOMBRE:Angel Ricardo Blanco Blanco

MATERIA:

Microbiologia MAESTRA:

IIA. Nancy Deyanira Hernandez

TRABAJO:

Antologa Unidad 1-7.

UNIDAD NO. 1 INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA

1.1. Concepto y contenido de la Microbiologa1.1.1. Concepto de Microbiologa y sus implicacionesEl vocablo Microbiologa deriva de las palabras griegas: mikros (pequeo), bios (vida) y logos (ciencia), por lo que se puede definir, sobre la base de su etimologa, como la ciencia que trata de los seres vivos muy pequeos, concretamente de aquellos cuyo tamao se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga determinado por la metodologa apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los microorganismos. Precisamente, el origen tardo de la Microbiologa con relacin a otras ciencias biolgicas, y el reconocimiento de las mltiples actividades desplegadas por los microorganismos, hay que atribuirlos a la carencia, durante mucho tiempo, de los instrumentos y tcnicas pertinentes. Con la invencin del microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue de una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes 150 aos su progreso se limit casi a una mera descripcin de tipos morfolgicos microbianos, y a los primeros intentos taxonmicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los sistemas naturales de los Reinos Animal y Vegetal.El asentamiento de la Microbiologa como ciencia est estrechamente ligado a una serie de controversias seculares (con sus numerosas filtraciones de la filosofa e incluso de la religin de la poca), que se prolongaron hasta finales del siglo XIX. La resolucin de estas polmicas dependi del desarrollo de una serie de estrategias experimentales fiables (esterilizacin, cultivos puros, perfeccionamiento de las tcnicas microscpicas, entre otras), que a su vez dieron nacimiento a un cuerpo coherente de conocimientos que constituy el ncleo aglutinador de la ciencia microbiolgica. El reconocimiento del origen microbiano de las fermentaciones, el definitivo abandono de la idea de la generacin espontnea, y el triunfo de la teora germinal de la enfermedad (cualquier enfermedad infecciosa est causad por grmenes) propuesta por Pasteur y Koch, representan la edad de oro de la Bacteriologa y las conquistas definitivas que proporcionan la naturaleza de la Microbiologa en los albores del siglo XX.Tras la Edad de Oro de la Bacteriologa, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y Koch, la Microbiologa qued durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada, estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la Qumica, que le aportara varios avances metodolgicos fundamentales. Sin embargo, una corriente, en principio minoritaria, dedicada a los estudios bsicos centrados con ciertas bacterias del suelo poseedoras de capacidades metablicas especiales, incluyendo el descubrimiento de las que afectan a la nutricin de las plantas, logr hacer ver la ubicuidad ecolgica y la extrema diversidad fisiolgica de los microorganismos. De esta forma, se estableca una cabeza de puente entre la Microbiologa y otras ciencias biolgicas, que lleg a su momento decisivo cuando se comprob la unidad qumica de todo el mundo vivo, y se demostr, con material y tcnicas microbiolgicas que la molcula de la herencia era el ADN. Con ello se asiste a un ntimo y frtil intercambio entre la Microbiologa, la Gentica y la Bioqumica, que se plasma en el nacimiento de la Biologa Molecular, base del espectacular auge de la Biologa desde mediados del siglo XX. Por otro lado, el programa inicial de la Microbiologa (bsqueda de agentes infectivos, desentraamiento y aprovechamiento de los mecanismos de defensa del hospedador) condujeron a la creacin de ciencias subsidiarias (Virologa, Inmunologa) que finalmente adquirieron su mayora de edad y una acentuada autonoma.Por ltimo, la vertiente aplicada que estuvo en la base de la creacin de la Microbiologa, mantuvo su vigencia, enriquecida por continuos aportes de la investigacin bsica, y hoy muestra una no menos prometedora perspectiva de expansin a mltiples campos de la actividad humana, desde el control de enfermedades infecciosas (higiene, vacunacin, quimioterapia, antibioterapia) hasta el aprovechamiento econmico racional de los mltiples procesos en los que se hallan implicados los microorganismos (biotecnologas).

1.1.2. Objeto de estudio de la Microbiologa1.1.2.1. Los microorganismos como objeto material de la MicrobiologaLa Microbiologa se define como la ciencia que estudia los microorganismos, esto es, aquellos organismos demasiado pequeos cuya visualizacin requiere el empleo del microscopio. Tal definicin implica que el objeto material de la Microbiologa viene delimitado por el tamao de los seres vivos que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonmicos: desde partculas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los protozoos y parte de las algas y de los hongos.Los microorganismos son seres vivos de tamao microscpico dotados de individualidad, con una organizacin biolgica sencilla, acelular o celular, y en este ltimo, pudiendo presentarse como unicelulares, cenocticos, coloniales o pluricelulares, pero sin diferenciacin en tejidos u rganos, y que necesitan para su estudio una metodologa propia y adecuada a sus pequeas dimensiones. Bajo esta denominacin se engloban tanto microorganismos celulares como las entidades subcelulares.Los microorganismos celulares comprenden todos los procariotas incluidos en el Dominio Archea y Dominio Bacteria, as como los microorganismos eucariticos incluidos en el Dominio Eukarya, dentro de diferentes reinos: hongos filamentosos o verdaderos; levaduras, algas y protozoos. Los virus y partculas subvirsicas son otro tipo de objetos de estudio de la Microbiologa, aunque son entidades no celulares que no poseen ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida, cuentan con individualidad y entidad biolgica, y caen de lleno en el dominio de esta ciencia.Los virus son entidades no celulares de muy pequeo tamao (normalmente inferior al del ms pequeo procariota), por lo que debe de recurrirse al microscopio electrnico para su visualizacin. Son agentes infectivos de naturaleza obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporacin al protoplasma vivo para que su material gentico sea replicado por medio de su asociacin ms o menos completa con las actividades celulares normales, y que pueden transmitirse de una clula a otra.Cada tipo de virus consta de una sola clase de cido nucleico (DNA o RNA, nunca ambos), con capacidad para codificar varias protenas, algunas de las cuales pueden tener funciones enzimticas, mientras que otras son estructurales, disponindose stas en cada partcula virsica (virin) alrededor del material gentico formando una estructura regular (cpsida); en algunos virus existe, adems, una envuelta externa de tipo membranoso, derivada en parte de la clula en la que se desarroll el virin (bicapa lipdica procedente de membranas celulares) y en parte de origen virsico (protenas)En su estado extracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la maquinaria de biosntesis de protenas, de replicacin de su cido nucleico y de obtencin de energa. Esto les obliga a un modo de vida (sic) parasitario intracelular estricto o fase vegetativa, durante la que el virin pierde su integridad, y normalmente queda reducido a su material gentico, que al superponer su informacin a la de la clula hospedadora, logra ser expresado y replicado, producindose eventualmente la formacin de nuevos viriones que pueden reiniciar el ciclo.Los viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvirsicas, descubiertas en 1967 porT.O. Diener en plantas. Estn constituidos exclusivamente por una pequea molcula circular de ARN de una sola hebra, que adopta una peculiar estructura secundaria alargada debido a un extenso, pero no total, emparejamiento intracatenario de bases por zonas de homologa interna. Carecen de capacidad codificadora y muestran cierta semejanza con los intrones autocatalticos de clase I, por lo que podran representar secuencias intercaladas que escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. Se desconocen detalles de su modo de multiplicacin, aunque algunos se localizan en el nucleoplasma, existiendo pruebas de la implicacin de la RNA polimerasa II en su replicacin, por un modelo de crculo rodante que genera concatmeros lineares. Esta replicacin parece requerir secuencias conservadas hacia la porcin central del viroide.Los viroides aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones patolgicas. El mecanismo de patogenia no est aclarado, pero se sabe que muchos de ellos se asocian con el nucleolo, donde quiz podran interferir; sin embargo, no existen indicios de que alteren la expresingnica (una de las hiptesis sugeridas); cada molcula de viroide contiene uno o dos dominios conservados que modulan la virulencia.Los RNAs satlites son pequeas molculas de tamao similar al de los viroides de plantas (330-400 bases), que son empaquetados en cpsidas de determinadas cepas de virus (con cuyos genomios no muestran homologas). Se replican slo en presencia del virus colaborador especfico, modificando (aumentando o disminuyendo) los efectos patgenos de ste.Los virusoides constituyen un grupo de RNA satlites no infectivos, presentes en el interior de la cpsida de ciertos virus, con semejanzas estructurales con los viroides, replicndose exclusivamente junto a su virus colaborador.Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original, descubiertas por Stanley Prusiner en 1981, responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema nervioso central de mamferos (por ejemplo, el "scrapie" o prurito de ovejas y cabras, la encefalitis espongiforme bovina), incluyendo los humanos (kuru, sndrome de Gerstmann-Strassler, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob). Se definen como pequeas partculas proteicas infectivas que resisten la inactivacin por agentes que modifican cidos nucleicos, y que contienen como componentemayoritario (si no nico) una isoforma anmala de una proteina celular. Tanto la versin celular normal (PrPC) como la patgena (PrPSc en el caso del "scrapie") son glicoprotenas codificadas por el mismo gen cromosmico, teniendo la misma secuencia primaria. Se desconoce si las caractersticas distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos oligosacridos que adquieren por procesamiento post-traduccional.A diferencia de los virus, los priones no contienen cido nucleico y estn codificados por un gen celular. Aunque se multiplican, los priones de nueva sntesis poseen molculas de PrP que reflejan el gen del hospedador y no necesariamente la secuencia de la molcula del PrP que caus la infeccin previa. Se desconoce su mecanismo de multiplicacin, y para discernir entre las diversas hiptesis propuestas quiz haya que dilucidar la funcin del producto normal y su posible conversin a la isoforma patgena infectiva.Recientemente se ha comprobado que, al menos algunas de la enfermedades por priones son simultneamente infectivas y genticas, una situacin inslita en la Patologa humana, habindose demostrado una relacin entre un alelo dominante del PrP y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. El gen del prin (Prn-p) est ligado genticamente a un gen autosmico (Prn-i) que condiciona en parte los largos tiempos de incubacin hasta el desarrollo del sndrome.

