Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería: enfermedades...

Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería:

enfermedades hereditarias y no hereditarias

Inmaculada Martín BurrielInmaculada Martín [email protected]@unizar.es

Enfermedad genética

Desviación del estado de salud debida total o parcialmente a la constitución genética del individuo, en el que factores ambientales pueden cumplir una función importante en la expresión y gravedad de los defectos o síntomas

¿Cómo reconocerlas?

Historia familiar – análisis de pedigríes:

Especies: Perros, Caballos, Vacuno lechero

Reconocimiento del modo de herencia

Control de filiación


Epidemiología de la enfermedadAparición de casos puntualesAparición en estirpes

Análisis de pedigríes

Determinación del tipo de herencia


Examen físico:Buscar cambios estructurales, fenotipos

característicos, alteraciones en las manos, pies, piel, pelo, etc.


Examen laboratorial:Estudios bioquímicos, inmunológicos,

citogenéticos y de genética molecular.

Tipos de Herencia en Medicina Veterinaria

Fenotipo (enfermedad) = genotipo + ambiente

Factor genético

1. Enfermedades (o rasgos) monogénicas: • Con herencia mendeliana más o menos regular• Citrulinemia, BLAD, DUMPS,etc.

2. Enfermedades de herencia multifactorial

1. Poligénicas

2. Monogénicas con importante componente ambiental

3. Enfermedades de origen cromosómico (cromosomopatías)

1. Se detectan al microscopio

2. Se originan en la meiosis

3. No heredables o herencia irregular

4. Afectan a muchos genes cuadro grave, muchos letales

Caracteres Mendelianos

Online Mendelian Inheritance in Animals: http://omia.angis.org.au/

Perro Vaca Gato Cerdo Caballo Oveja Pollo Cabra Conejo

Fenotipos totales

489 376 280 215 193 186 179 70 49

Monogénicos 131 75 47 35 29 68 72 10 13

Caracterizados a nivel molecular

68 43 24 13 15 17 22 7 3

Modelos humana

224 126 136 70 97 68 38 25 29

Modelo en animales

280 229 215 149 135 131 72 59 39

20/01/09

Enfermedades en bovino

CVM (malformación vertebral compleja)BLADDUMPSHIPERTROFIA MUSCULAR “hm”MULEFOOT O SINDACTILISMOCITRULINEMIA

http://www.gov.on.ca/OMAFRA/english/livestock/beef/facts/93-007.htm

Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnóstico de Diagnóstico de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias

BLADBLAD

VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL

BLAD GROBET y cols. (1992)

"Enfermedad autosómica

recesiva que afecta a descendientes del toro holstein O. Ivanhoe, abuelo paterno de

C. M. Ivanhoe Bell "


Difusión rápida de enfermedades hereditarias (con frecuencia baja)

17% Mejores toros de EEUU y Canada son portadores de BLAD

HOLSTEINIZACION

ESPAÑA

MOET IA

Shuster y cols. (1992)


BLAD

Un gen autosómico letal recesico

Ganado vacuno Holstein

BASE MOLECULAR:

Deficiencia de la proteína Mac-1 (Complejo CD 11B/CD18)

Leucocitos no pueden trasportarse desde la sangre a lugares de infección

BTA 1 (U 10)

CONTROL:

AFECTA:

LOCALIZACION:

VI JORNADAS PRODUCCION ANIMALBLADBLAD

SINTOMAS

Muerte de las 7 semanas a los 8 meses

Fiebre Diarreas

Ulceraciones Gingivitis Anorexia

Retraso creto. Infecciones Pneumonia

Ganglios grandes

LESIONES

*Necrosis ganglionar *Riñones atroficos *Serositis en rumen *Enteritis ulcerativa

*Ausencia de neutrofilos en tejidos blandos *Hiperplasia de foliculos linfoides *Edema en áreas paracorticales

*Congestión esplénica *Vasos dilatados


Alteraciones del complejo

CD11/CD 18

VACUNO BLAD

HUMANA LAD

PERRO "Sindrome de

granulopatía canina"

