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RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICAFECHA DE

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Noviembre 2016

PROTOCOLO E INFORME ARMONIZADO PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL MÉTODO DE REFERENCIA PARA LA ESTIMACIÓN DE LA CUENTA DE S. aureus. APÉNDICE

NORMATIVO B,

NOM-210-SSA1-2014

PROTOCOLO ARMONIZADO PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL MÉTODO DE REFERENCIA PARA LA ESTIMACIÓN DE LA CUENTA DE S.

aureus.APÉNDICE NORMATIVO B,

NOM-210-SSA1-2014

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NOM-210-SSA1-2014

Participaron en la elaboración de este protocolo.

César Omar Gálvez GonzálezComisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.Coordinador de proyectos analíticos55 50805200 ext 2022cgalvez@cofepris. gob.mx

Odilia Hernández HernándezLaboratorio Estatal Salud Pública Veracruz.Jefa del Departamentos de Análisis Sanitarios.229 9811390 Ext: [email protected]

María Esperanza Rodríguez ParraLaboratorio Estatal Salud Pública TamaulipasResponsable de Laboratorio de Microbiología de Aguas y Alimentos834 312 [email protected]

Anastasio Palacios MarmolejoLaboratorio Estatal de Salud Pública de Aguascalientes449 [email protected]

Participaron en la revisión de este protocolo.

Liliana Cano RamírezComisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.Q. Analista55 50805200 EXT. [email protected]

Mirella Paredes SalasLaboratorio Estatal de Salud Pública de Aguascalientes449 [email protected]

Autorización

Imelda Rocío Guzmán CervantesComisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.Directora Ejecutiva de Control AnalíticoTeléfono: 01 55 50 80 52 00 ext. [email protected]

Josefina Gutiérrez RamírezComisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.Directora Ejecutiva de Innovación.01 55 50 80 52 00 ext. [email protected]

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1. OBJETIVO.Que los miembros de la Red Nacional de Laboratorios realicen de modo armonizado la evaluación del desempeño del Apéndice B Normativo. Método de referencia para la estimación de la cuenta de S. aureus, NOM-210-SSA1-2014 mediante la comprobación de los parámetros de desempeño: Repetibilidad, Reproducibilidad, Recuperación, Sesgo, Selectividad e Incertidumbre.

2. CAMPO DE APLICACIÓN.Este protocolo armonizado es de aplicación a la Red Nacional de Laboratorios en el proceso de implementación y autorización inicial del Apéndice B Normativo. Método de referencia para la estimación de la cuenta de S. aureus, NOM-210-SSA1-2014 para el análisis de los productos de interés. Puede considerarse un documento externo del sistema de gestión de calidad y por lo tanto no requiere ser modificado para hacerlo coincidir con los procedimientos internos.

3. MÉTODO DE ENSAYO.3.1. Apéndice B Normativo. Método de referencia para la estimación de la cuenta de S. aureus ,

NOM-210-SSA1-2014, Productos y Servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

3.2. En el proyecto de modificación de ésta norma se consideran los siguientes cambios:

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Dice Debe decir JustificaciónB.6.4. Invertir las placas e incubar por 44h a 48h a 36ºC ± 1ºC, buscar colonias con morfología colonial típica: colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1mm a 2mm y muestran una zona opaca, húmedas y con un halo claro (debido a la actividad de la lecitinasa) alrededor de la colonia.NOTA: En algunas ocasiones cepas que han sido aisladas de productos congelados o deshidratados que han sido almacenados por periodos largos de tiempo, frecuentemente desarrollan colonias menos negras con apariencia rugosa y textura seca. Las colonias atípicas son similares en apariencia pero sin halo claro alrededor.

B.6.4. Invertir las placas e incubar por 24h ± 2h a 36°C ± 1°C, marcar en la base de la placa la posición de las colonias típicas y atípicas, re-incubar por 24h ± 2h 36°C ± 1°C, marcar en la base de la placa la posición de las nuevas colonias típicas y atípicas 44h a 48h a 36ºC ± 1ºC, buscar colonias con morfología colonial típica: colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1mm a 2mm y muestran una zona opaca, húmedas y con un halo claro (debido a la actividad de la lecitinasa) alrededor de la colonia.NOTA: En algunas ocasiones cepas que han sido aisladas de productos congelados o deshidratados que han sido almacenados por periodos largos de tiempo, frecuentemente desarrollan colonias menos negras con apariencia rugosa y textura seca. Las colonias atípicas son similares en apariencia pero sin halo claro alrededor.B.6.4.1 Colonias Típicas: colonias negras o grises, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1mm a 1.5mm a las 24h de incubación y 1.5 a 2.5 mm después de 48h de incubación, rodeadas por una zona clara que puede ser parcialmente opaca. Después de 24 h, en esa zona clara, se puede observar un halo opalescente en la periferia de las colonias. Colonias Atípicas: Son colonias de las mismas dimensiones de las colonias típicas, pueden ser negras brillantes con o sin un pequeño borde blanco, la zona clara es muy pequeña o no visible, y el halo opalescente no está o es apenas visible. También son colonias atípicas las colonias grises sin zona clara, del mismo tamaño que las colonias típicas. Hay bacterias de géneros distintos al Staphylococcus, que pueden dar la morfología colonial típica o atípica, por lo que la observación microscópica usando una tinción de Gram puede ayudar en la distinción del género.

Se hace la modificación conforme a la versión vigente de la norma de referencia, antes se indicaba una sola lectura a las 44h, con la modificación se hacen dos lecturas, dado que no hay temperaturas adicionales ni el tiempo total excede al original, no se crean nuevos requisitos ni costos para la implementación del método.

La adición del punto B.6.4.1 y la eliminación de la nota es un cambio que mejora la redacción, por lo que no se crean nuevos requisitos, pero se facilita la ejecución del método.

B.6.5 Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas y atípicas de S. aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias. Seleccionar por muestra 5 colonias típicas para su confirmación o 5 colonias atípicas, para la realización de la tinción de Gram, en el caso de observar bacilos positivos, la colonia se tomará como negativa para S. aureus, por lo contrario si se observan cocos se seguirá con su confirmación.

B.6.5 Seleccionar las placas que como máximo 300 colonias con 150 colonias típicas y/o atípicas y las dos diluciones siguientes. Si solo están presentes colonias típicas, seleccionar por placa por un número de colonias típicas “Ac” (generalmente 5), Si solo están presentes colonias atípicas seleccionar un número de colonias atípicas “Anc”, Si hay de ambos tipos de colonias seleccionar colonias tanto típicas “Ac” como atípicas “Acn”.

entre 15 y 150 colonias típicas y atípicas de S. aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias. Seleccionar por muestra 5 colonias típicas para su confirmación o 5 colonias atípicas, para la realización de la tinción de Gram, en el caso de observar bacilos positivos, la colonia se tomará como negativa para S. aureus, por lo contrario si se observan cocos se seguirá con su confirmación.

Se hace la modificación conforme a la versión vigente de la norma de referencia, nota es un cambio que mejora la redacción, por lo que no se crean nuevos requisitos, pero se facilita la ejecución del método.

B.6.6 Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas se debe agregar la nota de "valor estimado" al reporte de los resultados.

B.6.6 Cuando las placas de la dilución más baja tengan menos de 15 colonias típicas y/o atípicas se debe agregar la nota de "valor estimado" al reporte de los resultados..

La aclaración de la dilución, evita ambigüedades o confusiones en la aplicación del método. Al ser una precisión, no se generan costos adicionales.

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Dice Debe decir JustificaciónB.6.8.1 Prueba de coagulasa. Seleccionar y sembrar cada colonia típica en tubos con 0.5mL de BHI y en tubos con AST. Utilizar simultáneamente un control positivo de S. aureus y un control negativo de S. epidermidis. Incubar a 35°C ± 1ºC en baño de agua, durante 20h a 24h. Mantener los cultivos en AST a no más de 27°C ± 1ºC para pruebas posteriores. Agregar a 0.1mL del cultivo anterior a 0.3mL de plasma de conejo con EDTA (a menos que el fabricante indique otras cantidades). Incubar a 37°C ± 1ºC en baño de agua y observar periódicamente a intervalos de 1h durante las primeras 4h a 6h; si no hay formación de coágulo, observar hasta las 24h. Considerar la prueba positiva cuando el coágulo se forma completamente y es firme al invertir el tubo. En otro caso se deberán realizar las pruebas auxiliares, descritas en el punto B.6.9.