1.1.2.2. Los enfoques de estudio como objeto formal de la MicrobiologaEl objeto formal de la Microbiologa viene determinado por todos aquellos aspectos (caractersticas estructurales, fisiolgicas, bioqumicas, genticas, taxonmicas, ecolgicas, entre otras) y enfoques desde los que se puede estudiar a los microorganismos y que conforman el cuerpo bsico de conocimientos de esta ciencia.Por otro lado, la Microbiologa tambin se ocupa de las distintas actividades microbianas en relacin con los intereses humanos, tanto las que pueden acarrear consecuencias perjudiciales (y en este caso estudia los nichos ecolgicos de los correspondientes agentes, sus modos de transmisin, los diversos aspectos de la microbiota patgena en sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de ste, as como los mtodos desarrollados para combatirlos y controlarlos), como de las que reportan beneficios (ocupndose del estudio de los procesos microbianos que suponen la obtencin de materias primas o elaboradas, y de su modificacin y mejora racional con vistas a su imbricacin en los flujos productivos de las sociedades).Finalmente, la Microbiologa ha de ocuparse de todas las tcnicas y metodologas destinadas al estudio experimental, manejo y control de los microorganismos, es decir, de todos los aspectos relacionados con el modo de trabajo de una ciencia emprica.

1.1.3. Ubicacin de los microorganismos en los sistemas de clasificacinEn la dcada de los 80, surgi una nueva visin sobre la clasificacin de los seres vivos y sus posibles relaciones evolutivas, provocando una verdadera revolucin en la Biologa moderna. Para entender esta revolucin debemos primero conocer cul era el conocimiento que haba entrado en crisis. El llamado paradigma clsico consideraba que la clasificacin natural de los seres vivos comprenda slo dos grandes clases de organismos (Figura 1): Procariontes (clulas sin ncleo) y Eucariontes (clulas con ncleo); estas dos grandes clases se diferenciaban profundamente a nivel de su estructura y organizacin subcelular, por lo que se les consider siempre como grupos excluyentes. Adems, estas clases de organismos eran agrupadas en 5 reinos (Whittaker, 1969), conformando los procariontes por si solos, el llamado reino Monera o Prokaryota (considerado primitivo o ancestral). Los 4 reinos eucariontes restantes Protozoa, Hongo, Plantae y Animalia seran reinos derivados del reino Monera (ms evolucionados)

Figura 1. Esquema de los 5 reinos clsicos de Wittaker y sus relaciones evolutivas: reino Metazoa (Animalia), reino Metafita (Plantae), reino Fungi (Hongo), reino Protista (Protozoo) y reino Procariota (Monera)

En el ao 1978 se descubre que las arquibacterias, hasta ese momento incluidas dentro del Reino Mnera, eran un nuevo tipo de seres vivos, tan distantes evolutivamente de las bacterias como de los eucariontes. En el ao 1990 Woese incorpora estos descubrimientos a un nuevo esquema sobre la evolucin y clasificacin de los seres vivos, planteando que la evolucin habra ocurrido en tres lneas o linajes filogenticos principales, y no en dos (procariontes y eucariontes), como postulaba el paradigma clsico.Esta nueva visin se caracteriza por considerar a las arquibacterias, actualmente denominadas archeas, como una tercera forma de vida, muy diferentes a los eucariontes y procariontes clsicos, el cambio propuesto por Woese resalta las diferencias, hasta ahora ocultas, entre organismos procariotas.Todos estos cambios y nuevas propuestas han sido posibles gracias al estudio y comparacin de secuencias de macromolculas conservadas en todos los seres vivos (denominadas relojes moleculares), tales como el RNA ribosomal (especialmente el RNAr 16S) y algunas protenas conservadas (como los factores traduccionales EF-G y EF-Tu). Tras una gran labor experimental, Woese se centr en un conjunto de informacin gentica en particular descubierto en el llamado 'RNA mitocondrial 16s'. Esta secuencia de cdigo gentico aparece en el genoma de todos los seres vivos. Es una secuencia perfectamente conservada, lo cual significa que ha evolucionado muy lentamente, por lo que puede ser utilizada para rastrear los cambios evolutivos sucedidos a lo largo de perodos de tiempo muy largos.El giro paradigmtico ocurrido en las dos ltimas dcadas, se ve plasmado en el nuevo rbol filogentico propuesto por Woese para la evolucin de los seres vivos. Esta nueva clasificacin se basa en una visin tricotmica (tres linajes principales) e incorpora un nuevo nivel o rango taxonmico denominado Dominio (superior a Reino). Estos tres nuevos linajes evolutivos reciben las siguientes denominaciones: dominio Bacteria, dominio Archaea y dominio Eukaya (Figura 2).

En el rbol filogentico de la vida, la distancia entre dos especies cualesquiera, trazada a lo largo de las lneas que las conectan, es proporcional a las diferencias entre su RNA mitocondrial. Las especies con secuencias prcticamente idnticas estn presumiblemente relacionadas y son representadas en el rbol, unas cerca de las otras; aquellas que estn ampliamente separadas, son parientes ms lejanos, y cuando se combina cierta cantidad de datos es posible inferir linajes. Cuando se emplea este mtodo con nuestras familiares plantas y animales, estos trazos en el rbol de la vida son muy similares a los de los rboles evolutivos deducidos de la anatoma estructural, pero la gran sorpresa lleg cuando se aplic esta tcnica al mundo microbiolgico.Dentro del Dominio Bacteria existen varios linajes bacterianos diferentes, cada uno de ellos estrictamente debera corresponder a un reino diferente, sin embargo por razones de ndole histrica, se les denomina Divisiones o Phyla. Hoy en da se describen 80 Divisiones o Phyla en el Dominio Bacteria, siendo la gran mayora de estas bacterias fotolitotrficas, quimiolitotrficas, ambientales y no patgenas para el hombre, muchas de ellas son fundamentales en varios ciclos geoqumicos del planeta (carbono, nitrgeno, fsforo, entre otros). El Dominio Archaea contiene al menos dos reinos (divisiones o Phyla) nuevos: Crenarchaeota y Euryarchaeota. El Dominio Eukarya histricamente comprendera los Reinos (Dominios o phyla) Fungi, Animalia, Plantae y Protozoa (llamados a veces Protista); pero actualmente, se conserva a los 3 primeros, mientras que el antiguo Reino Protozoa, se fragmenta en mltiples Reinos (Divisiones o Phyla) tales como: Microsporidios, Diplomonadas, Apicomplexa, Alveolados, Stramenopiles, Excavados, entre otros.As, los microorganismos se encuentran ubicados en los tres dominios: Archea, Bacteria y Eukarya,este ltimo comprende a todos los linajes microbianos constituidos por clulas eucariticas.

Figura 2. rbol filogentico de la vida, Este rbol filogentico se basa en la comparacin de secuencias del RNA ribosomal 16 S. La raz se localiz mediante el estudio de los factores traduccionales EF-Tu y EF-G (Woese, et al., 1990).Los virus no se incorporan a esta clasificacin por el hecho de no estar conformados por clulas y constituirse en seres vivos slo en unin a una clula viva preexistente. Sus orgenes no estn claros, algunos investigadores opinan que derivaran de entidades celulares y por lo tanto no seran primitivos. Otros investigadores piensan que corresponderan a remanentes de una etapa de la evolucin pre-celular de la vida, por lo que en este caso se consideraran entes primitivos.

Recientemente se descubri una nueva familia de virus denominada Mimivirus, que se caracteriza por infectar amebas y poseer un genoma de DNA mayor que el de algunas bacterias (dos veces mayor que el genoma de la bacteria Micoplasma genitalium). Algunos investigadores piensan, en base al estudio de las secuencias de algunas enzimas de estos virus, que esta familia podra corresponder a virus arcaicos, anteriores incluso al origen de las clulas eucariontes. En todo caso, hoy en da no existe consenso entre los investigadores respecto al origen de los virus y no parece posible, al menos al corto plazo, dilucidar experimentalmente tal cuestin.

1.2. Desarrollo histrico de la MicrobiologaAunque los microorganismos se originaron hace aproximadamente 4.000 millones de aos, la Microbiologa es relativamente una ciencia joven. Los primeros microorganismos se observaron hace300 aos y sin embargo pasaron unos 200 aos hasta que se reconoci su importancia. La Microbiologa aparece a finales del siglo XIX como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodolgicos que se haban iniciado en los siglos anteriores, y que obligaron a una revisin de ideas y prejuicios seculares sobre la dinmica del mundo vivo. De acuerdo al esquema propuesto por Collard (l976), se distinguen cuatro periodos en el desarrollo de la Microbiologa:Primer periodo. Periodo de especulacin que se extiende desde la antigedad hasta el arribo de los primeros microscopistas.Segundo periodo. Acumulacin de observaciones desde l675 con el descubrimiento de los microorganismos por Leeuwenhoek, hasta mediados del siglo XIX.Tercer periodo. Inicia con el cultivo de microorganismos, que llega hasta finales del siglo XIX, donde las investigaciones de Pasteur y Koch encabezan el establecimiento de la Microbiologa como ciencia experimental.Cuarto periodo. A partir de los albores del siglo XX con los descubrimientos de Winogradsky, Beijerinck, Kluver y van Niel, hasta nuestros das, en el que los microorganismos se estudian desde los aspectos morfolgicos, fisiolgicos, bioqumicos, genticos, ecolgicos, entre otros, lo que conlleva a la Microbiologa a un extraordinario crecimiento, as como tambin, al surgimiento de disciplinas microbiolgicas especializadas como la Virologa y la Inmunologa entre otras, y a la estrecha imbricacin de las ciencias microbiolgicas en el marco general de las Ciencias Biolgicas.

1.2.1. Periodo previo al descubrimiento del microscopio (periodo de especulacin)Durante el periodo de especulacin, la humanidad tuvo conocimiento sobre las actividades de los microorganismos, aunque stos no pudieron ser observados. El ser humano produca bebidas alcohlicas, productos lcteos y pan, sin embargo, especulaban sobre la forma en que se efectuaban dichos procesos fermentativos. Por otro lado, tambin se generaron especulaciones sobre el origen de las enfermedades infecciosas. Diversas fuentes escritas de la antigedad griega y romana hablan de grmenes invisibles que transmiten enfermedades contagiosas. Lucrecio (96-55 a.C.), en su De rerum natura hace varias alusiones a semillas de enfermedad.En el Renacimiento europeo, Girolamo Frascatorius, en su libro De contagione et contagionis (1546) dice que las enfermedades contagiosas se deben a grmenes vivos que pasan de diversas maneras de un individuo a otro. Estos inicios de explicacin que renunciaban a invocar causas sobrenaturales fueron probablemente catalizados por la introduccin en Europa de la sfilis, una enfermedad en la que estaba clara la necesidad de contacto para su contagio. Pero la cosa que se transmite en la enfermedad sigui siendo objeto de conjeturas durante mucho tiempo, sin embargo, la existencia de los microorganismos no se conoci hasta finales del siglo XVII.

