UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA

Facultad de Veterinaria

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

APORTACIONES AL ESTUDIO DE LA RESPUESTA

INMUNE EN HEMOCITOS DE MYTILUS

GALLOPROVINCIALIS LMK.

Memoria presentada por

Mª Asunción Cao Hermida

para optar al grado de Doctor en Biología

Lugo, abril de 2002

D. Juan Ignacio Ramos Martínez, Catedrático de Universidad y D.

Ramiro Barcia Vieitez, Profesor Titular de Universidad del Departamento de

Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela,

INFORMAN:

Que la presente memoria con título: " APORTACIONES AL ESTUDIO DE

LA RESPUESTA INMUNE EN HEMOCITOS DE MYTILUS

GALLOPROVINCIALIS LMK." elaborada por la licenciada en Biología Dña. Mª

Asunción Cao Hermida, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el laboratorio

de Bioquímica de la Facultad de Veterinaria de Lugo, y hallándose concluída,

autorizamos su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el tribunal

correspondiente para optar al grado de Doctor en Biología.

Lugo, abril de 2002.

Fdo: J. Ignacio Ramos Martínez Fdo: Ramiro Barcia Vieitez

Fdo: Mª Asunción Cao Hermida

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

FACULTAD DE VETERINARIA Universidad de Santiago de Compostela

A mis padres

AGRADECIMIENTOS

Deseo expresar mi gratitud a todas aquellas personas que con su ayuda y apoyo

han contribuído a la realización de este trabajo.

Al profesor Dr. Ramiro Barcia Vieitez porque me ha proporcionado más ayuda y

apoyo del que nadie puede esperar. Además de su ilimitada paciencia, de su buena

voluntad para dejarlo todo y leer cuando necesitaba su opinión, por su constante

dedicación y entrega.

Al profesor Dr. Juan I. Ramos Martínez, por ofrecerme la posibilidad de trabajar

con su grupo de investigación. Por ser una persona llena de ideas, entregada y siempre

dispuesta a ayudar.

Al resto de profesores del departamento por su ayuda y apoyo: Izaskun, José

Antonio, José Luis y Conchita.

A Lucía Medina por su inestimable ayuda.

Al Doctor Jaime Arbeteta, a Ángeles y a Pilar del Departamento de Hematología

del Hospital Xeral-Calde de Lugo, por su colaboración en los estudios de citometría de

flujo.

A los Drs. Antonio Villalba,. José Martínez y a las Dras Mª Jesús Carballal y Mª

Ángeles Freire por su tiempo, amabilidad y por sus sabios consejos.

Al Dr. Félix Camiña por su profesionalidad, apoyo y ánimo.

A todos los que trabajaron durante este tiempo en el Departamento de Bioquímica

de Lugo, por compartir experiencias e ilusiones.

A mis padres, por su constante dedicación, por su apoyo incondicional y por estar

siempre a mi lado.

A mi abuelo, por las largas charlas mantenidas durante este trabajo.

A mi familia, por su ayuda y comprensión.

A mis amigos, por su ayuda, apoyo y paciencia especialmente a Majo y a Bruno.

A Miguel, por compartir alegrías, inquietudes, ilusiones y una vida llena de

sorpresas. Algún día......se acerca.

ÍNDICE

ÍNDICE pág

1.-INTRODUCCIÓN 1

1.1.-Inmunidad natural y adquirida. 2

1.1.1.- La respuesta inmune. 4

1.1.2.- Relaciones entre la inmunidad innata y la adquirida: receptores

Toll. 6

1.1.2.1.- Características y funcionalidad del receptor Toll en Drosophila. 7

1.1.2.2.- Identificación de receptores Toll en mamíferos. 8

1.1.2.3.- Lipopolisacáridos (LPS) y receptores Toll. 9

1.2.- Células y tejidos del sistema inmune de invertebrados. 11

1.2.1.- Estructura y clasificación de las células sanguíneas/

coelomocitos. 11

1.2.2.- Células fijas. 14

1.2.3.- Defensas humorales. 15

1.3.- Sistema de reconocimiento no-clonal. Inmunidad innata. 20

1.3.1.- Mecanismos de reconocimiento inmune innato. 21

1.3.2.- Receptores del sistema inmune innato. 22

1.4.- Citoquinas en la respuesta inmune. 24

1.4.1.- Estructura del receptor de citoquinas y transducción de

señales 28

1.5.- Sistema IL-2/IL-2R. 32

1.5.1.- Mecanismos moleculares de transmisión de señales

mediadas por IL-2. 35

1.6.- Transmisión de señales mediadas por diferentes efectores. 38

1.6.1.- PKC. 38

1.6.2.- PKA. 40

1.6.3.- Lipopolisacáridos bacterianos (LPS). 42

1.6.4.- Corticotropinas. 47

1.6.5.- Factores de crecimiento. 50

1.7.- Células inmunitarias en el mejillón. 55

1.7.1.- La proteína quinasa C en mejillón. 57

1.7.2.- La proteína quinasa A en mejillón. 58

1.7.3.- La cadena ? del receptor de IL-2 en mejillón 59

1.8.- Presencia de moléculas similares a las citoquinas en hemocitos

de moluscos. 59

2.- OBJETIVOS 63

3.- MATERIAL Y MÉTODOS 65

3.1.- Material biológico. 65

3.2.- Reactivos 65

3.3.- Aparatos 66

3.4.- Procedimientos generales. 67

3.5.- Extracción de hemolinfa y obtención de hemocitos. 68

3.6.- Tinción de hemocitos de mejillón. 69

3.7.- Mantenimiento de hemocitos en cultivo. 69

3.8.- Citometría de flujo. 70

3.8.1.- Preparación de muestras de hemocitos. 70

3.8.2.- Análisis de las muestras por citometría de flujo (FACS). 71

3.9.- Western-blotting. 73

3.9.1.- Preparación del tampón de lisis celular. 73

3.9.2.- Tampón de extracción de proteínas de membranas. 74

3.9.3.- Preparaciones de lisados de hemocitos. 74

3.9.3.1.- Cromatografía de afinidad. 74

3.9.4.- Electroforesis para proteínas en geles de poliacrilamida-dodecil

sulfato sódico (SDS-PAGE). 75

3.9.5.- Inmunodetección. 78

3.10.- Detección de catecolaminas. 79

3.11.- Análisis estadístico. 82

4.- RESULTADOS 83

4.1.- Estudio de poblaciones celulares en hemolinfa de mejillón. 83

4.2.- Cultivo de hemocitos de M. galloprovincialis. 84

4.3.-Estudio del efecto de diversos efectores en hemocitos en

diferentes épocas del año. 87

4.3.1.- LPS. 87

4.3.2.- CRF. 93

4.3.3.- ACTH. 97

4.3.4.- ACTH 1-24. 101

4.3.5.-PDGF. 106

4.3.6.- TGF-? 1. 112

4.3.7.- EGF. 117

4.3.8.- IL-2. 120

5.- DISCUSIÓN 126

6.- CONCLUSIONES 143

7.- BIBLIOGRAFÍA 144

8.- ABREVIATURAS 170

INTRODUCCIÓN

1.-INTRODUCCIÓN

Las células y moléculas responsables de la inmunidad constituyen el sistema

inmunitario, y su respuesta colectiva y coordinada frente a la introducción de sustancias

extrañas es la respuesta inmunitaria. Ahora sabemos que muchos de los mecanismos de

resistencia a las infecciones están también implicados en la respuesta individual a

sustancias extrañas no infecciosas. Además, los mecanismos que normalmente protegen a

los individuos de las infecciones y eliminan a las sustancias más extrañas, son por sí

mismos capaces de lesionar los tejidos y producir enfermedad en algunas situaciones. Por

lo tanto, una definición más completa y moderna de inmunidad es la de una reacción frente

a sustancias extrañas, incluídos los microorganismos, y macromoléculas como las

proteínas y los polisacáridos, sin implicar a la consecuencia fisiológica o patológica de tal

reacción. La inmunología es el estudio de la inmunidad en este sentido amplio y de los

acontecimientos celulares y moleculares que se producen después de que un organismo se

encuentra con microorganismos u otras moléculas extrañas (Abbas, A.K. et al, 1995).

El sistema inmune en todos los animales comprende elementos celulares y

humorales que interaccionan para proteger al organismo de potenciales patógenos,

parásitos o células neoplásicas. El componente celular de la inmunidad en los

invertebrados está mediado por células sanguíneas (hemocitos) que participan en varios

mecanismos internos de defensa (Ratcliffe, N.A. et al., 1985; Smith,V.J.,1991).

Los invertebrados no poseen un mecanismo de defensa inducible, con el alto grado

de especificidad y memoria como el que presenta la respuesta inmune de los vertebrados

(Klein, J., 1989; Marchalonis, J.J. y Schluter, S.F., 1990), sin embargo son capaces de

reconocer y desarrollar reacciones citotóxicas contra células extrañas (Sminia, T. y Van der

Knaap, W.P.W., 1986; Cooper, E.L. et al., 1992; Renwrantz, L., 1990).

1.1.- INMUNIDAD NATURAL Y ADQUIRIDA.

Los individuos sanos se protegen a sí mismos contra los microorganismos por

medio de mecanismos muy diversos. Estos incluyen las barreras físicas, las células

fagocíticas y los eosinófilos de la sangre y de los tejidos, un tipo de linfocitos llamados

células agresoras naturales (NK), y varias moléculas transportadoras en sangre, los cuales

participan en la defensa del individuo frente a un ambiente potencialmente hostil. Todos

estos mecanismos de defensa están presentes antes de la exposición a microorganismos

infecciosos u otras moléculas extrañas, no aumentan por tales exposiciones y no

discriminan entre la mayor parte de las sustancias extrañas. Estos son los componentes de

la inmunidad natural (también llamada nativa o innata). Otros mecanismos de defensa

son inducidos o estimulados por la exposición a sustancias extrañas, son exquisitamente

específicos para distintas macromoléculas y aumentan en magnitud y capacidad defensiva

con cada exposición sucesiva a una macromolécula en particular. Estos mecanismos

constituyen la inmunidad adquirida o específica (Tabla 1). Las sustancias extrañas que

inducen una inmunidad específica se llaman antígenos (Abbas, A.K. et al ,1995).

NATURAL

ESPECÍFICA

BARRERAS FISICOQUÍMICAS MOLÉCULAS CIRCULANTES CÉLULAS

Piel, mucosas Complemento Fagocitos (macrófagos, neutrófilos) células agresoras naturales

Sistemas inmunitarios cutáneo y mucoso; anticuerpos en las secreciones mucosas Anticuerpos Linfocitos

MEDIADORES SOLUBLES ACTIVOS EN OTRAS CÉLULAS

Citoquinas derivadas de macrófagos, es decir, interferones ? y ? , factor de necrosis tumoral

Citoquinas derivadas de linfocitos, esto es, interferón ?

Actualmente, hay un resurgimiento del interés por la inmunidad natural, la cual se

considera que es innata y no adaptativa, en contraste con la respuesta inducida, adquirida, y

adaptativa, que caracteriza al sistema inmune específico (Hubbert, F. et al., 1997). La

inmunidad innata ha sido considerada como una entidad independiente, pero coincide en

parte, con una inmunidad adaptativa continua. Sin embargo se cree que la inmunidad

innata podría tener un papel suplementario en determinar qué antígenos responden al

sistema inmunitario adquirido y la naturaleza de la respuesta. La inmunidad de vertebrados

es un tipo especializado de inflamación generada contra agentes infecciosos, que se

desarrolla para combatir patógenos intracelulares que no pueden ser eliminados con

respuestas inmunes no específicas.

Tabla 1.- Características de la inmunidad natural y específica (adquirida) (tomado de Abbas, A.K. et al., 1995).

Hay al menos dos importantes razones para analizar el sistema inmune innato de

invertebrados; primera, podemos aprender más de la expansión y el desarrollo de la

evolución de la inmunidad de los invertebrados; segunda, porque los productos humorales

derivados de estos organismos son generalmente potentes agentes antibacterianos, que nos

permitirán un mejor entendimiento de los mecanismos de protección natural (Hubbert, F. et

al., 1997).

1.1.1.- LA RESPUESTA INMUNE

La inmunidad innata es filogenéticamente más antigua y ya está presente en

organismos multicelulares poco evolucionados, mientras que la adquirida se ha

desarrollado hace 400 millones de años y se encuentra en peces cartilaginosos y óseos,

anfibios, reptiles, pájaros y mamíferos (Thompson, C.B., 1995). La diferencia esencial

entre los dos sistemas es el medio por el cual reconocen microorganismos (Fearon, D.T. y

Locksley. R.M., 1996 ).

Los sistemas inmunes innatos utilizan proteínas codificadas en líneas de gérmenes

para identificar sustancias potencialmente nocivas. Estas proteínas son receptores de

superficie celular que generalmente reconocen estructuras carbohidratadas (Stahl, P.D.,

1995). Los macrófagos también tienen un receptor para lipopolisacáridos (LPS). Este

efector común en membranas externas de bacterias Gram-negativas indica la presencia de

infección y estimula la síntesis de productos químicos y citoquinas tales como

Interleuquina-1 (IL-1), IL-2, IL-12 y factor de necrosis tumoral (TNF) que inducen una

respuesta en fase aguda, un aumento de funciones antimicrobiales de macrófagos y otras

células y promueven el desarrollo y crecimiento de células T Cooperadoras (Ulevitch, R.J.

y Tobias, P.S., 1995).

La respuesta inmunitaria específica se inicia con el reconocimiento de los antígenos

extraños por linfocitos específicos, que proliferan y se diferencian a células efectoras

cuya función es eliminar el antígeno. La fase efectora de la inmunidad específica precisa la

participación de varios mecanismos de defensa, incluidos el sistema de complemento, los

fagocitos, las células inflamatorias y las citoquinas, que son operativas en la inmunidad

natural. La respuesta inmunitaria específica amplifica los mecanismos de la inmunidad

natural y potencia su función, sobre todo tras exposiciones repetidas al mismo antígeno

extraño. El sistema inmunitario posee varias características fundamentales, éstas son: la

especificidad, la diversidad, la memoria, la autoeliminación, y la capacidad para

discriminar entre lo propio y lo extraño (Abbas, A.K., et al., 1995).

Los principales constituyentes celulares del sistema inmunitario son los linfocitos,

los fagocitos mononucleares y las células accesorias relacionadas. Los linfocitos son las

únicas células inmunocompetentes capaces de reconocer de forma específica a los

antígenos. Son morfológicamente homogéneos aunque constan de diferentes subgrupos

que realizan diferentes funciones, y se les puede distinguir fenotípicamente. Los fagocitos

mononucleares son críticos para la defensa del huésped en ausencia de inmunidad

específica y se han convertido en participantes claves en las fases de reconocimiento,

activación y efectora de las respuestas inmunitarias específicas. Los linfocitos se originan

en la médula ósea, maduran en diferentes órganos generadores y se localizan en tejidos

linfoides periféricos anatómicamente definidos. La organización estructural de los tejidos

linfoideos optimiza el contacto íntimo y la interacciones entre las poblaciones celulares que

cooperan en la generación de las respuestas inmunitarias (Abbas, A. K. et al., 1995).

El sistema del complemento es el principal efector soluble de la inmunidad innata y

se activa cuando interacciona con partículas ricas en carbohidratos que carecen de ácido

siálico (Fearon, D.T. y Austen, K.F., 1980). De este modo la inmunidad innata ha dividido

las sustancias en inocuas y potencialmente nocivas dependiendo de su contenido en

carbohidratos. El reconocimiento de estos compuestos pudo haber evolucionado porque

estos constituyentes comunes de las paredes celulares microbiales tienen funciones, y

estructuras que son distintas de los carbohidratos de la superficie celular de eucariotas (Mc

Blane, J.F. et al., 1995).

Los receptores de los linfocitos B reconocen conformaciones de antígenos, que

pueden ser proteínas, carbohidratos, ó simplemente grupos químicos, mientras que la

mayoría de los receptores de los linfocitos T reconocen sólo péptidos, los cuales derivan de

antígenos proteicos que se unen a proteínas de la superficie celular denominados complejo

mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I (Engelhard, V.H., 1994 ) y clase II

(Cresswel, P., 1994).

1.1.2.- RELACIONES ENTRE LA INMUNIDAD INNATA Y LA

ADQUIRIDA: RECEPTORES TOLL

Los mecanismos de defensa inmune constan de dos tipos de respuestas: innata y

adaptativa. Los vertebrados poseen linfocitos B y T como un sistema inmunoadaptativo

contra la infección de microorganismos, que producen respectivamente inmunoglobulinas

y receptores de células T. La inmunidad innata juega un papel principal en la fase temprana

de los mecanismos de defensa y se encuentra presente tanto en vertebrados como en

invertebrados, además está mediada por macrófagos y células dendríticas (DCs), que

aunque carecen de receptores similares a los de las células B y T reconocen antígenos

microbiales.

Actualmente se ha demostrado que un conjunto de moléculas de superficie, al cual

pertenece la familia de receptores Toll (TRL), funcionan como modelo de receptores de

reconocimiento de antígenos (Kaisho, T. y Akira, S., 2000).

1.1.2.1.- Características y funcionalidad del receptor Toll en Drosophila

La proteína Toll fue originalmente identificada en Drosophila como una proteína

transmembrana tipo I que juega un papel crítico durante el desarrollo embrionario

(Hashimoto, C. et al., 1998, Belvin M.P. y Anderson, K.V., 1996). Posee dos dominios

intracelulares que contiene regiones repetitivas ricas en leucina (LRR) y otro dominio que

presenta cierta homología con la familia de receptores de IL-1 presentes en mamíferos (IL-

1R) (Gay, N.J. y Keith, F.J., 1991; O’Neill, L.A. y Greene, C., 1998 ). Toll se asocia con

una proteína adaptadora citoplasmática denominada Tube y como consecuencia se produce

la activación de Pelle, una serina-treonina-quinasa (figura 1). A continuación tiene lugar la

degradación de Cactus, seguido de la activación de un factor de transcripción denominado

Dorsal. Como se observa en la figura 1 existen similitudes funcionales y estructurales entre

los mecanismos de señalización mediados por los receptores Toll de Drosophila y los IL-

1R de mamíferos (O`Neil, L.A. y Greene, C., 1998). Los factores de señalización de

Drosophila - Tube, Pelle, Cactus y Dorsal - presentan cierta homología con los factores de

mamíferos My D88, IRAK (receptor de IL-1 asociado a kinasas), I-?B y el factor nuclear

NF-?B, respectivamente (Kaisho, T. y Akira, S., 2000).

1.1.2.2.- Identificación de receptores Toll en mamíferos

Inicialmente se consideró que IL-1R era homólogo al receptor Toll porque la región

citoplasmática del receptor de IL-1 es similar a la de Toll. No obstante, la región

extracelular de IL-1R tiene tres dominios similares a los que se encuentran en los

receptores para inmunoglobulinas pero carece de dominios LRR, sugiriendo que pueden

existir moléculas homólogas a Toll en mamíferos. Esto fue revelado por el grupo de

Janeway en 1997 (Medzhitov, R. et al.,1997). Este grupo de investigación fue el primero

en identificar esta homología con el receptor Toll en humanos, dicho receptor presenta

MyD88

Figura 1.- Similitud entre los caminos de señalización mediados por los receptores Toll de Drosophila y los IL-R de mamíferos (tomado de Kaisho, T. y Akira, S., 2000).

IRAK

I?B

NF-?B (p50/ReIA)

DROSOPHILA MAMÍFEROS

IL-1

IL-R

Pelle

Cactus

Dorsal

Toll

Tube

Spatzle

dominios LRR intracelulares homólogos. Posteriormente se encontraron cinco moléculas

más con estructuras similares (Rack, F.L. et al., 1998, Chandhary, P.M. et al., 1998;

Takenchi, O. et al., 1999) que se denominaron Toll de Drosophila.

El primer receptor Toll humano se denomina TRL4 y la sobre-expresión de este

receptor en líneas celulares permite la producción de citoquinas tales como IL-1, IL-6 e IL-

8 (Medzhitov, R. et al., 1997). Esto es crítico en el establecimiento de la respuesta inmune,

además la familia de receptores Toll en mamíferos puede estar implicada en mecanismos

de defensa, especialmente en la inmunidad innata, la cual puede potenciar

la inmunidad adaptativa (Kaisho, T. y Akira, S., 2000).

1.1.2.3.- Lipopolisacáridos (LPS) y receptores Toll

Los lipopolisacáridos (LPS) son componentes integrales de la membrana externa de

las bacterias gram-negativas. El LPS (figura 2) es un polisacárido hidrofílico que contiene

-

-

Kdo

Kdo P

P

Kdo

GlcN

GlcN

Unidad

POLISACÁRIDO

REGIÓN CENTRAL

FOSFOLÍPIDO

LÍPIDO A CADENA ESPECÍFICA

Hep

Hep

Hep P

P

NH3+

P-

-

-

Figura 2.- Estructura general del LPS de bacterias Gram-negativas. Abreviaturas de residuos de monosacáridos: GlcN, glucosamina; Kdo, ácido 2-keto-3-deoxioctulosónico; Hep, D-glicero-manno-heptosa (tomado de Alexander, C. y Rietschel, E., 2001).

una porción hidrofóbica (lípido A) altamente conservada.