B.6.8.1 Prueba de coagulasa. Seleccionar y sembrar cada colonia seleccionada típica en tubos con 0.5mL de BHI y en tubos con AST. Utilizar simultáneamente un control positivo de S. aureus y un control negativo de S. epidermidis. Incubar a 35°C ó 37°C ± 1ºC en baño de agua, durante 20h a 24h. Mantener los cultivos en AST a no más de 27°C ± 1ºC para pruebas posteriores. Agregar a 0.1mL del cultivo anterior a 0.3mL de plasma de conejo con EDTA (a menos que el fabricante indique otras cantidades). Incubar a 35 o 37°C ± 1ºC en baño de agua y observar periódicamente a intervalos de 1h durante las primeras 4h a 6h; si no hay formación de coágulo, observar hasta las 24h. Considerar la prueba positiva cuando el coágulo se forma completamente y es firme al invertir el tubo. En otro caso se deberán realizar las pruebas auxiliares, descritas en el punto B.6.9.

Cambio de redacción, para que tenga relación con la redacción de los párrafos anteriores. Se aclara que el baño de aguas e puede usar a 35°C ó 37°C

B.7.2 Si al menos el 80% de las colonias típicas seleccionadas fueron coagulasa positiva y/o termonucleasa positiva tomar el número total de las colonias contadas como presuntivas de S. aureus.

B.7.2 Si al menos el 80% de las colonias típicas seleccionadas fueron coagulasa positiva y/o termonucleasa positiva tomar el número total de las colonias contadas como presuntivas de S. aureus. Cálculo del número “a” de S. aureus confirmado por placa.B.7.2.1 Calcule el número de colonias confirmadas de S. aureus por placa “a” utilizando la siguiente fórmula

a= bcAcxCc+ bnc

AncxCnc

Ac es el número de colonias típicas seleccionadas a confirmarAnc es el número de colonias atípicas seleccionadas a confirmarbc es el número de colonias típicas confirmadasbnc es el número de colonias atípicas confirmadasCc es el número de colonias típicas contadas en la placaCnc es el número de colonias atípicas contadas en la placaRedondear los resultados a un número entero.

Se hace la modificación conforme a la versión vigente de la norma de referencia, y se incluye el subíndice B.7.2.1 mejorando la redacción del punto.

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Dice Debe decir JustificaciónB.7.3 En otros casos, calcular el número de colonias presuntivas de S. aureus a partir del porcentaje obtenido de colonias coagulasa y/o termonucleasa positivas confirmadas.

B.7.3 En otros casos, calcular el número de colonias presuntivas de S. aureus a partir del porcentaje obtenido de colonias coagulasa y/o termonucleasa positivas confirmadas.Cálculo del número N de S. aureus confirmado por muestraB.7.3.1 Para las placas con menos de 300 colonias de las cuales existan menos de 150 colonias típicas y/o atípicas en dos diluciones consecutivas, calcular el número de S. aureus por placa como se indica en B.7.2 y calcular el número N como una medida ponderada de las dos diluciones sucesivas, usando la siguiente ecuación:

N= ∑ aV (n1+0.1n2 )d

Σa es la suma de las cuentas encontradas en las placasV es el número de mL en cada placa, en mLn1 es el número de placas seleccionado en la primera diluciónn2 es el número de placas seleccionadas en la segunda diluciónd es el factor de dilución seleccionado en la primer diluciónRedondear los resultados utilizando dos cifras significativas.


B.7.4 Promediar los resultados de los duplicados.

B.7.4 Promediar los resultados de los duplicados Reportar los resultados como el número de S. aureus por mL o g de producto

Se adapta a la actualización del método y en coherencia a los puntos anteriores.

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Dice Debe decir JustificaciónB.7.5 Cuando en dos diluciones consecutivas se obtienen cuentas entre 15 y 150 colonias (típicas o atípicas) calcular el número de S. aureus para cada dilución como se especifica en los puntos anteriores, calcular la cuenta de S. aureus considerando el factor de dilución, calcular el logaritmo en base diez de cada dilución y realizar la resta de éstos, si la diferencia entre los logaritmos de las dos diluciones es menor a 0.3, reportar el promedio de las dos diluciones. Si por el contrario la diferencia entre los logaritmos es mayor a 0.3; reportar el valor más bajo.

B.7.5 Cuando en dos diluciones consecutivas se obtienen cuentas entre 15 y 150 colonias (típicas o atípicas) calcular el número de S. aureus para cada dilución como se especifica en los puntos anteriores, calcular la cuenta de S. aureus considerando el factor de dilución, calcular el logaritmo en base diez de cada dilución y realizar la resta de éstos, si la diferencia entre los logaritmos de las dos diluciones es menor a 0.3, reportar el promedio de las dos diluciones. Si por el contrario la diferencia entre los logaritmos es mayor a 0.3; reportar el valor más bajo.Estimación de las cuentas bajasB.7.5.1 Si las dos placas de la muestra directa o de la primera dilución contiene menos de 15 colonias, reportar los resultados como sigue:a) Para los productos líquidos, estime el número de S. aureus por mililitro.

Ne= ∑ aV X 2

Ne es el número estimado de colonias confirmadas de S. aureusΣa es el número de colonias confirmadas en las dos placasV es el volumen inoculado en las placasb) Para otros productos, estime le número de S. aureus por gramo

Ne= ∑ aV x2 xd

Ne es el número estimado de colonias confirmadas de S. aureusΣa es el número de colonias confirmadas en las dos placasV es el volumen inoculado en las placasD es el factor de dilución en la primera dilución


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Dice Debe decir JustificaciónB.7.7 Ejemplo para el cálculo de S. aureus.Por ejemplo, el 0.1mL del inóculo de la dilución 10-2 de la muestra da como resultado 65 y 85 colonias típicas por placa.Ninguna colonia atípica fue identificada en las placas.Todas las 5 colonias seleccionadas de la placa conteniendo 65 colonias fueron coagulasa y termonucleasa positiva por lo que las 65 colonias fueron consideradas como S. aureus.3 de las 5 colonias seleccionadas de la placa que contiene 85 colonias fueron coagulasa y termonucleasa positiva por lo que el 60%, es decir, 51 colonias son consideradas como S. aureus.La cuenta promedio tomando en cuenta solo las positivas es:65+51/2 = 58 S. aureus. Redondeando a dos cifras significativas 6058 por el inverso del factor de dilución (1/10 -2) es 5800 UFC.Si se considera que el inóculo fue de 0.1mL habrá que multiplicar por 10 para obtener 58000 UFC/mL o g según la naturaleza de la muestra.También puede aplicarse la siguiente formula:

B.7.7 Ejemplo para el cálculo de S. aureus.Se inoculó Por ejemplo, el 0.1mL de cada dilución inóculo deEn la dilución 10-2 de la muestra da como resultado se encuentran 65 y 85 colonias típicas por placa respectivamente y ninguna colonia atípica en ambas placas.En la siguiente dilución 10-3 se encontraron 3 y 7 colonias típicas en cada placa respectivamente y ninguna atípica en ambas placas.Se realizaron los siguientes cálculosDe las 65 colonias, se seleccionaron 5 colonias, y las 5 fueron confirmadas como S. aureus. Dando a=65De las 85 colonias, se seleccionaron 5 colonias, y solo 3 fueron confirmadas como S. aureus. Dando a=51De las 3 colonias, se probaron las 3 y las 3 fueron confirmadas como S. aureus. Dando a=3De las 7 colonias, se probaron 5 y las mismas fueron confirmadas como S. aureus. Dando a=7Entonces

N=(65+51+3+7)/ 0.1 (2+ 0.1 (2)) 10-2

N= 126 /0.22 X 10-2

N=57 272El resultado después del redondeo quedaría como: 5.7 x 104

UFC/gNinguna colonia atípica fue identificada en las placas.Todas las 5 colonias seleccionadas de la placa conteniendo 65 colonias fueron coagulasa y termonucleasa positiva por lo que las 65 colonias fueron consideradas como S. aureus.3 de las 5 colonias seleccionadas de la placa que contiene 85 colonias fueron coagulasa y termonucleasa positiva por lo que el 60%, es decir, 51 colonias son consideradas como S. aureus.La cuenta promedio tomando en cuenta solo las positivas es:65+51/2 = 58 S. aureus. Redondeando a dos cifras significativas 6058 por el inverso del factor de dilución (1/10-2) es 5800 UFC.Si se considera que el inóculo fue de 0.1mL habrá que multiplicar por 10 para obtener 58000 UFC/mL o g según la naturaleza de la muestra.También puede aplicarse la siguiente formula:

Se hace la modificación conforme a la versión vigente de la norma de referencia, la observación se hace para mejorar redacción

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Dice Debe decir JustificaciónB.9.9 Caldo Rojo de Fenol (para fermentación de carbohidratos).B.9.9.1 Fórmula

Tripticasa o proteona peptona No. 3 10gNaCl 5gExtracto de carne (opcional). 1gRojo de fenol (7.2mL de solución de rojo de fenol al 0.25%)

0.018g

Agua destiladapH 7.4 ± 0.2.