1.2.2. Primeros microscopistas y el descubrimiento de los microorganismosYa en el siglo XIV, con la invencin de las primeras lentes para corregir la visin, surgi una cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamao aparente de los objetos. En el siglo XVI surgieron algunas ideas sobre aspectos de la fsica ptica de las lentes de aumento, pero no encontraron una aplicacin inmediata. Se dice que Galileo hizo algunas observaciones microscpicas invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero en cualquier caso est claro que no tuvieron ninguna repercusin.El descubrimiento de los microscopios fue obra del holands Antony van Leeuwenhoek, quien fue la primera persona en describir los microorganismos en detalle. En 1675 descubri que en una gota de agua de estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeas criaturas a las que a los cuales denomin animculos. En 1683 descubre las bacterias, por lo que se considera el "padre de la Microbiologa". Sus dotes de observador le llevaron asimismo a describir protozoos (como Giardia,

que encontr en sus propias heces), la estructura estriada del msculo, la circulacin capilar, a descubrir los espermatozoides y los glbulos rojos (por lo que tambin se le considera el fundador de la Histologa animal), as como a detallar diversos aspectos estructurales de las semillas y embriones de plantas. Simultneamente el ingls Robert Hooke, usando microscopios compuestos, describi los hongos filamentosos en 1667, y descubri la estructura celular de las plantas en 1665, acuando el trmino clula. Sin embargo, estas observaciones no condujeron a ninguna investigacin acerca de las posibles actividades de los microorganismos, ni como agentes de fermentaciones ni de enfermedades infecciosas ya que el desarrollo de la qumica y de la medicina era demasiado primitivo.Una vez descubiertos los microorganismos por Leeuwenhoek se empez a especular sobre el origen de estos animculos, por lo que se formaron dos escuelas: la abiognesis (generacin espontnea) apoyada por los preformacionistas y la biognesis (los animculos se originaban a partir de animculos padres). La doctrina de la generacin espontnea fue puesta en entredicho por los experimentos de Redi quien acu la expresin "Omne vivum ex ovo" (1668), tras comprobar que los gusanos encontrados en la carne provenan de los huevos que previamente haban depositado en la carne las moscas.Los descubrimientos de Redi tuvieron el efecto de desacreditar la teora de la generacin espontnea para los animales y plantas, pero la reavivaron respecto de los recin descubiertos animlculos, una cosa eran los huevos de moscas y otra los microorganismos. En 1745 Needham hirvi trozos de carne para destruir los organismos preexistentes y los coloc en un recipiente abierto, posteriormente, observ colonias de microorganismos sobre la superficie y concluy que se generaban espontneamente a partir de la carne.En 1769, Spallanzani repiti el experimento pero tapando los recipientes, no apareciendo las colonias, lo que contradeca la teora de la generacin espontnea. Pero Needham argument que el aire era esencial para la vida incluida la generacin espontnea de microorganismos y este aire haba sido excluido en los experimentos de Spallanzani. En 1836 Franz Schulze pas el aire a travs de unas soluciones cidas fuertes hacia el interior de un recipiente con carne hervida. Al ao siguiente Theodor Schwann pas el aire a travs de tubos calientes. Los microorganismos no aparecan en ningn caso ya que los microorganismos presentes en el aire haban sido aniquilados. Sin embargo, los que apoyaban la generacin espontnea comentaban que el cido y el calor alteraban el aire de tal manera que impeda la generacin espontnea de los microorganismos. En 1864 Pasteur pone fin a la controversia sobre el origen de los microorganismos al utilizar matraces con cuello de cisne, el aire pasaba libremente a travs del cuello, pero los microorganismos no aparecan en la solucin ya que las partculas de polvo y microorganismos sedimentaban en el recodo del cuello. Estos experimentos de Pasteur promovieron el reconocimiento de la biognesis, de esta forma quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos, y se abra la Edad de Oro del estudio cientfico de las formas de vida no observables a simple vista. Los ltimos escpticos quedaron silenciados cuando en 1877 John Tyndall aplic su sistema de esterilizacin por calentamiento discontinuo (hoy conocida precisamente como tindalizacin), que evidenci la existencia de formas microbianas de reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco ms tarde por Ferdinand Cohn al descubrir las esporas bacterianas.Sin duda desde la Prehistoria los hombres utilizan con provecho las fermentaciones. Las teoras cientficas de esa poca reconocan la presencia de levaduras en la fermentacin alcohlica, pero estas levaduras eran consideradas como compuestos qumicos complejos, sin vida. Esta era la teora mecanstica liderada por los qumicos alemanes von Liebig y Whler. Luis Pasteur, qumico francs, propuso la teora vitalstica y demostr que las clulas viables de levaduras causan fermentacin en condiciones anaerbicas; durante dicha fermentacin el azcar presente en el mosto es convertido principalmente en etanol y CO2. En 1866, Pasteur public la obra titulada "Estudios sobre el vino, sus enfermedades, causas que las provocan. Nuevos procedimientos para la conservacin y envejecimiento". Entre las mejoras aconsejadas haba un mtodo para aumentar la calidad de la conservacin de los vinos consistente en calentarlos a una temperatura de 68 C durante 10 minutos y despus enfriarlos rpidamente. Esta tcnica ha venido a ser conocida como pasteurizacin y es ahora ampliamente utilizada en el tratamiento de la leche.

En 1546, Girolano Fracastoro sugiri que las enfermedades podan deberse a organismos tan pequeos que no podan verse y que eran transmitidos de una persona a otra. Sin embargo, el descubrimiento de que las bacterias pueden actuar como agentes especficos de las enfermedades infecciosas en los animales fue realizado a travs del estudio del carbunco, infeccin grave de los animales domsticos que es transmisible al hombre. La demostracin concluyente de la causa bacteriana o etiologa del carbunco la proporcion en 1876 Robert Koch, mdico alemn, seis aos despus Koch anunci al mundo que haba encontrado la bacteria del carbunco (Bacillus anthracis). Posteriormente l y sus colaboradores descubrieron las bacterias que causan la tuberculosis y el clera. El descubrimiento posterior de los virus (Dimitri Ivanovski en 1892; el virus del mosaico del tabaco pasaba los filtros que retenan a las bacterias), agentes que no crecen en medios artificiales en el laboratorio como lo hacen las bacterias, han permitido realizar algunas modificaciones en los postulados de Koch. Este trabajo sobre el carbunco condujo rpidamente a la edad de oro de la bacteriologa. En 25 aos la mayora de los agentes bacterianos de las principales enfermedades humanas haban sido descubiertos y descritos.Actualmente es difcil comprender la magnitud de la miseria y devastacin causada por los microorganismos antes de 1950. En Europa, durante el perodo de 1347-1350 ocurri una epidemia de peste bubnica, conocida como la "muerte negra" y causada por la bacteria Yersinia pestis, se estim que murieron 25 millones de personas. Con el conocimiento de que los microorganismos causaban enfermedades, los cientficos se dedicaron a investigar la prevencin y el tratamiento. Los hospitales adoptaron la antisepsia (Joseph Lister. 1860) la cual previene la diseminacin de las enfermedades infecciosas mediante la inhibicin o destruccin de los agentes causantes. Tambin se descubri la inmunizacin (Pasteur, 1880), proceso que estimula las defensas del cuerpo frente a la infeccin. Se empez a aplicar la quimioterapia (Paul Ehrlich, Gerhard Domagk, y Alexander Fleming), tratamiento de las enfermedades con una sustancia qumica. Tambin influy la sanidad pblica, sobre todo la higiene relacionada con los alimentos y aguas.Antes de 1940 el conocimiento del fenmeno gentico provena de las investigaciones sobre plantas y animales, pero no se saba si estos resultados se podan aplicar a los microorganismos. En 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod y MacLyn McCarty descubrieron el papel del DNA en la gentica bacteriana. Encontraron que el material de DNA de un tipo de neumococos puede transferir una caracterstica hereditaria a otro tipo de neumococos. Posteriormente, en 1953 Watson, Crick y Wilkins descubrieron la estructura molecular del DNA. Estos descubrimientos, junto con otros, establecieron que la informacin gentica de todos los organismos est codificada en el DNA. Esto hizo de los microorganismos un modelo muy atractivo para la investigacin gentica. Actualmente y utilizando la tecnologa del DNA recombinante o ingeniera gentica se pueden transferir fragmentos de DNA de un organismo a otro.

1.2.3. El cultivo de los microorganismosLa doctrina del pleomorfismo, vigente durante buena parte del siglo XIX, mantena que los microorganismos adoptaban formas y funciones cambiantes dependiendo de las condiciones ambientales. A estas ideas se oponan frontalmente investigadores como Koch, Pasteur y Cohn, que estaban convencidos de la especificidad y constancia morfolgica y fisiolgica de cada tipo de microorganismo (monomorfismo). El pleomorfismo haba surgido como una explicacin a la gran variedad de formas y actividades que aparecan en un simple frasco de infusin, pero ya Pasteur, en sus estudios sobre la fermentacin, se haba percatado de que los cultivos que aparecan podan considerarse como una sucesin de distintas poblaciones de microorganismos predominantes, que, a resultas de sus actividades, condicionaban la ulterior composicin de la comunidad microbiana. La solucin definitiva a esta cuestin dependa, de nuevo, de un desarrollo tcnico, que a su vez iba a suministrar una de las herramientas caractersticas de la nueva ciencia: los mtodos de cultivo puro.Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el miclogo Brefeld, quien logr aislar esporas de hongos y cultivarlas sobre medios slidos a base de gelatina. Por su menor tamao, este mtodo se haca inviable para las bacterias, por lo que se recurri a un mtodo basado en diluciones: Lister, en 1878 realiz diluciones secuenciales de cultivos mixtos, hasta lograr muestras en las que exista una sola clula. Pero la tcnica era larga y tediosa y, adems, normalmente slo se lograban aislar clulas