Una vez que el sistema de complemento o los fagocitos llevan a cabo la lisis

bacteriana, el lípido A se pone al descubierto y da lugar a una gran variedad de respuestas

biológicas. Por ejemplo, los macrófagos producen citoquinas inflamatorias tales como:

factor de necrosis tumoral ? (TNF-? ), IL-1 e IL-6 y sustancias efectoras inflamatorias tales

como leucotrienos y óxido nítrico (Morrison, D. C. et al., 1979; Ulevitch, R.J. y Tobias,

P.S., 1995; Medzhitov, R. y Janeway, C.A., 1997a). Además el LPS puede aumentar la

expresión de antígenos de superficie tales como el complejo mayor de histocompatibilidad

(MHC) clase II, CD 80 y CD 86. Estas funciones son importantes para el establecimiento

de la inmunidad innata contra microorganismos. El LPS liberado al flujo sanguíneo es

capturado por la proteína LBP (proteína que se une al LPS). Luego el complejo LPS-LBP

interacciona con CD 14 en la superficie de macrófagos y monocitos. Aunque la unión de

CD 14 con LPS puede ocurrir en ausencia de LBP, en su presencia la unión se ve

facilitada, además a pesar de que las células endoteliales y fibroblastos carecen de CD 14,

pueden utilizar su forma soluble para aumentar la unión con LPS. Después de la

interacción del LPS, LBP y CD 14 se activa el camino de transducción de la señal, que

incluye el factor de transcripción NF-?B y la cascada de quinasas MAP (figura 3) (Haziot,

A. et al., 1996).

1.2.- CÉLULAS Y TEJIDOS DEL SISTEMA INMUNE DE

INVERTEBRADOS

1.2.1.- ESTRUCTURA Y CLASIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS

SANGUÍNEAS/COELOMOCITOS

Hay una gran variedad de tipos de células sanguíneas en circulación en los

invertebrados (Ratcliffe, N.A. y Rowley, A.F., 1979; 1981), estas células desarrollan varias

funciones, incluyendo transporte, almacenamiento, síntesis, reparación de heridas y

pigmentación, así como la defensa del organismo. De acuerdo con su papel biológico

CD14

MAPK

LPS

TLR4

MEMBRANA

MyD88

IRAK

MD-2 LBP

Figura 3.- Reconocimiento del LPS en la membrana de fagocitos y activación del camino de transducción de la señal (tomado de Aderem, A. y Ulevitch, R.J. 2000).

presentan las apropiadas especializaciones estructurales, bioquímicas y de

comportamiento. Los crustáceos presentan una relativamente simple célula sanguínea (o

más propiamente hemocito), lo cual facilita mucho el análisis de sus características

bioquímicas y funcionales (Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983).

Las células pueden ser separadas convenientemente por centrifugación en

gradientes de densidad realizados con Percoll (Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1933; Smith,

V.J. y Söderhäll, K. 1983; 1991). El análisis funcional y bioquímico de los hemocitos

aislados así, sugiere que hay fundamentalmente tres tipos de células en este grupo: las

células hialinas, las células semigranulares y las células granulares (figura 4) (Söderhäll, K.

y Smith, V.J., 1983; 1986a; Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983; 1991).

CÉLULAS HIALINAS: carecen de grandes gránulos distintivos y presentan una gran actividad fagocítica. TIPOS DE HEMOCITOS CÉLULAS SEMIGRANULARES contienen grandes gránulos intracelu- lares que pueden descargarse cuando la célula se expone a materiales reco- CÉLULAS GRANULARES nocidos como no propios. Figura 4.- Tipos de hemocitos

Las células hialinas (hialinocitos) carecen de grandes gránulos distintivos. “In

vitro” se anclan y se extienden rápidamente sobre la superficie del cristal, y además

presentan una gran actividad fagocítica (Bauchau, A.G., 1981; Smith, V.J. y Söderhäll, K.,

1983; Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1986b).

Las células semigranulares y granulares contienen grandes gránulos intracelulares

que pueden descargarse cuando la célula se expone a materiales reconocidos como no

propios (Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983; Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1986b). Las células

semigranulares contienen menos gránulos que las células granulares, y quizás como una

consecuencia de esto, se unen y se extienden sobre la superficie del cristal más

rápidamente (Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983).

Las células semigranulares (pero no las granulares) pueden presentar actividad

fagocitaria (Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983; Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1986b).

Una importante característica de las células granulares y semigranulares de

crustáceos es la presencia dentro de los gránulos de profenoloxidasa, la enzima responsable

de la síntesis de melanina (Söderhäll, K y Smith, V.J., 1983).

No está claro si los hemocitos en los crustáceos derivan de una única célula

progenitora común, y constituyen una serie de desarrollo en la que las células incrementan

su grado de granulación, a medida que van madurando. La amplia variedad en su número y

en el grado de granulación, comúnmente apreciada en las células semigranulares, ha sido

tomada a veces como soporte de esa hipótesis (Jhonston, M.A. et al., 1973; Bauchau, A.G.,

1981). No obstante, la confirmación “in vitro” de esta idea es difícil por la falta de técnicas

de mantenimiento en cultivo a largo plazo de las líneas celulares sanguíneas de crustáceos.

No se han detectado hemocitos en división celular en circulación, y la localización del

tejido hematopoyético es conocida en pocas especies (Bauchau, A.G., 1981; Ratcliffe,

N.A. et al., 1985). En los crustáceos la proporción de células hialinas, semigranulares y

granulares varía con el grupo taxonómico del organismo.

En los Brachyura (cangrejos auténticos) por ejemplo; los hialinocitos y las células

granulares tienden a predominar, mientras que en cangrejos de agua dulce, langostas y

otros miembros de los Macrura, los tipos celulares principales son generalmente las células

semigranulares y granulares (Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1983; Smith, V.J. y Söderhäll,

K., 1983; 1991).

No se conoce la razón por la que se producen esas diferencias en la distribución de

los hemocitos en los crustáceos, pero no parece influir en el tipo de reacciones de defensa

desarrolladas por estos animales. Es importante subrayar que a diferencia de los

vertebrados, los invertebrados no tienen linfocitos T y B especializados, y no expresan

inmunoglobulinas como parte de sus mecanismos de defensa. En cambio, la inmunidad en

invertebrados se basa en reacciones no específicas de la sangre o fluidos corporales, así

como en estrategias tales como fagocitosis, encapsulación y liberación de factores

antimicrobianos (Smith,V.J., 1991).

1.2.2.- CÉLULAS FIJAS

La mayoría de los invertebrados tienen una variedad de células fijas que pueden

desempeñar alguna función en el mecanismo de defensa humoral y/o celular. En esas

células se incluyen las células cloragógenas de los anélidos (Cooper, E.L. y Stein, E.A.,

1981), las células reticulares, podocitos, porocitos y células de la cubierta sinusal de los

gasterópodos (Buchholz, K. et al., 1971; Boer, H.H. y Sminia, T., 1976; Sminia, T., 1977),

nefrocitos de los crustáceos (Doughtie, D.G. y Rao, K.R., 1981; Ratcliffe, N.A. et al.,

1982), células pericárdicas de insectos (Crossley, A.C., 1972; Ratcliffe, N.A. et al., 1982)

y nefrocitos de los tunicados (Millar, R.H., 1953).

Los nefrocitos de crustáceos e insectos están implicados en el secuestro de material

particulado pequeño y soluble de la sangre (Crossley, A.C., 1972) lo cual es consistente

con el hecho de que esas células estén implicadas en el proceso de excreción (Ratcliffe,

N.A. et al., 1985). Los porocitos de los gasterópodos también se encargan de la producción

de hemocianina (Boer, N.H. y Sminia, T., 1976; Sminia, T., 1977).

1.2.3.- DEFENSAS HUMORALES

El suero de los invertebrados, aunque carece de inmunoglobulinas, tiene una serie

de factores que desarrollan actividades líticas, aglutinantes y antimicrobianas frente a

diferentes agentes biológicos. Esos factores pueden estar presentes de forma natural y/o

formarse después de una estimulación antigénica, pero generalmente no muestran las

propiedades anamnésicas de las inmunoglobulinas. Estas sustancias se pueden clasificar en

cuatro grandes grupos: lisinas, aglutininas, sustancias similares a linfoquinas y factores

antimicrobianos; aunque realmente un factor químico determinado puede desarrollar varias

funciones.

HEMOLISINAS

En los vertebrados, la lisis de los parásitos microscópicos y macroscópicos es

llevada a cabo inicialmente por los componentes del sistema del complemento. Hasta hace

unos años, este sistema se había considerado ausente en la mayoría de los invertebrados,

pero trabajos de Bertheussen, K. (1983) demostraron la existencia de un sistema similar al

complemento, termolábil y calciodependiente en el sistema circulatorio del erizo de mar

Strongylocentrotus droebachiensis. Desgraciadamente, se conoce muy poco sobre la

naturaleza molecular de este sistema en invertebrados.

Las investigaciones sobre el sistema lítico de invertebrados se han concentrado

pricipalmente en su capacidad de lisar eritrocitos de vertebrados in vitro. Las hemolisinas

se han encontrado en muchos invertebrados, entre los que se incluyen moluscos (Anderson,

R.S., 1981; Wittke, M. y Renwrantz, L., 1984), anélidos (Roch, P., 1979; Parrinello, N. y

Rindone, D., 1981; Roch, P. et al., 1981; Dales, R.P., 1982), sipuncúlidos (Weinheimer,

P.F. et al., 1970), crustáceos (Cenini, P., 1983) y equinodermos (Parrinello, N. et al.,

1979). En general, las hemolisinas de los invertebrados son proteínas termolábiles, que se

inactivan a 56?C, son sensibles a las enzimas proteolíticas, pueden ser inhibidas por

agentes quelantes como el EDTA y requieren cationes divalentes (principalmente calcio)

para desarrollar su actividad óptima.

Varios artículos referidos a diferentes invertebrados muestran que tales factores son

inducibles, pero la especificidad y longevidad de sus reacciones son extremadamente

limitadas (Anderson, R.S., 1981).

Chateaureynaud-Duprat, P. e Izoard, F. (1977) han sugerido que en la lombriz

Eisenia foetida, los factores hemolíticos son sintetizados y liberados por las células

cloragógenas, mientras que en Mytilus edulis tales factores son producidos por los

hemocitos (Wittke, M. y Renwrantz, L., 1984). En relación con esta actividad lítica, se han

detectado en invertebrados componentes del sistema de complemento. Este sistema es un

grupo de proteínas solubles que se asocian a componentes de la superficie celular. Hay tres

caminos para la activación del complemento: el camino clásico, el camino alternativo y el

camino de las lectinas. Estos dos últimos caminos no están implicados en la unión de los

componentes del complemento al complejo antígeno-anticuerpo y son los que

posiblemente se encuentran en invertebrados (Du Pasquier, L., 2001).

AGLUTININAS

Muchos invertebrados poseen sustancias humorales capaces de aglutinar partículas

extrañas como pueden ser bacterias (Bretting, H. et al., 1978, Rostan-Abadi, H. y Pistole,

G.H., 1979, 1982; Pistole, T.G., 1982), protozoos (Pereira, M.E. et al., 1981; Ingram, G.A.

et al., 1983), eritrocitos y leucocitos de vertebrados, esperma (Ratcliffe, N.A. et al., 1985),

linfocitos (Cohen, E., 1980) y metazoos parásitos (Stein, P.C. y Basch, P.F., 1979; Lackie,

A.M., 1981).

Las aglutininas no se encuentran únicamente en invertebrados, por ejemplo, las hay

también en plantas y en el suero de los vertebrados (Harisdangkul, V. et al., 1972; Gold,

E.R. y Balding, P., 1975), donde operan juntamente con las inmunoglobulinas. Parece por

tanto razonable concluir que tales sustancias han podido evolucionar y pueden cumplir

muchas funciones diferentes, algunas de las cuales presumiblemente no son

inmunológicas.

SUSTANCIAS SIMILARES A LINFOQUINAS

Las linfoquinas fueron definidas por Dumonde, D.C. et al., (1982) como no-

anticuerpos proteicos generados por la activación de los linfocitos, que actúan como

mediadores intercelulares de la respuesta inmunológica. Esta definición orientada

únicamente hacia los vertebrados, podría dar razones a los puristas para negar la

posibilidad de que sustancias similares se encuentren en los invertebrados, donde no se ha

demostrado aún concluyentemente la existencia de linfocitos. Diferentes grupos de

investigación han comentado la presencia de factores similares a las linfoquinas en

invertebrados (Mohring, W. y Schittek, D., 1979; Leclerc, M. et al., 1981) y en este

contexto el término es utilizado para nombrar a factores que median procesos inmunes.

Uno de los más completos y convincentes estudios fue llevado a cabo por Robert

Prendergast y su grupo, trabajando con la estrella de mar Asterias forbesi (Prendergast,

R.A. y Suzuki, M., 1970; Willenborg, D.O. y Prendergast, R.A., 1974; Prendergast, R.A. et

al., 1974; 1983), ellos demostraron primero la existencia de una sustancia proteica aislada

a partir de coelomocitos de A. forbesi, a la que nombraron como factor de la estrella de mar

(Sea Star Factor, SSF), la cual, exhibió muchas propiedades características de las

linfoquinas de vertebrados, como por ejemplo la inhibición de la migración y la activación

de los macrófagos.

En estudios posteriores, el SSF fue aislado y caracterizado parcialmente; se vió que

era una proteína básica de 39.000 daltons, constituida por un par de cadenas (pesada y

ligera). Más tarde, Prendergast, R.A. et al., (1983) mostraron que tanto el SSF como las

linfoquinas liberadas por las células T actúan de forma similar cuando se aplican a la

estrella de mar, provocando un incremento en la adherencia y en la agregación de los

coelomocitos; sin embargo queda pendiente una cuestión, y ésta es la siguiente ¿cómo

actúa el SSF en equinodermos? y ¿verdaderamente es homólogo en estructura y función a

las linfoquinas de vertebrados?.

FACTORES ANTIMICROBIANOS

Varias conclusiones pueden ser extraídas del trabajo realizado hasta el momento

sobre estos factores:

1.- Pueden matar/lisar bacterias (bactericidas/bacteriolíticos) o pueden actuar como

desinfectantes generales inhibiendo el crecimiento de las bacterias (bacteriostáticos).

2.- Las bacterias patógenas tienen tendencia a ser resistentes a los factores

antimicrobianos producidos por sus huéspedes normales.

3.- Investigaciones realizadas sobre los factores antimicrobianos encontrados en los

invertebrados marinos, han mostrado que cuando se incuban bacterias tanto de origen

terrestre como de origen marino con estos factores, las bacterias terrestres muestran

normalmente una mayor resistencia (Johnson, P.T. y Chapman, F.A., 1970). Además, la

mayoría de las bacterias marinas son Gram-negativas y los factores antimicrobianos de los

invertebrados marinos presentan muy baja o ninguna actividad frente a las formas Gram-

positivas.

4.- Aunque los factores antimicrobianos son producidos probablemente por los

hemocitos/coelomocitos, puede haber implicados otros tipos celulares. Por ejemplo en la

langosta Homarus americanus, el hepatopáncreas produce un potente factor

antimicrobiano (Mori, K. y Stewart, J.E., 1978).

5.- No todo el mundo está de acuerdo con la “relativa” efectividad de los

mecanismos humorales frente a los celulares en la eliminación de bacterias y otros

microorganismos de la circulación.

6.- Hay una falta general de información sobre muchos aspectos de los factores

antibacterianos. Por ejemplo, ¿cuáles son los mecanismos mediante los que esos agentes

matan?, y también ¿cómo varía su estructura química dentro de los invertebrados?.

Entre estos factores antimicrobianos cabría señalar las didemninas encontradas en

los tunicados (Rinehart, K. et al., 1981), compuestos que inhiben el crecimiento de ARN y

ADN virus. También se ha encontrado un factor antitripanosomal en la hemolinfa de

Glossina spp (Croft, S.L. et al., 1982; East, J.S. et al., 1983; Ratcliffe, N.A. et al., 1985).

1.3.- SISTEMA DE RECONOCIMIENTO NO-CLONAL.

INMUNIDAD INNATA

El sistema inmune ha evolucionado por la presión selectiva impuesta por los

microorganismos infecciosos; como resultado de ello, todos los organismos multicelulares

han desarrollado varios mecanismos de defensa que tienen la capacidad de ser disparados

por la infección y que protegen al organismo destruyendo los microbios invasores y

neutralizando sus factores de virulencia. Ese filogenéticamente antiguo mecanismo de

defensa, también conocido como sistema inmune innato, utiliza receptores codificados

frente a líneas de gérmenes para el reconocimiento de microbios patógenos. Este hecho,

diferencia el sistema inmune innato del otro componente de la inmunidad, el sistema

inmune adaptado, presente sólo en vertebrados.

La inmunidad adaptada se basa en la presencia de receptores generados por

mecanismos somáticos, durante la ontogenia de cada organismo individual. Estos

mecanismos generan un repertorio diverso de receptores antigénicos con especificidades

aleatorias, los cuales se encuentran distribuidos clonalmente sobre dos tipos de linfocitos:

células T y células B. Consecuentemente, la especificidad de los receptores expresados

sobre cada linfocito no está predeterminada, y tampoco esta respuesta puede ser inducida

en linfocitos antes de la unión del antígeno a sus receptores. Sin embargo, la inducción de

una respuesta inmune es sólo apropiada si el antígeno reconocido se deriva o pertenece a

un organismo patógeno. La activación de linfocitos específicos por autoantígenos, o por

inocuos antígenos ambientales persistentes, puede provocar la aparición de problemas

autoinmunitarios y de reacciones de hipersensibilidad respectivamente. Además, la

protección frente a diferentes grupos de patógenos puede requerir la inducción de bastantes

tipos de respuestas diferentes. Por otra parte, la activación de efectores inadecuados que no

proporcionan protección contra los agentes patógenos, a menudo conduce al desarrollo de

inmunopatologías.

Por lo tanto, la respuesta inmune adaptada requiere señales que proporcionen

información sobre el origen del antígeno y el tipo de respuesta que debe ser inducida.

Evidencias acumuladas en estos años, sugieren que esas señales son proporcionadas por el

sistema inmune innato (Janeway, C.A., 1989, Fearon, D.T. y Locksley, R.M., 1996;

Medzhitov, R. y Janeway, C.A., 1997b).

1.3.1.-MECANISMOS DEL RECONOCIMIENTO INMUNE INNATO

Las estructuras moleculares que son esenciales para la supervivencia de los

microbios, no están sujetas a variabilidad pues las mutaciones que afectan a esas

estructuras son letales para los microbios. La conservación de esas estructuras moleculares

implica que sean producidas por grandes grupos de patógenos. Por ejemplo, la estructura

general del lipopolisacárido (LPS) está presente en todas las bacterias Gram-negativas.

Este ejemplo ilustra otro hecho del reconocimiento inmune innato, los blancos de

reconocimiento están representados por patrones moleculares llamados PAMPs (por

Pathogen-Associated Molecular Patterns) más que por estructuras particulares (Janeway,

C.A., 1989).

Los organismos hospedadores han desarrollado un grupo de receptores que pueden

especificamente reconocer PAMPs, a los que se conoce por PRRs (de Pattern Recognition

Receptors). Esta estrategia evolutiva del huésped, previene la generación de microbios

mutantes que puedan escapar, y al mismo tiempo permite, con un número limitado de

receptores codificados, reconocer una gran variedad de estructuras moleculares asociadas

con patógenos (Medzhitov, R.M. y Janeway, C.A., 1997b).

Otro factor que puede haber jugado un importante papel durante la evolución del

reconocimiento inmune innato, está relacionado con el efecto del reconocimiento, esto es,

la destrucción del blanco.

Posiblemente las estructuras seleccionadas para el reconocimiento inmune deberían

ser muy diferentes de los auto-antígenos, para evitar el daño de las células y tejidos

propios. La consecuencia de este requisito es la capacidad del sistema inmune innato para

discriminar entre lo propio y lo extraño (Janeway, C.A., 1992). Realmente, todos los

productos microbianos conocidos que dan lugar a una actividad inmunoestimuladora,

presentan estructuras invariables formadas por grupos amplios de microorganismos, y son

absolutamente esenciales para la supervivencia de los microbios; así: los ácidos teicoicos y

LPS son componentes comunes de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas

respectivamente; una doble cadena de RNA es una señal estructural de varios grupos de

RNA-virus, y los mananos son componentes conservados de las paredes celulares de las

levaduras. Ninguno de esos compuestos son producidos por el organismo huésped, y todos

ellos son esenciales para la fisiología y supervivencia de los microbios que los poseen

(Janeway, C.A., 1989).

1.3.2.-RECEPTORES DEL SISTEMA INMUNE INNATO

El reconocimiento inmune innato está mediado por un estructuralmente diverso

grupo de receptores que pertenecen a varias familias proteicas diferentes. Algunos

receptores (PRRs) reconocen directamente PAMPs, mientras otros (receptores del

complemento) reconocen los productos (CD14, colectinas) generados por el

reconocimiento de PAMP (figura 5).

INFECIÓN

PAMP

PRR

Insectos

Mamíferos

NF

?B

?

NF

? ? ?

Péptidos antimicrobianos Péptidos antimicrobianos,

B7, IL-1, IL-6, IL-8

TollToll

Figura 5.- Ruta general de defensa del sistema inmune (tomado de Medzhitov, R.M. y Janeway, C.A. 1997b).

Funcionalmente, los PRRs pueden ser clasificados en tres tipos: proteínas

humorales circulantes en el plasma, receptores endocíticos expresados sobre la superficie

celular, y receptores señalizantes que pueden ser expresados tanto sobre la superficie

celular como intracelularmente (Fearon, D.T. y Locksley, R.M., 1996; Medzhitov, R.M. y

Janeway, C.A., 1997b).

Los PRRs celulares son expresados sobre las células efectoras del sistema inmune

innato, en células del sistema inmune adaptado, y también en las células que se van a

encontrar en primer lugar con los patógenos durante la infección, como las células

epiteliales superficiales.

Este tipo de expresión permite que estos receptores induzcan directamente los

mecanismos efectores innatos, y también alerten al organismo huésped sobre la presencia

de agentes infecciosos, induciendo la expresión de un grupo de señales endógenas tales

como citoquinas inflamatorias y quimoquinas. Esta última función permite una

movilización eficiente de los efectores para combatir a los invasores microscópicos. Con el

desarrollo de la inmunidad adaptada, las señales inducidas por receptores no clonales

adquirieron nuevas funciones como por ejemplo, el control de la activación y

diferenciación de linfocitos producidos clonalmente con receptores de antígenos

específicos (Medzhitov, R.M. y Janeway, C.A., 1997b).

1.4.- CITOQUINAS EN LA RESPUESTA INMUNE

Las respuestas inmunes son el resultado de una compleja interacción entre una gran

variedad de células. Además hay una continua interacción entre los sistemas inmune,

nervioso y endocrino.