1L

Carbohidrato*B.9.9.2 Preparación: Disolver los ingredientes sin el carbohidrato, en 800mL de agua destilada con calentamiento y agitación ocasional. Distribuir en volúmenes de 2mL en tubos de 13mm x 100mm con campana de Durham. Esterilizar a 121ºC por 15 min y dejar enfriar. Disolver 20g del carbohidrato en 200mL de agua destilada y esterilizar por filtro de membrana, adicionar asépticamente 0.5mL del filtrado a cada tubo con medio esterilizado y enfriado a menos de 45ºC, agitar suavemente para mezclar.

B.9.9 Caldo Rojo de Fenol (para fermentación de carbohidratos).Seguir las instrucciones de preparación conforme se describe en C.9.8. sustituyendo ramnosa y xilosa por manitol o glucosa según se requieraB.9.9.1 Fórmula

Tripticasa o proteosa proteona peptona No. 3 10gNaCl 5gExtracto de carne (opcional). 1gRojo de fenol (7.2mL de solución de rojo de fenol al 0.25%)

0.018g

Agua destiladapH 7.4 ± 0.2.

1L

Carbohidrato*B.9.9.2 Preparación: Disolver los ingredientes sin el carbohidrato, en 800mL de agua destilada con calentamiento y agitación ocasional. Distribuir en volúmenes de 2mL en tubos de 13mm x 100mm con campana de Durham. Esterilizar a 121ºC por 15 min y dejar enfriar. Disolver 20g del carbohidrato en 200mL de agua destilada y esterilizar por filtro de membrana, adicionar asépticamente 0.5mL del filtrado a cada tubo con medio esterilizado y enfriado a menos de 45ºC, agitar suavemente para mezclar.

Al eliminar este medio y permitir el uso de otro medio base permite aprovechar un solo medio base para dos metodologías, reflejándose en reducción de costos y procesamiento.

3.3. Diagrama de flujo.■ Revisar punto B.8 Ayuda visual de la norma de referencia.

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■ El diagrama de flujo es una representación gráfica del método, en todo momento se debe tener acceso al método de prueba original.

4. EQUIPOS E INSTRUMENTOS4.1. Los equipos listados a continuación son los críticos requeridos por el método. En el informe de

evaluación de desempeño deberá completarse la “Tabla equipos de instrumentos empleados”

Nombre Características Estado deseado

Balanza Granataria Sensibilidad de 0.1 g Calibración vigente y verificada el día de uso.

Marco de pesas

Clase F1 o E210 ó 20 g;y 100 g ó 200 g ó 500 g

Calibrado

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Baño de agua

Temperatura controlada a 35°C ± 1°C ó 37°C ± 1°C.

Calificada1 35°C ó 37°C ± 1°C, por 24 h mínimo.Con termómetro calibrado o verificado para realizar la lectura de la temperatura de la cámara por lo menos dos veces al día. División mínima de 0.5°C. Adecuadamente inmerso.2

IncubadoraTemperatura controlada a 36°C ± 1°C

Calificada 36°C ± 1°C, por 24 h mínimo.Con termómetro calibrado o verificado para realizar la lectura de la temperatura de la cámara por lo menos dos veces al día. División mínima de 0.5°C. Adecuadamente inmerso.

Homogeneizador o licuadora Funcionando Mantenimiento Vigente.

5. MATERIALES5.1. El material de trabajo debe ser estéril, cuando no se indique otra cosa, el material esterilizado por

calor seco o calor húmedo se considera estéril hasta por un mes siempre que se mantenga la integridad del empaque; todo el material debe ser adecuadamente identificado, señalando la fecha de esterilización de material y la fecha de uso. Se deben anexar evidencias al informe.

5.2. Cuando se use material estéril éste deberá ser evaluado por lote antes de su uso o documentar la esterilidad mediante certificado de calidad, una vez abierto el empaque los materiales no deben ser usados después de tres días. Se deben anexar evidencias al informe.

5.3. El material de vidrio re-usado deberá demostrar que fue lavado adecuadamente, mediante registros de supervisión y demostrar la ausencia de residuos de detergente. Se deben anexar evidencias al informe.

5.4. Los siguientes materiales son de carácter enunciativo, el laboratorio deberá reportar los utilizados y sus características en el informe.● Bolsas estériles para homogeneizador peristáltico o vasos de licuadora de vidrio o aluminio. ● Cajas Petri de vidrio o desechable, diámetro de 90mm a 100mm.● Cucharas, tenedores y cuchillos estériles para el manejo de la muestra● Frascos de 500 mL con tapa de rosca esterilizables ● Gradillas para tubo de ensaye esterilizables● Mecheros Bunsen o Fisher.

1 Se entiende que la calificación de los equipos para incubación consiste en un procedimiento interno o externo por el cual se demuestre, a través del monitoreo en diferentes puntos que la temperatura de la cámara durante un periodo determinado mantiene una homogeneidad térmica, asegurando las condiciones de incubación de la prueba.2 Para la medición de la temperatura también se puede utilizar un termógrafo o termocupla trazable

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● Perillas o propipetas.● Pipetas estériles de vidrio graduadas con diferentes capacidades: 10 y 5 mL con divisiones

de 0.5 mL y 1 mL y con división mínima de 0.1 mL.● Micropipetas 100 a 1000 μL calibradas y/o verificadas.● Matraces Erlenmeyer con tapón de rosca de 250 mL.● Tubos de ensaye de 18 por 150 mm con tapón de rosca.● Puntas para micropipetas estériles y desechables.

6. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO (MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y MATERIAL BIOLÓGICO DE REFERENCIA).La preparación de los medios de cultivo se debe realizar conforme a las instrucciones del fabricante. En el informe, se deberán incluir evidencias de la preparación de los medios y su control de calidad.6.1. MEDIOS DE CULTIVO y REACTIVOS

■ Agar Baird Parker;■ BHI;■ Solución reguladora de fosfatos;■ Agua peptonada;■ Solución Salina 0.85%;■ Agar Azul de Toluidina-ADN;■ Plasma de Conejo con EDTA;■ Agua peptonada amortiguada;■ Peróxido de hidrógeno al 3%;■ Reactivos para la tinción de Gram;■ Caldo para la fermentación de carbohidratos.

6.2. CEPAS ■ S. aureus ATCC 6538 ó 25923;■ Para la prueba de selectividad se pueden escoger cepas que sean interferentes en la determinación

como S. epidermidis ATCC 12228 o Listeria monocytogenes ATCC19115.

7. MUESTRAS7.1. Para la autorización inicial cada laboratorio deberá realizar la evaluación del desempeño del

método con al menos una matriz del grupo de alimentos prioritario para el laboratorio.7.2. El laboratorio deberá contar con un programa para realizar la evaluación de desempeño en una

matriz por cada grupo de alimentos.7.3. En el informe de validación se deberá reportar los criterios para la selección de la matriz inicial

considerando lo siguiente:

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Grupo de alimentos Tipos de producto

Tipo de producto recibido en el laboratorio.

Matriz representativa mayormente recibida en el laboratorio.

Prioridad para el laboratorio. 3

Productos Cárnicos

CrudoProcesados térmicamenteCongeladosFermentadosCuradoPate

Reportar en el informe Reportar en el informe Reportar en el informe

Pescado y Productos de la pesca

CrudosCongelados


Frutas y Vegetales Crudos Reportar en el

informe Reportar en el informe Reportar en el informe

Leche y lácteos

CrudosCongeladosfermentadosQueso artesanal


Agua

Agua potableAgua embotelladaAgua de pozoHielo


Otros Productos Para ser llenado por cada laboratorio


7.4. La selección de las muestras debe realizarse con base en las prioridades del laboratorio considerando; la frecuencia de recepción y los programas prioritarios.