VI JORNADAS PRODUCCION ANIMALBASE MOLECULAR

Dos mutaciones

Silente

Sustitución en la posición 128 de A por G

(Glicina por Ac. Aspártico) D128G

ALTERACION DE LA PROTEINA Mac1 (CD 11/CD 18)

Secuencia anómala del gen CD18: Defecto de expresión del CD18

Falta subunidad en la integrina 2

Alelo raro "D128G"


FRAGMENTO AMPLIFICADO: 58 b. p. del gen CD11/CD18

OLIGONUCLEOTIDOS:

CONDICIONES DE AMPLIFICACION:

94º C., 10' Desnaturalización 94º C.. 15" Hibridación Elongación

69º C., 20"35 x

VISUALIZACION DEL FRAGMENTO:Gel de agarosa al 4 % y tinción con Br Et. (luz U. V.)

Desnaturalización previa

DIGESTION CON ENZIMAS DE RESTRICCION:

Taq I 65º C. Hae III 37º C.

> 4 horas

VISUALIZACION DEL PRODUCTO DIGERIDO:Gel de agarosa al 5 % y tinción con Br Et. (luz U. V.)

5' TCCGGAGGGCCAAGGGCTA 3' 5' GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG 3'

VI JORNADAS PRODUCCION ANIMALAMPLIACION POR PCR:

58 bp del gen CD18

D128/D128 :

Heterocigotos Sanos, portadores

Homocigotos recesivos Enfermos

Homocigotos dominantes Sanos, no portadores

3 GENOTIPOS

D128/D128G :

D128G/D128G :


G G C C T C G A C C

G G C C T C G G C C

7 bases 13 bases

7 bases 13 bases

30 bases

28 bases

8 9 10 11 25 26 2827

8 9 10 11 25 26 2827 29 30

Hae III

Hae III

Taq I

Hae III

19 bases9 bases

9 bases 49 bases

25 bases 33 bases

58 bases (Taq I no encuentra secuencia de corte)

Alelo MUTADO (D 128 G)

Secuencia reconocida por Taq I Secuencia reconocida por Hae III

Lugar de corte de Taq I Lugar de corte de Hae III

Fragmento originado por digestión con Taq I Fragmento originado por digestión con Hae III

Leyenda

* La mutación se produce en la base 28

Alelo NORMAL(D 128)


T H N

T H N

T H N

19 bp

9 bp

25 bp 30 bp 33 bp

49 bp

58 bp

+

_

Individuo NORMAL (TL) D 128 / D 128

Individuo PORTADOR (BL) D 128 / D 128 G Individuo ENFERMO D 128 G / D 128 G

T: DNA digerido con Taq I H: DNA digerido con Hae III N: DNA no digerido

DIAGNOSTICO DE BLAD

Diagnóstico: PCR + Taq I

G/G D/GD/GD/GD/G D/D


DIAGNOSTICO COLECTIVO

" A partir de la muestra recogida de un tanque leche de una explotación, conocer de forma rápida y

económica la existencia de hembras portadoras "

Método PCR detecta: " Presencia de un portador en una muestra de un tanque de leche correspondiente al

ordeño de 40 hembras "

Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnósticoDiagnóstico de de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias

SSPSSP

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)

$


MUTACIÓN EN EL GEN DE RYR-l Receptor de la ryanodina

Cambio de C (alelo Normal) por T (alelo mutado)

HerenciaAutosomica

recesiva


DETECCIÓN POR LIGAMIENTO- Halotano- Polimorfísmos bioquímicos (Hb,PGD y GPI)


C

199bp

PCR 199bp

T 165bp 34bp

BsiHKA I

Diagnóstico de Diagnóstico de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias

Susceptibilidad/ResistenciaSusceptibilidad/ResistenciaGenéticaGenéticaScrapieScrapie

Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNP Genética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de

abasto:EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino

ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES

ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

- hereditaria- esporádica- infecciosa

Animales

Humanas

KuruEnfermedad de Creutzfeld-JakobInsomnio Familiar Fatal

Encefalopatía Espongiforme BovinaEnfermedad Transmisible del VisónSCRAPIE (Tembladera) ovino y caprino