Moléculas como las hormonas, neuropéptidos y citoquinas están implicadas en la

transmisión de señales. Estás últimas se han clasificado según su origen o función. Hoy en

día, el término general de "citoquina" se usa para todas estas moléculas señal y sus

principales características son las siguientes: (1) son producidas por células del sistema

inmune, tales como linfocitos y monocitos, pero también por células del sistema

neuroendocrino (Nisticò, G., 1993; Schöbitz, B. et al., 1994), (2) son glucoproteínas de

pequeño peso molecular (10-20 kDa) y la mayoría son sintetizadas de novo por células

activadas durante la fase eferente de la respuesta inmune, (3) el principal papel de las

citoquinas es funcionar como mediadores y moduladores de la respuesta inmune y la

inflamación; recientemente se ha visto que las citoquinas juegan un importante papel como

moléculas señal en el sistema neuroendocrino (Nisticò, G., 1993; Blalock, J.E., 1994;

Schöbitz, B. et al., 1994), (4) desde el punto de vista funcional, las citoquinas se

caracterizan por ser pleiotrópicas y redundantes - la misma citoquina puede tener diferentes

blancos celulares y diferentes citoquinas pueden realizar una misma función; (5) actúan

sobre blancos celulares por mecanismos autocrinos, paracrinos y endocrinos; las citoquinas

se unen a receptores específicos de la membrana plasmática, los cuales muestran un cierto

grado de promiscuidad (Kishimoto, T. et al., 1994; Paul, W.E. y Seder, R.A., 1994;

Ottaviani, E. et al., 1994a,1995a), (6) en varios tipos celulares, las citoquinas actúan como

factores de crecimiento regulando la proliferación e inhibición de la apoptosis (Manfredini,

R. et al., 1993; Kroener, G., 1995).

Las citoquinas están presentes en prácticamente todos los organismos y

tejidos del cuerpo, incluyendo además del sistema nervioso, la piel, los intestinos, etc. De

este modo, las citoquinas parecen ser más moleculas señal que mediadores inmunes y

juegan un papel principal en fenómenos fisiológicos y patológicos, tales como reabsorción

de médula, producción de proteínas en fase aguda e inflamación. No obstante, las

citoquinas son los principales actores del sistema inmune e intervienen y modulan los

principales fenómenos inmunes, incluyendo proliferación y diferenciación de linfocitos y

otras células inmunes, muerte celular y apoptosis, citotoxicidad etc. (Brozek, C.M. y Ley,

R.D., 1991).

Por otra parte, se ha detectado la presencia de moléculas similares a citoquinas en

invertebrados tales como moluscos, insectos, anélidos, equinodermos y tunicados. Al igual

que en vertebrados estas moléculas están presentes en diferentes tejidos y órganos.

Moléculas similares a IL-1? , IL-1? , IL-2, IL-6 y TNF-? se han encontrado en hemocitos y

en la hemolinfa (Hughes, T.K. et al., 1990, 1991a, 1992; Stefano, G.B. et al., 1991;

Ottaviani, E. et al., 1993a; Granath, W.O. et al., 1994; Ouwe-Missi-Oukem-Boyer, O. et

al., 1994).

El sistema hematopoyético debe responder ante situaciones tales como una

infección o una pérdida de sangre; esta respuesta se lleva a cabo mediante la elaboración

de factores humorales que promueven una rápida expansión y maduración de grupos

específicos de células hematopoyéticas en los sitios afectados.

Las principales fuentes de factores humorales que desencadenan esta

hematopoyesis inducida son las células T activadas y los macrófagos (Miyajima, A. et al.,

1988). Mastocitos, células endoteliales y probablemente células B producen esos mismos y

otros grupos diferentes de factores. Esos factores son glucoproteínas tales como IL-1, IL-2,

IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, GM-CSF, G-CSF, IFN-?, TNF-? y linfotoxina,

que intervienen en diferentes respuestas inmunes e inflamatorias (tabla 2).

Interleuquinas CSFS y otros Interferones IL-1? GM-CSF INF-? IL-1? G-CSF INF-? IL-2 M-CSF IFN-? IL-3 EPO IL-4 TNF-? GF IL-5 TNF-? (LT) IL-6 LIF EGF IL-7 Steel Factor TGF-? IL-9 (p40 TCGF) aFGF IL-10 (CSIF) Familia TGF-? bFGF IL-11 KGF TGF-?1 PDGF-A Factores quimiotácticos TGF-?2 PDGF-B TGF-?3 NGF-? Inhibina IGF-I IL-8 (NAP-1) Actibina IGF-II MCP I Tabla 2.- Citoquinas (tomado de Miyahima, A. et al., 1992).

Asimismo, factores producidos por células estromales tales como M-CSF, IL-7,

LIF e IL-11 también participan en esas respuestas.

Junto con el IFN-? , IFN-? , TGF-? y TGF-? esas moléculas se denominan

colectivamente citoquinas. Entre ellas, las interleuquinas son citoquinas que transmiten

señales entre linfocitos. Por tanto, las citoquinas están implicadas en la respuesta a las

infecciones virales (como los interferones), a la inflamación y la inmunidad (como las

monoquinas y linfoquinas) y en la hematopoyesis (como los factores estimulantes de

colonias (CSFs)) (Arai, K. et al., 1990).

Las citoquinas producidas por los macrófagos y las células endoteliales pueden ser

importantes en el establecimiento de la inmunidad innata, respuesta inmune definida como

un sistema antimicrobiano no específico para autolimitar la respuesta inflamatoria. Por otra

parte, las linfoquinas producidas por células T activadas (y probablemente también por

células B) son los componentes responsables de la inmunidad adquirida. A diferencia de

las inmunoglobulinas, las citoquinas no presentan la capacidad de reconocer a un antígeno

específico (Miyajima, A. et al., 1992).

1.4.1.-ESTRUCTURA DEL RECEPTOR DE CITOQUINAS Y

TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES

En general, un receptor funcional se puede dividir en varios componentes: una

unidad de unión, un transductor, un efector y una unidad reguladora.

Un receptor hormonal complejo se compone de un receptor de hormonas (con 7

segmentos transmembranales), una proteína G heterotrimérica (subunidades ? , ? , ?) como

transductor, y un efector que genera señales intracelulares (Benovic, J.L. et al., 1988).

En otros casos, como los receptores de factores de crecimiento como EGF, PDGF y

FGF, los receptores están constituidos por una cadena polipeptídica sencilla con motivos

estructurales comunes; con un gran dominio extracelular de unión del ligando, un dominio

sencillo situado dentro de la membrana, y un gran dominio citosólico con actividad quinasa

(figura 6) (Ullrich, A. y Schelessinger, J., 1990).

¿Cuál es la estructura de los receptores de citoquinas y, cómo transducen sus

señales?

Figura 6.- Estructura de los receptores de citoquinas. A) Receptores de citoquinas

heteromultiméricos que requieren por los menos dos subunidades distintas para formar un receptor de alta

afinidad. B) Receptores de citoquinas que tienen una alta afinidad por el ligando, bien por sí mismos o

formando homodímeros (tomado de Miyahima, A. et al., 1992).

Es importante señalar que una misma citoquina puede actuar tanto como señal

positiva como negativa, dependiendo del tipo y del estado de desarrollo de la célula blanco

(Arai, K. et al., 1990). Igualmente, diferentes citoquinas mediante diferentes receptores

dan lugar a aparentemente idénticas respuestas biológicas.

Una estructura constituida por multisubunidades es un hecho común a varios

receptores de citoquinas, como los receptores de IL-2, IL-3, IL-5, IL-6 y GM-CSF

(Hatakeyama, M. et al., 1989a; Kitamura, T. et al., 1991; Takaki, S. et al., 1991; Hibi, M.

et al., 1990; Hayashida, K. et al., 1990; Devos, R. et al., 1991). Todos esos receptores de

alta afinidad están constituidos por al menos dos componentes distintos, ? y ? . Las

subunidades ? son proteínas de unión de citoquina, y las subunidades ? por sí mismas no

unen o unen citoquinas muy débilmente.

Tanto los receptores de alta afinidad como de baja afinidad cuando se expresan en

fibroblastos, son incapaces de transducir señales de proliferación (Hatakeyama, M. et al.,

1989b; Hayashida, K. et al., 1990), por lo tanto son necesarios componentes adicionales,

presentes en las células hematopoyéticas, para promover el crecimiento celular. Existen

varios esquemas posibles para explicar el comportamiento de los receptores funcionales y

de alta afinidad: a) la proteína que une citoquinas con baja afinidad, interacciona

extracelularmente con una segunda molécula que genera una señal intracelular. b) uno de

los componentes de los receptores heteromultiméricos (probablemente la subunidad ? )

genera señales intracelulares funcionando como transductor y/o efector. c) el mismo

receptor heteromultimérico interacciona con un tercer componente, como por ejemplo una

tirosina quinasa, para generar señales intracelulares (Miyajima, A. et al., 1992).

La interacción de las citoquinas con su receptor específico en la superficie celular

desencadena la activación de caminos de señalización intracelulares que desencadenan

respuestas celulares.

Las quinasas Janus (JAKs) son mediadores centrales en la transducción de la señal

y fosforilan residuos de tirosina dentro de dominios intracelulares del receptor, creando

lugares cercanos para el reclutamiento de componentes adicionales en la señalización,

incluyendo el dominio SH2 que contiene transductores de señales y activadores de factores

de transcripción (STAT). Un gran número de citoquinas, factores de crecimiento y

hormonas activan el camino JAK/STAT. Este camino puede ser regulado por múltiples

mecanismos, hay tres principales reguladores negativos en la señalización a través de

JAK/STAT; SHP-1, una tirosina fosfatasa, la cual actúa provocando una regulación por

degradación proteolítica de la actividad JAK seguida de una autoactivación; proteínas

inhibidoras de STATs activadas (PIAS), las cuales se unen a STATs activadas e inhiben su

actividad transcripcional; y las proteínas supresoras de la señalización de citoquinas

(SOCS), las cuales son blancos transcripcionales en las STATs y funcionan en un feedback

negativo para atenuar la señalización a través de JAK/STAT (figura 7) (Kile, B.T. et al.,

2000).

La activación de las quinasas JAK tiene lugar mediante la fosforilación de residuos

de tirosina en los receptores a los que se asocian. Estas fosfotirosinas pueden servir como

lugares de anclaje para moléculas de señalización incluídas las proteínas STAT

(Greenlund, A.C. et al., 1995). Después de la dimerización del receptor y de la activación

Figura 7.- Reguladores negativos en el camino de señalización a través de JAK/STAT. Las líneas en forma de T representan inhibición y las flechas representan activación (tomado de Kile, B.T. et al., 2000).

P

P

Stat

SOCS-3

CIS

Stat

Stat

JAK JAK

PStat

SHP-1

PIAS

SOCS-1

Transcripción de genes

de las JAKs, los factores de transcripción STAT son reclutados, activados y translocados al

núcleo donde estimulan la transcripción de genes que afectan a la respuesta biológica

(Darnell, J.E. et al., 1994; Darnell, J.E., 1997; Horvath, C.M. et al., 1997).

1.5.- SISTEMA IL-2/IL-2R

La interleuquina 2 (IL-2) desempeña un papel fundamental en la proliferación de

las células T al unirse a un receptor específico que se expresa en la superficie celular

(Smith, K.A., 1988). Además la IL-2 modula las funciones inmunológicas de células T, B

y NK (Waldmann, T.A., 1989) con lo que podemos concluir que desempeña un papel

fundamental en la fisiología del sistema inmune.

La IL-2 es producida por una subpoblación de células T conocida como células

TH1. Esta glucoproteína, de 133 aminoácidos, presenta una gran heterogeneidad con

respecto al peso y la carga debido a los distintos grados de glucosilación y sialización

(Taniguchi, T. et al., 1983; Robb, R.J. y Smith, K.A., 1981).

Para ejercer su efecto biológico, la IL-2 interacciona con su receptor específico en

la superficie celular. Este receptor está formado por tres subunidades denominadas en

función de su peso molecular: p55 (subunidad ? ), p70 (subunidad ? ) y p64 (subunidad ?),

que al combinarse forman el receptor de baja afinidad (p55, Kd 10-8M), afinidad media

(p70/p64, Kd 10-9M) y alta afinidad (p55/p70/p64, Kd 10-11M) (figura 8) (Leonard, W.J. et

al., 1984; Nikaido, T. et al., 1984; Hatakeyama, M. et al., 1989a).

Figura 8.- Representación esquemática del receptor de IL-2

(tomado de Taniguchi, T. y Minami, Y. 1993)

La caracterización y la clonación de la subunidad p55 del receptor de IL-2 se hizo

gracias a la disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos (Leonard, W.J. et al.,

1984; Nikaido, T. et al.,1984; Uchiyama, T. y Border, S., 1981). Originariamente esta

subunidad se describió con un peso molecular de 33 kD, pero por modificaciones

postranscripcionales, entre las que se encuentran N y O-glucosilaciones, su peso molecular

pasa a ser de 55 kD.

La subunidad p55 puede ser detectada también como forma soluble en el medio de

cultivo de linfocitos que expresan el receptor de alta afinidad (Rubin, L.A. et al., 1985); o

en el suero tras la activación de células T “in vivo” (Osawa, H. et al., 1986). Esta

subunidad soluble es una forma truncada de la proteína que se expresa en la membrana y

tiene capacidad de unir IL-2 (Baran, D. et al., 1988) con la misma afinidad que la forma

? IL-2R

jun

)

?

??

gen c- myc

gen c- fos / c-

src -familia PTK (p56lck, p59fyn .)

(p21 ras IL-2R

IL-2R

IL-2

anclada a la membrana (Kd 10-8M). La liberación de p55 soluble es un fenómeno asociado

a la activación celular y parece que desempeña un papel importante en la regulación de la

respuesta inmune. La presencia de niveles elevados de p55 soluble en suero puede ser

utilizada como un indicador de una posible enfermedad o anomalía, ya que se ha

comprobado que individuos con determinadas enfermedades autoinmunes y neoplasias

presentan niveles anormales en la expresión del receptor de IL-2 (Ishida, H. et al., 1987;

Tsudo, M. et al., 1987).

Los conocimientos que se tienen sobre la subunidad p70 son más recientes

(Hatakeyama, M. et al., 1989b; Tsudo, M. et al., 1989). La región extracelular de esta

proteína tiene 214 aminoácidos, tamaño comparable con el de la subunidad p55 (219

aminoácidos). Ambas subunidades reconocen epitopos distintos en la molécula de IL-2

(Rebollo, A. et al., 1992). La región citoplasmática tiene 286 aminoácidos, y no contiene

secuencias con actividad tirosina-quinasa.

La transfección de esta subunidad en células que no responden a la IL-2 y expresan

la subunidad p64 permite la recuperación de la capacidad de proliferación en respuesta a la

IL-2 (Doi, T. et al., 1989). Estos resultados sugieren que la subunidad p70 y

probablemente la subunidad p64, son las subunidades implicadas en la transmisión de

señales mediadas por IL-2.

Las subunidades p55 y p70 no están unidas covalentemente. No está claro si el

receptor de alta afinidad existe como un heterodímero en ausencia de IL-2 (Saragovi, H. y

Malek, T.R., 1988) y si existe una interacción funcional entre ambas subunidades.

La subunidad p64 del receptor de IL-2 tiene 347 aminoácidos y un peso molecular

estimado de 40 kD. La región extracitoplasmática (254 aminoácidos) incluye seis sitios

posibles de glucosilación y la secuencia consenso que la incluye dentro de la familia de

receptores para factores de crecimiento. La región citoplasmática tiene 86 aminoácidos y

parece que está implicada en la transmisión de señales junto con la subunidad p70. Esta

subunidad participa en la formación del receptor de media y alta afinidad, así como en los

procesos de internalización, y es capaz junto con la subunidad p70, de unir IL-2 (Kumar,

A. et al., 1987).

1.5.1.- MECANISMOS MOLECULARES DE TRANSMISIÓN DE SEÑALES

MEDIADAS POR IL-2

Se tiene muy poca información acerca de cuáles son los mecanismos que transmiten

las señales mediadas por la IL-2 desde la superficie celular al núcleo.

Cuando la IL-2 se une a su receptor de alta afinidad este complejo se internaliza

rápidamente (Kumar, A. et al., 1987). La internalización es un paso necesario pero no

suficiente en el proceso de proliferación mediada por IL-2, lo que parece indicar que

probablemente esta molécula no interacciona de una forma directa con las vías de

transmisión de señales (Kono, T. et al., 1990).

La interacción de la IL-2 con su receptor desencadena varios sucesos de

señalización intracelular, incluyendo la fosforilación de proteínas en restos de tirosina y la

subsiguiente inducción de varios protooncogenes críticos para la proliferación celular

(Minami, Y. et al., 1993a; Minami, Y. et al., 1993b; Kono, T. et al., 1993). Ninguna de las

tres subunidades del receptor de IL-2 posee actividad catalítica. Las subunidades ? y ?

juegan un papel esencial en el desarrollo de la señalización inducida por IL-2 (Minami, Y.

et al., 1993a; Hatakeyama, M. et al., 1989a; Kawahara, A. et al ., 1994; Nakamura, V. et

al., 1994; Nelson, B.H. et al., 1994). El receptor de IL-2 puede reclutar múltiples PTKs:

p56lck y p59fyn de la familia src, syk de la familia syk/ZAP-70 y Jak1 y Jak3 de la familia

Jak (Hatakeyama, M. et al., 1991; Minami, y. et al., 1993b; Kobayashi, N. et al., 1993;

Minami, Y. et al., 1995; Russell, S.M. et al., 1994; Miyazaki, T. et al., 1994).

El dominio citoplasmático de la cadena ? se asocia con p56lck , Syk y Jak1, mientras

que la subunidad ? se asocia con Jak3 (Hatakeyama, M. et al., 1991; Minami, Y. et al.,

1993b; Minami, y. et al., 1995; Russell, S.M. et al., 1994; Miyazaki, T. et al., 1994). Estas

interacciones ocurren a través de la región rica en serina de la subunidad ? y la región C-

terminal de la cadena ? (Miyazaki, T. et al., 1994; Kawahara, A. et al., 1995), aunque se ha

propuesto un camino alternativo para la activación de Stat que está mediada por la

interacción de Jak y Stat (Fujitani, Y. et al., 1997).

La IL-2 desencadena la activación de PTK e induce la fosforilación en tirosina de

una proteína adaptadora denominada Shc. La fosforilación de Shc crea una región

consenso para el dominio SH2 de otra proteína adaptadora, Grb2, la cual está compuesta

por un dominio SH2 flanqueado a ambos lados por dominios SH3, esta proteína adaptadora

interacciona con SOS un factor de intercambio de nucleótidos de guanina. Por un

mecanismo desconocido, se forma el complejo trimolecular Shc-Grb2-SOS que

desencadena la transformación de GDP en GTP provocando la activación de Ras. La forma

activa de Ras desencadena la cascada de serina/treonina quinasas. Aunque la interacción de

Ras-Raf es necesaria para la activación de Raf, la interacción no activa la actividad

catalítica de Raf. Después de la activación de esta proteína tiene lugar la fosforilación y

activación de MEK el cual finalmente fosforila a MAPK. Estas fosforilaciones activan a

MAPK, la cual retransmite la señal a sistemas efectores por fosforilación de múltiples

sustratos citoplasmáticos, incluyendo otras serina/treonina quinasas. Además MAPK se

transloca al núcleo y fosforila ciertos factores de transcripción. Por otra parte, Jak también

transduce señales directamente al núcleo por fosforilación de Stat3 y/o Stat5. La

fosforilación induce la dimerización de STAT, que desencadena la posterior translocación

al núcleo (figura 9) (Karnitz, L.M. y Abraham, R.T., 1996).

Además de estas proteínas quinasas, la IL-2 provoca la activación de PI3-quinasa

(Augustine, J.A. et al., 1991; Merida, I. et al., 1991; Remillard, B. et al., 1991; Karnitz,

L.M. et al., 1994). Una vez activada, esta quinasa fosforila al fosfoinositol (PI) 4,5-P2 para

Figura 9.- La IL-2 induce la activación de Ras y Stat (tomado de Karnitz, L.M. y Abraham, R.T., 1996).

P

IL-2R?

IL-2R? IL-2

Jak3 Jak1

Stat3/5

Src-familia PTK Y P Grb 2

SOS

Ras GTP

MEK

MAP Kinasa

Raf

Transcripción de genes y progresión del ciclo celular

Shc

?C

P Stat3/5

P Stat3/5

YY

producir un segundo mensajero lipídico, PI-3,4,5-P3 el cual activa a otros efectores

(Karnitz, L.M. y Abraham, R.T., 1996).

1.6.-TRANSMISIÓN DE SEÑALES MEDIADAS POR DIFERENTES

EFECTORES

1.6.1.- PKC

La proteína quinasa C es una familia multigénica de serina-treonina-quinasas que se

agrupa en tres secciones diferentes en base a características estructurales similares y a

requisitos de activación (tabla 3).

La PKC puede interaccionar con varios sistemas de señalización incluyendo el

camino a través de Ras-Raf-MAP y el dependiente de calcio-calmodulina y puede regular

FAMILIA

ISOFORMAS

COFACTORES

Clásicas

? , ? I, ? II, ?

Ca2+, DAG, PS, PMA

Nuevas

?, ?, ? , ?

PS, DAG, PMA

Atípicas

?, ?/?

PS

Tabla 3.- Clasificación de las isoenzimas de la familia PKC.

de forma positiva o negativamente la disponibilidad de sus propios cofactores lipídicos.

(Keenan, C. et al., 1997).

La hidrólisis de fosfolípidos de membrana es un mecanismo común para la

transducción de varias señales extracelulares en la célula como hormonas,

neurotransmisores, antígenos y algunos factores de crecimiento. La fosfolipasa C está

implicada en la hidrólisis de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) que produce dos

segundos mensajeros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), el cual libera calcio de depósitos

intracelulares, (Berridge, M.J. e Irvine, R.F., 1984) y diacilglicerol (DAG) el cual activa la

proteína quinasa C (figura 10).

Figura 10.- Activación de células diferenciadas e indiferenciadas a través de PKC (tomado de Kanashiro, A.C. y Khalil, R.A., 1998).

Ca2+

P MAPK Sustrato Sustrato

c-myc c-jun c-fos

Núcleo Proliferación

celular

Respuestas celulares

Contracción

MEK

IP3

PIP 2 DGA

PS

PLCPKC

PKC Ras

Raf

G

GTP GDP

Retículo Endoplasmático

Se han asignado algunas funciones fisiológicas a la PKC incluyendo su implicación

en la secreción y exocitosis, contracción del músculo liso, expresión de genes y

proliferación celular, además la PKC ejerce un control negativo en varias etapas del

proceso de señalización celular (Nishizuka, Y., 1992).

La implicación de la PKC en el control del crecimiento y diferenciación es

evidente, pues varios efectores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento

derivado de plaquetas y en algunos casos EGF pueden involucrar a la PKC en su proceso

de transducción de señal (Kanashiro, A.C. y Khalil, R.A., 1998).

1.6.2.- PKA

La proteína quinasa dependiente de AMPc (proteína quinasa A, PKA; E.C. 2.7.1.37)

fue descubierta por el grupo de Krebs, durante el estudio de la regulación de la glucógeno

fosforilasa (Walsh, D.E. et al., 1968; Krebs, E.G., 1993a, 1993b).