7.5. Para la ejecución de este protocolo es necesario contar con una muestra con cuentas altas de S. aureus, pudiendo ser esta naturalmente contaminada o fortificada.

7.6. Para la selección de las muestras se deberá contar con aproximadamente 1.5 kg o L de muestra y almacenar en condiciones adecuadas, dependiendo de la matriz. Además se debe tener trazabilidad de la muestra por ejemplo: marca, número de lote, fecha de caducidad, para productos como frutas, vegetales, agua de la llave, se deben contener información de los datos de muestreo o lugar de la compra, fecha de la compra, etc.

8. DESARROLLO EXPERIMENTAL3 Reportar numéricamente indicando 1 para el más prioritario.

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Considerando que el método de S. aureus tiene tres etapas; aislamiento y selección de colonias sospechosas (típicas y atípicas), la confirmación de estas colonias, y el cálculo. Resulta necesario evaluar la capacidad de cada laboratorio para poder distinguir y seleccionar las colonias sospechosas, que serán después incluidas en el cálculo de estimación de UFC de S. aureus, lo cual será evaluado por la medición de la selectividad.

8.1. Ajuste del inóculo del microorganismo de interés. ■ Previo al ensayo de evaluación se debe identificar la dilución adecuada de los

microorganismos para preparar la suspensión de trabajo, en las concentraciones que se indican más adelante.

■ El protocolo de preparación del inóculo puede ser elegido a conveniencia del laboratorio, éste debe describirse en el informe.

■ Para la preparación del inóculo puede consultarse la “Guía para la Evaluación del Desempeño de Métodos de Prueba Microbiológicos para el Análisis de Alimentos” (CCAYAC-CR-018).

■ Inocular aproximadamente 1,200,000 UFC en la primera dilución (250mL), para obtener una cuenta aproximada de 480 UFC en la primera serie de placas, 48 UFC en la segunda y 5 UFC en la tercera.

8.2. Ajuste del inóculo de los microorganismos para la prueba de selectividad. ■ Preparar un inóculo de < 25,000 UFC del microorganismo de interés y >250,000 UFC del

microorganismo interferente.

Tabla 1 Preparación de muestras Repetibilidad, Reproducibilidad, Recuperación, Selectividad, Sesgo e Incertidumbre.

Parámetro Analistas Muestra Diluciones decimales

Número de réplicas Microorganismo Tamaño de Inóculo

Verificación de la muestra

Al menos un analista

25 g o 25mL 3 3 Sin microorganismoSin inóculo

RepetibilidadRecuperación

SesgoUn analista 25 g ó 25 mL por

réplica

3 diluciones10 Staphylococcus aureus 1,200,000 UFC

aproximadamente

Reproducibilidad Al menos 2 analistas, o 2 tiempos diferentes

25 g ó 25 mL por réplica

10 por analista o

Staphylococcus aureus 1,200,000 UFC aproximadamente

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cada tiempo.

Selectividad Un analista 25 g ó 25 mL por réplica 1 10 por

analista

Staphylococcus aureus

S. epidermidis ATCC 12228 o Listeria monocytogenes ATCC 19115

< 25,000 UFC

> 250,000 UFC

8.3. Repetibilidad■ Medir 10 alícuotas de 25 g o 25 mL de la matriz seleccionada en 225 mL de agua peptonada

amortiguada.■ Inocular cada alícuota con aproximadamente 1,200,000 UFC.■ Verificar el inóculo utilizando la técnica de vaciado en placa, empleando para el cálculo 6

cajas.■ Proceder como lo establece el método de prueba correspondiente basado en el Apéndice B

Normativo. NOM-210-SSA1-2014.4

■ Registrar los resultados en el formato del informe.

8.4. Reproducibilidad■ Un segundo analista simultáneamente con el que realiza repetibilidad ó el mismo en un

tiempo diferente, deberá ejecutar lo descrito en repetibilidad.■ Registrar los resultados en el formato del informe.

8.5. Recuperación■ Obtener el logaritmo de los resultados obtenidos de las cuentas de S. aureus en la

repetibilidad, y calcular la media de los logaritmos de éstas.■ Dividir la media del logaritmo de los resultados obtenidos de las cuentas de S. aureus (Vo)

entre el logaritmo de las UFC inoculadas (Ve), y multiplicarlo por 100 para calcular el porcentaje de recuperación según se indica en el apartado 10.4.

8.6. Sesgo

4 Para los cálculos se deberán considerar las modificaciones a la norma.15


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■ Obtener el sesgo sacando el valor absoluto de la diferencia entre la media del logaritmo de los resultados obtenidos de las cuentas de S. aureus (Vo) menos el logaritmo de las UFC inoculadas (Ve).

8.7. Selectividad ■ Preparar una dilución de la muestra midiendo 10 alícuotas de 25 g o 25 mL de muestra en

225 mL de de agua peptonada amortiguada, inocular < 25,000 UFC del microorganismo de interés y >250,000 UFC del microorganismo interferente, a partir de esta, inocular por extensión en placa dos placas de ABP y continuar con el método de prueba correspondiente basado en el Apéndice B normativo NOM-210-SSA1-2014. Simultáneamente verificar ambos inóculos utilizando la técnica de vaciado en placa, empleando para ello 6 placas con cada cepa.

■ Proceder como lo establece el método de prueba correspondiente basado en el Apéndice B Normativo. NOM-210-SSA1-2014.4

■ Registrar los resultados en el formato del informe.

9. Resultados9.1. Registrar resultados en el informe de desempeño.9.2. Para el cálculo de los resultados se podrá usar el formato CCAYAC-F-731

10. Análisis estadístico

10.1. Repetibilidad ■ Colocar las lecturas obtenidas en el formato del informe, la hoja realizará automáticamente

el cálculo. ■ El valor de r se calcula como:

DSR= sx

r=2.8√DSR2

nDónde:s=desviación estándarr= repetibilidadDSR=Desviación estándar relativa

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n = número de réplicasx = Promedio

10.2. Reproducibilidad■ Calcular la reproducibilidad utilizando los resultados obtenidos de las 10 réplicas de la

prueba de repetibilidad de un analista, más los resultados de un segundo analista, o el mismo analista en un segundo tiempo.

■ Colocar las lecturas obtenidas en el formato del informe, la hoja realizará automáticamente el cálculo.

■ El valor de R se calcula como:

R=2.8√DSR12+DSR2

2

nDónde:R= Reproducibilidad (por analista)DSR1=Desviación estándar relativa del analista 1DSR2=Desviación estándar relativa del analista 2n= Total de réplicas considerando los dos analistas

10.3. Recuperación■ Colocar las lecturas obtenidas en el formato del informe, la hoja realizará automáticamente

el cálculo. ■ El valor de % de recuperación se calcula como:

% Recuperación= Media del logaritmo de las cuentas x100 Logaritmo de las UFC inoculadas

10.4. Sesgo■ El sesgo es la diferencia absoluta entre el valor conocido como verdadero y el valor obtenido

experimentalmente.■ Colocar las lecturas obtenidas en el formato del informe, la hoja realizará automáticamente

el cálculo.El sesgo se calcula como:

Sesgo= [Ve-Vo]Dónde Ve= valor esperado

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Vo= valor obtenido10.5. Selectividad

■ Al menos en el 80% de los resultados se obtienen confirmación de S. aureus.

S= No .deresultados confirmados comoS .aureusNo.de resultados esperados

×100

Considerando que se requieren 10 réplicas por analista y al menos 1 analista el número total de resultados esperados debería ser 10.

10.6. Estimación de la incertidumbre■ Identificar y mencionar las posibles fuentes de incertidumbre.■ Colocar las lecturas obtenidas en el formato del informe, la hoja realizará automáticamente

el cálculo.■ La incertidumbre expandida U tal como se define por GUM, se deriva de la incertidumbre

estándar combinada uc(y), con un factor de cobertura k elegido en esta especificación técnica como un valor de 2 (que aproximadamente corresponde a un nivel de confianza del 95%.