Susceptibilidad genética

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

Encefalopatías Espongiformes Transmisibles

CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS COMUNES

Depósitos de PrPSc Pérdida neuronal y gliosis

Espongiosis Vacuolización

Encefalopatías Espongiformes Transmisibles

Agente causal de tipo infeccioso

PrP (Proteína Prión)

PrPC PrPSc

Cambio de conformación

Proteína sensible a proteasas Proteína resistente a proteasas

depósito en tejidos celulares

Sistema linfoide SNC

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

GEN PRNP (Proteína prión)

• Secuencia muy conservada en un gran número de especies (230-256 aa)

• Alto grado de polimorfismo

relacionado conSUSCEPTIBILIDAD

Período de incubación(humano, ovino ycaprino)

Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNP Genética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de


Implicaciones genéticas de las EETs

NPU (1961): Selección intra-raza según la resistencia a la infección de scrapie experimental

Interacción entre el genotipo del hospedador y las cepas de scrapie.


Gen Sip (Scrapie incubation period): Gen mayor que controla la duración del periodo de incubación de scrapie.

NPU:

sA (p.i. corto) > pA (p.i. largo)

Dickinson (1968):

Gen “sinc” (Scrapie incubation): Estudios experimentales en

ratones.

Comportamiento dependiente de la cepa de scrapie (ME7 y 22A)

s7 (p.i. corto) > p7 (p.i. largo)


La proteína priónica PrP aparece en la fracción infecciosa de los homogeneizados de scrapie.

Asociación genética entre el gen PRNP y la longitud del periodo de incubación de scrapie en ratón.

Identificación de mutaciones del gen PRNP en ciertas patologías humanas

En ovino el gen mayor Sip está estrechamente ligado a PRNP .

Ratones knock-out para el gen PRNP son resistentes a la enfermedad

Gen de la proteína prión (PRNP):

Factores genéticos de las EETs Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de


Gen PRNPLongitud 16-22 kpb:

2 o 3 exones según la especie

Región codificante (ORF) en un único exón (2kpb)

Codifica una glicoproteína de membrana de entre 230 y 250 aa según la especie

Altamente conservado entre especies.

Gen PRNP

ORF 3’UTR

Exon1 Exon2 Exon3

Proteína PrP murina

Péptido señal

Repet. octapéptidos

1 23 51 90 231 254213178

196180

S S UniónGPI

CHO CHO

Proteína PrP humana

1 245

Http://www.errnm.cbcu.carn.ac.uk

Gen PRNP

Gen PRNPIdentificación y localización del gen PRNP

Especie Localización Especie Localización

Bos taurus 13q17 Homo sapiens 20pter-p12

Bufalus bufalis 14q15 Mus musculus 2

Cervus elaphus 2 Ovis aries 13q15

Capra hircus 13q17 Rattus norvegicus 3q35

Equus caballus 22 Vulpes fulva 14

Gen PRNPHomología de secuencia

Humano vs BovinoHumano vs OvinoBovino vs Ovino

66.7 %65.4 %94.0 %

Prusiner (1998)

Gen PRNP

Mutaciones puntuales:

Inserciones y delecciones de octapéptidos

GTC GCC Val Ala

PHGGGWGQ

Polimorfismos

Gen PRNP

Prusiner (1998)

Polimorfismos

Factores genéticos de las EETs Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de


Genética de las EETs humanas

• Polimorfismo más importante: Codón 129

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

Met/MetVal/Val

Susceptibilidad

http://www.bse.org.uk/report/volume2



• Mutación más común en el codón 200

- Sustitución de Lisina por Glutamina

- 70% de familias

• Patologías distintas dependiendo de la combinación de mutaciones existente

Familiar


http://www.bse.org.uk/report/volume2



• Hipótesis muy probable:

Se produce una mutación somática del gen PRNP

en un número muy reducido de células.

Esporádica

Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de


Genética de las EETs en ratón

Polimorfismos genéticos del gen Prnp murino

Polimorfismos en los codones 108 y 189 determinan diferencias en el periodo de incubación de scrapie.

Utilizado como modelo para confirmar la importancia de las mutaciones detectadas en el gen PRNP humano.

Identificación de QTLs ligados al periodo de incubación del la enfermedad.