En su estado inactivo, la enzima es un tretámero formado por dos subunidades

reguladoras (R) y dos subunidades catalíticas (C). La unión de AMPc a las primeras

promueve la disociación de la holoenzima en un dímero de subunidades reguladoras y dos

subunidades catalíticas monoméricas y activas que pueden fosforilar restos de serina o

treonina de un amplio espectro de proteínas, dependiendo del tipo de célula y de su estado

de diferenciación, lo que se traduce en numerosos efectos biológicos (Zetterquist, O. et al.,

1990).

En relación a los caminos de transducción de señales se ha observado que la IL-1?

y TNF-? pueden activar la PKC o la PKA, vía fosfolipasa C y adenilato ciclasa

respectivamente (Dinarello, C., 1991; Vilcek, J. y Lee, T.H., 1991). La activación o

inhibición de la adenilato ciclasa es una de las funciones mejor estudiadas en cuanto a la

modulación de efectores a través de receptores hormonales acoplados a proteínas G (figura

11) (Herrera, E., 1993).

El LPS también induce la activación de varios caminos de transducción de señales

en los que está implicada la proteína quinasa A. El complejo LPS-LBP se une a su receptor

de membrana, esta asociación induce la expresión de COX-2 (ciclooxigenasa-2), la

posterior formación de PGE2 (prostaglandina E2), la producción de AMPc y la activación

de la PKA (figura 12) (Chen, C. et al., 1999).

Figura 11.- Sistemas de la adenilato ciclasa y del fosfatidilinositol en la respuesta hormonal. Abreviaturas: PKA y PKC, proteína quinasa A y C; PDE, fosfodiesterasa de fosfatidilinositol; PI, PIP,PIP2 , fosfatidilinositol, fosfatidilinositol 4-fosfato y fosfatidilinositol 4.5- bisfosfato; IP3,inositol-1,4,5 trifosfato; DG, diacilglicerol; AC,adenilato ciclasa.

G PDE

PKC

PKA

PI PIP PIP 2

DG

ATP AMPC

Fosforilaciónde proteínas

IP 3

Movilización de Ca2+

G

GTP

AC

1.6.3.- LIPOPOLISACÁRIDOS BACTERIANOS (LPS)

Los lipopolisacáridos bacterianos son los principales componentes de la mayoría de

las bacterias Gram- negativas y actúan como fuertes estimuladores de la inmunidad innata

o natural en diversas especies eucarióticas desde insectos a humanos.

COX-2

PGE2

AMPC

PKA

LBP LPS

mCD-14

Figura 12.- Representación esquemática de la activación de la PKA inducida por LPS. Abreviaturas: LPS, lipopolisacáridos; LBP, proteína que se une al LPS; COX-2, ciclooxigenasa 2; PGE2, prostaglandina E2; AMPc, adenosín monofosfato cíclico; PKA, proteína quinasa A; mCD14, complejo diferenciado de membrana

La membrana externa de las bacterias Gram-negativas (figura 13) es asimétrica.

Las caras interna y externa son diferentes y constan principalmente de lípidos y proteínas.

(Nikaid, H. y Vaara, M., 1987; Hayashi, S. et al., 1990; Dmitriev, B.A. et al., 1999). Los

lipopolisacáridos son componentes integrales de la membrana externa de estas bacterias y

contienen un dominio hidrofóbico conocido como lípido A (figura 2) (Ulevitch, R.J. y

Tobias, P.S., 1995).

La capa de lipopolisacáridos de la membrana externa está estabilizada por la

asociación de cationes divalentes y representa una barrera permeable frente a factores de

estrés externos (Vaara, M., 1992).

Figura 13.- Membrana externa de las bacterias Gram-negativas.

El lípido A representa el centro inmunoreactivo del LPS debido a la especificidad y

al reconocimiento altamente sensible de la estructura lipídica por numeros componentes

celulares y humorales de la inmunidad innata (Medzhitov, R., y Janeway, C.A.Jr., 1998;

Hoffmann, J.A. et al., 1999; Medzhitov, R. y Janeway, C.A.Jr., 2000).

El LPS induce un amplio espectro de efectos biológicos en varios organismos

eucarióticos. El blanco celular primario del LPS en mamíferos son los fagocitos de la

inmunidad innata o natural, monocitos periféricos, macrófagos y neutrófilos, los cuales

expresan el antígeno CD 14 así como TRL4 (Haziot, A. et al., 1988; Kitchens, R.L., 2000;

Zhanf, F.X. et al., 1999 ; Muzio, M. et al., 2000).

Los macrófagos llevan a cabo funciones críticas en el sistema inmune. Actúan

como reguladores de la homeostasis y como células efectoras en la infección e intervienen

en la curación de heridas (Celada, A y Nalhan, C., 1993). A diferencia de otras células del

sistema inmune, los macrófagos muestran una pronunciada dualidad en su respuesta

biológica; tampoco proliferan o se hacen activos, experimentando un paro en su

crecimiento y comienzan a llevar a cabo sus funciones especializadas en el contexto de la

respuesta inmune (Vairo, G. et al., 1992). El LPS activa macrófagos e induce la secreción

de metabolitos de ácido araquidónico, intermediarios del nitrógeno y citoquinas tales con

TNF-? , IL-1 e IL-6 (Adams, D.O. et al., 1984; Morrison, D.C. et al., 1987), las cuales

juegan un papel importante en la respuesta inmune.

En macrófagos, el LPS desencadena la activación de varios caminos de

transducción de señales en los que están implicados proteínas G, tirosina-quinasas,

fosfolipasa C (PLC), proteína quinasa A (PKA) y proteína quinasa C (PKC) (Sweet, M.J.

et al., 1996; Fujihara, M. et al., 1994; Liu, M.K.P. et al., 1994, Shapira, L. et al., 1994)

EL LPS también activa diferentes cascadas de proteínas quinasas activadas por

mitógenos (MAPK), incluyendo las proteínas quinasas reguladas por señales extracelulares

(ERK) (Reimann, T.D. et al., 1994; Weinstein, S.L. et al., 1992). Para la actividad de

MAPK es necesaria la fosforilación de residuos de tirosina y treonina (Boulton, T.G. et al.,

1991). ERK activa fosforila y regula varias proteínas quinasas adicionales, componentes

del citoesqueleto, fosfolipasa A2 , y factores de transcripción nuclear (c-Jun) (Treisman, R.,

1996).

MAPK fosfatasa–1 (MKP-1) es un miembro inducible de doble especificidad

(Charles, C.H. et al., 1993; Keyse, S.M. et al., 1992; Noguchi, T. et al., 1993). MKP-1

desfosforila residuos de tirosina y treonina en ERK1/2 (Alesi, D.R. et al., 1993; Sun, H. et

al., 1993), de este modo permite la inactivación de estas quinasas. MKP-1 desfosforila e

inactiva c-Jun y p 38 (Chun, Y. et al., 1996). La expresión de MKP-1 no es dependiente de

la activación de MAPKs y ERK 1 / 2 en respuesta al LPS. En cambio, la inducción de esta

fosfatasa necesita la activación de tirosina quinasas y de la isoforma ? de la PKC. Esto

sugiere que, en macrófagos, la PKC? juega un papel importante en el control negativo de la

actividad de MAPK a través de la inducción de la fosfatasa MKP-1 (figura 14) (Valledor,

A.F. et al., 2000).

La activación de la PKC está asociada con la translocación de la enzima desde el

citosol a la membrana. El LPS estimula la actividad de la PKC en macrófagos de dos

maneras. La primera, es rápida y ocurre sólo a altas concentraciones de LPS. La segunda

manera es más lenta y tiene lugar tanto a dosis bajas como altas del efector. Además, hay

una fuerte evidencia que sugiere que la PKC? es la principal isoforma implicada en la

respuesta de los macrófagos a la estimulación por LPS (Shapira, L. et al., 1997).

Figura 14.- Control negativo de la actividad de MAPK a través de la inducción de la fosfatasa MKP-1. Las líneas sólidas representan interacción directa y las discontínuas representan la presencia de pasos intermedios. Las líneas en forma de T representan inhibición. Los círculos representan formas activas y los cuadrados formas inactivas.

PTK PKC?

MKP-1

ERK-1 ERK-2

ERK-1 ERK-2

NÚCLEO

c-jun p38

c-jun p38

1.6.4.- CORTICOTROPINAS

El factor liberador de corticotropinas (CRF) parece ser una molécula señal

potencialmente importante en procesos autoinmunoreguladores y neuroinmunes de

vertebrados e invertebrados (Smith, E.M. et al.,1992a).

Recientes estudios muestran que ciertos neuropéptidos participan en procesos

reguladores en el sistema inmune de vertebrados e invertebrados (Van Epps, D.A., 1984;

Fisher, E.G. y Falke, N.E., 1986; Stefano, G.B. et al., 1989). Además varios neuropéptidos

endógenos, estimulan la adherencia, cambios conformacionales, y actividad locomotora en

humanos y en inmunocitos de invertebrados (moluscos, insectos) (Stefano, G.B., 1989).

Por otra parte el CRF parece inducir inmunosupresión celular a través de su propio

receptor (Smith, E.M. et al., 1992b)

Los hemocitos de invertebrados son capaces de responder a CRF y a fragmentos de

ACTH (hormona adrenocorticotrópica) proporcionando evidencias de una complejidad en

la señalización intracelular dentro del sistema inmune en animales relativamente primitivos

(Genedani, S. et al., 1994).

El estrés en vertebrados, ocurre en parte, a través de neuropéptidos, u otras

moléculas señal, particularmente CRF y pro-opiomelanocorticoides (POMC), los cuales

son sintetizados por el sistema inmune y nervioso (Blalock, J.E., 1989). El fenómeno de

estrés también ocurre en invertebrados (Ottaviani, E. et al., 1992; 1993; Stefano, G.B. et

al., 1990) y la influencia de la respuesta inmune parece estar mediada por neuropéptidos y

moléculas señal similares a las implicadas en la respuesta al estrés en vertebrados (Leung,

M.K. y Stefano, G.B., 1987; Ottaviani, E. et al., 1990a; 1991).

Recientemente, Ottaviani, E. et al., demostraron que el fragmento ACTH 1-24 y las

? - endorfinas pueden estimular la locomoción de hemocitos y la fagocitosis (Ottaviani, E.

et al., 1990; 1991b).

El ACTH debería de ser considerado un importante inmunoregulador que forma

parte del complejo mosaico de relaciones entre el sistema inmune y el neuroendocrino.

Esta molécula es capaz de neutralizar directa o indirectamente agentes que pueden

perturbar la homeostasis del cuerpo. El efecto del ACTH en las células inmunes es

compleja y está influenciada por varios factores, tales como su concentración , presencia

de citoquinas, etc. Este efector puede ejercer efectos directos o indirectos a varios niveles,

modulando la transducción de señales en la membrana plasmática o alterando la

producción de factores de crecimiento y la diferenciación celular, ej: TNF-? (Hughes, T.K.

y Smith, E.M., 1989).

La hormona adrenocorticotrópica (ACTH) induce cambios en la forma de los

inmunocitos de moluscos por la via adenilato ciclasa/AMPc /PKA y también provoca la

activación de la PKC. Sin embargo estos efectos desaparecen al añadir inhibidores de las

proteínas G , de la adenilato ciclasa, o de la PKA. Además se ha demostrado que ACTH

induce movilidad en hemocitos fagocíticos de Vivíparus ater por modificación de

componentes del citoesqueleto, también induce la secreción de glucocorticoides adrenales

y puede afectar a diferentes sistemas y comportamientos. En concreto está implicada en las

funciones del sistema cardiovascular de células inmunocompetentes y juega un papel

importante en la inflamación, termorregulación, alimentación y en el comportamiento

social y sexual. De este modo, ACTH, puede tener una importancia central en el

mantenimiento de la homeostasis del organismo (Ottaviani, E. et al., 1999).

El equilibrio homeostático de los organismos está en constante cambio y es

amenazado por diversos efectores. Para mantener la homeostasis, los animales estresados

desencadenan una serie de respuestas fisiológicas y de comportamiento denominadas

"respuestas al estrés" para adaptarse a situaciones amenazantes (Wingfield, J.C. and

Ramenofsky, M., 1999).

Una vez detectado por los órganos sensores, el estrés es el resultado de la

estimulación de dos principales ejes neuroendocrinos en vertebrados: el eje celular

hipotalámico-pituitaria y el eje celular hipotalámico-sistema nervioso simpático (Chousos,

G.P. y Gold, P.W., 1992; Wendelaar Bonga, S.E., 1997).

En el primer camino están implicados neuropéptidos y glucocorticoides como

principales mensajeros, mientras que en el segundo camino están implicadas las

catecolaminas (CA). De tal modo que, los glucocorticoides y las catecolaminas inducen

respuestas secundarias, incluyendo incrementos en los niveles de oxígeno, movilización de

sustratos y relocalización de energía ajena a la requerida en los procesos fisiológicos, tales

como crecimiento, reproducción y determinadas funciones inmunes (Wendelaar Bonga,

S.E., 1997).

En moluscos, las catecolaminas juegan un papel esencial en varios procesos

fisiológicos, incluyendo alimentación (Teyke,T. et al., 1993), locomoción ( Sakharov, D.A.

y Salänski, J., 1982), respiración (Syed, N.I. y Winlow, W., 1991), reproducción

(Martínez, G. y Rivera, A., 1994) y en el asentamiento de las larvas y metamorfosis en

especies marinas (Pires, A. et al., 1997), sin embargo, se conoce poco, sobre como influye

el estrés en la secreción de catecolaminas y en el metabolismo de estos animales.

Las catecolaminas también desempeñan un papel importante en los moluscos

bivalvos. Estudios fisiológicos y farmacológicos indican que las catecolaminas afectan al

músculo (Greenberg, M.J., 1960; Hidaka, T. et al., 1977; Muneoka, Y. y Kamura, M.,

1982) y a la actividad ciliar (Aiello, E., 1990; Beiras, R. y Widdows, J., 1995; Paparo, A y

Aiello, E., 1970). Aunque el sistema nervioso de bivalvos no ha sido extensivamente

examinado neurofisiológicamente, mucha información de los efectos de catecolaminas en

gasterópodos puede aplicarse a bivalvos (Walker, R.J., 1986) , indicando posibles papeles

como transmisores en el sistema nervioso central. Estudios histológicos han informado de

un abundante contenido de catecolaminas en células del sistema nervioso central y en

algunos tejidos periféricos de bivalvos (Smith, S.A. et al., 1998; Stefano, G.B. y Aiello, E.,

1975; Sweeney, D.C., 1968). Además de la implicación de catecolaminas en el control de

la alimentación, respiración y digestión.

Las concentraciones de catecolaminas en varios tejidos están relacionadas con la

época de desove en bivalvos (Martínez, G. y Rivera, A., 1994; Osada, M. y Nomura, T.,

1989; Paulet,Y-M. et al., 1993). Además, recientes estudios han demostrado que varios

agentes farmacológicos pueden tener largos y duraderos efectos sobre la concentración de

catecolaminas en bivalvos "in vivo" (Pani, A.K. y Croll, R.P., 1998), abriéndose, de este

modo, nuevos caminos en la investigación de la acción de las catecolaminas (Smith, S.A. y

Croll, R.P., 1997).

1.6.5.- FACTORES DE CRECIMIENTO

Factores de crecimiento, factores de diferenciación y hormonas son componentes

importantes en el sistema regulador que coordina el desarrollo de organismos

multicelulares. Algunos de estos factores median sus acciones pleiotrópicas por la unión y

activación de receptores de la superficie celular con proteínas intrínsecas que presentan

actividad tirosina quinasa (Ullrich, A. y Schlessinger, J., 1990).

Los factores de crecimiento desencadenan una serie de respuestas celulares. Estas

incluyen estimulación de intercambio Na+/H+, afluencia de Ca2+, activación de fosfolipasa

C-? y estimulación del transporte de glucosa y aminoácidos. La estimulación de la

fosfolipasa C-? permite la generación de metabolitos de fosfatidilinositol, tales como

inositol 1,4,5- trifosfato, el cual provoca la liberación de Ca2+ desde compartimentos

intracelulares y la generación de diacilglicerol, un activador natural de la PKC (figura 15)

(Nishizuka, Y., 1988).

La fosfatidilinositol 3-quinasa (Varticovski, L. et al., 1989) y las proteínas ras

(Molloy, C.J. et al., 1989) son sustratos directos de algunos receptores que presentan

actividad tirosina quinasa (Morrison, D.K. et al., 1989).

El PDGF está formado por dos tipos de cadenas: una cadena A y una cadena B. En

su forma activa el PDGF es un dímero de dos monómeros que puede presentar todas las

Figura 15.- Mecanismo de activación del fosfatidilinositol por receptores de tirosina quinasas. Abreviaturas: PMA, forbol 12-miristoato 13-acetato; PIP2, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato, DG, diacilglicerol; IP3, inositol 1,4,5-trifosfato, IP3 R, receptor de IP3

(tomado de Ullrich, A. y Schlessinger, J., 1990).

EGF

ATPG PLC?

PMA Ca+2

PIP2 DG

IP3

IP3 R

PKC

SUSTRATOS

combinaciones posibles (ej: PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB) (figura 16) (Bowen-Pope,

D.F. et al., 1989; Hart, C.E. et al., 1990; Claesson-Welsh, L., 1994).

El receptor de PDGF tiene dos subunidades: la subunidad ? (PDGF? r) y la ?

(PDGF? r). Las subunidades tienen un peso molecular de 170 y 190 kDa respectivamente.

La unión de PDGF con sus receptores induce la dimerización de las subunidades del

receptor (Ullrich, A. y Schlessinger, J., 1990).

El PDGF inicia un camino definido de transducción de la señal. La unión del

ligando a cualquiera de las subunidades induce la autofosforilación del receptor (Ek, B. y

Heldin, C.H., 1982). A su vez, la estimulación del receptor de PDGF activa una cascada de

enzimas como PKC, Ras, Raf, MAPK y finalmente desencadena la división celular

(Bornfeldt, K.E. et al., 1995; Hart, K.C. et al., 1995).

B

? ?

A A A B B

? ? ? ?

Dímeros de PDGF

Dímeros del receptor

Figura 16.- Interacción del PDGF con su receptor.

La activación de la cascada Ras-Raf-MAPK induce la proliferación celular

(Bornfeldt, K.E. et al., 1995) (figura 17). De este modo, MAPK juega un papel crítico en el

control del crecimiento y diferenciación celular.

Un camino alternativo para estimular la actividad MAPK es a través de la PKC

(Sözei, O. et al., 1992; Kolch, W. et al., 1993; Li, X. et al., 1995).

Cuando el PDGF se une a un receptor, rápidamente estimula un grupo de respuestas

"tempranas" que ocurren en minutos. Esto incluye la activación de tirosinas-quinasas,

Figura 17.- Caminos de transducción de señales iniciados por PDGF (tomado de Luo, J. y Miller, M.W., 1999).

Núcleo

PDGF? r

PDGF-BB PDGF-AA

PDGF? r

MAPK

?

Dominios efectores SH2

Ras

Raf-1

MEK

Etanol

PKC

hidrólisis de fosfatidilinositol (PI), alteraciones en el pH celular, incremento en los niveles

de calcio citosólico, incremento en la expresión de determinados genes e internalización y

degradación del receptor (Lewis, T.W., 1989). El factor de crecimiento derivado de

plaquetas (PDGF) estimula la transcripción de c-fos y c-myc a través de al menos dos

caminos, uno de ellos está mediado por la proteína quinasa C y el otro no. Los mecanismos

moleculares de estos caminos no han sido aclarados, pero parece que ambos culminan en la

modificación covalente de una proteína que une directamente DNA ó bien a otra proteína

que se une a la región reguladora del mismo. Los pasos que intervienen pueden consistir en

una cascada de reacciones quinasa en las que estarían implicadas tirosina, serina y

treonina quinasas ( Lewis, T. W., 1989).

Por otra parte, miembros de la familia del factor de crecimiento transformante ?

(TGF-? ) se unen a receptores serina/ treonina quinasas del tipo II y tipo I, los cuales

inician señales intracelulares a través de la activación de proteínas Smad. Las funciones de

Smads son reguladas por otros caminos de señalización, tales como MAPK. Además, estas

proteínas interaccionan y modulan varios factores de transcripción que son blancos de

otros caminos de señalización (Miyazoho, K. et al., 2000).

El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es una llave reguladora del crecimiento

y diferenciación celular en algunas células de mamíferos (Carpenter, G., 1987). Los pasos

en la transducción de señales, parecen ser similares en diferentes células: la unión de EGF

a su receptor induce la dimerización de éste y la activación de su actividad tirosina-

quinasa, la cual es esencial para la transducción de la señal (Ullrich, A. y Schlessinger, J.,

1990; Sdhlessinger, J. y Ullrich, A. 1992). Como consecuencia de la activación de EGFR,

se desencadenan una variedad de cambios iónicos incluyendo una hiperpolarización

pasajera de la membrana, la alcalinización citoplasmática y un incremento en la

concentración del calcio citosólico (Hesketh, T.R., et al., 1985; Moolenar. W.H., 1986;

Solthoff, S.P. and Cantley, L.C., 1988; Peppelenbosh, M.P., et al., 1991).

En algún tipo de células el EGF también activa la fosfolipasa A2 (PLA2), que

estimula la liberación de ácido araquidónico (AA) y la producción de eicosanoides

(Bonvetre, J.V., et al ., 1990; Goldberg, H.J., et al., 1990; Spaargeren, M. et al., 1992).

1.7.- CÉLULAS INMUNITARIAS EN EL MEJILLÓN

Estudios realizados sobre inmunidad innata en invertebrados han demostrado

similaridades filogenéticas en las estrategias seguidas por esos organismos para responder

rápidamente a una herida o a una infección. El sistema de defensa en los insectos presenta

muchas características similares a las encontradas en la fase aguda de la respuesta en

mamíferos (Hoffmann, J.A., 1995), por tanto los invertebrados pueden ser un sistema

modelo válido para abordar aspectos específicos de la inmunidad innata.

Los hemocitos circulantes juegan un papel clave en las reacciones de defensa de los

invertebrados. Están implicados como fagocitos activos y también en la secreción de

factores humorales (Pipe, R.K. et al., 1997).

Sin embargo, no se tiene un conocimiento detallado de las subpoblaciones de

hemocitos de invertebrados y de su implicación respectiva en los diferentes aspectos de

defensa del huésped. Tal información es particularmente limitada con respecto a los

hemocitos de moluscos bivalvos, que sólo han podido ser clasificados morfológicamente

como células agranulares y células granulares (figura 18) (Cheng, T.C., 1981).