U = 2 sR

Dónde:U = Incertidumbre expandida.YiA = Son los datos transformados a logaritmo, en log10 (ufc/g) ó log10 (ufc/ml) del analista AYiB = Son los datos transformados a logaritmo, en log10 (ufc/g) ó log 10 (ufc/ml) del analista Bn = 20

11. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

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Parámetro Criterio de aceptación

Repetibilidad 10 Réplicas un analista.Nivel de fortificación: valor medioResultado r < 3

Reproducibilidad 10 Réplicas por cada analista, 2 analistas.Nivel de fortificación: valor medioResultado R < 3

Recuperación 10 Réplicas, un analista.Nivel de fortificación valor medioResultado entre 90 y 110% log

Sesgo 10 réplicas un analista.Nivel de fortificación: valor medioLa diferencia absoluta de lo recuperado y lo inoculado es <0.3 log

Selectividad. 10 Réplicas por analista.Al menos 1 analista.Nivel de fortificación: < 10 UFC por placa de microorganismos de interés. > 100 UFC por placa del microorganismo interferente.Resultado: confirmación del microorganismo de interés en > 80 % de las muestras.

Incertidumbre Especificar el mensurandoListar las fuentes de incertidumbreRealizar los cálculos de la incertidumbre expandida.

Referencia: Guía para la Evaluación del Desempeño de Métodos de Prueba Microbiológicos para análisis de alimentos. CCAYAC-CR-018.

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INFORME PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL MÉTODO DE

REFERENCIA PARA LA ESTIMACIÓN DE LA CUENTA DE S. aureus

APÉNDICE B NORMATIVO, NOM-210-SSA1-2014

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Participaron en la elaboración de este informe

María Esperanza Rodríguez ParraLaboratorio Estatal Salud Pública TamaulipasResponsable de Laboratorio de Microbiología de Aguas y Alimentos834 312 [email protected]

Odilia Hernández HernándezLaboratorio Estatal Salud Pública Veracruz.Jefa del Departamentos de Análisis Sanitarios.229 9811390 Ext: [email protected]

Paul CastroLaboratorio Estatal de Salud Pública de Baja California Sur.Aseguramiento de [email protected]

Karina Guerrero ColinaLaboratorio Estatal Salud Pública Veracruz.Q. Analista de Análisis Microbiológicos229 9811390 Ext: [email protected]

César Omar Gálvez GonzálezComisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.Coordinador de la Oficina de Proyectos Analíticos.5550805200 ext. [email protected]

Mirella Paredes SalasLaboratorio Estatal de Salud Pública de Aguascalientes449 [email protected]

Participaron en la revisión de este informe.

Odilia Hernández HernándezLaboratorio Estatal de Salud Pública de VeracruzJefe de Departamento de Análisis Sanitarios(229) 9811390 [email protected]

IBQ Claudia Lorena Garcia GreenLaboratorio Estatal de Salud Pública de Baja California Sur.

Geovani Ramírez HernándezGerencia de la Red nacional de laboratorios.50805200 ext. [email protected]

Maria Esperanza Rodriguez ParraLaboratorio Estatal Salud Pública TamaulipasResponsable de Laboratorio de Microbiología de Aguas y Alimentos834 312 6633 [email protected]

Liliana Areli Cano RamirezComisión de Control Analítico y Ampliación de CoberturaCoordinadora de Microbiología Sanitaria.50805200 ext. [email protected]

Autorización

Imelda Rocio GuzmanDirectora Ejecutiva de Control Analítico.Comisionada de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.Teléfono: 01 55 50 80 52 00 ext [email protected]

Josefina Gutiérrez RamírezComisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.Directora Ejecutiva de Innovación.01 55 50 80 52 00 ext [email protected]

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mailto:[email protected]


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1. OBJETIVOReportar los resultados de Repetibilidad, Reproducibilidad, Recuperación, Sesgo, Selectividad e Incertidumbre, obtenidos en el desarrollo del protocolo armonizado para la evaluación del desempeño del Método de referencia para la estimación de la cuenta de S. aureus, Apéndice B Normativo. NOM-210-SSA1-2014 en la matriz(ces) <<indicar la matriz>> utilizado el método interno <<colocar la clave del método interno>> .

2. CAMPO DE APLICACIÓNEste informe es de aplicación a la Red Nacional de Laboratorios en la implementación y evaluación del desempeño del Apéndice B Normativo, Método de referencia para la estimación de la cuenta de S. aureus NOM-210-SSA1-2014.

3. EQUIPOS E INSTRUMENTOS Equipo Descripción:

Identificación, Marca, Modelo

Estado deseado5 Evidencia del estado.6

Balanza Granataria Haga clic aquí para escribir texto.

Verificado el día de uso y Calibrado7

<<Registro de verificación diaria>>

<<certificado de calibración de la balanza>>

Marco de pesas Haga clic aquí para escribir texto.

Calibrado 7 <<Certificado de calibración>>

Incubadora36°C ± 1°C

Haga clic aquí para escribir texto.

Calificada <<Informe de calificación>>

Instrumento de medición de temperatura


Calibrado o verificado <<Informe de calibración o verificación vigente>>

5 Seguir los criterios de aplicación descritos en http://www.cofepris.gob.mx/TyS/Paginas/Terceros-Autorizados.aspx6Hacer referencia al registro, número de informe de calibración/calificación. Anexar copia de las evidencias al presente informe.7 Se recomienda implementar el uso del CCAYAC-CR-13.

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Equipo Descripción:Identificación, Marca, Modelo

Estado deseado Evidencia del estado.

Baño de agua35°C ó 37°C ± 1°C


Calificado <<Informe de calificación>>

Instrumento de medición de temperatura


Calibrado o verificado <<Informe de calibración o verificación vigente>>

Homogeneizador peristáltico, licuadora


Mantenimiento Vigente

<<Evidencia de mantenimiento>>.

Reportó SupervisóFirma Firma

Nombre Haga clic aquí para escribir texto.


Fecha Haga clic aquí para escribir una fecha.


4. MATERIALES Material Descripción Clave de

ProcedimientoEvidencia8

Material de vidrio reutilizable estéril.

<<Indique qué tipo de material utiliza, por ejemplo pipetas, varillas etc.>>

<<Lavado de material>>.

<<Procedimiento de lavado de material y control del material lavado y Registros de lavado de material y su

8 Cuando se use material esterilizado en el laboratorio, se deberá anexar evidencias de la prueba de esterilidad realizada al material.

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control.>>

Material desechable estéril

<<Indique qué tipo de material utiliza, pipetas, asas, etc.>>

<<Verificación de la esterilidad de material>>

<<Procedimiento y registros de la verificación de la esterilidad o certificados de esterilidad del material>>

Reportó SupervisóFirma FirmaNombre Haga clic aquí para escribir

texto.Nombre Haga clic aquí para escribir texto.



5. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVOReactivo o medio de cultivo

Marca Lote y caducidad Resultados de desempeño y fecha de evaluación.9

Lote de preparación.Fecha de vida útil del

medio preparado.

Agar Baird Parker Haga clic aquí para escribir texto.




BHI Haga clic aquí para escribir texto.




9 Enviar evidencia de la preparación y de la evaluación del desempeño los medios utilizados en este informe.

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Reactivo o medio de cultivo

Marca Lote y caducidad Resultados de desempeño y fecha de evaluación.


medio preparado.

Solución reguladora de fosfatos o agua peptonada amortiguada





Solución salina 0.85% Haga clic aquí para escribir texto.




AST Haga clic aquí para escribir texto.




Agar azul de toluidina-ADN





Plasma de conejo con EDTA





Peróxido de hidrógeno al 3 %





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Reactivo o medio de cultivo

Marca Lote y caducidad Resultados de desempeño y fecha de evaluación.


medio preparado.

Kit para tinción de Gram Haga clic aquí para escribir texto.




Caldo rojo fenol (glucosa y manitol)










6. CEPAS

Cepas utilizadas ATCC u origen de la cepa.

Certificado u hoja de identidad y aseguramiento de calidad

Staphylococcus aureus Haga clic aquí para escribir texto.


Staphylococcus epidermidis o Listeria monocytogenes




Nombre Haga clic aquí para escribir Nombre Haga clic aquí para escribir texto.

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texto.Fecha Haga clic aquí para escribir una

fecha.Fecha Haga clic aquí para escribir una

fecha.

