Aplicaciones Biotecnológicas del Acuífero de...
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Miguel David Marfil Santana, Aileen O’Connor Sánchez, Alejandra Prieto Davó METAGENÓMICA DEL ACUÍFERO DE YUCATÁN: ESCRUTINIO DE UNA GENOTECA PARA LA BÚSQUEDA DE NUEVOS METABOLITOS CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Transcript of Aplicaciones Biotecnológicas del Acuífero de...
Miguel David Marfil Santana, Aileen O’Connor
Sánchez, Alejandra Prieto Davó
METAGENÓMICA DEL ACUÍFERO DE YUCATÁN:
ESCRUTINIO DE UNA GENOTECA PARA LA
BÚSQUEDA DE NUEVOS METABOLITOS
CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Acuífero de Yucatán: el río subterráneo más
grande del mundo
• Sistema en flujo constante
• Disolución de CaCO3 en plataforma Kárstica
• Mezcla de agua de mar y dulce
• Muy poco contenido de materia orgánica
• Diversidad de microorganismos poco estudiada
Estudio de un metagenoma microbiano
(Handlesman et al., 1998) Imagen: Lewin et al., 2013
CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍA
METAGENÓMICA
www.bluebayresorts.com
Aunque el fabricante del kit te da las
instrucciones, la construcción no es
trivial
Cepa y fósmido vector
Escherichia coli EPI300
ANÁLISIS DESCRIPTIVO DEL
METAGENOMA
es.mesoamericanreef.org
Diversidad de microorganismos en muestras
de agua de pozo (acuífero de Yucatán)
MG Rast
Presencia de microorganismos con gran
capacidad de producción de metabolitos
secundarios
MG-Rast
MG Rast
Diversidad funcional demuestra
potencial del metagenoma en
metabolismo secundario
MG-Rast
Crecimiento exponencial del número de
artículos relacionados con metagenomas y
antibióticos/antimicrobianos
Primeros compuestos antimicrobianos aislados a
partir de un metagenoma (Gillespie et al., 2002)
Garmendia, et al., 2012
Estrategia experimental
Biblioteca metagenómica del
acuífero de Yucatán
Escrutinio por actividad
fenotípica
(inhibición de crecimiento
del patógeno)
Escrutinio molecular in
silico (por secuencia
de PKS y NRPS)
Análisis de resultados
pirosecuenciación
Análisis de los fragmentos en
la bases de datos del NCBI
Secuenciación de
clonas positivas
Análisis de los fragmentos positivos en la
bases de datos del NCBI
Metagenóma del acuífero de Yucatán
Identificación y Aislamiento de
clonas positivas por
hibridación DNA-DNA
(sondas para PKS y NRPS)
Miguel David Marfil Santana
ESCRUTINIO MOLECULAR
Trabajo de doctorado de Miguel David Marfil Santana
Culturacolectiva.com
Policétidos: por lo general, compuestos
biológicamente activos
TE
Miguel Marfil, modificado de Robinson JA (1991)
23,000 pb
45,000 pb
Región reguladora Región reguladora
hidrolisis
Condensación
Miguel Marfil, modificado de Sieber and Marahiel 2003
Péptidos no ribosomales: Biosíntesis
por módulos utilizando aminoácidos
Moffit y Neilan, 2001; Neilan et al., 1999
• PerfectBlast (Santiago-Sotelo y Ramírez Prado, 2012) para encontrar secuencias
similares en base de datos creada con el metagenoma
• PKS I: 125 secuencias con mas del 80 % de similitud con secuencias ya reportadas
• NRPS: 85 secuencias con mas del 80% de similitud con secuencias ya reportadas
Uso de secuencias reportadas para dominios
de ceto-sintasa (PKS) y de adenilación (NRPS)
AGGAYVPLDPAYPAGRQAQMLNDCSARCVLTCKIVAFSLYWYTRRYIWICQCPRYNYVTLAYVMYTSGSTGKPKGVRIGHPS
IINFLLSMNDRLQVTTETQLLAITTYAFDISILELLIPLMYGGVVHVCPREVSQDGNQLVDYLNAKSINILQATPASWKMLL
DSEWSGNARLTALCGGEALDTILAEKLLGKVGCLWNVYGPTETTVWSSAARITDAKYIDLGEPLANTQLYVLDEQQRLVPPG
VMGELWIGGDGLAVDYWHRSELTDAQFRTLPSLPNAGRLYRTGDKVCLRTDGRLTHHGRLDLQVKIRGY
AMDPQQWLVLEVSWHALENANLAPDKLVGSRSGVYMGISTHDYSGLHMKQGDETAVDMYVSTGNAANVAAGRLSYLLGLQGP
SMAIDTACSSSLVAVYLACQSLRSGDSDLALAGGVNLVLAPEVSIMLSKAHMMSPDGRCKTFDAGANGFVRGEGCGVVVLKR
LSDAQAANDTIVAVIRGWACNQDGRSSGLTAPNGVAQQAVVRQALACGGVKPHQIGYVETHGTGT
(Zhao et al., 2008)
KS
Dominio A
La función asignada a las secuencias
obtenidas por PerfectBlast se comprobó al
comparar con NCBI PKS
RNPS
ESCRUTINIO FUNCIONAL
http://espeleomineria.blogspot.mx
Escrutinio funcional: método doble
capa
Biblioteca metagenómica
•Incubación 12 hrs
•Temperatura 37 C
•Secado por 2 horas
Cepa patógena
•Incubación 12 hrs
•Temperatura 37 C
•0.5 DO
Inoculación
•Medio solido a 45 C
•1 mL de cepa patógena
en 100 mL de medio
•0.5 DO
Doble capa
•Incubación 12- 24 hrs
•Temperatura 37 C
•Capa de 15mm
resultados
Miguel Marfil
EPI300 1TZA11 2TZA16 1TZA17 1XHA25
E. coli
Cellulomonas sp.
B. subtilis
Estandarización de técnica de doble capa
con controles positivos
Cepas control obtenidas de cenotes del acuífero (Susana de la rosa, 2007)
Miguel Marfil
Sensi-disco:
estreptomicina
100μg/ml
Resultados después de modificación del
método de escrutinio
Resultados fortuitos del escrutinio
vs Staphylococcus aureus
¿A DÓNDE VAMOS?
www.cenotesyucatan.com
Deletion of S. lividans endogenous antibiotic gene clusters.
Martinez A et al. Appl. Environ. Microbiol. 2004;70:2452-
2463
Construcción de genoteca en cepas
distintas a E. coli y con capacidad de
producción de antibióticos
Comparación de metagenomas en
distintos puntos del acuífero
Geological Survey of Canada
Cultivo de bacterias productoras de
compuestos bioactivos
Agradecimientos
Amigos y compañeros de laboratorio
Dr. Cesar de los Santos Briones
Max Mizrain Apolinar Hernández
Yokojushy Cerón
Raziel Cachón Herrera
Lidia Ek Novelo
Judyt Caamal Chan
Abril Morales
¡Gracias por su atención!
• Becas de licenciatura y tesis de licenciatura disponibles
• Además:
– Posgrados de excelencia CONACyT (maestría y doctorado) en
– Ciencias del Mar y Limnología (UNAM, Sisal)
– Ciencias Biológicas con opción a biotecnología (CICY, Mérida)
– Posgrado institucional en ciencias agropecuarias y manejo de recursos naturales tropicales (UADY)