La investigación de los mecanismos de defensa del mejillón, es de particular interés

debido a su prolífica distribución, su importancia en acuicultura y su empleo como modelo

para realizar estudios de polución ambiental (Dyrynda, E.A. et al., 1997).

La clasificación de los hemocitos del mejillón Mytilus edulis, ha recibido

históricamente una considerable atención (Jones, T.W., 1846; Williams, T., 1852; Sabatier,

A., 1877; Flemming, W., 1878; Griesbach, H., 1891; De Bruyne, C., 1896; Kollmann, M.,

1908; Feng, S.Y. et al., 1977; Moore, N.N. y Lowe, D.H., 1977; Rasmussen, L.P.D. et al.,

1985; Pipe, R.K., 1990a; Noël, D. et al., 1994).

En las observaciones iniciales (Jones, T.W., 1846) se clasificaron varias fases de su

desarrollo incluyendo estados granulares finos y gruesos, así como células nucleadas, y

también se incluyeron descripciones de aglomeraciones y la formación de pseudópodos.

Una de las más recientes clasificaciones (Noël, D. et al., 1994) describe la caracterización

Figura 18.- Poblaciones celulares en hemolinfa de mejillón.

antigénica de subpoblaciones con anticuerpos monoclonales y reconoce tres clases de

hemocitos (Pipe, R.K. et al., 1997).

Según Friebel, B. y Renwrantz, L. (1995) los hemocitos de M. edulis pueden ser

divididos en dos grupos, basófilos y eosinófilos, en el primer grupo se incluyen

hialinocitos (células agranulares) y células granulares; en el grupo de los eosinófilos sólo

se encuentran células granulares (Pipe, R.K. et al., 1994). Los hemocitos granulares de M.

edulis contienen dos tipos distintos de gránulos, distinguibles por tamaño, características

de tinción con lectinas y por el contenido enzimático (Pipe, R.K., 1990a; 1990b; Dyrynda,

E.A. et al., 1997).

1.7.1.- LA PROTEÍNA QUINASA C EN MEJILLÓN

En el manto de Mytilus galloprovincialis se ha purificado una proteína de 105 kDa

(p105) que presenta actividad quinasa dependiente de fosfatidil L-serina y PMA, e

independiente de Ca2+. Los parámetros cinéticos de esta proteína p105 la asemejan a

isoformas de nPKC de mamíferos. Además el Ca2+ ejerce una inhibición de tipo mixto

sobre la enzima purificada. La proteína p105 es capaz de autofosforilarse, en condiciones

de ensayo, sin mediar la presencia de cofactores lipídicos. Esta proteína también se

encuentra presente en manto, branquias, pie, músculo aductor, hepatopáncreas y hemocitos

de M. galloprovincialis. La estimulación de hemocitos con PMA induce la translocación de

p105 a la membrana plasmática y se regula por degradación (Down-Regulation) en función

del tiempo de exposición. Esta enzima fosforilada contiene residuos de P-Ser. Por otra

parte, se obtuvieron anticuerpos policlonales que reconocen específicamente p105

(Mercado, L., 2001).

1.7. 2.- LA PROTEÍNA QUINASA A EN MEJILLÓN

Se ha caracterizado la proteína quinasa dependiente de AMPc procedente del

mejillón Mytilus galloprovincialis. Al igual que ocurre con su homóloga de mamíferos, la

enzima del molusco está constituída por dos tipos de subunidades: catalítica y reguladora,

que fueron purificadas de forma independiente mediante procesos diferentes.

La subunidad catalítica de la PKA de mejillón mostró unas propiedades tanto

físicas como cinéticas y un mecanismo de regulación, esencialmente idénticos a los

descritos para la proteína homóloga de mamíferos, lo que sugiere un elevado grado de

conservación estructural entre ambas proteínas a pesar de las diferencias en la escala

evolutiva.

En extractos de manto de mejillón, se identificaron tres proteínas que unen

específicamente AMPc, con masas moleculares de 54 kDa, 42 kDa y 37 kDa, que

posteriormente fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad a través de AMPc-

agarosa. Sin embargo, de las tres proteínas, solamente la de 54 kDa fue capaz de

reasociarse con la subunidad catalítica de la PKA e inhibir su actividad quinasa, en

ausencia de AMPc, lo que indica que únicamente esta proteína puede actuar como

subunidad reguladora de la proteína quinasa A del molusco.

En relación a las proteínas que unen AMPc de 42 kDa y 37 kDa, incapaces de

inhibir la subunidad catalítica de la PKA, probablemente son fragmentos proteolíticos

procedentes de la subunidad reguladora, tal como indica el hecho de que sean reconocidas

por un anticuerpo generado frente a la proteína de 54 kDa (Cao, J., 1996).

1.7. 3.- LA CADENA ? DEL RECEPTOR DE IL-2 EN MEJILLÓN

En la hemolinfa de Mytilus galloprovincialis se ha detectado un péptido de

características inmunógenas similares a la IL-2. También se han identificado en la fracción

particulada de la hemolinfa de M. galloprovincialis Lmk. dos tipos de células (hemocitos)

bien diferenciadas, unas (células RH) son redondeadas con un núcleo muy grande en

relación al tamaño celular y las otras (células SH) tienen un citoplasma mucho más

expandido y son las únicas en las que se ha detectado la presencia de un receptor para IL-2.

Este receptor es similar estructuralmente al de las células de vertebrados, está constituído

por tres subunidades (? , ? , ?) cuyas masas moleculares son del mismo orden de magnitud

que las encontradas en vertebrados (Barcia, R. et al., 1999).

La incubación de los hemocitos con IL-2 y/o LPS induce un incremento en la

expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2 (Cao, A., 1998).

1.8.- PRESENCIA DE MOLÉCULAS SIMILARES A LAS CITOQUINAS EN

HEMOCITOS DE MOLUSCOS

En la hemolinfa de Planorbarius corneus, se encontraron dos tipos de células: los

hemocitos redondos (RH) y los hemocitos expandidos (SH). Los SH pertenecen a la línea

macrofágica, mientras que los RH presentan características de los linfocitos T (Ottaviani,

E., 1983; Franceschi, C. et al., 1991). En la hemolinfa de Viviparus ater se ha encontrado

únicamente un tipo celular, con las mismas funciones que los hemocitos SH de P. Corneus.

Sólo las células SH de ambos organismos presentan inmunorreactividad positiva

frente a cinco citoquinas (tabla 4), es de notar que estas células pertenecen a una línea

macrofágica y fueron las únicas que presentaron moléculas parecidas a los péptidos

derivados de la pro-opiomelanocortina (Ottaviani, E. et al., 1990b). En vertebrados, los

macrófagos son también los productores más importantes de IL-1, IL-6 y TNF-? .

P.corneus V.ater Citoquinas SH RH SH IL-1? + - + IL-1? + - + IL-2 + - + IL-6 + - + TNF-? + - + SH= hemocitos expandidos ; RH= hemocitos redondos

La presencia de moléculas parecidas a las citoquinas se ha demostrado en otros

invertebrados. En la hemolinfa de Mytilus edulis se han encontrado moléculas similares a

la IL-1 y TNF-? (Hughes, T. et al., 1990).

Experimentos realizados tanto “in vivo” como “in vitro” sugieren que esas

moléculas dan lugar a efectos biológicos similares sobre los hemocitos de moluscos y

granulocitos humanos (Hughes, T. et al., 1990).

Además, también se ha detectado la presencia de IL-1? en las células de la glía

presentes en los ganglios de M. edulis y Nereis diversicolor (Paemen, L. et al., 1992).

Tabla 4.- Citoquinas detectadas en hemocitos de Planorbarius corneus y Viviparus ater (tomado de Ottaviani, E. et al., 1993b).

Realmente, un incremento en las moléculas que reaccionan con el anticuerpo frente

a la IL-1? se obtiene tanto en ganglios como en hemocitos de M. edulis después de la

adición “in vitro” de opiáceos, como algún análogo sintético de la Met-encefalina,

resultados similares a los obtenidos en linfocitos periféricos humanos (Stefano, G.B. et al.,

1991; Ottaviani, E. et al., 1993b).

Se ha visto que diferentes citoquinas (IL-1? , IL-2, TNF-? ) afectan a la misma

célula blanco (el hemocito), incrementando su actividad fagocítica, induciendo la

producción de NOS y liberando bioaminas. Esas múltiples funciones subrayan el hecho de

que una de las características de las citoquinas de los mamíferos, como es su

pleiotropicidad, ha sido preservada a través de la evolución (Akira, S. et al., 1990).

El conocimiento de los mecanismos de defensa y resistencia a enfermedades es

esencial en el estudio de la fisiología y patología animal. El mecanismo de defensa de

moluscos es relativamente poco conocido, y frecuentemente estudios experimentales se

han visto ralentizados por la falta de un adecuado modelo "in vitro" (Stein, H.M. et al.,

1996).

Los cultivos celulares viables, derivados de invertebrados marinos son necesarios

para prometedoras aplicaciones: diagnóstico patológico, estudios del tratamiento de

enfermedades, crecimiento y control en la reproducción de moluscos comerciales, diseños

de nuevos test toxicológicos para vigilar la calidad del agua, etc. Cultivos semejantes

pueden abrir el camino de la producción "in vitro" de moléculas complejas marinas, con

resultados farmacológicos o de interés industrial.

Se han mantenido cultivos primarios de células de invertebrados durante intervalos

de tiempo del rango de varias horas, varios semanas, o varios meses, pero su funcionalidad

es incierta y su crecimiento limitado (Lenoir, L., 1989; Auzoux, S. et al., 1993; Odintsova,

N.A. y Khomenko, A.V., 1991). Aunque algunos autores hablan de incremento en el

número de células (Brewster, F. y Nicholson, B.L., 1979) o de procesos mitóticos (Lenoir,

F., 1989), todavía no se han establecido líneas celulares consecutivas debido al fracaso de

las sucesivas pruebas con estas células.

Pero la mayor dificultad es la frecuente contaminación por protozoos, bacterias y

hongos que provocan la pérdida de la mayoría de los cultivos. Muchos de los autores

indican la carencia de datos relacionados con la fisiología de estas células "in vitro", de la

ausencia de un medio de cultivo apropiado y de condiciones que expliquen la baja

frecuencia de mitosis observada (Domart-Coulum, J. et al., 1994; Mialhe, E. et al ., 1988).

OBJETIVOS

2.- OBJETIVOS

En todos los animales el sistema inmune comprende elementos celulares y

humorales que actúan de manera conjunta para proteger a los organismos de patógenos,

parásitos o células neoplásicas. El componente celular de la inmunidad de invertebrados

está mediado por células sanguíneas (hemocitos), las cuales participan en los mecanismos

internos de defensa (Ratcliffe, N.A. et al., 1985; Smith, V.J., 1991). Sin embargo, no se

tiene un conocimiento detallado de las subpoblaciones de hemocitos de invertebrados y de

su implicación respectiva en los diferentes aspectos de defensa del huésped. Tal

información es particularmente limitada con respecto a los hemocitos de moluscos

bivalvos, que sólo han podido ser clasificados morfológicamente como células agranulares

y células granulares (Cheng, T.C., 1981).

La investigación de los mecanismos de defensa del mejillón, es de particular interés

debido a su prolífica distribución, su importancia en acuicultura y su empleo como modelo

para realizar estudios de polución ambiental (Dyrynda, E.A. et al., 1997).

Por este motivo, el objetivo global del presente trabajo es: el estudio del efecto de

diversas citoquinas y otros efectores en la respuesta inmune desarrollada por los

hemocitos de Mytilus galloprovincialis.

Para ello este objetivo general se divide en varios sub-objetivos que deben ser

cubiertos secuencialmente:

1.- Aislamiento de los hemocitos de M. galloprovincialis y estudio de poblaciones

celulares en la hemolinfa.

2.- Cultivo de hemocitos de Mytilus galloprovincialis.

3.- Estudio del efecto de diversos efectores sobre la expresión de la cadena ? del

receptor de IL-2 en hemocitos de mejillón en diferentes épocas del año.

4.- Estudio del efecto de diferentes inductores sobre la expresión de la PKA y PKC

en hemocitos de M. galloprovincialis en distintas épocas del año.

5.- Detección de diferentes catecolaminas (Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina)

liberadas al medio, después de la incubación de los hemocitos de mejillón con diferentes

efectores durante los períodos invernal y estival.

MATERIAL Y MÉTODOS

3.- MATERIAL Y MÉTODOS

3.1.- MATERIAL BIOLÓGICO

Se utilizaron mejillones de la especie Mytilus galloprovincialis Lmk. Los moluscos

fueron recogidos en una planta purificadora localizada en la ría de Betanzos (La Coruña).

Una vez en el laboratorio, se llevó a cabo la extracción de la hemolinfa.

3.2.- REACTIVOS

Para la preparación de las disoluciones y tampones se utilizaron reactivos de las

casas: Merck (Darmstad, Alemania); Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA); Boehringer

Mannheim (Mannheim, Alemania); Montplet & Esteban, Probus, Vorquímica (España). En

todos los casos fueron reactivos de grado analítico. El agua que se usó para las

disoluciones y tampones fue desionizada.

El medio de cultivo Leibovitz L-15 (L-glutamina), y el suero fetal de ternero (FCS)

se obtuvieron de Biochrom K.G., Berlín.

Las electroforesis de poliacrilamida se realizaron con reactivos y aparatos de la

firma Bio-Rad (Richmond, USA), de la misma firma procedía la resina Affi-gel? Blue. Las

membranas de nitrocelulosa para la transferencia de proteínas, así como los sistemas de

quimioluminiscencia (ECL) y el kit de Biotrak utilizado para la detección de diferentes

catecolaminas fueron proporcionados por Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala,

Sweden) de la misma firma procedía la resina SephadexTM G-25 Fine.

El anticuerpo para la identificación de la subunidad ? del receptor de IL-2, fue de la

firma Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, C.A., USA). Los anticuerpos anti IgG de

conejo y anti IgG de ratón conjugados con peroxidasa fueron de la firma Sigma Chemical

Co. (St. Louis, USA). De la misma firma procedían la IL-2 recombinante humana, BSA,

LPS, CRF, ACTH 1-24, TGF-? 1, EGF, PDGF, gentamicina, estreptomicina, penicilina G,

anfotericina B, Azul de Coomassie R-250 e IgG,? de ratón conjugado con R-ficoeritrina.

Suramina, Bisindolilmaleimida I y H-89 fueron obtenidos de Calbiochem? ,

Alemania. Pharmingen (San Diego, USA) proporcionó el anticuerpo monoclonal de ratón

anti IL-2R? humano conjugado con ficoeritrina.

Los anticuerpos anti-PKC de mejillón y anti-PKA de mejillón fueron cedidos por el

Dr. Mercado y el Dr. Villamarín respectivamente.

La membrana Immobilon-P? (PVDF), y los filtros Millex 0,45 ?m y Sterivac TM-

GP10 0,22 ?m fueron de Millipore.

3.3.- APARATOS

Para la manipulación en condiciones estériles se utilizó una campana de flujo

laminar Telstar AH-100.

Las centrifugaciones para el lavado de hemocitos, así como la obtención de lisados

celulares se realizaron en centrífugas Denver Instrument, Centromix Selecta y BHG-

Herma Z229.

Las centrífugas utilizadas para la detección de catecolaminas fueron una Heraeus

Sepatech y una Heraeus Instruments.

Para el mantenimiento de los hemocitos en condiciones estables se utilizó una

estufa P. Selecta.

Para determinar el pH de los tampones se utilizó un pHmetro Crison modelo

microdigit-2001. El osmómetro utilizado para determinar la osmolaridad fue un Osmomat

030 de la casa Gonotec. El autoclave fue de la casa Matachana.

Los tratamientos térmicos, se realizaron en un baño termostatizado Selecta

Precisterm S-138.

El microscopio utilizado en las observaciones celulares fue un Olimpus CX40.

El material fotográfico fue de la firma Kodak (Biomax MS) y Agfa (Curix R2),

realizándose el revelado de las placas con un equipo automático de la firma Agfa-Gevaert,

modelo Gevamatic 60.

Las incubaciones a 4ºC y en movimiento continuo se realizaron en un Mixing Rotor

de la casa Renner GmbH.

El citómetro de flujo Ortho/Cytoron Absolute de Ortho-Clinical Diagnostics

Johnson & Johnson se utilizó para el análisis de las muestras.

Las placas de silicagel utilizadas en la cromatografía en capa fina fueron de Merck.

La visualización de las diferentes catecolaminas a 254 nm se realizó con una

lámpara de la casa Vilber Lourmat.

El contador de centelleo Beckman LS 6000TA se utilizó para la cuantificación de

Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina.

3.4.- PROCEDIMIENTOS GENERALES

Todas las manipulaciones de las células se realizaron en condiciones estériles;

también fueron esterilizados los disolventes y el material empleado en el aislamiento

celular. La esterilización de la solución antiagregante de Alsever (ALS) se hizo por

filtración a través de membrana Millipore de 0,22 ?m al igual que la solución de ALS y

formol 6% utilizada para fijar células.

Las sales añadidas al medio de cultivo se esterilizaron por filtración a través de

filtros Millipore de 0,45 ?m.

3.5.- EXTRACCIÓN DE HEMOLINFA Y OBTENCIÓN DE HEMOCITOS

Para obtener hemolinfa, con ayuda de una lima, se realizó una incisión en la unión

de las dos valvas del mejillón a la altura del músculo aductor posterior.

La hemolinfa fue extraída del seno de este músculo con una aguja y jeringa de 2 ml

estériles que contenía 1 ml de ALS (glucosa 20,0 g/l, citrato sódico 8 g/l, EDTA 3,36 g/l,

ClNa 22,5 g/l, pH 7, 1000 mOs) (figura 19). Esta operación se repitió el número de veces

necesarios hasta extraer la hemolinfa del total de los mejillones, obteniéndose un volumen

final de 40 ml que contenía aproximadamente 9x106 células (hemocitos). El recuento de las

células se realizó en cámara de Thoma empleando como colorante vital Trypan Blue.

Figura 19 .- Extracción de hemolinfa de Mytilus galloprovincialis.

3.6.- TINCIÓN DE HEMOCITOS DE MEJILLÓN

Los hemocitos se tiñeron con la solución colorante de May-Grünwald.

Técnica de Auffret:

Las células se fijaron durante 5 min en glutaraldehído diluido al 1,25% en tampón

fosfato 0,1 M a pH 7,4 suplementado con ClNa para ajustar la osmolaridad a 1010 mOs.

Después de la fijación y de un lavado en agua (1 min) y secado al aire, las preparaciones se

incubaron en las distintas tinciones como sigue: 3 min en May-Grünwald diluido 1/1 en

tampón fosfato (0,1 M, pH 7,2) y 10 min en Giemsa diluido 1:20 en tampón fosfato (0,1

M, pH 7,2). Al finalizar la tinción, se hizo un lavado en agua (1 min) y se dejaron secar las

preparaciones.

3.7.- MANTENIMIENTO DE HEMOCITOS EN CULTIVO

Una vez lavados los hemocitos y eliminadas las impurezas, se resuspendieron en

medio Leibovitz L-15 comercial modificado al añadir una mezcla de sales esterilizadas por

filtración a través de filtros de 0,45 ?m que contenía: ClNa (20,2 g/l), KCl (0,54 g/l),

CaCl2 (0,6 g/l), MgSO4 x 7 H2O (1g/l), MgCl2 x 6 H2O (3,9 g/l), glucosa (20,8 g/l), (pH 7

y osmolaridad 1000 mOs) también se añadió al medio penicilina G (100 units/ml),

estreptomicina (100 ?g/ml), gentamicina (40 mg/ml) y anfotericina B (0,1 ?g/ml) para

evitar el desarrollo microbial. Posteriormente se mantiene a 4.

El medio Leibovitz L-15 fue utilizado suplementado con FCS (10% v/v) o

hemolinfa (10% v/v) previamente inactivados de la siguiente manera:

a) FCS: se deja 30 min. a temperatura ambiente, posteriormente se pone a 37ºC

para descongelar completamente y a continuación se calienta en un baño a 55ºC durante

una hora o más.

b) Hemolinfa: después de calentarla 30 min. a 56ºC, se centrifuga a 12000g durante

15 min. y posteriormente se filtra a través de filtros de 0,45 ?m.

Una vez resuspendidos los hemocitos en medio Leibovitz L-15 suplementado con

FCS o hemolinfa se mantienen en frascos de cultivo a una temperatura constante de 20ºC

(figura 20).

3.8.- CITOMETRÍA DE FLUJO

3.8.1.- PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE HEMOCITOS

La hemolinfa se almacenó en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Con el fin de lavar los

hemocitos y eliminar restos de impurezas, se centrifugaron tres veces durante 5 min. a

7000 rpm y a temperatura ambiente. Después se añadieron 10 ? l del anticuerpo

monoclonal de ratón anti-IL-2R? humano conjugado con ficoeritrina (8,3 ?g/ml) a las

muestras y 1,3 ? l del anticuerpo IgG,? de ratón conjugado con R-ficoeritrina (8,3 ?g/ml) al

Figura 20.- Mantenimiento de los hemocitos en frascos de cultivo

control. Después de 30 min. de incubación a 4ºC y con agitación, se realizaron dos lavados

con ALS y se añade a los tubos 1 ml de ALS y formol 6% para proceder a su análisis

mediante citometría.

3.8.2.- ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS POR CITOMETRÍA DE FLUJO

(FACS)

En primer lugar se ajustaron los parámetros de dispersión frontal (FS) y de

dispersión lateral (SS) mediante un calibrado con partículas comerciales de tamaño

conocido. Para el tipo de muestra a analizar (hemolinfa de mejillón) se definieron dos

regiones llamadas región A y región B (figura 21). Las células de la región A son de mayor

tamaño y mayor complejidad mientras que las células de la región B son de menor tamaño

y de menor complejidad estructural.

FS

SS

Figura 21.- Distribución de células presentes en hemolinfa de M. galloprovincialis y selección de las regiones de interés FS: dispersión frontal; SS: dispersión lateral.

Una vez seleccionada la región de interés (región A), en donde los hemocitos

expresan la cadena ? del receptor de IL-2, se estudia esta subpoblación celular marcada

por ficoeritrina utilizando histogramas en los que se indica la intensidad de fluorescencia

frente al número de células (figura 22).