7. MUESTRAS7.1. Criterio de selección de la muestra

En la tabla se indica en una escala de 1 al 5 la prioridad para el laboratorio, donde uno es el más importante y 5 el menos importante.

Criterio de selección de la muestra

Tipos de producto Tipo de producto recibido en el laboratorio.

Matriz representativa, mayormente recibida en el laboratorio

Prioridad para el laboratorio

Productos Cárnicos CrudoProcesados térmicamenteCongeladosFermentadosCuradoPate

Reportar en el informe

EjemploCárnico crudoCárnico congelado

EjemploCarne molida congelada

Ejemplo 4

Pescado y Productos de la pesca

CrudosCongelados

Reportar en el informeEjemplo Pescado refrigeradoCrudosCongelado


EjemploTilapia

Ejemplo 2

Frutas y Vegetales CrudosMínimamente procesados

Reportar en el informe Ejemplo fruta crudaNo recibe

Reportar en el informeEjemploNo recibe

Ejemplo 3

Leche y lácteos FrescoCrudosQueso artesanal

Reportar en el informeEjemploQueso Fresco

Reportar en el informeEjemploQueso fresco

Ejemplo 1

Otros Productos Para ser llenado por cada laboratorio

Ejemplo No aplica


Ejemplo 5

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EjemploNo aplica

Muestra Seleccionada Haga clic aquí para escribir texto.

Cantidad de Muestra Haga clic aquí para escribir texto.

Descripción de la muestra (cuando aplique: marca, lote, fecha de caducidad, condiciones de preservación): Haga clic aquí para escribir texto.






8. DESARROLLO EXPERIMENTAL.8.1. Preparación del Inóculo. (Ver punto 8.1 del protocolo)

8.1.1. Descripción de la preparación del inóculo:

Escriba en esta sección el protocolo empleado, por ejemplo:

Se inoculó una asada de Staphylococcus aureus en 10 mL de Caldo Infusión Cerebro Corazón, se incubó a 36o C +/- 1o C por 22 a 24 h. A partir del cultivo se realizaron una serie de diluciones con solución salina 0.85% hasta llegar a la dilución 10 -9.Se colocó 1 mL por duplicado en cajas petri de la dilución 10 -7 a 10-9 y se adiciona agar métodos estándar, se incubó a 36o C +1o C por 22 a 24 h. Se realizó el conteo en cada dilución y se realizó el registro de los resultados de la concentración del microorganismo en cada dilución.

Se seleccionó la dilución con cuentas aproximadamente de 12 X 105UFC.

Las diluciones se mantuvieron en refrigeración y no son utilizadas por más 26 h.

Ver resultados en 9.1

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8.2. Verificación de la muestra.8.2.1. Descripción de la verificación de la muestra.

<< Describa las actividades para la verificación de la muestra, por ejemplo:

Se seleccionó una muestra de queso de rancho, sin número de lote, de 2 kg de peso.

El día 20 de mayo de 2016 se tomaron 3 porciones de 25 g de muestra y se analizaron siguiendo el método del Apéndice B normativo, utilizando como diluyente agua peptonada amortiguada lote 23, las muestras se inocularon en placas de ABP Lote 233 y se incubaron en la incubadora ID 422 a 36°C por 24h.

El día 21 de mayo se contaron las colonias típicas y atípicas, y se volvieron a incubar por 24h más.

El día 22 de mayo después del tiempo de incubación se volvieron a revisar las placas y se contaron las nuevas colonias típicas y atípicas, para este protocolo se seleccionó una colonia típica y una atípica (para S. aureus) de cada placa, de cada dilución, si esta confirma se continúa con el cálculo, en caso contrario se seleccionan otras 4 y se someten al proceso de confirmación los registros de anotaron en la bitácora 1 hoja 6 a 12, las colonias seleccionadas fueron sembradas en AST a 35°C, y caldo BHI incubadas a 35°C en baño de agua.

El dia 23 de mayo con el cultivo en caldo BHI se corrieron la determinación de coagulasa, incubado a 35°C en el baño de agua ID 229 realizando lecturas cada hora durante las primeras cuatro horas, y posteriormente hasta 24h. Del mismo cultivo se corrieron las pruebas de termonucleasa usando el agar azul de toluidina lote 5, incubando a 35°C en la incubadora ID6, después de 4 horas se reportó como negativo.

El día 24 se leyeron los resultados de la prueba de coagulasa reportando todos los cultivos como negativo, por lo que todas las porciones de la muestra fueron reportadas como <100 UFC/g de muestra.

Los resultados se encuentran en el punto 9.2 de este informe>>

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8.3. Repetibilidad<< Describa las actividades para la evaluación de este parámetro. Ver resultados en 9.3>>

8.4. Reproducibilidad<< Describa las actividades para la evaluación de este parámetro. Ver resultados en 9.4>>

8.5. Selectividad<< Describa las actividades para la evaluación de este parámetro. Ver resultados en 9.5>>

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9. Resultados.9.1.Preparación del Inóculo. Registro

Fecha de preparación: <<Haga clic aquí para escribir una fecha.>> Fecha de lectura: <<Haga clic aquí para escribir una fecha.>>

Diluciones <<10.7>>

<<10.8>>

<<10.9>>

Cuenta de colonias

145

160

12 18 4 1

UFC/<<mL>> 150 15 3

Tamaño de inóculo deseado <<1 200 000 UFC>>Cálculo: << Si en la dilución 10-7 hay 150 UFC/mLEntonces se puede estimar que En la dilución 10-6 hay 1 500 UFC/mL

10-5 hay 15 000 UFC/mL 10-4 hay 150 000 UFC/mL 10-3 hay 1 500 000 UFC/mL

Entonces se selecciona la dilución 10-3 donde hay 1 500 000 UFC/mL1 500 000 UFC --- 1 mL1 200 000 UFC --- X

X = 0.8 mLPor lo tanto se usará como inóculo 0.8 mL de las dil 10-3 >>

Reportó SupervisóNombre y Firma

<<>> Nombre y Firma

<<>>

Fecha Haga clic aquí para escribir una fecha. Fecha Haga clic aquí para escribir una fecha.

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9.2. Resultados de Verificación de la muestra:9.2.1. Fecha de preparación de la muestra: Haga clic aquí para escribir una fecha.

Cantidad pesada por muestra:réplica 1 <<>>réplica 2 <<>>réplica 3 <<>>

Balanza<<>>

Número de diluciones realizadasréplica 1 <<>>réplica 2 <<>>réplica 3 <<>>

Diluyente<<Nombre >> <<lote de preparación>>

mL de muestra inoculados por placa<<0.1>>

Medio de cultivo<<Nombre >> <<lote de preparación>>

Incubación: Temperatura <<>> Tiempo <<>> Incubadora <<>> Termómetro <<>>

Reportó SupervisóNombre y Firma

<<>> Nombre y Firma

<<>>


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9.2.2 Primera lecturaFecha:Haga clic aquí para escribir una fecha.

Placa 1 Placa 2

Dilución <<10-1>>

<<10-2>>

<<10-3>>

d= <<10-1>>

<<10-2>>

<<10-3>>

Répl

ica 1

Colonias típicas contadas en la placa

cc <<>> <<>> <<>> cc <<>> <<>> <<>>

Colonias atípicas contadas en la placa

cnc <<>> <<>> <<>> cnc <<>> <<>> <<>>

Répl

ica 2


cc <<>> <<>> <<>> cc <<>> <<>> <<>>


cnc <<>> <<>> <<>> cnc <<>> <<>> <<>>

Répl

ica 3


cc <<>> <<>> <<>> cc <<>> <<>> <<>>


cnc <<>> <<>> <<>> cnc <<>> <<>> <<>>

Analista SupervisorNombreY firma

Haga clic aquí para escribir texto. Nombre y firma




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9.2.3 Segunda lecturaFecha:Haga clic aquí para escribir una fecha.