Genética de las EETs en ratónBúsqueda de QTLs asociados a las EETs QTL: Quantitative Trait Loci

Caracteres cuantitativos determinados por el efecto aditivo de la acción de varios genes.

El periodo de incubación es un carácter cuantitativo El ratón como animal modelo:

Razones económicas Control del manejo Disponibilidad de líneas consanguíneas con

periodos de incubación muy distintos.

Loyd et al. (2001)

Genética de las EETs en ratónBúsqueda de QTLs asociados a las EETs

CAST/Ei NZW/OlaHsd CAST/EiNZW/OlaHsd

F1

F2

Loyd et al. (2001)

Genética de las EETs en ratón

Análisis de la F2:• Inoculación intracerebral con scrapie• Determinación del periodo de incubación (1000 anim)• Análisis de 150 microsatélites (marcadores altamente polimórficos dispersos por todo el genoma)• Análisis de ligamiento entre el genotipo de los marcadores y el periodo de incubación.

Chr. 2

Chr. 11

Chr. 12

Loyd et al. (2001)

Otros QTLs:Chr. 9 y 11 (Stephenson et al., 2001)

Existen otros genes relacionados con el periodo de incubación de la enfermedad

Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de


Genética de las EETs en ovino

Gen PrP ovino

Tamaño del gen 20kpb Proteína de 256 aa Homología con bovino (94%)

Secuencia aminoacídica de la PrP bovina de la ovina en 7 u 8 posiciones

Localización: 13 (13q17/18)

INTRODUCCIÓN

GEN PRNP OVINO

• Más de 45 cambios aminoacídicos (Vaccari y cols., 2007)

Codones136154171

SCRAPIE CLÁSICO

Codón141

SCRAPIE ATÍPICO

(Nor98)

4 codones asociados a susceptibilidad

En scrapie y EEB experimentales y ensayos in vitro:

M137T, I142K, H143R, R151C, P168L, N176K

(Goldmann y cols., 2006; Vaccari y cols., 2007; Bossers y cols., 2000)

Efecto protector

Estudios de los diferentes codones según la

raza

Codón 136

VV136 SusceptibilidadAV136 SusceptibilidadAA136 SusceptibilidadAA depende de la raza:

CheviotIle de FranceFlemishSwifter

Resistencia

SwaledaleTexelLacauneRomanov

Susceptibilidad



Estudios de los diferentes codones según la raza

Codón 154

Codón 171

RR154 No determinadoRH154 Cierta resistenciaHH154 Resistencia

QQ171 ResistenciaQR171 ResistenciaRR171 Resistencia 1 Suffolk en Japón


Definidos los codones se establecen las posibles variantes

A R R

A H Q

A R H

A R Q

V R Q

Cierta resistencia

Cierta susceptibilidad

Susceptibilidad

Según el genotipo del animal y su comportamiento frente a la

enfermedad se definen 5 categorías de riesgo:

R1: Riesgo muy bajo individual y de la progenie

R2: Riesgo bajo individual y de la progenie

R3: Riesgo bajo individual y progenie dependiente del otro

parental

R4: Scrapie ocasional y progenie con mayor riesgo que

R5: El mayor riesgo a scrapie



Riesgo 4ARQ/ARQ

ARR/VRQ

Riesgo 5ARQ/VRQ

VRQ/VRQ

Riesgo 3ARR/ARQ

Riesgo 1ARR/ARR

Categoría de riesgoGenotipo

Razas: Charolaise y Blue de Maine


Razas: Bluefaced y Leicester

Riesgo 2ARR/AHQ

AHQ/AHQ

Riesgo 4ARR/ARQ

ARQ/ARQ

Riesgo 5ARQ/ARQ

Riesgo 1ARR/ARR

Categoría de riesgoGenotipo


¿Qué sucede en nuestras razas?

Comunidad Autónoma de Aragón

¿Qué sucede en los animales con scrapie

pertenecientes a nuestras razas?

¿Qué sucede en otras razas Mediterráneas?

* Determinación del riesgo genético de las razas ovinas aragonesas:

Rasa Aragonesa. Ojinegra. Cartera. Maellana. Ansotana.