del tipo bacteriano ms abundante en el cultivo original; sin embargo, el experimento sirvi para confirmar la naturaleza particulada de los agentes de las fermentaciones.Por aquella poca Koch buscaba con ahnco mtodos ms sencillos de cultivo puro, indispensables para proseguir sus investigaciones sobre bacterias patgenas. Primero emple rodajas de patata como sustrato slido nutritivo sobre el que se podan desarrollar colonias macroscpicas de bacterias que presentaban morfologa caracterstica, que Koch interpret como resultantes del crecimiento a partir de clulas individuales. Pero enseguida recurri a compactar el tpico caldo de cultivo a base de carne (diseado por Loeffler) aadindole gelatina (1881). El medio slido as logrado era transparente, lo que permita visualizar fcilmente los rasgos coloniales, y contena los nutrientes adecuados para el crecimiento de una amplia gama de bacterias. stas eran inoculadas en la superficie del medio con un hilo de platino pasado previamente por la llama, por la tcnica de siembra en estra. Sin embargo, la gelatina presentaba los inconvenientes de ser atacada por determinados microorganismos, y de tener un bajo punto de fusin; ambos problemas se solventaron cuando en 1882 el mdico alemn Walter Hesse, introdujo el agar (polisacrido extrado de algas rojas) como nuevo agente solidificante. El trabajo de Koch ya citado tuvo la trascendental consecuencia de derribar las ideas pleomorfistas, y supuso la primera propuesta del concepto de especie dentro del mundo bacteriano. En 1887 Petri, un ayudante de Koch, sustituy las engorrosas bandejas de vidrio cubiertas con campanas, usadas hasta entonces para los cultivos slidos, por un sistema manejable de placas de cristal planas, que se conoce como cajas de Petri.El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue una consecuencia de las investigaciones llevadas a cabo por Beijerinck y Winogradsky entre 1888 y los primeros aos del siglo XX, sobre bacterias implicadas en procesos biogeoqumicos y poseedoras de caractersticas fisiolgicas distintivas (quimioauttrofas, fijadoras de nitrgeno, entre otras). Estos medios, donde se aplica a pequea escala el principio de seleccin natural, se disean de forma que su composicin qumica definida favorezca slo el crecimiento de ciertos tipos fisiolgicos de microorganismos, nicos capaces de usar ciertos nutrientes del medio. Otra importante aportacin a este perodo de cultivo dentro del desarrollo de la Microbiologa surgi del uso de medios diferenciales, en los que se manifiesta algn rasgo bioqumico o metablico, lo que contribuye a la identificacin microbiana. Fue Wrtz quien, en 1892, introdujo el uso de indicadores de pH, incorporados en los medios, lo cual permita revelar la produccin de acidificaciones por fermentacin en ciertas bacterias.Grandes naturalistas como Haeckel, Strassburger y Abb interaccionando con una poderosa industria ptica y qumica. Estas influencias recprocas se plasmaron en numerosos proyectos que reflejaban la efervescencia de las ciencias naturales tras la estela de Darwin (cfr. Jahn et al., 1985). Concretamente, la industria ptica de Abb y Zeiss, pudo satisfacer la necesidad de Koch de perfeccionar el microscopio compuesto, introduciendo lentes acromticas y una iluminacin inferior provista de condensador. El mismo Abb desarroll en 1878 el objetivo de inmersin en aceite. Por otro lado, la industria qumica BASF, que por aquella poca se encontraba en pleno auge de patentes de nuevos colorantes, suministr al laboratorio de Koch una serie de derivados de anilina que tean las bacterias permitiendo su fcil visualizacin al microscopio en frotis de tejidos infectados. En 1875 Carl Weigert ti bacterias con pirocarmn, un colorante que ya vena siendo usado desde haca unos aos en estudios zoolgicos. En aos sucesivos se fueron introduciendo el azul de metileno (Koch, 1877), la fuchsina, y el violeta cristal. En 1882-1883 Ziehl y Neelsen desarrollan su mtodo de cido- alcohol resistencia para teir Mycobacterium tuberculosis. En 1884 el patlogo dans Christian Gram establece una tincin de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en funcin de sus reaccin diferencial de tincin y que, como se vera mucho ms tarde, reflejaba la existencia de dos grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos. En 1890 Loeffler logra visualizar flagelos bacterianos por medio de su tcnica de impregnacin argntica. Como veremos ms adelante, la misma industria de colorantes alemana previa a la primera guerra mundial fue decisiva tambin para los comienzos de la quimioterapia.Estas innovaciones tcnicas (mtodos de cultivo, microscopa y tinciones) fueron fundamentales (junto con los sistemas de esterilizacin abordados en el anterior apartado) para la consolidacin de la Microbiologa como ciencia, permitiendo eliminar las grandes dosis de especulacin que hasta entonces haban predominado.

1.2.4. Auge de la Microbiologa (Winogradsky, Beijerinck, Kluyver y van Niel)Gran parte de los avances en Microbiologa descritos hasta ahora se debieron a la necesidad de resolver problemas prcticos. Pero hacia finales del siglo XIX una serie de investigadores, desarrollaron importantes estudios bsicos que fueron revelando una enorme variedad de microorganismos y sus actividades metablicas, as como su papel crucial en ciclos biogeoqumicos, sus relaciones con procesos de nutricin vegetal, entre otros.El descubrimiento de la quimioautotrofa, obra del gran microbilogo ruso Sergei Winogradsky (1856- 1953), oblig a revisar los conceptos previos, procedentes de la Fisiologa Vegetal, de que el crecimiento autotrfico dependa de la presencia de clorofila. Winogradsky haba comenzado investigando las bacterias del hierro descubiertas por Cohn en 1875, observando que podan crecer en medios minerales, por lo que supuso que obtenan su energa de la oxidacin de sales ferrosas a frricas (1888).En 1889, combinando tcnicas de observacin secuencial de cultivos microscpicos con ensayos microqumicos sobre bacterias del azufre (Beggiatoa, Thiothrix), infiri que estos microorganismos oxidaban sulfuro de hidrgeno hasta azufre elemental (acumulando ste como grnulos), y luego hasta cido sulfrico, obteniendo de este modo su energa. Estas observaciones pueden haber sido el arranque del concepto de litotrofa. Pero el descubrimiento de la quimioautotrofa lleg cuando al ao siguiente Winogradsky y Omeliansky pasaron a estudiar las bacterias nitrificantes, demostrando de manera clara que la energa obtenida de la oxidacin del amonio o del nitrito era usada para fijar CO2 (1889-1890). Ms tarde el mismo Winogradsky extendi la demostracin a cultivos puros en los que el agente solidificante de los medios era el gel de slice. La explicacin del proceso de oxidacin de los compuestos de azufre no lleg hasta los estudios de Dangeard (1911) y Kiel (1912). Nuevas capacidades metablicas fueron reveladas al estudiar los procesos respiratorios de las bacterias que oxidan hidrgeno o metano (Shngen, 1906).El qumico Berthelot haba sealado (1885) que los microorganismos del suelo podan incorporar nitrgeno molecular directamente del aire. Fue igualmente Winogradsky el primero en aislar una bacteria capaz de fijar nitrgeno atmosfrico (Clostridium pasteurianum) y en explicar el ciclo del nitrgeno en la naturaleza (1890), siendo el holands Martinus Beijerinck (1851-1931) el descubridor de Azotobacter como bacteria aerobia fijadora de vida libre (1901). Ms tarde Beijerinck demostr por mtodos qumicos que, en efecto, Azotobacter incorpora nitrgeno de la atmsfera mientras crece (1908). La importancia de la fijacin de nitrgeno para la nutricin vegetal lleg con los estudios sobre bacterias formadoras de ndulos en las races de las leguminosas. Ya los experimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes, realizados por Boussingault a mediados del siglo XIX, haban indicado que las leguminosas asimilaban nitrgeno de la atmsfera. En 1866 Voronin descubri las bacterias de los ndulos radicales de esta familia de plantas. Frank, en 1879, demostr que los ndulos parecan inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y Ward (1887) us bacterias procedentes de ndulos machacados para inocular semillas, logrando la produccin de ndulos en suelo estril, y describiendo en un bello trabajo el proceso de infeccin, con su produccin de hifas (cordn de infeccin). Tras la introduccin del concepto de simbiosis por De Bary, en 1878, fue Schindler (1884) el primero en describir los ndulos radicales como resultado de una simbiosis entre planta y bacterias.Los trabajos de Hermann Hellriegel (1831-1895) y de su colaborador Hermann Willfahrt (1853-1904), que trabajaban en la Estacin Experimental de Bernburg, comunicados en primer lugar en un congreso en Berln, en 1886, y publicados en un artculo ejemplar en 1888, asociaron la fertilidad nitrogenada natural de las leguminosas con la presencia de sus ndulos radicales, sealando que estos ndulos se inducan por microorganismos especficos; de este modo lograron una brillante sntesis de las observaciones microbiolgicas y qumicas. El mismo ao de 1888 Beijerinck logr el cultivo puro in vitro de las bacterias nodulares (a las que bautiz como Bacillus radicicola), observando que no reducan nitrgeno en vida libre; ms tarde (1890) aport la prueba definitiva de que las bacterias aisladas eran capaces de nodular especficamente ciertas especies de leguminosas, adquirindose de esta forma la facultad de fijar nitrgeno en su asociacin con la raz de la planta. Irnicamente el nombre definitivo para las bacterias de los ndulos de leguminosas (Rhizobium) fue propuesto por Frank, quien durante mucho tiempo se haba negado a reconocer los resultados de

Hellriegel y Willfahrt, y que haba oscilado en sus opiniones, desde suponer que la fijacin de nitrgeno era un rasgo general de las plantas, hasta creer que las estructuras intranodulares observadas a microcopio (bacteroides) eran grnulos de reserva (incluidas las que l mismo observ en plantas no leguminosas de los gneros Alnus y Eleagnus, originadas por una bacteria bautizada en su honor -Frankia); incluso cuando se convenci de que los simbiontes eran bacterias (y no hongos o mixomicetes), pensaba que stas slo estimulaban a que las plantas fijaran nitrgeno en sus hojas; su conversin (y an as incompleta y con reticencias) no lleg hasta 1892. El aislamiento de los bacteroides intranodulares (Prazmowski, 1890), y la relacin entre su formacin y la fijacin de nitrgeno (Nobbe y Hiltner, 1893) complet esta primera oleada de investigacin sobre este tema que tanta trascendencia presentaba para la Agronoma. Estos estudios estn en la base de todos los ulteriores trabajos de Microbiologa Agrcola, de modo que esta especiliadad fue incorporada tempranamente a los laboratorios cientficos y estaciones experimentales.Las obras trascendentales de Winogradsky y Beijerinck abrieron un nuevo horizonte para el estudio de la diversidad microbiana. La escuela de Beijerinck, en la Universidad Tcnica de Delft, fue continuada por A.J. Kluyver y C.B. van Niel, siendo este ltimo el padre de la escuela norteamericana desde su establecimiento en California, ya que form a figuras tan importantes como R.Y. Stanier, R.E. Hungate o M. Doudoroff. La escuela holandesa fundada por Beijerinck tuvo asimismo otra fructfera colonia en la ciudad alemana de Konstanz, donde N. Pfennig continu el trabajo emprendido junto a van Niel en Delft. Todos estos autores, y sus colaboradores, fueron realizando contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la variedad de las bacterias fotosintticas, los tipos de organismos litotrficos, y profundizando en multitud de aspectos estructurales y fisiolgicos de las bacterias recin descubiertas. Como dice T.D. Brock en una recensin de Kluyver (1961) los hombres de la escuela de Delft de Microbiologa General fueron pioneros en una poca en la que la mayora de los investigadores estaban demasiado fascinados por problemas aplicados en medicina, agricultura o industria, como para preocuparse por microorganismos quimiosintticos o fotosintticos, o por aquellos que muestran fermentaciones inusuales.... Pero, como en tantas otras ocasiones, este enfoque de ciencia bsica ha sido extraordinariamente frtil, y aparte de la profundizacin en la unidad y diversidad de la vida ha dado origen a penetrantes percepciones en multitud de problemas planteados, tarde o temprano, a las ciencias biolgicas.