Placa 1 Placa 2

Dilución <<10-1>>

<<10-2>>

<<10-3>>

d= <<10-1>>

<<10-2>>

<<10-3>>

Répl

ica 1


cc <<>> <<>> <<>> cc <<>> <<>> <<>>


cnc <<>> <<>> <<>> cnc <<>> <<>> <<>>

Répl

ica 2


cc <<>> <<>> <<>> cc <<>> <<>> <<>>


cnc <<>> <<>> <<>> cnc <<>> <<>> <<>>

Répl

ica 3


cc <<>> <<>> <<>> cc <<>> <<>> <<>>


cnc <<>> <<>> <<>> cnc <<>> <<>> <<>>

Analista SupervisorNombreY firma

Haga clic aquí para escribir texto. Nombre y firma




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9.2.4 Confirmación10, 11 Haga clic aquí para escribir una fecha.BHI Lote de preparación <<>>AST Lote de preparación <<>>Coagulasa Lote <<>> Fecha de hidratación Haga clic aquí para escribir una fecha.Azul de Toluidina Lote de preparación Haga clic aquí para escribir texto.Bioquímicas Lote <<>> ó Manitol lote <<>> Glucosa lote <<>>Catalasa Lote <<>> Baño de agua <<ID>> Temperatura <<°C>> Termómetro <<ID>>Incubadora <<ID>> Temperatura <<°C>> Termómetro <<ID>>

Muestra Cepa Resultado coagulasa Tiempo de incubación para coagulasa

Resultado Termonucleasa

Control Positivo

S. aureus <ATCC>> Haga clic aquí para escribir texto.



Control Negativo

S. epidermidis <<ATCC>> Haga clic aquí para escribir texto.



9.2.4.1 Para el registro de resultados de confirmación utilice el formato anexo 13.1 “Registro de resultados de confirmación” o los formatos internos del laboratorio y anexe al informe la cantidad de formatos necesarios.

Analista Nombre y Firma


Supervisor Nombre y firma




10 De las siguientes tabla solo utilice las celdas necesarias, cancela las celdas que no use siguiendo las buenas prácticas de documentación11 Las pruebas auxiliares pueden hacerse para apoyar la determinación de coagulasa y termonucleasa.

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9.2.4.2 Para la interpretación de los resultados y cálculos utilice el CCAYAC-F-731 anexe a este informe.

9.2.5 Resumen de resultados.

Réplica Resultado Valor esperado Cumple

1 Haga clic aquí para escribir texto. ☐Muestras no contaminadas:

< 100 UFC/g o <1 UFC/g

☐Muestras naturalmente contaminadas:☐No aplica

☐si☐no☐no aplica

2 Haga clic aquí para escribir texto.

3 Haga clic aquí para escribir texto.

Reportó Nombre y firma

Haga clic aquí para escribir texto. Supervisó Nombre y firma



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9.3. Repetibilidad y Reproducibilidad9.3.1. Analista 1

Nombre del Analista: <<>> Fecha de inicio de la Prueba <<>>9.3.1.1. Registro de preparación de la muestra.

Fecha de preparación de la muestra: <<>>Identificación de la Balanza <<>>Número de diluciones realizadas por muestra <<3>>Diluyente <<Nombre >> <<lote de preparación>>mL de muestra inoculados por placa <<0.1>>Medio de cultivo: <<ABP >> <<lote de preparación>>Por cada muestra registre la cantidad pesada realmente.

Réplica 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cantidad real pesada (g)















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9.3.1.2. Registro de inoculación de la muestra y verificación del inóculo.Fecha de la preparación del inóculo: <<>> Fecha de la verificación: <<>>Microorganismo: <<>>mL inoculados a la muestra: <<1 mL>> UFC esperado (teórico) << 1 200 000>> UFC/mL.

9.3.1.3 Verificación del inóculo.mL inoculados por placa para la cuenta en placa: <<>>Método de recuento: Vaciado en placa ☐, Extensión en superficie ☐Medio de cultivo <<AST u otro medio sin inhibidores >> Lote de preparación: <<>>Incubación: Temperatura <<>> Tiempo <<>> Incubadora <<>> Termómetro <<>>Dilución en la que se cuentan < 300 UFC <<>>

Resultados:

Réplica 1 2 3 4 5 6

UFC en la placa 1 <<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>


<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

Promedio por réplica. <<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

Promedio de las 6 réplicas Haga clic aquí para escribir texto.

Valor esperado por g o mL de muestra






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9.3.1.4 Registro de incubación Temperatura <<>> Tiempo <<>> Incubadora <<>> Termómetro <<>>Fecha de incubación: <<>>





9.3.1.5 Registro de lectura: Utilizando el formato anexo 13.2 “Registros de cuentas” registre el número de colonias de cada réplica.

9.3.1.6 Confirmación Registre los resultados de confirmación en el formato anexo 13.1 “registro de resultados de confirmación”.

9.3.1.7 Cálculos Realice el cálculo de UFC por g o mL de muestra utilice el formato CCAYAC-F-731.

9.3.1.8 Resuma los resultados en el punto 9.3.3.

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9.3.2. Analista 2Nombre del Analista: <<>> Fecha de inicio de la Prueba <<>>

9.3.2.1. Registro de preparación de la muestra.Fecha de preparación de la muestra: <<>>Identificación de la Balanza Haga clic aquí para escribir texto.Número de diluciones realizadas por muestra <<3>>Diluyente <<Nombre >> <<lote de preparación>>mL de muestra inoculados por placa <<0.1>>Medio de cultivo: <<ABP >> <<lote de preparación>>Por cada muestra registre la cantidad pesada realmente.

Réplica 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>





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9.3.2.2. Registro de inoculación de la muestra y verificación del inóculo.Fecha de la preparación del inóculo: <<>>Fecha de la verificación: <<>>Microorganismo: <<>>mL inoculados a la muestra: <<1 mL>>UFC esperado (teórico) << 1 200 000>> UFC/mL.

9.3.2.3 Verificación del inóculo.mL inoculados por placa para la cuenta en placa: <<>>Método de recuento : Vaciado en placa ☐ , Extensión en superficie ☐,

Medio de cultivo <<AST u otro medio sin inhibidores <<>> Lote de preparación: <<>>Incubación: Temperatura <<>> Tiempo <<>> Incubadora <<>> Termómetro <<>>Dilución en la que se cuentan < 300 UFC <<>>

Resultados:

Réplica 1 2 3 4 5 6


<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>


<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

Promedio por réplica. <<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

Promedio de las 6 réplicas Haga clic aquí para escribir texto.

Valor esperado por g o mL de muestra





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NOM-210-SSA1-2014


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9.3.2.4 Registro de incubación Temperatura <<>> Tiempo <<>> Incubadora <<>> Termómetro <<>>Fecha de incubación: <<>>





9.3.2.5 Registro de lectura: Utilizando el formato anexo 13.2 “Registros de cuentas” registre el número de colonias de cada réplica.

9.3.2.6 Confirmación Registre los resultados de confirmación en el formato anexo 13.1 “registro de resultados de confirmación”.

9.3.2.7 Cálculos Realice el cálculo de UFC por g o mL de muestra utilice el formato CCAYAC-F-731.

9.3.2.8 Resuma los resultados en el punto 9.3.3.

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9.3.3 Resumen de resultados de la evaluación del desempeño.12

Réplica

Analista 1 Analista 2

UFC/g o mL Log(UFC) UFC/g o mL Log(UFC)

Valor esperado <<>> <<>> <<>> <<>>

1 <<>> <<>> <<>> <<>>

2 <<>> <<>> <<>> <<>>

3 <<>> <<>> <<>> <<>>

4 <<>> <<>> <<>> <<>>

5 <<>> <<>> <<>> <<>>

6 <<>> <<>> <<>> <<>>

7 <<>> <<>> <<>> <<>>

8 <<>> <<>> <<>> <<>>

9 <<>> <<>> <<>> <<>>

10 <<>> <<>> <<>> <<>>

Promedio por analista <<>> <<>>

Desviación estándar por analista

<<>> <<>>

DSR <<>> <<>>

r <<>> <<>>

R <<>>

12 Para la realización de los cálculos puede apoyarse de la siguiente herramienta.https://docs.google.com/spreadsheets/d/1Abkig3HwxozC-xrT01eU-DK-q-MejF-NRCqSkRWeFso/edit?usp=sharing

44

https://docs.google.com/spreadsheets/d/1Abkig3HwxozC-xrT01eU-DK-q-MejF-NRCqSkRWeFso/edit?usp=sharing

https://docs.google.com/spreadsheets/d/1Abkig3HwxozC-xrT01eU-DK-q-MejF-NRCqSkRWeFso/edit?usp=sharing


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% de recuperación <<>> <<>>

Sesgo <<>> <<>>

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9.4. Selectividad. 9.4.1. Registro de preparación de la muestra.