* Búsqueda de nuevos polimorfismos en el gen PRNP.

Polimorfismo de PRNP en ovino aragonés

Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

Material y Métodos

- Razas estudiadas :

Rasa Aragonesa. (4 Rebaños) Ojinegra. (4 Rebaños) Cartera. (2 Rebaños) Maellana. (2 Rebaños) Ansotana. (1 Rebaño)

- De cada rebaño: Todos los machos reproductores y hasta 50 de hembras.

- Extracción y purificación del DNA de sangre entera, usando el Kit de Amersham® GFX Genomic DNA blood Minikit.


- Condiciones de la PCR:

Componentes de la Componentes de la reacciónreacción

Volumen / Volumen / ReacciónReacción

(ml)(ml)

Concentración Concentración finalfinal

Tp10XTp10X 2,52,5 1X1X

dNTPsdNTPs 2,42,4 120120mMmM

ClCl22MgMg0,750,75 1,5mM1,5mM

Cebador-FrCebador-Fr0,250,25 0,2mM0,2mM

Cebador-RCebador-R0,250,25 0,20,2mMmM

HH22O hasta O hasta 2525 ------

94ºC 5min

72ºC 5min

94ºC 30secTaºC 30sec72ºC 1min

(x40)

Material y Métodos


* Codones 136 y 154 con BspHI. (O’Doherty et al., 2000)

* Codón 171 con BslI y AccI. (Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1999)

- PCR/RFLPs:

- SECUENCIACIÓN:

* Amplificación de toda la región codificante.

- F: 5’-ATGGTGAAAAGCCACATAGGCAGT-3’ - R: 5’-CTATCCTACTATGAGAAAAATGAG-3’

* Purificación del producto PCR (NúcleoTraPCR, Marcherey-Nagel®) y secuenciación.

Material y Métodos


Resultados

136 y 154

171

- PCR/RFLPs:

368241179+189

AR AH VR

127

R Q/H

918160

PCR

PCR171

R/Q H PCR171149125

PC

R

AR

R/A

RR

AR

R/A

HQ

AH

Q/A

HQ

AR

R/A

RQ

AR

Q/A

HQ

AR

R/A

RH

AH

Q/A

RH

AR

Q/A

RQ

AR

Q/A

RH

AR

Q/V

RQ


Resultados

R1

R2

R3

R4

R5

Ansotana Cartera Maellana

Ojinegra Rasa Aragonesa

44%31%

15%

39%47%

14%

6% 4%

26%

48%

26%

83%

12%

2.5% 2.5%

72%

24%

2% 2%

Porcentaje de animales según su nivel de riesgo

Su

scep

tib

ilid

ad

–

+

R. Aragonesa:46 ARQ/ARQ2 ARR/ARQ

Acín et al. (2004) Vet Rec

Scrapie


Resultados

* Se detectó (Ojinegra) la variante rara (Lisina) en el codon 171.

* Se detectaron polimorfismos en 14 codones.

* Se detectaron nuevos polimorfismos en la especie ovina:

101 (Q R) 151 (R G) 151 (R H) 172 (Y D) 175 (Q E)

- SECUENCIACIÓN:

* Se ha confirmado la mayoría de los resultados de RFLPs.

Codon 171


Conclusiones

* Las razas ovinas autóctonas analizadas se presentan como razas muy susceptibles al padecimiento de scrapie.

* El gen PRNP presenta una gran variabilidad en el ovino autóctono.

* La técnica de PCR/RFLPs presenta un riesgo de error en la lectura debido a la presencia de alelos raros.

* La técnica de secuenciación evita los riesgos de falsas lecturas, permitiendo además detectar nuevos polimorfismos.


POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN OVINO MARROQUÍ

Serrano et al. (2007) Vet Rec

MATERIAL Y MÉTODOS

OVINO MARROQUÍ: 154 animales

• Animales

89 D’man 43 Boujâad 22 Sardi

• Extracción de DNA de sangre entera

Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare)

• Amplificación por PCR

Fragmento de 768 pb: región codificante de PRNP

Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí


ComponentesConcentración

finalVolumen

(µl)Tampón 10X 1X 5

dNTPs (1,25mM) 120µM 4,8

Cl2Mg (50mM) 1,5 1,5

Cebador-F (20mM)5’-GGCAGTTGGATCCTGGTTCTC-3’

0,2 0,5

Cebador-R (20mM)5’-ACAGGAAGGTTGCCCCTATCC-3’

0,2 0,5

DNA 100-500ng 2

Taq polimerasa (5U/ml) 0,05U/µl 0,5

H2O milliQ hasta -- 50

PROTOCOLO de PCR

Programa

94ºC 2min

94ºC 15seg60ºC 15seg72ºC 20seg

72ºC 5min

x 30 ciclos

Purificación del producto de PCR

ExoSAP-IT (USB)

SECUENCIACIÓN

MATERIAL Y MÉTODOSPolimorfismos de PRNP en ovino marroquí


Química: Kit Big Dye Terminator (ddNTPs fluorescentes)

• Optimización de la reacción de secuenciación

ComponentesVolumen / Reacción

(ml)

Mix (Big Dye) 4

Producto PCR 1Cebador-F / R (3,2mM)

1

H2O milliQ 4

TOTAL 10

Programa

96ºC 1min

96ºC 10seg50ºC 5seg60ºC 4min

x 25 ciclos

Precipitación con Etanol/EDTA y desnaturalización

ABI PRISM 3100

MATERIAL Y MÉTODOS

• Análisis estadístico (GENEPOP) : cálculo de frecuencias alélicas, haplotípicas y genotípicas




Electroferogramas de los fragmentos DNA

Análisis de las secuencias (Chromas, BioEdit)

CGT CAT (His Arg)

Raza D’man

Codón 114

Codón 146

AAT AGT (Asn Ser)

Raza Boujâad

171176

114

146

Nuevo

Nuevo

10 polimorfismos

conocidos (112, 136, 141, 143, 154, 171, 172, 176, 231, 237)

RESULTADOS

silentes


Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS

• Polimorfismos relacionados con susceptibilidad

Frecuencias de haplotipo y genotipo / codones 136, 154, 171

ARQ ALTA SUSCEPTIBILIDAD

ARR CIERTA RESISTENCIA

ARQ/ARQ

ARR/ARQ

SUSCEPTIBILIDAD

(razas mediterráneas)

(Mutaciones en codón 171)

Haplotípicas Genotípicas


0

20

40

60

80

Boujâad D'man Sardi

Fre

cu

enci

a (%

)

ARQ

ARR

ARH

0

10

20

30

40

50

60

Boujâad D'man SardiF

rec

uen

cia

(%) ARQ/ARQ

ARR/ARQ

ARR/ARR

ARH/ARQ


• Otros polimorfismos Frecuencias alélicas

228943Total

2.32.252.35KAAA

97.797.7597.65NAAC176

017.950DGAT

10082.05100YTAT172

001.17SAGT

10010098.83NAAT146

2.37.8517.5RCGT

97.792.1582.5HCAT143

4.5019.8FTTT

95.510080.2LCTT141

02.80RCGT

10097.2100HCAT114

2.31.70TACG

97.798.3100MATG112

SardiD’manBoujâadAminoácido

SecuenciaCodón

NUEVO

NUEVO

(Acín y cols., 2004)

Nor98


Haplotipos Sardi D’man Boujâad

ARR 31.83 25.85 30.23

ARH - - 3.49

ARQ 54.55 41.57 25.58

T112ARQ 2.27 1.68 -

R114ARQ - 2.80 -

AF141RQ 4.54 - 19.77

AR143RQ 4.54 7.87 17.44

AS146RQ - - 1.16

ARQD172 - 17.98 -

ARQK176 2.27 2.25 2.33

Total 22 89 43

10 haplotipos (2 nuevos) 27 genotipos diferentes


Frecuencias haplotípicas


Primer análisis del gen PRNP en poblaciones ovinas

africanas

Gran variabilidad genética

Susceptibilidad a scrapie clásico y atípico, a pesar de ausencia de casos de scrapie (= Australia y Nueva Zelanda)