1.3. Relaciones de la Microbiologa con otras cienciasEl auge de la microbiologa desde finales del siglo XIX se plasm, entre otras cosas, en el aislamiento de gran variedad de cepas silvestres de microorganismos, lo que suministr un enorme volumen de nuevo material biolgico sobre el que trabajar, aplicndose una serie de enfoques que eran ya habituales en las ciencias naturales ms antiguas; as, haba que crear un marco taxonmico (con sus normas de nomenclatura) para encuadrar a los organismos recin descubiertos, era factible desarrollar trabajos sobre morfologa y fisiologa comparadas, sobre variabilidad y herencia, evolucin, ecologa, etc. De este modo la joven Microbiologa fue objeto, en pocos aos, de la utilizacin, a un ritmo acelerado, de los mtodos taxonmicos y experimentales que haban ido surgiendo y madurando desde el siglo XVIII en los mbitos de la Historia Natural clsica.Los esfuerzos tempranos para lograr un clasificacin bacteriana por parte de Cohn (1875) y Migula (1894), que sustentaban su concepto de especie predominantemente sobre caracteres morfolgicos, pero hacia 1900 era evidente la arbitrariedad e insuficiencia de este tipo de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores hicieron uso de caracteres bioqumicos (Orma Jensen, 1909), o de una mezcla de rasgos morfolgicos, bioqumicos, patognicos y de tincin (Buchanan, 1915). El sistema de taxonoma bacteriana adquiri un nuevo impulso a partir de la 1 edicin del Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1923), y de las propuestas de Kluyver y van Niel (Prospects for a natural system of classification of bacteria, 1936). En cuanto a la nomenclatura, no fue hasta 1958 en que se gener un Cdigo Internacional de Nomenclatura Bacteriolgica, aunque ya se vena aplicando desde haca tiempo el procedimiento tipolgico para los microorganismos, con criterios similares a los de la Zoologa y la Botnica.El establecimiento de relaciones taxonmicas precis el recurso a mtodos cada vez ms amplios y afinados de anlisis gentico, estructural o fisiolgico. En un apartado anterior ya vimos las conexiones tempranas entre la Bioqumica y la Microbiologa a propsito del descubrimiento de la base enzimtica de las fermentaciones, lo cual abri el camino para dilucidar el metabolismo energtico microbiano, y para demostrar su similitud qumica con rutas metablicas de organismos superiores. Otro paso importante en la percepcin de la unidad bioqumica del mundo vivo deriva del descubrimiento de las vitaminas (trmino acuado por Funk en 1911), al establecerse que determinados factores de crecimiento requeridos por algunos microorganismos eran qumicamente similares a las vitaminas necesarias en la dieta de los animales, y que este tipo de compuestos representa precursores biosintticos de coenzimas del metabolismo celular. As pues, este tipo de investigaciones sent claramente la idea de la unidad qumica de los seres vivos, independientemente de su encuadre taxonmico, y encauz una buena parte de los trabajos bioqumicos hacia los microorganismos, dadas sus cualidades de facilidad de manejo y cultivo en laboratorio.En cuanto a las conexiones de la Microbiologa con la Gentica, ya Beijerink, en 1900, tras analizar la teora de la mutacin de De Vries, haba predicho que los microoganismos podran convertirse en objetos de investigacin ms adecuados que los sistemas animales o vegetales. Pero las primeras conexiones entre ambas ciencias arrancan de la necesidad que hubo, a principios del siglo XX, de determinar la sexualidad de los hongos con fines taxonmicos. En 1905 Maire demostr la existencia de meiosis en la formacin de ascosporas, y Claussen (1907) evidenci fusin de ncleos en Ascomicetos, mientras que Kniepp, hacia finales de los aos 30 haba recogido un gran volumen de informacin sobre procesos sexuales en Basidiomicetos. El sueco Lindegren (1936) realiza las primeras cartografas genticas en cromosomas de Neurospora, durante su estancia en el laboratorio californiano de Morgan; este ltimo, propugnador de la teora de los genes (1926), confiaba desde haca aos en ampliar sus xitos, logrados en Drosophila, hacia el estudio de la gentica microbiana. En 1941, otros dos discpulos de Morgan, Beadle y Tatum, aislan mutantes auxotrficos de Neurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioqumica de la herencia, y convierten a este hongo en una valiosa herramienta de trabajo en esta lnea de investigacin.Las estrategias diseadas por Beadle y Tatum fueron aplicadas por Luria y Delbrck (1943) a cultivos bacterianos, investigando la aparicin de mutaciones espontneas resitentes a fagos o estreptomicina. La conexin de estos experimentos con las observaciones previas de Griffith (1928) sobre la transformacin del neumococo, llev a Avery y colaboradores (1944) a demostrar que el principio transformante portador de la informacin gentica es el ADN. En 1949 Erwin Chargaff demuestra

bioqumicamente la transmisin gentica mediante ADN en Escherichia coli , y en 1952 Alfred Hershey y Martha Chase, en experimentos con componentes marcados de fagos, ponen un elegante colofn a la confirmacin de la funcin del ADN, con lo que se derribaba el antiguo y asentado paradigma de las protenas que hasta mediados de siglo intentaba explicar la base de la herencia. De esta forma, la Microbiologa experimental se sita en pleno centro del nacimiento de la Gentica molecular, de la mano de los avances paralelos en Bioqumica (anlisis por rayos X de la estructura del ADN debido a Maurice Wilkins y Rosalind Franklin, modelo de Watson y Crick de la doble hlice del ADN, etc.), dando origen esta confluencia a lo que se ha llamado la Edad de Oro de la Biologa Molecular.

1.4. Importancia de la MicrobiologaLa Microbiologa es una de las Ciencias que tiene ms que ofrecer a los pases en desarrollo, por su trascendencia en la salud pblica, medicina, agricultura e industria, siendo las colecciones de microorganismos el epicentro que la sostiene, debido a que las exigencias de la investigacin son cada vez ms firmes en el empleo de cultivos de procedencia conocida y garantizados en pureza y conservacin. Sin cultivos microbianos sus constituyentes celulares o enzimticos no puede existir la Microbiologa aplicada y por consiguiente, la Biotecnologa que se encarga de transformar los resultados obtenidos de la ciencia bsica (Microbiologa, Biologa Molecular. Bioqumica, entre otras) en productos y procesos de valor comercial.La Microbiologa muestra una prometedora perspectiva de expansin a mltiples campos de la actividad humana, desde el control de enfermedades infecciosas (higiene, vacunacin, quimioterapia, antibioterapia) hasta el aprovechamiento econmico y racional de los mltiples procesos en los que se hallan implicados los microorganismos (biotecnologas). La industria alimentaria utiliza microorganismos en la produccin de vinagre, bebidas alcohlicas, aceitunas, mantequilla, queso, yogurt, pan, entre otros. Adems, las bacterias y otros microorganismos ahora pueden ser manipulados para producir sustancias que ellos normalmente no sintetizan; el impacto de las nuevas tecnologas est determinando notables cambios en la Microbiologa. Entre los avances de mayor trascendencia en los ltimos aos, se encuentran: la secuenciacin completa de genomas bacterianos; la identificacin de microorganismos por tcnicas genotpicas; el desarrollo de la microbiologa clnica; el reconocimiento y las posibilidades de la aplicacin de la biodiversidad microbiana.Existen cazadores de microbios modernos que en ambientes exticos, aslan bacterias nuevas, no descritas, si se considera que se desconoce ms del 95% de las bacterias, el describir bacterias nuevas parecera una actividad sin fin. En este sentido, resulta interesante investigar si existen microorganismos en extincin y cules seran las causas. Se desconoce los efectos que la actividad humana tiene sobre los microorganismos; la devastacin de selvas y bosques probablemente tienen efectos drsticos sobre los microorganismos; los fertilizantes qumicos alteran las poblaciones de bacterias fijadoras de nitrgeno, y el uso de antibiticos ha favorecido la proliferacin de las resistentes. Por otra parte, se estn realizando investigaciones sobre la obtencin de genes del ambiente, donde no importa el microorganismo del que provenga el gen, ya que la meta es expresarlo en alguna bacteria conocida y obtener un producto novedoso que pueda probarse como frmaco, insecticida o promotor del crecimiento.La secuenciacin de genomas completos ha mostrado la existencia de enormes cantidades de genes potenciales, cuya funcin se desconoce; una manera de descifrar su funcin es eliminarla de las clulas por mutacin. Se puede prever que el futuro de la investigacin en microbiologa, requerir de la generacin de un enorme nmero de mutantes en muchos genes potenciales de diferentes especies. Esta tarea parece titnica, sin embargo, es factible.Otro enfoque ingenioso con perspectivas a futuro es de la "evolucin in vitro", aqu se mezclan genes de diferentes vas inclusive de vas metablicas no relacionadas y tambin se pueden incluir genes mutados al azar o por recombinacin. El objetivo es obtener sntesis de enzimas, protenas, compuestos novedosos; esta estrategia ha sido utilizada con xito en la sntesis de nuevos carotenoides. Mediante manipulaciones genticas ms tradicionales de ingeniera gentica se han logrado microorganismos productores de diferentes compuestos, existen bacterias que producen cantidades prodigiosas de riboflavina (vitamina B2), o se ha cambiado la especificidad de una enzima en otra, la enzima lactato deshidrogenasa se convirti en la enzima malato deshidrogenasa.En Microbiologa se han seleccionado modelos de estudio y algunos de stos se han analizado con gran profundidad, ello se ve reflejado en el nmero de publicaciones por microorganismo; por ejemplo, E. coli es la bacteria en la que ms investigacin se hace y entre los hongos ms estudiados se encuentra Saccharomyces. Sin embargo, una vez que se detecta un microorganismo de inters se puede avanzar muy rpido en su conocimiento basado en lo que se sabe en otros microorganismos, este ha sido el caso del virus del SIDA y en Helicobacter pylori, de este ltimo, por su importancia mdica, se secuenciaron dos cepas, se han secuenciado las islas de patogenicidad de muchas cepas y se han implementado experimentos de citoxicidad en diferentes lneas celulares de humano.