Fecha de preparación de la muestra: <<>>Identificación de la Balanza <<>>Número de diluciones realizadas por muestra <<3>>Diluyente <<Nombre >> <<lote de preparación>>mL de muestra inoculados por placa <<0.1>>Medio de cultivo: <<ABP >> <<lote de preparación>>Por cada muestra registre la cantidad pesada realmente.

Réplica 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


<<>> <<>> <<>> <<>> <<>> <<>> <<>> <<>> <<>> <<>>





9.4.2.

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9.4.2 Registro de inoculación de la muestra y verificación de los inóculos.Fecha de la preparación del inóculo: <<>>Fecha de la verificación: <<>>Microorganismo de interés: <<S. aureus>>mL inoculados a la muestra: <<1 mL>>UFC esperado (teórico) << < 10 >> UFC

Verificación del inóculo.mL inoculados por placa para la cuenta en placa: <<>>Método de recuento : Vaciado en placa ☐, Extensión en superficie ☐Medio de cultivo <<AST>> Lote de preparación: <<>>Incubación:Temperatura <<>> Tiempo <<>> Incubadora <<>> Termómetro <<>>

Resultados:

Réplica 1 2 3 4 5 6

Dilución en la que se cuentan < 300 UFC

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

UFC en la placa 1

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

UFC en la placa 2

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

Promedio por réplica

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

Promedio <<>>

Valor esperado por g o mL de muestra <<>>

Fecha de la preparación del inóculo: <<>>Fecha de la verificación: <<>>Microorganismo Interferente: <<>>mL inoculados a la muestra: <<1 mL>>UFC esperado (teórico) << >100 >> UFC.

Verificación del inóculo.mL inoculados por placa para la cuenta en placa: <<>>Método de recuento : Vaciado en placa ☐, Extensión en superficie ☐Medio de cultivo <<AST>> Lote de preparación: <<>>Incubación:Temperatura <<>> Tiempo <<>> Incubadora <<>> Termómetro <<>>

Resultados:

Réplica 1 2 3 4 5 6

Dilución en la que se cuentan < 300 UFC

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

UFC en la placa 1

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

UFC en la placa 2

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

Promedio por réplica

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

<<>>

Promedio <<>>

Valor esperado por g o mL de muestra <<>>

Reportó Nombre y

Haga clic aquí para escribir texto. Supervisó Nombre y


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firma firmaFecha Haga clic aquí para escribir una fecha. Fecha Haga clic aquí para escribir una

fecha.

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9.4.2.1. Registro de incubación Temperatura <<>> Tiempo <<>> Incubadora <<>> Termómetro <<>>





9.4.2.2 Lectura Utilizando el formato anexo 13.2 “registros de cuentas” registre el número de colonias de cada réplica.

9.4.2.3 Confirmación Utilizando el formato anexo 13.1 “registro de resultados de confirmación” anote los resultados de la confirmación.

9.4.2.4 Cálculos Realice el cálculo de UFC por g o mL de muestra utilice el formato CCAYAC-F-731

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9.4.3 Resumen de resultados de selectividad.

Réplica Cuenta de S. aureusUFC/g o mL

Log(UFC)

Valor esperado <<>> <<>>

1 <<>> <<>>

2 <<>> <<>>

3 <<>> <<>>

4 <<>> <<>>

5 <<>> <<>>

6 <<>> <<>>

7 <<>> <<>>

8 <<>> <<>>

9 <<>> <<>>

10 <<>> <<>>

Promedio <<>>

% de recuperación <<>>

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9.5. Cálculo de incertidumbre.Describa los cálculos

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9.6. Comparación de los resultados obtenidos con los criterios de aceptación.

Parámetro Resultados obtenidos Criterio de aceptación Dictamen

Repetibilidad Analista 1Haga clic aquí para escribir texto.Analista 2Haga clic aquí para escribir texto.

r < 3☐Cumple☐No cumple

Reproducibilidad Haga clic aquí para escribir texto.

R < 3 ☐Cumple☐No cumple

Recuperación Analista 1Haga clic aquí para escribir texto.Analista 2Haga clic aquí para escribir texto.

Entre 90 y 110 log ☐Cumple☐No cumple

Sesgo Analista 1Haga clic aquí para escribir texto.Analista 2Haga clic aquí para escribir texto.

Diferencia absoluta entre lo recuperado e inoculado < 0.3 log

☐ Cumple☐No cumple

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Parámetro Resultados obtenidos Criterio de aceptación Dictamen

Selectividad 1 AnalistaHaga clic aquí para escribir texto.

Inóculo confirmado < 25, 000 UFC por placa de microorganismos de interés.Inóculo confirmado de > 250 000 UFC por placa del microorganismo interferente.

Resultado: confirmación del microorganismo de interés en > 80 % de las muestras.Las recuperaciones deberían estar dentro del 80%, del valor esperado.

☐Cumple☐No cumple

Incertidumbre expandida

Haga clic aquí para escribir

texto.

No aplica No aplica

10. Discusión de los resultados

Por ejemplo: Los resultados del análisis estadístico realizado, demuestran que al aplicar el método se obtienen resultados confiables y reproducibles y por tanto se puede utilizar para el análisis de los productos descritos en este informe.La presencia de microorganismos interferentes no afecta sustancialmente la recuperación del microorganismo de interés.

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11. CONCLUSIÓN

☐Al cumplirse todos los criterios de validez se concluye que el Método de Referencia para la

estimación de la cuenta de S. aureus Apéndice B Normativo. NOM-210-SSA1-2014 (Colocar la clave y nombre del documento que describe el método del laboratorio), al ser aplicado por el

Laboratorio Estatal de Salud Pública de XXXXXXX es adecuado para el análisis del grupo de alimentos

(matriz específica).

☐Al NO cumplirse los criterios de validez (indicar cuales no se han cumplido) se concluye que el

Método de Referencia para la estimación de la cuenta de S. aureus Apéndice B Normativo.Apéndice Normativo. NOM-210-SSA1-2014 (Colocar la clave y nombre del documento que describe el método del laboratorio), al ser aplicado por el Laboratorio Estatal de Salud

Pública de XXXXXXX NO es adecuado para el análisis del grupo de alimentos cárnicos o para la matriz

específica.

12. BIBLIOGRAFÍA

12.1 Norma Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, PRODUCTOS Y SERVICIOS. MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS INDICADORES. DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS. APÉNDICE B NORMATIVO. Método de Referencia para la estimación de la cuenta de S. aureus.

12.2 Guía para la Evaluación del Desempeño de Métodos de Prueba Microbiológicos para análisis de alimentos. CCAYAC-CR-18/2 2016.

13. ANEXOS13.1 Registros de resultados de confirmación.

13.2 Registros de cuentas.

Anexe copia de las evidencias referidas en el protocolo e informe.

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13.1 “Registro de resultados de confirmación”

Prueba :__________________ <<por ejemplo: verificación de la muestra >> Replica ___________________<<1, 2, 3 ...n>> Dilución ____________<< 10-1 >> Placa:______________ <<1>>

Colonias Típicas Colonias Atípicas

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Resultado coagulasa13

Tiempo de incubación

Resultado Termonucleasa14

Gram15

BioquímicaCatalasa/Manitol/Glucosa16

Interpretación17

13 (+) = Positivo ó (-) = negativo14 (+) = Positivo ó (-) = negativo15 (+) = Gram Positivo ó (-) = Gram negativo16 Si se usan bioquímicas colocar (+) = si confirma S. aureus ó (-) = para otro microorganismo, para catalasa/manitol/glucosa colocar (+) = Positivo ó (-) = negativo, por ejemplo S. aureus sería +/+/+17 (+) = si confirma S. aureus ó (-)= para otro microorganismo

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13.2 Registros de cuentasAnalista: _________________________

Fecha de incubación: ________________

Fecha de primer lectura: ____________________

Fecha de segunda lectura: ____________________

Replica __________ Placa 1 Placa 2

Dilución d=<<10-

1>>

<<10-

2>>

<<10-

3>>

<<10-

1>>

<<10-

2>><<10-3>>

Total de colonias

típicas contadas en la

placa

cc24h

48h

Total de colonias

atípicas contadas en

la placa

cnc24h

48h

Colonias típicas

seleccionadas a

confirmar

Ac

Colonias atípicas

seleccionadas a

confirmar

Anc

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