Para el análisis de los resultados obtenidos, se utilizaron los histogramas que

representan la fluorescencia en naranja (OR/FL) frente a la fluorescencia en verde

(GR/FL), permitiéndonos una mejor visualización de los datos y una clara diferenciación

en la expresión de la cadena ? del receptor de IL-2 en células control y células activadas

con el efector correspondiente (figura 23).

Figura 22. - Histogramas correspondientes a los hemocitos de mejillón A: Representa el número de células frente a la intensidad de fluorescencia B: Representa la fluorescencia en el naranja frente a la fluorescencia en el verde.

1000

100

10

10 100 1000 1

1

(NONE)/OR-FL

(NONE)/GR-FL

Intensidad de fluorescencia

Número de células

A B

3.9.- WESTERN -BLOTTING

3.9.1.- PREPARACIÓN DEL TAMPÓN DE LISIS CELULAR

Se preparó una disolución de Hepes 20 mM, Triton X-100 al 0,5% (pH 7,4). Esta

disolución se guardó a 4ºC para su utilización posterior en los distintos experimentos.

A

FS

SS

1000

100

10

10 100 1000

1

(NONE)/OR-FL

(NONE)/GR-FL

(NONE)/OR-FL

1000

100

10

1

1 10 100 1000

(NONE)/GR-FL

B

C

Figura 23.- Activación de los hemocitos cultivados en medio L-15 suplementado con FCS durante tres días. A: Distribución de células presentes en hemolinfa de M. galloprovincialis B: Histograma de células no activadas C: Histograma de células activadas con un determinado efector

3.9.2.-TAMPÓN DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAS

Se preparó una disolución de MES 20 mM (pH 6,5), EGTA 10 mM, EDTA 2 mM,

sacarosa 250 mM, ? -mercaptoetanol 10 mM, glicerol 10%, Triton X-100 al 1%.

3.9.3.- PREPARACIONES DE LISADOS DE HEMOCITOS

Las suspensiones celulares de hemocitos obtenidas como se ha descrito

anteriormente (apartado 3.5) se lavaron con ALS, centrifugándose durante 5 min. a 7000

rpm y a temperatura ambiente. El sobrenadante se trasvasó a tubos eppendorf y se congeló

para su posterior utilización. El precipitado de células se resuspendió en 150 ? l de tampón

de lisis celular y se mantuvo 15 min. a 4ºC. Posteriormente se centrifugó durante 10 min. a

máxima velocidad retirando 120 ? l de sobrenadante a los que añadimos 25 ? l de Sample

Buffer (agua destilada 2 ml, tampón Tris HCl 1,5 mM (pH 8,8) 2 ml, solución SDS 10 %

1,6 ml, glicerol 1,3 ml, ? -mercaptoetanol 0,4 ml, bromofenolblue 0,05% 0,7 ml). El pellet

restante se resuspendió en 150 ? l del tampón de extracción de proteínas de membrana y se

mantuvo 15 min en agitación. Posteriormente se centrifugó durante 10 min. a máxima

velocidad retirando 120 ? l de sobrenadante a los que añadimos 25 ? l de Sample Buffer.

Las dos muestras (lisados de hemocitos y lisados de membranas) tratadas con Sample

Buffer se calentaron a 90-100ºC durante 5 min., e inmediatamente se enfriaron en hielo.

3.9.3.1.- Cromatografía de afinidad

En el caso particular de la PKA, las muestras de lisados de hemocitos y de

membranas se pasaron a través de dos resinas:

a) Resina SephadexTM G-25 Fine: para la dialización de las muestras.

b) Affi-gel Blue: con el fin de retener proteínas de la familia de la albúmina que

interferían debido a su tamaño con la subunidad reguladora de la PKA.

El tamaño de las columnas utilizadas fue de 9 cm de largo por 6 mm de diámetro.

El procedimiento se realizó de la siguiente manera:

Una vez preparadas las columnas con lana de vidrio en el extremo inferior, se

añadieron 500 ? l de la resina G-25, a continuación, lavamos dos veces con 500 ? l del

tampón A (tampón fosfato 20 mM pH 7,1).

Después de la filtración de las muestras a través de filtros de 0,45 ?m se añaden a

las columnas y se centrifugan a 8000 rpm durante 15 min. Una vez obtenidas las muestras

se les añade 100 ? l del tampón A y se pasan a través de columnas que contienen 500 ? l de

la resina Affi-gel Blue , previamente lavadas con el tampón A, se centrifugan a 8000 rpm

durante 15 min. y la muestra obtenida se trata con Sample Buffer, se calienta a 90 - 100ºC

durante 5 min. e inmediatamente se enfría en hielo.

3.9.4.- ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS EN GELES DE

POLIACRILAMIDA-DODECIL SULFATO SÓDICO (SDS-PAGE)

Se realizó según el método de Laemmli (1970) utilizando placas en las cuales se

construyen dos geles de diferentes concentraciones de acrilamida / bisacrilamida. Dichos

geles se prepararon a partir de las siguientes soluciones:

Solución Bis-acrilamida:

Acrilamida: N,N’- Metilenbisacrilamida

(Se utilizó una mezcla comercial de Bio-Rad 30% Acrilamida/Bis Solución 30:0,8)

Tampón Tris-HCl 1,5 M pH 8,8

(18,15 g de Tris en 100 ml de agua. Conservar a 4ºC).

Tampón Tris- HCl 0,5 M pH 6,8

(Se disuelven 6 g de Tris en un pequeño volumen de agua. Llevar el pH a 6,8 y

enrasar a 100 ml. Conservar a 4ºC).

Solución de SDS 10%

(Se pesa 1 g de SDS y se lleva a 10 ml. Conservar en alícuotas).

Tampón de muestra

Se realizó con los materiales que se describen a continuación y en las proporciones

indicadas para una muestra estándar:

Agua destilada 4 ml

Tris HCl 0,5 M pH 6,8 1,0 ml

Glicerol 0,8 ml

SDS 10% 1,6 ml

? - Mercaptoetanol 0,4 ml

0,05% bromofenol 0,2 ml

Tampón de electroforesis:

Se pesaron 15 g de Tris y 72 g de glicina. Al conjunto se añaden 5 g de SDS y la

mezcla se disolvió en 500 ml de agua. Se valora el pH que debe ser 8,3 y se enrasa la

solución a 1 litro. Esta solución debe diluirse cinco veces antes de utilizarse.

Solución de Persulfato amónico 10%:

(Se disuelven 0,025 g en 250 ? l de agua. Debe ser preparado diariamente)

Preparación del gel:

Todo el material debe ser limpiado cuidadosamente: cubetas, cristales, goma. Una

vez montados los cristales de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se deposita la

mezcla correspondiente al gel de poliacrilamida de la mayor proporción o gel separador. El

depósito se realizó con sumo cuidado, para no formar burbujas. Se añadió un poco de

isopropanol para evitar la formación del menisco y se esperó la polimerización. Una vez

polimerizado se retiró el agua y se depositó el segundo gel, de menor proporción de

acrilamida, o gel concentrador. En este mismo momento se introdujo entre los cristales, el

peine para formar los pocillos de muestra y se dejó polimerizar.

Preparación de los geles:

Gel separador (12%)

Agua milli QR 3,35 ml

Tampón Tris-HCl 1,5M pH 8,8 2,5 ml

Acrilamida 4 ml

SDS 10% 100 ? l

Temed 5 ? l

Persulfato amónico 50 ? l

Gel concentrador (4%)

Agua milli QR 6,1 ml

Tampón Tris-HCl 0,5M pH 6,8 2,5 ml

Acrilamida 1,3 ml

SDS 10% 100 ? l

Temed 10 ? l

Persulfato amónico 50 ? l

Una vez equilibrado el gel, se cargan las muestras y los marcadores de peso

molecular. Se cargó en cada calle el extracto citosólico obtenido a partir de 106 células. Se

rellenaron las cubetas con tampón y se conectó al alimentador de corriente.

La electroforesis se realizó durante unos 45-60 min con un voltaje de 180 V y en

cámara fría con el fin de compensar el aumento de temperatura que se produce por efecto

Joule.

Cuando el marcador de la electroforesis llega a unos dos milímetros del final del gel

se corta el paso de corriente y se extrae el gel para transferir las proteínas a una membrana

de nitrocelulosa, o bien para teñirlo con Coomassie (isopropanol 20%, ácido acético 7% y

coomassie blue R-250 1%) durante una media hora y después desteñirlo ( 400 ml metanol,

100 ml ácido acético, 500 ml Agua milli QR ) y secarlo en el secador de geles.

Como marcadores de peso molecular se utilizaron las siguientes proteínas: Miosina

(200 kDa), ? -galactosidasa (135 kDa), Seroalbúmina bovina (81 kDa), Anhidrasa

carbónica (41 kDa), Inhibidor de la tripsina de soja (31,4 kDa), Lisozima (18 kDa), y

Apoproteína (6,9 kDa) (Bio Rad Kaleidoscope Prestaines 161-0324).

3.9.5.- INMUNODETECCIÓN

Tras realizar la correspondiente electroforesis, las proteínas se transfirieron a una

membrana de nitrocelulosa de acuerdo con las condiciones del fabricante. Se sumergió el

sandwich con el gel de poliacrilamida y la membrana de nitrocelulosa en tampón de

transferencia (Tris-HCl 20 mM, glicina 150 mM y 20 % metanol pH 8) y se dejó durante

toda la noche con una corriente de 30 V. Tras la transferencia se recoge la membrana y los

lugares no específicos se bloquean mediante incubación con leche en polvo desnatada.

Para comprobar la bondad de la transferencia, la membrana puede ser teñida con

una solución al 0,1 % de Rojo Ponceau en ácido acético al 5 %.

Una vez realizada la transferencia y el bloqueo de la membrana con una solución de

leche descremada al 10 % en TTBS durante 3 a 5 horas a temperatura ambiente, se lavó la

membrana con TTBS durante un minuto para a continuación realizar dos lavados de 10

min.

TBS: Tris-HCl (pH 7,5) 20 mM, 0,15 M ClNa

TTBS: TBS + 0,05 % de Tween 20

Se incubó la membrana con anticuerpo anti IL-2R? diluido en TBS (1/1000)

durante una hora a temperatura ambiente. Seguidamente se lavó la membrana 1 minuto con

TTBS y se realizaron cuatro lavados de diez minutos con la misma solución

A continuación se incubó la membrana con el segundo anticuerpo (anti IgG de

conejo conjugado con peroxidasa (1/4000)) durante una hora a temperatura ambiente.

Se repitió el proceso con cuatro lavados de la forma realizada anteriormente y

finalmente se procedió al desarrollo del revelado por luminiscencia, en cámara oscura y

exponiendo una placa fotográfica durante un tiempo variable. Posteriormente la placa

fotográfica se reveló mediante un sistema automático.

Este proceso se realizó exactamente igual para las incubaciones de la membrana

con los anticuerpos: anti PKA (1/3000) y anti PKC (1/500) utilizando en el caso de la PKC

anti IgG de ratón conjugado con peroxidasa (1/4000) como segundo anticuerpo.

3.10.- DETECCIÓN DE CATECOLAMINAS

Las soluciones empleadas en la detección de catecolaminas fueron las siguientes:

Solución estándar: contiene 500 ? l de una solución de L-noradrenalina, L-

adrenalina y dopamina a una concentración de 100 ?gr/ml en glutation ácido. Conservar a -

20ºC.

Solución estabilizante: contiene 500 ? l de una solución ácida de glutation.

Conservar a -20ºC.

Solución tampón : contiene 2 ml de una solución Tris (pH 8,5) que contiene etileno

glicol-bis N,N'-ácido tretraacético (EGTA) y MgCl2. Conservar a -20ºC.

Solución trazadora ([3H] SAM): contiene S-adenosil-L-[metil-3H]-metionina, 9,25

MBq, 25 ? l Ci en HCl: etanol (9:1) (pH 2,1). Conservar a -20ºC.

Solución COMT: contiene 500 ? l de una solución de catecol-O-metiltrasferasa de

hígado de rata en tampón Tris conteniendo glutation, dihidrocloruro de bencilhidroxiamina

y ditiotreitol. Conservar a -20ºC.

Solución stop: contiene 5 ml de una solución de normetanefrina, metanefrina y

metoxitiramina (4 mM) en tampón que contiene EDTA a pH 11. Conservar a -20ºC.

Solución metaperiodato: contiene 10 ml de una solución al 4 % (w/v) de

metaperiodato de sodio. Conservar a -20ºC.

Solución glicerol: contiene 10 ml de una solución al 10 % (v/v) de glicerol.

Conservar a -20ºC.

Una vez obtenido el sobrenadante del cultivo celular como se ha descrito

anteriormente (apartado 3.9.3) se añaden 20 ? l de la mezcla EGTA/glutation reducido (90

mg/ml EGTA, 60 mg/ml glutation, pH 7,4) por cada ml de muestra. A continuación se

lleva a cabo la mezcla de reacción.

Al blanco se le añade 50 ? l de FCS y 10 ? l de la solución estabilizante (1/10000).

A las muestras se les añade 50 ? l del sobrenadante del cultivo celular y 10 ? l de la

solución estabilizante y a los estándars se les añade 50 ? l de sobrenadante y 10 ? l de la

solución estándar (1/10000). Para finalizar la mezcla de reacción se les añade a todas las

muestras 40 ? l del reactivo mezcla que contiene agua destilada, solución tampón, solución

trazadora y solución COMT. Posteriormente se centrifuga a 300g durante 30 seg., se

incuba una hora a 37ºC, y se llevan los tubos a un baño con hielo. A continuación, se añade

50 ? l de solución stop y 2 ml de la mezcla tolueno-isoamilalcohol (3:2 v/v) a todas las

muestras, se mezclan vigorosamente y se centrifugan a 800g durante 2 min., se congelan

15 seg. en nitrógeno líquido y se decanta la fase orgánica superior en tubos con 100 ? l de

ácido acético 0,1 M y se repite el proceso de mezcla, centrifugación y congelación en

nitrógeno líquido. En el siguiente paso se descarta la fase superior orgánica, se deshiela la

fase acuosa del ácido acético, se añade 1 ml de tolueno-isoamilalcohol y a continuación se

mezcla, centrifuga, congela, y se descarta la fase orgánica superior. Se añade 100 ? l de

etanol absoluto sobre el ácido acético descongelado, se mezcla y se centrifuga a 800g

durante 1 min. A continuación se aplica toda la mezcla en el extremo inferior de la placa

cromatográfica y una vez seca se coloca la placa en el tanque que contiene

alcohol/benceno/metilamina (6:2:3 v/v). Después de que el solvente llege al extremo

superior de la placa, se quita del tanque, se seca y se visualiza a 254 nm, se marca la zona

del silicagel correspondiente a cada catecolamina, se raspa la placa introduciendo el

silicagel en el vial correspondiente y se analiza el contenido de cada catecolamina de

manera diferente:

DOPAMINA

Se añade 1 ml de hidróxido de amonio a cada vial y 4 ml de líquido de centelleo.

ADRENALINA

Se añade 1 ml de hidróxido de amonio a cada vial, 50 ? l de la solución de

metaperiodato de sodio, 50 ? l de glicerol, 1 ml de ácido acético y 2 ml del líquido de

centelleo.

NORADRENALINA

Se añade 1ml de hidróxido de amonio a cada vial, 50 ? l de la solución

metaperiodato de sodio, 50 ? l de glicerol, 1 ml de ácido acético y 2 ml del líquido de

centelleo.

Finalmente se obtuvieron las cuentas por minuto (cpm) en el contador de partículas

? .

Para el cálculo de la concentración de catecolaminas (pg/ml) se utilizó la fórmula:

3.11.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para calcular los valores promedio de la concentración de las diferentes

catecolaminas se utilizó la prueba T de Student.

Los valores promedio, error estándar, así como la prueba T se realizaron con el

paquete estadístico SPSS 10.1 (SPSS Inc.)

cpm (muestra) - cpm blanco

cpm (muestra + estándard) - cpm muestra

pg estándard

vol. muestra (ml)

x

RESULTADOS

4.- RESULTADOS

4.1.- ESTUDIO DE POBLACIONES CELULARES EN HEMOLINFA DE

MEJILLÓN.

En la hemolinfa de M. galloprovincialis Lmk. se han detectado dos tipos diferentes

de células. En primer lugar, un grupo de células pequeñas redondeadas (células RH)

(figura 24), con un núcleo muy grande y un pequeño volumen de citoplasma que a veces

es tan sólo un halo alrededor del núcleo.

El segundo tipo de células encontradas en la hemolinfa de M. galloprovincialis

presentan un mayor tamaño y un citoplasma expandido (células SH) (figura 25).

.

Figura 24.- Células RH de hemolinfa de Mytilus galloprovincialis Lmk.

4.2.- CULTIVO DE HEMOCITOS DE M. GALLOPROVINCIALIS.

Para el mantenimiento del medio de cultivo en condiciones óptimas se realizó un

antibiograma (tabla 5) en el que se observa que las bacterias presentes en la hemolinfa de

ANTIBIÓTICOS GRAM + GRAM –

AMPICILINA S R

GENTAMICINA S S

CANAMICINA S S

TETRACICLINA S S

ÁCIDO NALIDÍXICO R R

CLORANFENICOL S S

NITROFURANTOÍANA R R

TRIMETROPÍN S R

CEFATAXINA S R

CEFOSITINA S R

Tabla 5 .- R: resistente S: sensible.

Figura 25.- Células SH de hemolinfa de Mytilus galloprovincialis Lmk.

los mejillones son sensibles a la gentamicina, de ahí que se incorpore al medio de cultivo

este antibiótico. Además también se añadió anfotericina B para evitar el crecimiento de

hongos.

Las figuras 26 y 27 muestran la viabilidad de células mantenidas en medio de

cultivo L-15 con FCS y hemolinfa, respectivamente. Esta viabilidad dependió de las

concentraciones de anfotericina B añadidas al medio, obervándose una mayor viabilidad

(más de 36 días) con la menor concentración del antifúngico.

Figura 26.- Viabilidad expresada en días, de las células mantenidas en medio de cultivo L-15 suplementado con FCS.

0

1

2

3

0 7 17 27 36

DÍAS DE CULTIVO

Nº

DE

CÉ

LULA

(X

1O6

)

Anfotericina B 1 µg/mlAnfotericina B 0,5 µg/mlAnfotericina B 0,25 µg/mlAnfotericina B 0,1 µg/ml

Figura 27.-Viabilidad expresada en días, de las células mantenidas en medio de cultivo L-15 suplementado con hemolinfa.

0

1

2

3

0 7 17 27 36

DÍAS DE CULTIVO

Nº

DE

CÉ

LU

LA

S (X

106 )

Anfotericina B 1µg/ml

Anfotericina B 0,5 µg/ml

Anfotericina B 0,25 µ/ml

Anfotericina B 0,1 µg/ml

Por otra parte, en las figuras 28 y 29 se puede observar, a través de la expresión de

la cadena ? del receptor de IL-2 (con o sin estimulación), una mayor respuesta al tercer

día de cultivo en L-15 suplementado con FCS o hemolinfa respectivamente.

Figura 28.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se activaron incubándose con IL-2 (0,01?g/ml) durante 15 min, manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

20

40

1 3 5 7 9

DÍAS DE CULTIVO

AC

TIV

AC

IÓN

(%)

CONTROL

CÉLULAS ACTIVADAS

Figura 29.-Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se activaron incubándose con IL-2 (0,01?g/ml) durante 15 min, manteniéndose en medio L-15 con hemolinfa.

0

4

8

12

16

1 3 5 7 9

DÍAS DE CULTIVO

AC

TIV

AC

IÓN

(%)

CONTROL

CÉLULAS ACTIVADAS

4.3.- ESTUDIO DEL EFECTO DE DIVERSOS EFECTORES EN

HEMOCITOS DE MEJILLÓN EN DIFERENTES ÉPOCAS DEL AÑO.

4.3.1.- LPS

Después de incubar los hemocitos con LPS (5 ?g/ml) en el período invernal no se

observan cambios en el patrón electroforético (figura 30), ni en la expresión de la cadena

? del receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 31).

Sin embargo por citometría (figura 32) se observa un incremento en la

concentración de esta subunidad a los 30 segundos de incubación con dicho efector.

6

3

Figura 30.- Electroforesis de células activadas con LPS. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min

5

C C C M M M

1 2 4 6 MA

Figura 31.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-IL-2R? Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.

M

3

50 kDa

2

C C C

1 4 5

M M

6

Como se muestra en la figura 33 al estudiar por western blotting la expresión de la

subunidad reguladora de la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) no se observan

diferencias al incubar los hemocitos con LPS, siendo mayor su expresión en el extracto

citosólico que en la membrana, no obstante para la proteína quinasa C (figura 34) se

observa un aumento en la expresión de esta enzima en el extracto citosólico de hemocitos,

pero la translocación de la enzima a la membrana en células activadas durante 30 minutos

y 30 segundos se inhibe.

Figura 32.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con LPS a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS

Figura 33.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

54 kDa

C C C M M M

Figura 34.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

020406080

100120

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

INVIERNO

Además, en células estimuladas con LPS y puestas en contacto con

Bisindolilmaleimida I (inhibidor de la PKC) (figura 35) se observa que el efecto provocado

por el LPS desaparece.

Este efector también conduce a una liberación de catecolaminas (tabla 6),

observándose un incremento en la liberación de Dopamina y Noradrenalina a los 30

minutos de estimulación, mientras que para la Adrenalina el mayor incremento se produce

a los 60 minutos de incubar las células con dicho efector.

105

Figura 35.- Western blotting de hemocitos estimulados con LPS e incubados con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 60 min. 3 y 6 Células activadas con LPS y BISINDOLILMALEIMIDA durante 60 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

108

kDa

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

2114,45 ? 0,45 ***

160,10 ? 0,10***

3377,25 ? 0,25***

60 MINUTOS

435,02 ? 0,02 ***

234,28 ? 0,28***

931,25 ? 0,25***

Sin embargo, como se puede observar en la tabla 7, las células estimuladas con

LPS y tratadas con inhibidores de la PKC, PKA y proteínas G pierden la capacidad de

liberar catecolaminas.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

LPS

435,02 ?0,02

234,28 ? 0,28

931,25 ? 0,25

LPS + BSM

10,18 ? 0,18***

9,03 ? 0,03***

16,10 ? 0,10***

LPS + H-89

ND

16,10 ? 0,10***

ND

LPS + SURAMINA

ND

ND

ND

Tabla 6.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con LPS en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001). ND: no detectado.