La identificacin de los organismos causantes de brotes infecciosos es posible gracias al uso de tcnicas moleculares que permiten rastrear, a manera de detectives, la fuente de la contaminacin, as por ejemplo, muy recientemente las diarreas de unas pocas personas en ciudades alejadas en Estados Unidos, se atribuyeron a que el perejil que fue adquirido por algunos restaurantes llevaba Shigella sonnei por haber sido regado con agua contaminada; la rapidez en la deteccin evit que otras personas enfermasen, se estima que si se hubiera podido realizar este tipo de rastreo en aos anteriores, como en 1993, se hubieran podido prevenir algunos de los decesos causados por las E. coli enteropatgenas de las hamburguesas.

UNIDAD NO. 1MTODOS Y TCNICAS MICROBIOLGICAS BSICAS.

2.1 Aislamiento y Seleccin de Microorganismo

2.1.1 RESERVORIO DE MICROORGANISMOS

2.1.1.1 Agua, Suelo y Aire

Diversidad en AmbientesRaramente podemos encontrar a los microorganismos como cultivos puros. Cada especie de cada microorganismo se encuentra en diferentes ambientes donde existen las condiciones necesarias para su crecimiento: agua, suelo y aire, por lo que tambin las tcnicas de aislamiento ser diferente para cada ambiente y para cada especie de microorganismo.AguaEl agua es un amiente donde existen diferentes microorganismos y cada uno de ellos realizan diferentes actividades en el ambiente. Tambin, los microorganismos forman parte esencial en la cadena alimenticia, as mismo, tambin son instrumentos en el proceso de reciclaje de elementos presentes en el agua. Llamaremos por agua a los ambientes acuticos a todas las extensiones de agua presentes en el globo terrqueo: mares, ros, arroyos, aguas domsticas, aguas residuales, etc.Distribucin de los Microorganismos PlanctonEs una forma de vida flotante y a la deriva en extensiones de agua. Son mviles debido a las caractersticas de flotacin que presentas, algunas de ellas estn cubiertas por gotas de aceite o simplemente por la estructura que presenta. Existen dos grupos principales: fitoplancton, que son todas las algas; y el zooplancton, lo constituyen los protozoos y los animales vivos diminutos. Microorganismos BentnicosEsta clase de microorganismos habitan en el fondo de una masa grande de agua y sta a su vez es la regin ms rica en microorganismos de un estuario marino puesto que contiene millones de microorganismos por gramo de agua.El Papel de los MicroorganismosAlgas: Son productores primarios Predominan en el fitoplancton Por fotosntesis cambian energa radiante en compuestos qumicos.

Protozoos: Se alimenta del fitoplancton Evita la luz y hace migraciones diurnas Presentes en la regin del zooplanctonPlancton: Fuente de alimento de peces, ballenas, calamares. Capacidad de producir materia orgnicafertilidad delos ocanos. Crecimiento dependiente de energa radiante, CO2, N2 orgnico y de compuestos de fsforo. Producen color caracterstico de algunos mares.

SueloEl suelo es otro de los ambientes donde abundan los microorganismos. Debido a que en este medio se depositan diversos residuos, ocurren cambios en la naturaleza y ambiente, todos estos cambios, sin embargo, son modulados y controlados por diferentes clases de microorganismos.Bacterias, hongos, algas, protozoos y virus son abundantes y se presentan en cantidades de miles de millones de organismos por gramo de suelo. Debido a la gran diversidad de microorganismos, al realizar un cultivo muestra slo se puede recuperar un pequeo sector de todos los miles de microorganismos presentes. Es por ello que se requiere de muchos estudios para conocer y clasificar a los microorganismos. Esta es una labor extenuante porque, como ya mencionamos, existe un gran nmero de microorganismos por cada gramo de suelo.Los microorganismos principalmente realizan los cambios de materia mediante un proceso bioqumico: cambios qumicos de compuestos orgnicos e inorgnicos y los procesos cclicos del ciclo del nitrgeno y la fijacin del nitrgeno.

Fijacin de Nitrgeno Transformacin del N2 atmosfrico en nitrgeno de un compuesto.

Microorganismos no simbiticos: Viven libres en independientes en el suelo Microorganismos simbiticos: Viven en races de algunas plantas Bacterias del gnero Rhizobium Se establecen en las clulas de hospedador (raz) Fijacin Simbitica del Nitrgeno Clulas aumentan tamao formando ndulos Leguminosas, bacterias y ndulos= sistema de fijacin. Bacterias hacen el nitrgeno aprovechable por la planta Bacterias utilizan nutrientes de los tejidos de la planta.

AireEste ambiente es distinto de los anteriores. Ac los microorganismos no cuentan con las condiciones necesarias para su crecimiento ni reproduccin sino slo servir como vehculo o medio de transporte que las esparcir por los diferentes ambientes, ya sea en forma de gotitas o acompaadas de polvo.La cantidad de microorganismos presentes en el aire est en funcin de las fuentes de contaminacin y la sobrevivencia de los microorganismos est definida por las condiciones atmosfricas, humedad, luz solar y temperatura. Contenido microbiolgico del Aire Dentro de los edificiosEst influido por las corrientes de ventilacin, generalmente los microorganismos son depositados en el aire en pequeas gotitas que fluyen de la nariz y la boca, estas partculas micromtricas quedan en el aire que posteriormente se desplazarn por la presencia de corrientes de aire y las partculas ms grandes quedarn fijadas en el. Tambin depender del nmero de personas dentro del edificio, poco nmero de personas indica que tambin habr poco nmero de microorganismos, a mayor nmero de personar la cantidad de microorganismos tambin aumentar. AtmsferaEl contenido microbiano estar definido por partcula de polvo proveniente del suelo, gotas de agua provenientes de masas de agua, agentes contaminantes generados por actividades industriales, agrcolas y domsticas. Las esporas de hongos son las ms abundantes en este ambiente.

2.1.2 Animales y PlantasAnimalesEn los animales tambin podemos encontrar diferentes microorganismos, algunos son dainos para la salud produciendo enfermedades, alguna curables y otras no, pero tambin encontramos a los que estn relacionados o qu la sobrevivencia depende de la relacin microorganismo-animal.Debido a la alimentacin de cada animal, se dice que estos no pueden sobrevivir con preses pequeas en relacin a su tamao: microorganismos. Los microorganismos que habitan en los animales generalmente son hospedadores de los tractos intestinales donde estos microorganismos contribuyen a la digestin y algunos a la produccin de vitaminas y los desechos de los animales forman parte del ciclo del nitrgeno donde nuevamente los microorganismos desempean un papel importante.

No todos los microorganismos son benficos para los animales, algunos tienen interacciones negativas. Existen las depredaciones por hongos y nematodos; las que alteran el habitad: Eutroficacin: agota el oxgeno disuelto y puede provocar la muerte de los peces, alteraciones en los alimentos (bioacumulacin), la produccin de toxinas y las que causan infecciones.

PlantasLas plantas son un habitad microbiano que varia dependiendo de la temperatura de las plantas a lo largo del da como del ao. Los microorganismos no se transfieren fcilmente de planta a planta y stos se hospedan principalmente en las races de la misma donde realizan las funciones simbiticas. Los microorganismos satisfacen sus requerimientos bsicos para su crecimiento y reproduccin; as como los microorganismos se benefician con las plantas, las plantas tambin tienen influencia de los microorganismos: el reciclado y la solubilizacin de los nutrientes minerales; sntesis de vitaminas, aminocidos, auxinas, citoquinas y giberelinas; sntesis de sustancias alelopticas (antagnicas) inhiben crecimiento de otras plantas.

2.1.2 MTODOS Y TCNICAS DE AISLAMIENTO Y SELECCINUna vez conocidos los habitad de los microorganismos, podemos extraer algunos de ellos para su estudio, al aislamiento de un microorganismos en un medio de cultivo se le conoce como cultivo puro. Los cultivos puros se pueden lograr por diferentes tcnicas de muestreo y aislamiento. Tambin es menester mencionar que se debe tener cuidado en contar con las condiciones adecuadas para el crecimiento de las bacterias: pH, nutrientes requeridos, temperatura para el crecimiento y reproduccin, etc.

2.1.2.1 Estra en Placa.El inculo se siembra sobre la superficie de un medio del tipo del agar nutritivo, en una caja Petri, haciendo estras con una aguja enmangada o con una asa bacteriolgica. El mtodo ms utilizado es por cuadrantes (ya sea por dilucin o conservacin).

2.1.2.2 Vertido en PlacaEl inculo se deposita en mezclas de agar fundido, posteriormente son vaciadas en cajas petri. Algunas de las colonias crecern en la superficie del medio despus del periodo de incubacin.

2.1.2.3 Extensin en Placa con Varilla de VidrioSe coloca una gota de inculo en el centro de una caja petri con un medio del tipo agar nutritivo y utilizando un tubo de vidrio doblado o con un asa Diralsky se extiende el inculo sobre la superficie del medio. Puede utilizarse la misma varilla de vidrio para inocular una segunda placa para asegurar una adecuada dispersin de las clulas. En algunas cajas aparecern colonias aisladas.

2.1.2.4 Enriquecimiento Poblacional

Para mejorar la probabilidad de aislar un organismo que posee una caracterstica fisiolgica o bioqumica nica, se puede sembrar por estra, por extensin en placa o en masa, pasando el inculo a travs de una serie de transferencias, a un medio de una composicin (y condiciones de incubacin) que favorezcan el desarrollo del microorganismo deseado. El procedimiento de enriquecimiento aumenta en efecto la proporcin del organismo deseado en relacin con la que estaba presente en el inculo inicial.

2.1.2.5 Diluciones en Serie

Est mtodo permite reducir la concentracin de los microorganismos cuando ste crezca demasiado. Este es uno de los mtodos ms sencillo y barato y se pueden obtener un nmero definido de colonias.

2.1.2.6 MicromanipulacinMediante un micromanipulador se puede usar una micropipeta para obtener un solo microorganismo de una suspensin de clulas en un lquido, mientras se examina la preparacin con el microscopio. La clula aislada es luego transferida a un medio estril.