Las mutaciones detectadas aparecen también en otras

razas mediterráneas, posiblemente debido a la influencia de

las migraciones desde el continente africano

Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS Y DISCUSIÓN


Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de


GEN PRNP CAPRINO

INTRODUCCIÓN

• 24 cambios aminoacídicos descritos en la región codificante (Acutis y cols., 2008)

• 6 codones asociados con susceptibilidad a scrapie:

I142M

H154R

W102G + 3 repeticiones

de octapéptidos

Período de incubación(Goldmann y cols., 1996; Billinis y cols., 2002; Vaccari y cols., 2006)

Resistencia (Billinis y cols., 2002; Papasavva-Stylianou y cols.,

2007;Vaccari y cols., 2006)

H143R

N146S y N146D

Q222K

• Mutación más frecuente: S240P (TCC CCC)

POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN POBLACIONES CAPRINAS

MARROQUÍES

Serrano et al. (en prensa) An Genet

CAPRINO MARROQUÍ: 137 animales

MATERIAL Y MÉTODOSPolimorfismos de PRNP en caprino marroquí

80 D’man 57 Chaouni

• Animales

• Identificación de polimorfismos: Secuenciación (= ESTUDIO 1)

• Análisis estadístico: GENEPOPARLEQUIN (estimación de frecuencias haplotípicas)

• Determinación y diferenciación de haplotipos: PCR alelo-específicaSecuenciación


Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADO

S

145

138 139

101

Análisis de electroferogramas (BioEdit)

3 NUEVAS MUTACIONES

AGC AGG (Arg Ser)

D’man

Codón 139

Codón 145

GGC GAC (Gly Asp)

Chaouni y D’man

CGG CAG (Gln Arg)

D’man

Codón 101

10 polimorfismos conocidos


Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS

• Nuevas mutaciones

Codón SecuenciaAminoácido

Chaouni D’man

101CAG Q 100 98.1CGG R 0 1.9

139AGG R 100 98.8AGC S 0 1.3

145GGC G 98.2 99.4GAC D 1.8 0.6

Total 57 80

Frecuencias alélicas

Frecuencias bajas (< 2 %)


Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS• Polimorfismos conocidos

Codón SecuenciaAminoácido

Chaouni D’man

37GGG G 93 100GTG V 7 0

127GGC G 98.2 100AGC S 1.8 0

137ATG M 95.6 97.5ATA I 4.4 2.5

142ATA I 99.1 99.4ATG M 0.9 0.6

154CGT R 74.6 77.5CAT H 25.4 22.5

222CAG Q 98.2 98.8AAG K 1.8 1.3

240TCC S 41.2 40CCC P 58.8 60

Total 57 80

Frecuencias alélicas

CIERTA RESISTENCIA

FRECUENCIAS INTERMEDIAS



• Mutaciones silentes:

Codón 181: GAC GAT (Asp) (1.8% en raza D’man)

Codón 42:

Codón 138:

CCA CCG (Pro)

AGC AGT (Ser)

LIGADOS AL DIMORFISMO S240P (TCC CCC)

(Goldmann y cols., 1996; Kurosaki y cols., 2005; Acutis y cols., 2006; Babar y cols, 2007)


CC CCAG

Codón 42 Codón 240Codón 138

CCA TCCCA/GG AGCAGG/C GG/AC CG/AT

Codón 101

Codón 139

Codón145

Codón 154

GGT(PrP) Rev

42 240138101 139 145 154

PCR alelo-específica

Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí

PP240 PS240 SS240

Secuenciación (cebador específico- S240)

139138

Heterocigotos



• Determinación de haplotipos PCR alelo-específicaS240

P240

Haplo 37 101 127 137 139 142 145 154 222 240 Chaouni D’man1 G Q G M R I G R Q S 15.8 26.22 G Q G M R I G R Q P 41.1 43.73 V Q G M R I G R Q S 7 04 G R G M R I G R Q P 0 1.95 G Q S M R I G R Q P 1.8 06 G Q G I R I G R Q P 4.4 2.57 G Q G M S I G R Q P 0 1.38 G Q G M R M G R Q P 0.9 0.69 G Q G M R I D R Q S 1.8 0.6