Tabla 7.-: Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con LPS y el inhibidor correspondiente durante 60 minutos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (***p < 0,001) ND: no detectado.

Con respecto a los hemocitos estimulados con LPS durante el período estival

tampoco se han observado cambios en el patrón electroforético (figura 36), sin embargo

después de un período de estimulación de 30 segundos y 30 minutos se observa una mayor

expresión de IL-2R? en el citoplasma celular (figura 37).

En estudios de citometría (figura 38) se ha observado que este efector induce un

incremento en la concentración de la cadena ? del receptor de IL-2 en la membrana celular

después de 3 y 60 minutos de estimulación.

3

Figura 36.- Electroforesis de células activadas con LPS. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.

5

C C C M M M

1 2 4 6 MA

Figura 37.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 60 min.

2 3

50 kDa

1 4 5 6

C C C M M M

Figura 38.- Porcentaje de células que expresan la cadena ?del receptor de IL-2. Las células se incubaron con LPS a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

10

20

30

40

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

VERANO

Por otra parte, al estudiar por western blotting la expresión de la subunidad

reguladora de la PKA (figura 39) no se observan diferencias, sin embargo, la concentración

de la PKC (figura 40) disminuye en el extracto citosólico al incubar los hemocitos con

LPS, mientras que en la membrana desaparece.

Como se puede observar en la tabla 8 durante este período la liberación de

catecolaminas inducida por LPS es menor que en invierno.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

67,09 ? 0,09***

1,01 ? 0,01***

32,27 ? 0,27***

60 MINUTOS

110,34 ? 0,34***

45,11 ? 0,11***

200,15 ? 0,15***

Tabla 8.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con LPS en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (***p < 0,001). ND: no detectado.

Figura 39.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-PKA Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.

54 kDa

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

108

Figura 40.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

4.3.2.- CRF

En el período invernal, después de la incubación de los hemocitos con CRF (100

ng/ml), no se observan cambios en el patrón electroforético (figura 41), sin embargo se

observa una mayor expresión de la cadena ? del receptor de IL-2 en el extracto citosólico,

después de un período de estimulación de 30 minutos (figura 42).

En estudios citométricos, (figura 43) este efector induce un aumento en la expresión

de IL-2R? en la membrana, después de 30 segundos y 60 minutos de incubación.

1 2 3 4 5 6

Figura 42.- Células activadas con CRF e incubadas con anti -IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.

50 kDa

C C C M M M

Figura 41.- Electroforesis de células activadas con CRF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.

1

M

3 5

C C C M M

2 4 6 MA

Como se muestra en la figura 44 al estudiar por western blotting la expresión de la

subunidad reguladora de la proteína quinasa A, se detecta su presencia en el citosol y la

membrana, sin embargo, en el estudio de la proteína quinasa C (figura 45) se detecta una

translocación del citosol a la membrana en hemocitos incubados con dicho efector durante

30 minutos.

Figura 43.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con CRF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

Figura 44.- Células activadas con CRF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

54 kDa

Figura 45.- Células activadas con CRF e incubadas con anti- PKC. Calles 1 a 3 : Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

0

20

40

60

80

100

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

INVIERNO

Como se observa en la tabla 9 la liberación de catecolaminas inducida por CRF es

bastante baja.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

19,33 ? 0,33***

11,26 ? 0,26**

37,03 ? 0,03***

60 MINUTOS

11,45 ? 0,45**

ND

0,23 ? 0,23 ns

Después de incubar los hemocitos con CRF en el período estival, no se observan

cambios en el patrón electroforético (figura 46), ni en la expresión de la cadena ? del

receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 47).

Tabla 9.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con CRF en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001, **p < 0,01, ns: no significativo). ND: no detectado.

50kDa

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

Figura 47.- Células activadas con CRF e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min. Figura 46.- Electroforesis de células activadas

con CRF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min

1

M

3 5

C C C M M

2 4 6 MA

Por citometría de flujo, (figura 48) se observa que el CRF induce un incremento en

la concentración de la subunidad ? de dicho receptor depués de 5 y 60 minutos de

estimulación.

Como se puede observar en la figura 49 en hemocitos estimulados con CRF no se

detectan diferencias en la expresión de la subunidad reguladora de la PKA, mientras que

para la PKC (figura 50) se aprecia una disminución de la expresión de la enzima en la

membrana en hemocitos incubados durante 30 segundos y 30 minutos.

Figura 49.- Células activadas con CRF e incubadas con anti-PKA Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.

54 kDa

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

108

Figura 50.- Células activadas con CRF e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.

M

1 2 3 4 5 6

C C C M M

kDa

105

Figura 48.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con CRF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

10

20

30

40

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

VERANO

Además, la liberación de catecolaminas también es nula en esta época del año.

4.3.3.- ACTH

En hemocitos estimulados con ACTH (100 ng/ml) en invierno, (figura 51) no se

observan cambios en el patrón de proteínas, ni en la expresión de la cadena ? del receptor

de IL-2 en el extracto citosólico (figura 52).

Sin embargo, como se puede observar en la figura 53, por citometría de flujo dicho

efector induce un aumento de IL-2R? después de la incubación de las células durante 1 y

15 minutos.

Figura 52.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.

C

1 2 3 4 5 6

C C M M M

50 kDa

Figura 51.- Electroforesis de células activadas con ACTH. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.

1 3 5

C C C M M M

2 4 6 MA

Como se puede observar en las figuras 54 y 55, en células activadas con ACTH no

se observan diferencias en la expresión de la PKA mientras que la PKC desaparece en la

membrana.

No obstante, en relación a la liberación de catecolaminas (tabla 10), se observa una

mayor liberación de Adrenalina a los 60 minutos y de Noradrenalina y Dopamina a los 30

minutos de incubación con dicho efector.

Figura 55.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

Figura 54.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.

C

1 2 3 4 5 6

C C M M M

50 kDa

Figura 53.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con ACTH a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

20

40

60

80

100

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

INVIERNO

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

70,02 ? 0,02***

25,28 ? 0,28***

213,13 ? 0,13***

60 MINUTOS

49,35 ? 0,35***

69,18 ? 0,18***

104,08 ? 0,08***

En verano, tampoco se han detectado cambios en el patrón electroforético (figura

56), sin embargo, después de un período de estimulación de 30 minutos se observa una

disminución en la expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2 en el extracto

citosólico (figura 57).

Tabla 10.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con ACTH en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001). ND: no detectado.

50kDa

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

Figura 57.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.

Figura 56.- Electroforesis de células activadas con ACTH. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.

1 3 5

C C C M M M

2 4 6 MA

Por otra parte, como se observa en la figura 58, estudios de citometría han revelado

un incremento máximo en la expresión de IL-2R? en la membrana celular después de

incubar las células durante 3 minutos.

En hemocitos estimulados con ACTH (figura 59) no se observan diferencias en la

expresión de la subunidad reguladora de la proteína quinasa A, sin embargo (figura 60) al

estudiar la proteína quinasa C se detecta una disminución de la enzima en el citosol y una

clara translocación a la membrana en células incubadas durante 30 minutos con dicho

efector.

Figura 59.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

54 kDa

Figura 60.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.

105

1 2 3 4 54

6

C C C M M M

108

kDa

Figura 58.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con ACTH a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS

0

10

20

30

40

50

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

VERANO

Como se observa en la tabla 11 , este efector induce además una mayor liberación

de Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina después de 30 minutos de incubación.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

20,45 ? 0,45**

69,27 ? 0,27**

68,32 ? 0,32***

60 MINUTOS

5,39 ? 0,39**

ND

38,40 ? 0,40***

4.3.4.- ACTH 1-24

Después de incubar los hemocitos con ACTH 1-24 (10 ?g/ml) en el período

invernal, (figura 61) no se observan cambios en el patrón electroforético, ni en la

expresión de la cadena ? del receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 62).

Tabla 11.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con ACTH en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedios ? error estándar de seis ensayos (***p < 0,001, **p < 0,01). ND: no detectado.

Sin embargo por citometría, (figura 63) se observa un máximo en la concentración

de IL-2R? después de incubar las células durante 1 minuto con dicho efector.

Figura 63.- Porcentaje de células que expresan la cadena ?del receptor de IL-2. Las células se incubaron con ACTH 1-24 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

Figura 62.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

50 kDa

3

Figura 61.- Electroforesis de células activadas con ACTH 1-24. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min

5

C C C M M M

1 2 4 6 MA

0

20

40

60

80

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

INVIERNO

Como se puede observar en las figuras 64 y 65, al estudiar por western blotting la

expresión de la subunidad reguladora de la proteína quinasa A, no se detectan diferencias

en su expresión citosólica, mientras que la PKC desaparece en la membrana.

Como se observa en la tabla 12, el ACTH 1-24 induce un incremento en la

liberación de Noradrenalina después de la incubación de las células durante 60 minutos,

mientras que, la liberación de Dopamina y Adrenalina es nula.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

ND

ND

11,18 ? 0,18***

60 MINUTOS

ND

ND

219,03 ? 0,03***

Tabla 12.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con ACTH 1-24 en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001). ND: no detectado.

Figura 64.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

54 kDa

C C C M M M

Figura 65.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

Con respecto a los hemocitos estimulados con ACTH 1-24 durante el período

estival, (figura 66) tampoco se han observado cambios en el patrón electroforético, sin

embargo, como se observa en la figura 67, después de un período de incubación de 30

minutos la IL-2R? no se detecta en el citoplasma celular.

En estudios de citometría, se ha observado que este efector induce un máximo

incremento en la expresión de dicha subunidad después de 30 minutos de incubación

(figura 68).

Figura 66.- Electroforesis de células activadas con ACTH 1-24. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min

5

C C C M M M

1 2 4 6 MA 3

Figura 67.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti- IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

50 kDa

Por otra parte, al estudiar la expresión de la subunidad reguladora de la PKA (figura

69), no se observan diferencias en su expresión, sin embargo la concentración de la PKC

disminuye en el extracto citosólico y desaparece en la membrana (figura 70).

Figura 68.- Porcentaje de células que expresan la cadena ?del receptor de IL-2. Las células se incubaron con ACTH 1-24 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

Figura 69.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-PKA Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.

54 kDa

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

108

Figura 70.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

0

10

20

30

40

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

VERANO

Como se puede observar en la tabla 13, en este período del año la liberación de

catecolaminas inducidas por ACTH 1-24 es baja.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

5,43 ? 0,43**

21,20 ? 0,20***

ND

60 MINUTOS

11,37 ? 0,37**

23,22 ? 0,22***

ND

4.3.5.- PDGF

En el período invernal, después de la incubación de los hemocitos con PDGF

(5 ng/ml) (figura 71) no se observan cambios en el patrón de proteínas, ni en la expresión

de la cadena ? del receptor de IL-2 (figura 72).

Tabla 13.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con ACTH 1-24 en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001, ** p < 0,01). ND: no detectado.

Sin embargo, como se observa en la figura 73, por citometría se detecta un

incremento significativo en la expresión de la IL-2R? después de la incubación de las

células durante 5 minutos.

Figura 72.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-IL-2R? Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.

M

3

50 kDa

2

C C C

1 4 5

M M

6

Figura 71.- Electroforesis de células activadas con PDGF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.

1

M

3 5

C C C M M

2 4 6 MA

Figura 73.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con PDGF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

20

40

60

80

100

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

INVIERNO

Como se observa en la figura 74, en células activadas con PDGF no se detectan

cambios en la expresión de la subunidad reguladora de la PKA y tampoco en la expresión

de la PKC en el citosol, mientras que en membrana esta última desaparece (figura 75).

Como se observa en la figura 76, la translocación de la PKC a la membrana en

células activadas durante 60 minutos se inhibe, sin embargo, en células estimuladas con

PDGF y puestas en contacto con Bisindolilmaleimida I el efecto provocado por dicho

efector desaparece.

Figura 74.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calless 4 a 6: Membrana 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

54 kDa

C C C M M M

Figura 75.- Células activadas con PDGFe incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

108

Figura 76.- Western blotting de hemocitos estimulados con PDGF e incubados con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 60 min. 3 y 6 Células activadas con PDGF y BISINDOLILMALEIMIDA durante 60 min.

C C C M M M

1 2 3 4 5 6

105

kDa

Como se observa en la tabla 14, el PDGF también conduce a una mayor liberación

de Dopamina y Noradrenalina a los 30 minutos de incubación.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

316,40 ? 0,40***

ND

552,45 ? 0,45***

60 MINUTOS

217,45 ? 0,45***

ND

203,44 ? 0,44***

Sin embargo, cuando las células son estimuladas con PDGF y tratadas con

inhibidores de la PKC, PKA y proteinas G, los niveles de Dopamina y Noradrenalina

disminuyen mientras que los de adrenalina aumentan (tabla 15).

Tabla 14.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con PDGF en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001). ND: no detectado.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

PDGF

217,45 ? 0,45

ND

203,44 ? 0,44

PDGF + BSM

ND

9,48 ? 0,48**

72,22 ? 0,22***

PDGF+H-89 50,40 ? 0,40*** 5,34 ? 0,34**

96,10 ? 0,10***

PDGF+ SURAMINA 3,21 ? 0,21*** 32,50 ? 0,50*** 107,49 ? 0,49***

Con respecto a los hemocitos estimulados con PDGF durante el período estival,

(figura 77) tampoco se han observado cambios en el patrón electroforético, ni en la

expresión de IL-2R? , sin embargo, se observa un disminución en la concentración de la

subunidad después de un período de estimulación de 30 minutos (figura 78).

Tabla 15.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con PDGF y elinhibidor correspondiente durante 60 min. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001, **p <0,01). ND: no detectado.

50 kDa

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

Figura 78.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.

Figura 77.- Electroforesis de células activadas con PDGF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.

1

M

3 5

C C C M M

2 4 6 MA

En estudios de citometría se ha observado que el incremento de la expresión de IL-

2R? después de la incubación de las células durante 5 y 60 minutos es menor que la

observada en invierno (figura 79).

En células activadas con PDGF, figura 80 y 81, no se observan diferencias en la

expresión de la subunidad reguladora de la PKA, sin embargo, este efector parece bloquear

la expresión de la PKC.

Figura 80.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

54 kDa

C C C M M M

Figura 81.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

Figura 79.- Porcentaje de células que exp resan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con PDGF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

10

20

30

40

50

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

VERANO

Como se observa en la tabla 16, el PDGF induce una mayor liberación de

catecolaminas después de 30 minutos de incubación con dicho efector.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

56,19 ? 0,19***

36,36 ? 0,36***

115,38 ? 0,38***

60 MINUTOS

28,42 ? 0,42***

ND

15,14 ? 0,14***

4.3.6.- TGF-ß1

En hemocitos estimulados con TGF-? 1 (0,1 ng/ml) en invierno, no se observan

cambios en el patrón de proteínas (figura 82), ni en la expresión de la cadena ? del

receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 83).

Tabla 16.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con PDGF en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001). ND: no detectado.

Sin embargo por citometría de flujo, dicho efector induce un aumento de IL-2R?

después de 30 minutos de incubación con dicho efector (figura 84).

50kDa

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

Figura 83.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.

Figura 82.- Electroforesis de células activadas con TGF-?1. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.

1 3 5

C C C M M M

2 4 6 MA

Figura 84.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con TGF-?1 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

20

40

60

80

100

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

INVIERNO

Como se observa en las figuras 85 y 86, en células activadas con TGF-? 1 no se

observan diferencias en la expresión de la subunidad reguladora de la PKA ni en la

expresión de la PKC, mientras que en la membrana esta última desaparece.

Sin embargo, con respecto a la liberación de catecolaminas se observa, (tabla 17)

una mayor liberación de Dopamina y Adrenalina a los 30 minutos y de Noradrenalina a los

60 minutos de incubación con dicho efector.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

109,10 ? 0,10***

220,10 ? 0,10***

24,23 ? 0,23***

60 MINUTOS

102,45 ? 0,45***

61,14 ? 0,14***

143,12 ? 0,12***

Tabla 17.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con TGF-?1 en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( *** p < 0,001). ND: no detectado.

Figura 86.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

Figura 85.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3:Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.

C M

5 1 2 3 4 6

C C M M

54 kDa

En verano como se observan en las figuras 87 y 88, tampoco se han detectado

cambios en el patrón electroforético, sin embargo este efector parece bloquear la expresión

de la IL-2R? .

Estudios de citometría han revelado que este efector induce una mayor

concentración de la cadena ? del receptor de IL-2 en la membrana celular, después de 30

segundos de incubación (figura 89).

Figura 88.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

50 kDa

Figura 89.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con TGF-?1 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

10

20

30

40

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

VERANO

Figura 87.- Electroforesis de células activadas con TGF-?1. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.

1 3 5

C C C M M M

2 4 6 MA

En hemocitos estimulados con TGF-? 1 no se observan diferencias en la expresión

de la subunidad reguladora de la PKA, ni en la expresión de la PKC (figuras 90 y 91 ).

Este efector induce un incremento en la liberación de Dopamina y Adrenalina y un

descenso en la liberación de Noradrenalina después de incubar los hemocitos durante 60

minutos (tabla 18).

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

17,40 ? 0,40**

18,30 ? 0,30***

32,03 ? 0,03***

60 MINUTOS

7602,10 ? 0,10***

61490,10 ? 0,10***

ND

Figura 90.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg.

3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

54 kDa

C C C M M M

Figura 91.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

108 105

kDa

Tabla 18.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con TGF-?1 en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001, **p < 0,01). ND: no detectado.

4.3.7.- EGF

En el período invernal, después de la incubación de los hemocitos con EGF (50

ng/ml) no se observan cambios en el patrón de proteínas, ni en la expresión de la cadena ?

del receptor de IL-2 (figuras 92 y 93).

Sin embargo por citometría (figura 94) se ha detectado un incremento significativo

en la expresión de IL-2R? a los 30 minutos de incubación.

Figura 93.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-IL-2R? Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.

6

M

3

50 kDa

2

C C C

1 4 5

M M

Figura 92.- Electroforesis de células activadas con EGF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.

1

M

3 5

C C C M M

2 4 6 MA

Figura 94.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con EGF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

20

40

60

80

100

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

INVIERNO

Como se observa en las figuras 95 y 96, en células activadas con EGF no se

detectan cambios en la expresión citosólica de la subunidad reguladora de la PKA, ni en la

expresión de la PKC, mientras que en la membrana la PKC desaparece y la liberación de

catecolaminas es nula.

En el período estival tampoco se han observado cambios en el patrón

electroforético (figura 97) ni en la expresión de la IL-2R? (figura 98).

Figura 95.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

54 kDa

C C C M M M

Figura 96.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

1 2 3 4 5 6

Figura 98.- Células activadas con EGF e incubadas con anti -IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.

50 kDa

C C C M M M

Figura 97.- Electroforesis de células activadas con EGF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.

1

M

3 5

C C C M M

2 4 6 MA

Sin embargo, por citometría (figura 99) se observa un aumento significativo en la

concentración de la subunidad ? en la membrana celular después de un período de

estimulación de 30 minutos.

En células activadas con EGF no se observan diferencias en la expresión de la

subunidad reguladora de la PKA (figura 100), sin embargo al estudiar la PKC se detecta

una clara translocación del citosol a la membrana en células activadas durante 30 minutos

(figura 101). Este efector no induce liberación de catecolaminas.

Figura 100.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

54 kDa

Figura 101.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

Figura 99.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con EGF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

10

20

30

40

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

VERANO

4.3.8.- IL-2

Después de incubar los hemocitos con IL-2 (0,01 ?g/ml) en el período invernal no

se observan cambios en el patrón electroforético (figura 102), ni en la expresión de la

cadena ? del receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 103).

Figura 102.- Electroforesis de células activadas con IL-2. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.

3 5

C C C M M M

1 2 4 6 MA

1 2 3 4 5 6

50 kDa

C C C M M M

Figura 103.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.

Sin embargo, por citometría se observa un incremento significativo en la expresión de la

cadena ? de IL-2R después de la incubación de las células durante 3 y 60 minutos (figura

104).

Al estudiar por western blotting la subunidad reguladora de la PKA, no observamos

diferencias en su expresión (figura 105), no obstante en el caso de la proteína quinasa C, se

observa la desaparición de la enzima en el citosol y su aparición en la membrana después

de incubar las células durante 30 minutos (figura 106).

Figura 105.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

54 kDa

Figura 106.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durnate 30 min.

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

108 105

Figura 104.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con IL-2 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0102030405060

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

INVIERNO

Como se observa en la tabla 19, este efector también conduce a una liberación de

Adrenalina y Noradrenalina después de 60 minutos de incubación.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

ND

ND

ND

60 MINUTOS

ND

70,10 ? 0,10***

21,40 ? 0,40***

Sin embargo, en células estimuladas con IL-2 se observa un incremento en la

liberación de Dopamina y Noradrenalina cuando se añade un inhibidor de la PKC, mientras

que la adición de inhibidores de PKA y proteínas G provocan una disminución

significativa en la producción de adrenalina y noradrenalina (tabla 20).

Tabla 19.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con IL-2 en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001). ND: no detectado.

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

IL-2

ND

70,10 ? 0,10

21,40 ? 0,40

IL-2 + BSM

31,45 ? 0,45***

ND

106,01 ? 0,01***

IL-2+H-89 ND 47,10 ? 0,10***

3,07 ? 0,07***

IL-2+ SURAMINA ND 3,25 ? 0,25*** ND

Con respecto a los hemocitos estimulados con IL-2 durante el período estival

tampoco se han observado cambios en el patrón electroforético (figura 107), ni en la

expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2, siendo su expresión menor en la

membrana (figura 108).

Tabla 20.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con IL-2 y el inhibidor correspondiente durante 60 min. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis

ensayos (***p < 0,001). ND: no detectado.

En estudios de citometría, se observa una mayor expresión de IL-2R? a los 3 y 15

minutos de incubación con la citoquina (figura 109).

Figura 107.- Electroforesis de células activadas con IL-2. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.

3 5

C C C M M M

1 2 4 6 MA

1 2 3 4 5 6

50 kDa

C C C M M M

Figura 108.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.

Figura 109 .- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con IL-2 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.

0

10

20

30

40

50

0 0,5 1 3 5 15 30 60

TIEMPO (minutos)

% A

CT

IVA

CIÓ

N

VERANO

Por otra parte, al estudiar por western blotting la expresión de la subunidad

reguladora de la PKA no se detectan cambios (figura 110), sin embargo, al incubar los

hemocitos con IL-2 se observa que la PKC (figura 111) desaparece en la membrana.