Micromanipulador

2.1.3 SELECCIN DE MICROORGANISMOS DE INTER INDUSTRIAL: SCREENINGDeteccin y aislamiento de microorganismos de inters industrial de entre una poblacin compleja de organismos utilizando procedimientos selectivos. Screening Primario: Deteccin y aislamiento de microorganismos potencialmente tiles. Screening Secundario: Estudio de los microorganismos aislados en el screening primario para separar los que tienen inters potencial de los que tienen inters real y mejorar estas cepas seleccionadas.Para llevar a cabo un screening primario generalmente se parte de una poblacin mixta (suelo, fermentaciones naturales, etc.) donde existe tanto una gran cantidad como variedad de microorganismos potencialmente tiles que debemos seleccionar. Para ello lo primero que hacemos es utilizar medios selectivos donde crezca el tipo de microorganismo que nos interesa aislar. A este medio se le pueden aadir inhibidores para eliminar los que no nos interesan. Por ejemplo, si queremos obtener un microorganismo aerobio lo creceramos en presencia de O2 con lo que los anaerobios no creceran; o bien si queremos seleccionar hongos, aadiramos cloranfenicol, antibitico que acta frente a bacterias pero que no afecta a los hongos. Los parmetros generales que tenemos que tener en cuenta son la fuente de carbono, fuente de nitrgeno, aireacin, temperatura, pH e inhibidores. Posteriormente se reaslan en cultivo puro aquellos microorganismos que hemos aislado para su posterior estudio.

2.2 Cultivo de microorganismos. 2.2.1 Clasificacin de los microorganismos con base a sus requerimientos nutricionalesLa nutricin es el proceso por el cual los seres vivos toman del medio donde habitan, los compuestos qumicos que necesitan para llevar a cabo sus procesos energticos y biosintticos que les permiten crecer y reproducirse. Los requerimientos nutricionales de cada grupo microbiano estn dados por la composicin qumica de las clulas que los constituyen y por sus caractersticas genticas las que determinan sus propiedades fisiolgicas y su capacidad para utilizar y transformar los compuestos que se encuentran en el ambiente en que se desarrollan. En general los requerimientos nutricionales de los microorganismos reflejan el ambiente natural en que viven; este conocimiento y el uso de medios de cultivo de composicin qumica definida, son de primordial importancia en el estudio de la nutricin microbiana cuyas caractersticas varan ampliamente entre los microorganismos. Algunos tienen requerimientos nutricionales muy simples, obtienen su energa de compuestos inorgnicos y utilizan CO2 o carbonatos como fuente de carbono, en tanto que otros requieren de compuestos orgnicos con diferentes grados de complejidad. La fuente de nitrgeno, la obtienen a partir de aminocidos o nitrgeno inorgnico en diferentes estados de oxidacin incluyendo el nitrgeno molecular. Respecto a los requerimientos de oxgeno, los microorganismos pueden vivir con diferentes concentraciones de este elemento. En el siguiente experimento se pondrn de manifiesto el tipo de nutricin y necesidades de oxgeno de diferentes microorganismos, para ello, estos se inocularn en dos medios de cultivo, en el primero se variarn las fuentes de carbono y de nitrgeno y en el segundo la tensin de oxgeno y se relacionarn sus caractersticas nutricionales con el desarrollo y las transformaciones qumicas microbianas obtenidas en los diferentes medios de cultivo,

De acuerdo con estos criterios, los microorganismos se ubican en cuatro clases nutricionales las que se describen en el cuadro 1. No obstante, la versatilidad fisiolgica de los microorganismos determina que la clasificacin expuesta no sea de ninguna manera estricta, como lo demuestran los siguientes ejemplos: algunos microorganismos fotoauttrofos crecen tambin en la oscuridad comportndose como quimiohetertrofos. Esta versatilidad se conoce con el trmino de facultativo. Asimismo, algunas bacterias y algas fotoautotrficas son incapaces de sintetizar alguno de sus constituyentes celulares a partir de CO2, por lo que generalmente viven asociadas con otros microorganismos que le proporcionan este componente y cuando se les cultiva en medios artificiales es necesario suministrar ese compuesto orgnico. Es importante recalcar que aun cuando el grupo bacteriano es, desde el punto de vista estructural, el ms simple de los microorganismos (procariotes); fisiolgicamente es el ms complejo y el nico en el que se encuentran todos los tipos nutricionales descritos.

2.2.2 Tipos de nutrientes.

2.2.2.1 Macronutrientes.

2.2.2.2 Micronutrientes.

La nutricin microbiana consiste en suministrar a las clulas los ingredientes qumicos que necesitan para hacer monmeros, ya que recordemos las clulas estn compuestas fundamentalmente por agua y macromolculas, y estas estn estructuradas o formadas precisamente por los monmeros antes mencionados. Y los nutrientes como vimos anteriormente son esos famosos compuestos qumicos que la clula necesita para vivir. Las distintas especies bacterianas tienen diferentes requerimientos nutricionales (a veces especficos) y condiciones fisicoqumicas que les permiten permanecer viables.

Los nutrientes requeridos en grandes cantidades son denominados macronutrientes mientras que los micronutrientes son necesarios en cantidades trazas. Entre los primeros se encuentran C, H, O, N (los ms abundantes), P, S, K, Ca, Fe y Na, y entre los segundos podemos citar Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn. Algunos organismos, adems de los minerales, necesitan muy pequeas cantidades de nutrientes de naturaleza orgnica llamados factores de crecimiento. stos son vitaminas, aminocidos, purinas y pirimidinas. Los organismos que tienen tales requerimientos se denominan auxtrofos para diferenciarse de los prottrofos que son independientes de tales factores.

MACRONUTRIENTESVamos a comenzar hablando de los macronutrientes, como dijimos anteriormente estos son los que la clula requiere o consume en mayor cantidad, precisamente por ser suministro de la mayor parte de energa metablica, o de funcionamiento en la clula, a continuacin mostraremos una tabla en la que se detalla los principales macronutrientes, su fuente natural en el ambiente, y su forma suministrada en los medios de cultivo:

Ahora analizaremos cada uno de ellos, con sus respectivas funciones en el medio de cultivo y por lo tanto en el requerimiento nutricional de los microorganismos.Carbono: Muchas procariotas necesitan algn tipo de compuesto orgnico como fuente de carbono. Los estudios nutricionales han demostrado que las bacterias pueden asimilar varios compuestos orgnicos carbonados y usarlos para hacer nuevo material celular. Los aminocidos, los cidos grasos, los cidos orgnicos, los azucares, las bases nitrogenadas, los compuestos aromticos y sin fin de compuestos orgnicos de otro tipo pueden ser por una u otra bacteria. Algunos procariotas son auttrofos, capaces de construir todas sus estructuras orgnicas a partir del dixido de carbono con la energa obtenida de la luz o de compuestos inorgnicos. En peso seco, una clula tpica contiene un 50% de carbono; el carbono es el principal elemento de todas las clases de macromolculas. La ms utilizada es la glucosa (una pentosa).

Nitrgeno: Despus del carbono, el siguiente elemento ms abundante en la clula es el nitrgeno. En una bacteria tpica alrededor del 12 % de su peso es nitrgeno, este elemento es importante en las protenas, en los cidos nucleicos y en otros constituyentes celulares. En la naturaleza el nitrgeno se encuentra en forma inorgnica y orgnica. Sin embargo la mayor parte del nitrgeno natural disponible esta en forma inorgnica, como el amoniaco (NH3), nitratos (NO3) o N2. La mayora de las bacterias son capaces de utilizar amoniaco como nica fuente de nitrgeno, y muchas pueden utilizar nitratos. El nitrgeno gaseoso puede ser usado como fuente de nitrgeno en algunas bacterias, las bacterias fijadoras de nitrgeno.

Fsforo: El fsforo se presenta en la naturaleza en forma de fosfatos orgnicos e inorgnicos, y la clula lo necesita fundamentalmente para la sntesis de cidos nucleicos y fosfolpidos. Recordemos que el ADN se encuentra formado por nucletidos, los cuales se constituyen por una base nitrogenada, una pentosa (azcar), y por supuesto un grupo fosfato que sirve como unin o enlace entre los nucletidos, es por esto que la presencia de fosforo es muy importante.

Azufre: El azufre se lo necesita o se lo requiere porque es un componente estructural de los aminocidos cistena y metionina, y aparte de eso porque se presenta en ciertas vitaminas, como la tiamina, la biotina, y el acido lipoco, as como en la coenzima A. Es muy importante sealar tambin que en las protenas se depende de los enlaces de azufre para que esta se mantenga compacta y no se desnaturalice, razn por la cual este elemento es indispensable en muchos de los microorganismos. El azufre sufre una serie de transformaciones qumicas en la naturaleza, muchas de las cuales son llevadas a cabos exclusivamente por microorganismos, y es utilizado por ellos en varias formas qumicas. La mayora del azufre celular procede de fuentes inorgnicas, ya sean sulfatos (SO4) 2-, sulfuros (HS)-.

Potasio: El potasio es necesario en todos los organismos. Una gran diversidad de enzimas lo requiere especficamente, como por ejemplo algunas implicadas en la sntesis de protenas.

Magnesio: El magnesio funciona como estabilizador de los ribosomas, las membranas celulares, y los cidos nucleicos, y tambin se necesita para la actividad de varias enzimas.

Calcio: El calcio, que no es un nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos, ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y tiene una funcin importante en la termorresistencia en las endoesporas.

Sodio: El sodio es requerido, por algunos microorganismos, aunque no todos, y su necesidad suele ser un reflejo del hbitat del microorganismo. Por ejemplo el agua de mar tiene un elevado contenido de sodio y los microorganismos marinos normalmente lo requieren para su crecimiento; en cambio, otras especies muy relacionadas, pero de agua dulce, crecen bien en ausencia de este elemento.

Hierro: El hierro es fundamental en la respiracin celular y es tambin un elemento clave para los citocromos y para las protenas que contienen hierro y azufre implicados en el transporte de electrones. En condiciones anaerbicas, el hierro se encuentra por lo general en estado de oxidacin +2 y por lo tanto es soluble. Sin embargo, bajo condiciones aerbicas suele estar en el estado de oxidacin +3 y formar varios minerales no solubles. Para obtener el hierro de tales minerales, las clulas producen agentes quelantes de hierro llamados siderforos, que solubilizan el hierro y lo transportan dentro de la clula. Un grupo importante de siderforos derivan del cido hidroxmico y quelan el hierro frrico +3 fuertemente. Una vez que el complejo hierro hidroxamato pasa a la clula, el hierro se libera y el hidroxamato puede salir y ser reutilizado de nuevo para el transporte de hierro. Las bacterias como el Escherichia coli y Salmonella Typhimutium producen siderforos fenlicos, estructuralmente complejos, llamados entereobactinas. Estos siderforos derivan del compuesto aromtico catecol y tienen una elevada afinidad de unin de hierro. Sin tales agentes quelantes de hierro muchas bacterias patgenas seran incapaces de iniciar la infeccin debido a la limitacin de hierro.