10 G Q G M R I G H Q S 14.9 1011 G Q G M R I G H Q P 10.5 11.912 G Q G M R I G R K S 1.8 1.3

Frecuencias haplotípicas17 Estimados

(ARLEQUIN)

10 Chaouni

13 D’man

12 haplotipos (3 nuevos)

28 genotipos diferentes

(4 no reales)Serrano et al. (en prensa) An Genet

Primer análisis de PRNP en poblaciones caprinas africanas

Gran variabilidad genética

Cierta resistencia a scrapie (H154)

Proximidad genética con razas caprinas mediterráneas deItalia y Grecia

Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí

RESULTADOS Y DISCUSIÓN


Genética de las EETs en bovino

Secuencia aminoacídica de la PrP bovina

de la ovina en 7 u 8 posiciones.

Polimorfismos: 22 mutaciones silentes

12 cambios aminoacídicos

Repeticiones de octapéptidos 5 copias (5/5).

6 copias (6/6). El más común

5 y 6 copias (5/6) (Heterocigoto).

Gen PrP bovino

Sin relación con la susceptibilidad a

BSE

Genética de las EETs en bovino Posible control genético:

Formas clásicas de BSE: cambios en la expresión de PrPC:

23 bp del en la región promotora elimina un sitio de unión de RP58

12 bp del en intrón 1 elimina el sitio SP1 de unión de FT.

Forma atípica: USA 2006:

E211K: análogo al humano E200K responsable de TSE hereditaria

¿Otros genes?

Posibles QTLs en BTA5, 10 y 20 (Hernández-Sánchez et al. 2002);

BTA17, X/YPS y posibles en BTA1, 6, 13 y 19 (Zhang et al., 2004).

Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnósticoDiagnóstico de de enfermedades:enfermedades:No HereditariasNo Hereditarias

LeishmaniosisLeishmaniosis

ENFERMEDADES ENDEMICAS

SALUDImpacto económico y social

Diagnóstico precoz

SALUDImpacto económico y social

Diagnóstico precoz

PROTOZOOS del género Leishmania Enfermedad que afecta al hombre y perro ZOONOSIS ENDEMICA EN ARAGON (OMS indicadora de SIDA)

Riesgo calidad de vida - SaludMorbilidad y mortalidad

LEISHMANIOSIS

Presencia de factores ecológicos:VECTORES

RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO

Presencia de factores ecológicos:VECTORES

RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO

TECNICAS CLASICASObservación microscópica en ganglio o médulaMétodos serológicos:IFI

NUEVAS TECNICASReacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Diagnóstico problemático

PCRSENSIBLE

ESPECIFICA

ECONOMICO

EFICAZ

Cebadores - Zona del genoma del parásito de varias copias

Kinetoplastos: Pequeños círculos de DNA con genes repetidos

SSUrRNA

18SrRNA

Zonas bien conocidas en más de 100 especies: Leishmania infantum, Trypañosoma brucei,

Trypanosoma cruzi, ...

Comparar-Zona candidataSecuencias hospedador: humano y perro Secuenias del vector: artrópodo Secuencias del Kinetoplasto: parásito

Diagnóstico directo del agente etiológico: Diferenciar portadores, enfermos y sanos

PCR

Ampliación del DNA

94ºC --- 5' 94ºC --- 1' 60ºC --- 1' 72ºC --- 1' 72ºC ---10' 4ºC --- hasta recoger muestra

Termociclador 9600 Perkin Elmer

35 ciclos

muestra 15l.

ACTIVIDADES REALIZADAS

Análisis de los fragmentos amplificados

Comprobación: Digestión con enzimas de restricción - RFLP Comparar modelos de Leishmania con bibliografía Evitar falsos positivos: - Análisis de un animal sano - Control negativo ( muestra sin DNA) - Control positivo (DNA de enfermo) - Control de DNA (en muestras de amplificación -)

Electroforesis horizontal gel agarosa 2% Tinción:Bromuro de Etidio - UVA

Fragmento de 603 bp

DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA

Amplificación del gen SSU rRNA repetido mas de 100 veces

Muestra: Médula ósea, Ganglio linfático y Sangre.

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Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería: enfermedades...

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