En las aguas marinas, el hierro prcticamente es indetectable (las aguas ocenicas superficiales tpicamente solo unos cuantos picogramos de hierro por milmetro y se han encontrado bacterias marinas que producen siderforos estructuralmente complejos capaces de secuestrar el hierro presente en concentraciones tan bajas. Estos siderforos poseen una regin peptdica que compleja el fe +3 y una regin lipdica que se asocia con la membrana celular. Compuestos como la aquachelina, unen el hierro, se agregan en micelas, y luego transportan el hierro a la clula

Algunos procariotas pueden crecer en ausencia total de hierro. Por ejemplo las bacterias Lactobacillus plantarum y Borrelia burgdorferii no contienen hierro. El Mn 2+ sustituye en estas bacterias al hierro como componente metlico de las enzimas que normalmente contienen Fe+2.

MICRONUTRIENTESLos micronutrientes como dijimos anteriormente son los que la clula consume en menos cantidades, pero eso no quiere decir que son menos importantes que los macronutrientes, para nada, en realidad son igual de importantes que los que se consumen en grandes cantidades. Los micronutrientes son metales, muchos de los cuales tienen una funcin estructural en varias enzimas. La tabla presentada a continuacin resume los principales micronutrientes en los sistemas vivos y enzimas que los contienen. Debido a que la necesidad de estos elementos trazas es muy pequea en cuanto a su concentracin, con frecuencia no es necesario aadirlos a los medios de cultivo para cultivar microorganismos en el laboratorio. No obstante, si un medio de cultivo contiene compuestos muy puros, disueltos en agua destilada de elevada pureza, puede darse una deficiencia en algn elemento traza. En tales casos, se aade al medio una pequea cantidad de una solucin de metales traza a fin de suministrar los metales necesarios.Es importante recalcar que el hierro como vemos se encuentra dentro de los micronutrientes pero generalmente se lo considera como uno macro, ya que en realidad dentro de todos los metales sealados, es el que ms es utilizado por ciertas clulas, se la lleg a considerar micro por su naturaleza metlica, pero por su importancia y requerimiento elevado en las clulas se lo considera como un macronutriente.

2.2.2.3 Factores de crecimiento.

Requerimientos de Nitrgeno El nitrgeno en los compuestos orgnicos de las clulas se presenta en estado reducido como grupo amino. La gran mayora de los organismos fotosintticos asimilan el nitrgeno en estado inorgnico como nitratos, que posteriormente son reducidos. Muchos organismos no fotosintticos como bacterias y hongos tambin pueden asimilar el nitrgeno como nitrato, otros microorganismos son incapaces de llevar a cabo esta reduccin y utilizan como fuente de nitrgeno formas reducidas de este. Las necesidades de nitrgeno se cubren frecuentemente con materiales orgnicos que contienen nitrgeno en estado reducido.

Requerimientos de AzufreEl azufre en los compuestos orgnicos de las clulas se presenta en estado reducido como grupo sulfhidrilo. La mayora de los organismos fotosintticos asimilan el azufre en estado inorgnico como sulfatos que posteriormente son reducidos. Bacterias y hongos tambin pueden asimilar el azufre como sulfato. Las necesidades de azufre, se cubren frecuentemente con materiales orgnicos que contienen azufre en estado reducido.

Requerimientos de OxgenoEn los organismos superiores, el oxgeno es un componente universal de las clulas y gran parte de este elemento lo proporciona el agua. No obstante, los organismos superiores y muchos microorganismos necesitan adems oxgeno molecular, ya que dependen de la respiracin aerobia como mecanismo generador de energa, donde el oxgeno acta como oxidante terminal. A estos organismos que requieren oxgeno molecular se les denomina aerobios obligados. Dentro de esta categora, hay algunos grupos que crecen mejor a presiones parciales de oxgeno ms bajas (0,2 atmsferas) que las del aire y se les denomina microaerfilos.

Otros microorganismos, obtienen energa por la va fermentativa o por respiracin anaerobia, que no implica la necesidad de oxgeno como oxidante terminal. En muchos casos el oxgeno puede actuar como una sustancia txica o bien inhibir el crecimiento. A estos microorganismos se les denomina anaerobios obligados.

Otros microorganismos pueden crecer tanto en ausencia como en presencia de oxgeno molecular, alternando la respiracin con la fermentacin, a estos se les denomina anaerobios facultativos. Un caso particular son las bacterias del cido lctico, que no son sensibles al oxgeno molecular y en presencia de ste, continan la fermentacin.

2.2.5 Esterilizacin y asepsia

Esterilizacin por calor:El calor es el mtodo de eleccin para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material dependende que se est utilizando calor seco o calor hmedo.

Esterilizacin con calor seco:La accin bactericida del calor seco se debe a la oxidacin fsica de un procedimiento lento o coagulacin de la protena bacteriana por quemadura. En ausencia de humedad se necesita una temperatura ms alta,ya que en esta forma los microbios son destruidos al absorber el calor. Pueden ser dos tipos: Directa: flameado o incineracin ms utilizada enlaboratorios y en algunos hospitales pequeos. Indirecto: aire caliente u horno de Pasteur con temperatura de 160C a 180C por 1 a 2 horas siendoel ms eficaz y seguro el elctrico.

Esterilizacin con calor hmedo:El calor hmedo es la forma de vapor saturado a presin es eficaz para la destruccin de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada por la desnaturalizacin y coagulacin de su protena o su sistemaintercelular enzima-protena. Estas reacciones son catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:

Calor hmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como lagelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas. Vapor a presin: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables comogrados de temperatura y tiempo de exposicin, que junto con el tamao del autoclave y el flujo delvapor, la densidad y el tamao de la carga en la cmara aumentan la tasa se muerte de losmicroorganismos, en una temperatura de 121C 132C durante 15 minutos o ms.Esterilizacin por radiacin:La ionizacin por radiacin genera iones al liberar electrones de lostomos, estos se desprenden violentamente con tomos adyacentes y se une a ellos, o bien se desprenden del segundo tomo. La energa liberada se transforma en energa trmica o qumica la cual causa la muerte de los microorganismos al romper la molcula del ADN e impide la divisin molecular y la propagacin de la vida. Las principales fuentes de radiacin ionizante son las partculas Beta y rayos gamma.

Esterilizacin por gas xido de etileno:Este es un gas incoloro, soluble en agua y en solventes comunes, se emplea para esterilizar objetos sensibles al calor, este proceso es relativamente lento. El poder bactericida depende de la concentracin del mismo gas, temperatura, humedad y tiempo de exposicin. La actividad esporicida se produce por aniquilacin de los grupos terminales hidroxilo,carboxilo, amino y sulfridrilo.

Esterilizacin por glutaraldehido:La solucin acuosa de glutaraldehido activado y amortiguado al 2%,destruye a los microorganismos por desnaturalizacin de la protena. Es preferida para esterilizar instrumentos que no pueden esterilizarse al vapor o no se cuenta con otro mtodo de esterilizacin.

Filtracin:Las clulas microbianas pueden retirarse de los lquidos o gases por filtracin. La filtracin es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razn, se utiliza slo para los lquidos termolbiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los slidos termolbiles tambin se pueden esterilizar por filtracin, si previamente se disuelven en un lquido. Tcnicamente, la filtracin no esteriliza porque los virus pueden pasar a travs de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayora de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio.

2.3 Criterios utilizados en la identificacin de microorganismos

1. Mtodos basados en criterios morfolgicos

Los rasgos morfolgicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos aos a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos anatmicos tan diferentes que pueden ser fcilmente utilizados en su clasificacin, pero con respecto a los microorganismos, stos lucen bajo el micro-coscopio tan similares que se dificulta su clasifica- cin. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden di- ferir en propiedades bioqumicas, fisiolgicas y/o serolgicas. Sin embargo, aun cuando la morfolo- ga celular dice poco sobre las relaciones filogen- ticas, sigue siendo til para la identificacin bacte- riana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localizacin resulta de mucha utilidad en la identificacin de bacilos esporulados.

2. Mtodos basados en tincin diferencial

Es posible sacar conclusiones en relacin con la morfologa de una bacteria, examinando una lmina que fue sometida a un proceso de tincin diferen- cial. Estos criterios morfolgicos encabezan las primeras etapas del proceso de identificacin bacte- riana. La mayor parte de las bacterias, teidas con Gram, las podemos clasificar como gram positivas o gram negativas, otras tinciones diferenciales, como la cido resistente, se aplican a otro tipo de bacte- rias, como por ejemplo micobacterias. Un examenmicroscpico de una lmina teida por medio de gram o de una tincin diferencial es til para obtener una informacin rpida sobre la calidad de un ambiente clnico. Por otro la- do, un mdico tambin puede obtener suficiente informacin de un reporte tcnico de la- boratorio para comenzar el tratamiento apropiado de un paciente.

3.4. Mtodos basados en pruebas bioqumicas

Las pruebas bioqumicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas prue- bas se fundamentan en demostrar si el microor- ganismo es capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de com- puestos, la produccin de compuestos colorea- dos, etc. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con base a pruebas bioqumicas. Por ejemplo,las bacterias entricas gram negativas, forman un grupo muy grande y heterogneo cuyo hbitat natural es el tracto gastrointestinal de humanos y otros animales. Esta familia, En- terobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos. Un gran nmero de ensayos han sido desarrollados de manera de identificar rpidamente al pat- geno, para que posteriormente el mdico, con base al reporte, indique el tratamiento adecuado, o para que los epidemilogos puedan localizar la fuente de la infeccin.

Existen flujogramas, como el que se describe a continuacin para la identificacin bacte- riana, mediante pruebas bioqumicas de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de un coco bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo, nos indica la presencia de una enterobacteria, para determinar su gnero podemos seguir el siguiente esquema.

Fermenta la Lactosa?

NoSi

Pueden utilizar cido ctrico como nica fuente de carbono?Pueden utilizar cido ctrico como nica fuente de carbono?

NoSiNoSi

Shigella: produce lisina DecarboxilasaSalmonella: Generalmente produce H2SEscherichia

NoProduceacetona?Si

Enterobacter

Citrobacter

Los gneros clnicamente ms importantes de la familia Enterobacteriaceae son: Esche- richia, Salmonella, Shigella, Citrobacter y Enter