La IL-2 también conduce a una ligera liberación de Adrenalina a los 30 minutos

mientras que para la Dopamina y Noradrenalina el incremento se produce a los 60 minutos

de incubación con dicho efector (tabla 21).

DOPAMINA

(pg/ml)

ADRENALINA

(pg/ml)

NORADRENALINA

(pg/ml)

CONTROL

ND

ND

ND

30 MINUTOS

3,13 ? 0,13**

3,10 ? 0,10**

ND

60 MINUTOS

14,17 ? 0,17***

ND

60,16 ? 0,16**

Tabla 21.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con IL-2 en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (***p < 0,001, **p < 0,01). ND: no detectado.

Figura 110.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.

1 2 3 4 5 6

54 kDa

C C C M M M

Figura 111.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.

108

1 2 3 4 5 6

C C C M M M

105

kDa

DISCUSIÓN

5.- DISCUSIÓN

En la hemolinfa de Mytilus galloprovincialis Lmk. se han detectado dos tipos

diferentes de células. En primer lugar, un grupo de células pequeñas redondeadas (células

RH), con un núcleo muy grande y un pequeño volumen de citoplasma que a veces es tan

solo un halo alrededor del núcleo (figura 24), su morfología es similar a la de las células

RH aisladas a partir de la hemolinfa del gusano Planorbarius corneus (Ottaviani, E., 1998)

o a la de los hialinocitos aislados de la hemolinfa de Mytilus edulis utilizando gradientes de

percoll (Pipe, R. K. et al., 1997).

El segundo tipo de células encontradas en la hemolinfa de M. galloprovincialis

presenta un mayor tamaño y un citoplasma expandido (células SH) (figura 25). Éstas son

muy parecidas a las células SH aisladas de P. corneus (Ottaviani, E., 1983) y recuerdan la

estructura de los macrófagos de vertebrados y de eosinófilos detectados y obtenidos

mediante gradientes de percoll en M. edulis (Pipe, R.K. et al., 1997).

El estudio de enfermedades que afectan a especies de moluscos comercialmente

importantes, ha estado impedido por la falta de sistemas de cultivo apropiados. El cultivo

"in vitro" de células de moluscos marinos ha sido abordado por varios investigadores pero

con éxito limitado (Power, A. et al., 1998). En los últimos años se han desarrollado

cultivos primarios de células de glándula digestiva y de manto de varios moluscos marinos

(Lebel, J.H. et al., 1996; Mortensen, S.H. y Glette, J., 1996). En M. galloprovincialis se

estudió el efecto de diversas citoquinas y otros efectores en la respuesta inmune de

hemocitos. Estas poblaciones no fueron homogéneas ni estables (Ottaviani, E. et al.,

1995b, 1998). Carballal, M.J. et al., (1997) alcanzó una mayor aproximación usando

explantos de hemocitos de mejillón.

Con nuestro método, no se observa una disminución significativa en el número de

células vivas hasta el día 20 de cultivo (figuras 26 y 27). Cuando las células se mantienen

en medio de cultivo con FCS inactivado su supervivencia es similar a la obtenida

utilizando como suplemento hemolinfa inactivada. Es posible que la hemolinfa de

moluscos marinos, al igual que el FCS, contenga ciertos factores de crecimiento que

pueden contribuir a una mayor viabilidad celular (Domart-Coulon, I. et al., 1994; Lebel,

J.H. et al., 1996; Mortensen, S.H. y Glette, J., 1996).

Para mantener la supervivencia celular, es importante que el medio de cultivo no

altere las propiedades de las células. Con frecuencia, la eficiencia fagocitaria de los

hemocitos es usada como control (Lebel, J.H. et al., 1996; Mortensen, S.H. y Glette, J.,

1996). En nuestro caso, optamos por medir la activación celular valorando la expresión de

la cadena ? del receptor de IL-2 (Barcia, R. et al., 1999). Después de la confirmación de

los resultados previamente mencionados, se observó que la eficiencia de la expresión de

IL-2R? era mayor en células mantenidas en FCS que en las mantenidas con hemolinfa. La

mayor expresión se detectó después de tres días de cultivo disminuyendo a los siete días

de mantenimiento en el mismo (figuras 28 y 29). El estudio del cultivo por citometría de

flujo, reveló que sólo las células SH expresan la cadena ? del receptor de IL-2 y que tanto

el LPS como la IL-2 inducen la sobreexpresión de esta subunidad (figuras 32, 38, 104 y

109). Estos resultados fueron similares a los obtenidos en extractos de células frescas

(Barcia, R. et al., 1999).

Algunos autores sugieren que diferentes citoquinas compartirían un receptor

universal el cual actuaría generando respuestas en hemocitos, de tal manera que estas

células desarrollarían una función parecida a la del eje hipotálamo/pituitaria/adrenal de los

vertebrados (Ottaviani, E. y Franceschi, C., 1996; Ottaviani, E. et al., 1997). Sin embargo

una hipótesis posterior sugiere la existencia de receptores específicos para cada citoquina

(Ottaviani, E. et al., 1998). Trabajos realizados en nuestro laboratorio han permitido

detectar la presencia de un receptor para IL-2 exclusivamente en las células SH. Este

receptor es similar estructuralmente al de las células de vertebrados, está constituído por

tres subunidades (? , ? , ?) cuyas masas moleculares son del mismo orden de magnitud que

las encontradas en vertebrados (Barcia, R. et al., 1999).

En vertebrados, las células T son capaces de expresar la cadena ? del receptor de

IL-2 individualmente, sin formar parte del receptor; además las cadenas ? y ? son

constitutivas en células de ratón y humanas, y comunes a otros receptores, tales como los

correspondientes a IL-15, IL-4 o IL-7 (Cao, X. et al., 1993; Takeshita, T. et al., 1992). Por

estos motivos se estudió la expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2 en hemocitos

incubados con diversos efectores en diferentes épocas del año.

Frecuentemente, se comparan los hemocitos de moluscos con macrófagos de

vertebrados, ya que actúan de manera similar. En este sentido, LPS induce en hemocitos de

M. edulis la síntesis de TNF-? e IL-1, citoquinas que provocan movilización celular,

síntesis de NO y producción de aminas biógenas (Ottaviani, E. et al., 1995b).

Como se muestran en las tablas 22 y 23, la incubación de los hemocitos con

diversos efectores en diferentes épocas del año induce un incremento significativo en la

expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2, siendo el EGF en invierno el inductor

que provoca un menor grado de estimulación, mientras que el LPS provoca un mayor

incremento en la concentración de esta subunidad.

EFECTORES

CONTROL

INVIERNO

P

LPS 28,55 ? 0,04 100 ? 0,12 ***

CRF ACTH

68,68 ? 0,12 58,01 ? 0,07

88,42 ? 0,06 82,20 ? 0,05

*** ***

ACTH1-24 42,26 ? 0,13 68,46 ? 0,10 *** PDGF TGF-?1 EGF IL-2

68,68 ? 0,12 42,26 ? 0,15 68,68 ? 0,12 41,21 ? 0,13

78,45 ? 0,7 89,65 ? 0,08 70,93 ? 0,13 49,77 ? 0,10

*** *** ** ***

Sin embargo, los efectores que inducen un incremento menos significativo en la

expresión de la cadena ? del receptor de IL-2 durante el período estival, son CRF, ACTH y

PDGF, siendo la IL-2 el que induce una mayor expresión de dicha subunidad en esta época

del año.

Tabla 22 .- Porcentaje de activación de células SH de M. galloprovincialis activadas por diferentes efectores en invierno. Se reflejan los valores promedios ? error estándard de seis ensayos (P: probabilidad; ***p? 0,001; ** p? 0,01).

EFECTORES

CONTROL

VERANO

P

LPS 19,85 ? 0,11 30,97 ? 0,25 ***

CRF ACTH

30,55 ? 0,14 38,56 ? 0,09

37,24 ? 0,20 42,26 ? 0,13

** **

ACTH1-24 24,81 ? 0,15 36,03 ? 0,15 *** PDGF TGF-?1 EGF IL-2

27,35 ? 0,08 23,13 ? 0,05 23,85 ? 0,08 37,31 ? 0,10

29,83 ? 0,11 34,38 ? 0,07 33,63 ? 0,03 47,30 ? 0,07

** *** *** ***

Además, como se observa en la tabla 24, al comparar el porcentaje de células que

expresan IL-2R? en diferentes períodos del año se detecta un incremento significativo en

la expresión de dicha subunidad en invierno, con respecto al período estival, siendo este

incremento menos significativo en el caso de la IL-2, mientras que el LPS es el agente que

induce un mayor incremento en la concentración de la cadena ? del receptor de IL-2. Estos

valores en la expresión de IL-2R? son más bajos en verano, que en invierno, hecho que

puede estar relacionado con el ciclo gametogénico.

Tabla 23 .- Porcentaje de activación de células SH de M. galloprovincialis activadas por diferentes efectores en verano. Se reflejan los valores promedios ? error estándard de seis ensayos (P: probabilidad; ***p? 0,001; ** p? 0,01).

EFECTORES

INVIERNO

VERANO

P

LPS 100 ? 0,12 30,97 ? 0,25 ***

CRF ACTH

88,42 ? 0,06 82,20 ? 0,05

37,24 ? 0,20 42,26 ? 0,13

*** ***

ACTH1-24 68,46 ? 0,10 36,03 ? 0,15 *** PDGF TGF-?1 EGF IL-2

78,45 ? 0,07 89,65 ? 0,08 70,93 ? 0,13 49,77 ? 0,10

29,83 ? 0,11 34,84 ? 0,07 33,62 ? 0,03 47,30 ? 0,07

*** *** *** **

En los meses de verano, la actividad metabólica del mejillón M. galloprovincialis

es más baja, estas variaciones podrían ser resultado de cambios en las condiciones

medioambientales o en la movilización de reservas de carbohidratos (Robledo, J.A.F. et

al., 1995).

El tipo y el número de hemocitos de M. galloprovincialis se ven influenciados por

factores estacionales (Feng, S.Y.,1965). Fue este autor quien relató que el número de

hemocitos presentes en Crassostrea virginica está influenciado por la cantidad de alimento

y la temperatura. Si la temperatura y la disponibilidad de alimento estaban directamente

relacionados con la densidad de hemocitos, los niveles más altos deberían de observarse en

Tabla 24.- Porcentaje de activación de células SH de M. galloprovincialis activadas por diversos efectores en diferentes épocas del año. Se reflejan los valores promedios ? error estándard de seis ensayos (P: probabilidad; ***p? 0,001; ** p? 0,01).

octubre. Santarém, M.M. et al., (1994) detectan que los niveles de hemocitos en julio son

muy bajos, sugiriendo que la combinación de una concentración alimentaria baja junto con

el período de desove podría contribuir a una menor circulación de hemocitos (Santarém,

M.M. et al., 1994).

Por otra parte, al analizar por citometría la expresión de IL-2R? en hemocitos

estimulados con diversos efectores a diferentes tiempos, se observa que en el período

estival la respuesta tiene lugar después de períodos de incubación del orden de 3 a 30

minutos, mientras que en invierno la respuesta (en general) se produce después de períodos

más cortos de estimulación (figuras 32, 38, 43, 48, 53, 58, 63, 68, 73, 79, 84, 89, 94, 99,

104 y 109). Además, por western blotting no se detectan cambios en la expresión de la

cadena ? del receptor de IL-2, esto puede ser debido a que la proteína se encuentre en una

concentración tan baja que no nos permita su detección, o a una baja especificidad del

anticuerpo o bien a alguna alteración de la proteína que no permita la unión del anticuerpo,

impidiendo la detección de la señal (figuras 31, 37, 42, 47, 52, 57, 62, 67, 72, 78, 83, 88,

93, 98, 103 y 108).

A pesar de que la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) es una proteína

quinasa muy estudiada, existe actualmente muy poca información acerca de la estructura y

funcionamiento de esta enzima en organismos diferentes a los mamíferos. Particularmente

en moluscos bivalvos, aunque se ha demostrado la implicación de procesos de

fosforilación dependientes de AMPc en la regulación de diferentes enzimas (Vázquez-

Illanes, M.D. y Ramos-Martínez. J.I., 1991; Fernández, M. et al., 1994; Michaelidis, B. y

Storey, K.B., 1990, 1991) existe un total desconocimiento, no sólo acerca de las señales

externas que originan estos procesos sino también de los mecanismos implicados en la

transmisión de estas señales al interior de la célula (Cao, J., 1996).

En este trabajo se ha estudiado la expresión de la subunidad reguladora de la PKA

en hemocitos de mejillón estimulados con diversos efectores en diferentes épocas del año,

observándose que ningún inductor de los ensayados provoca cambios en la expresión de

esta subunidad de 54 kDa.

En todos los casos, la concentración de esta subunidad es mayor en el citosol que en

la membrana, y en el caso de hemocitos estimulados con TGF-? 1 durante el período

invernal la subunidad reguladora de la PKA sólo se expresa en el citosol (figuras 33, 39,

44, 49, 54, 59, 64, 69, 74, 80, 85, 90, 95, 100, 105 y 110). Esto puede ser debido a la

distribución de la proteína quinasa dependiente de AMPc dentro de la célula. Se sabe que la

PKA que posee como subunidad reguladora RII (? y ? ) se encuentra fundamentalmente

asociada a la membrana plasmática, a componentes del citoesqueleto, a glándulas

secretoras, al aparato de golgi, centrosomas y posiblemente también al núcleo celular (De

Camilli, P. et al., 1986; Jahnsen, T. et al., 1986a, 1986b; Scott, J.D. et al., 1987; Pariset, C.

et al., 1989; Joachim. S. y Schwoch, G., 1990; Ndubuka, C. et al., 1993) aunque también

se puede encontrar, soluble en el citosol.

En relación a los caminos de transducción de señales se ha observado que tanto la

IL-1? como el TNF-? pueden activar la PKA via adenilato ciclasa (Dinarello, C., 1991;

Vilcek, J. y Lee, T.H., 1991).

La proteína quinasa C es reconocida como una familia de serina/treonina quinasas

que ha sido identificada como el receptor celular para el lípido DAG, es una enzima que

fosforila una amplia variedad de sustratos celulares y es clave en los mecanismos de

transducción de señales, involucrados en la activación de receptores acoplados a

fosfolipasas (Chauhan, V. et al., 1990; Khan, W. et al., 1995; Ron, D. y Kazanietz, M.,

1999).

Por este motivo, se estudió la expresión de la PKC en hemocitos de mejillón

estimulados con diversos efectores en diferentes épocas del año.

El análisis de la PKC de mejillón, evidenció una característica, que comparte con

otras nPKCs descritas en mamíferos, PKC? (Davidson, L. et al., 1994), PKC?

(Leibersperger, M. et al., 1991) y PKC? (Zang, R. et al., 1994). Estas isoformas dan lugar

a una doble banda, detectada mediante western blotting, que es habitualmente un indicador

de un estado diferencial de fosforilación, detectable en extractos crudos de tejidos

(Mercado, L., 2001).

Durante el estudio de esta enzima, se observa que en el período invernal, LPS,

ACTH, ACTH 1-24, PDGF, TGF-? 1 y EGF (figuras 34, 55, 65, 75, 86 y 96) no provocan

cambios en la presencia de la PKC en la fracción citosólica, mientras que en la membrana

desaparece, es decir, estos efectores bloquean la translocación de la enzima a la membrana.

Por otra parte, en hemocitos estimulados con CRF e IL-2 (figuras 45 y 106), se observa

una desaparición después de 30 segundos de incubación y una clara translocación a los 30

minutos de incubar las células con dichos efectores, a diferencia de lo observado por Lu,

Y. y Durkin, P.J. (1997), los cuales investigando el papel de la PKC en la transducción de

señales mediadas por IL-2 en células T, llegaron a la conclusión de que la estimulación con

este efector no conduce a una translocación de la enzima a la membrana. Sin embargo, en

hemocitos estimulados con LPS y ACTH 1-24 durante el período estival (figuras 40 y 70),

se observa que estos efectores a los 30 segundos bloquean la translocación de la enzima,

mientras que a los 30 minutos de incubación la proteína no se encuentra presente ni en el

citosol, ni en la membrana, posiblemente debido a la degradación de la misma (down

regulation), a diferencia de lo que ocurre con estos efectores en invierno, en donde no se

detectan cambios en la presencia de la PKC en el citosol.

No obstante, en hemocitos estimulados en la época de verano con CRF no se

observan cambios en la presencia de la proteína quinasa C en el citosol, sin embargo este

efector induce una disminución de la concentración de la enzima en la membrana (figura

50), mientras que en invierno este inductor provoca la translocación a la membrana

(figura 45). Al incubar los hemocitos con ACTH en el período estival, la expresión de la

PKC disminuye en función del tiempo de incubación, además este efector induce a los 30

minutos la translocación de la enzima a la membrana en contraste con el período invernal

caracterizado principalmente por la ausencia de la PKC en la membrana (figuras 60 y 55).

Por otra parte, en verano, el PDGF bloquea la expresión de la PKC, sin embargo en

invierno este efector no provoca cambios en la presencia de la enzima en el citosol (figura

81 y 75).

En relación al TGF-? 1, este efector en el período estival, no induce cambios en la

expresión de la PKC, a diferencia de lo que ocurre en el período invernal caracterizado por

la ausencia de la enzima en la membrana (figura 91 y 86). En hemocitos estimulados con

EGF en verano, se observa que este efector induce una translocación de la enzima a la

membrana después de un período de incubación de 30 minutos, mientras que en invierno,

este efector bloquea la translocación (figura 101 y 96).

Sin embargo, en el caso de la IL-2, este inductor, en el período estival, no provoca

cambios en la presencia de la PKC en la fracción citosólica, mientras que en la membrana

desaparece, después de 30 minutos de incubación con dicho efector (figuras 111 y 106).

En la hemolinfa de moluscos terrestres (V. ater y P. corneus) e invertebrados

marinos (Hughes, T. et al., 1990; Stefano, G.B. et al., 1989) se detectó la presencia de IL-1

y TNF-? . Estas moléculas parecen activar a los hemocitos induciendo un aumento de la

motilidad y superficie celular e incrementando la síntesis de aminas biógenas (Morgan,

D.A. et al., 1976). La IL-2 modula la actividad asesina de los hemocitos (Franceschi, C. et

al. 1991), y junto con IL-1? y ? y TNF-? y ? está implicada en la liberación de aminas

biógenas, un fenómeno considerado como un tipo ancestral de respuesta al estrés

(Ottaviani, E. et al., 1991; 1992; 1994b; 1995a).

En vertebrados la IL-2 desempeña un papel fundamental en la proliferación de las

células T al unirse a un receptor específico que se expresa en la superficie celular (Smith,

K.A., 1988). Además la IL-2 modula las funciones inmunológicas de células T, B y NK

(Waldman, T.A., 1989) con lo que podemos concluir que desempeña un papel fundamental

en la fisiología del sistema inmune. En invertebrados, la IL-2 induce activaciones en

células de la hemolinfa, aunque las activaciones son menos potentes que las inducidas por

IL-1 o CRF (Hughes, T. et al., 1991b), ésto es particularmente notorio en el caso de la

síntesis de aminas biógenas promovidas por citoquinas.

Se ha observado en hemocitos de mejillón M. galloprovincialis, un incremento en

la producción de catecolaminas (Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina) después de la

incubación de estas células con LPS, PDGF, ACTH 1-24, ACTH, IL-2, TGF-? 1 y CRF en

diferentes épocas del año.

Durante el período invernal (figura 112), se ha observado un incremento en la

liberación de Dopamina a los 30 minutos de incubación con LPS, PDGF, ACTH, TGF-? 1

y CRF. En el caso de la Adrenalina, el incremento se detecta a los 60 minutos de

incubación con LPS, ACTH e IL-2, mientras que en el caso de hemocitos estimulados con

TGF-? 1 y CRF la mayor liberación tiene lugar después de 30 minutos de incubación con

dichos efectores. Sin embargo los inductores que provocan una mayor liberación de

Nordrenalina a los 30 minutos de incubación son LPS, PDGF y ACTH mientras que

ACTH 1-24 y TGF-? 1 provocan una liberación a los 60 minutos. Por lo tanto, en

hemocitos de M. galloprovincialis el CRF provoca la liberación de las tres catecolaminas

analizadas, mientras que ACTH 1-24 sólo induce la liberación de Noradrenalina. Estos

resultados difieren de lo observado por Ottaviani. E. et al., (1992) en P. corneus en donde

ambos efectores inducen la liberación de Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina.

No obstante, durante el período estival, (figura 113) se ha observado en hemocitos

de M. galloprovincialis un incremento en la liberación de Dopamina a los 60 minutos de

incubación con LPS y TGF-? 1, mientras que en hemocitos estimulados con PDGF y

Figura 112.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con diferentes efectores en invierno. A: 30 minutos. B: 60 minutos.

ACTH la mayor liberación tiene lugar después de 30 minutos de incubación con dichos

efectores.

.

En el caso de la Adrenalina, este incremento se detecta a los 60 minutos de

incubación con LPS y TGF-? 1, mientras que en el caso de hemocitos estimulados con

PDGF y ACTH la mayor liberación tiene lugar después de 30 minutos de incubación. Sin

Figura 113.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con diferentes efectores en verano. A: 30 minutos. B: 60 minutos.

embargo, los inductores que provocan una mayor liberación de noradrenalina a los 60

minutos de incubación son LPS e IL-2 mientras que el PDGF, ACTH y TGF-? 1 provocan

un mayor incremento a los 30 minutos.

Por lo tanto, estos resultados sugieren una mayor concentración de catecolaminas

liberadas al medio después de la incubación con diferentes efectores en el período invernal

resultados similares a los obtenidos en Crassostrea virginica (Osada, M. y Nomura, T.,

1989), excepto en el caso de hemocitos estimulados con TGF-? 1, en donde la mayor

liberación de Dopamina y Adrenalina tiene lugar durante el período estival. En el caso de

la vieira los niveles de Dopamina decrecen durante el período de desove mientras que la

Noradrenalina no muestra cambios (Osada, M. et al., 1987). Se sabe que la temperatura y

el fotoperíodo provocan variaciones estacionales en los niveles de monoaminas (Le Bras,

Y.M., 1984) y que en M. edulis los niveles de Dopamina y Noradrenalina son más bajos

durante los meses de invierno que en verano (Stefano, G.B. y Catapane, E.J., 1980).

Estas diferencias en las concentraciones de catecolaminas pueden estar relacionadas

con el ciclo gametogénico. Osada, M y Nomura, T. (1989) y Paulet, Y.M. et al.,(1993) han

encontrado cambios en los niveles de catecolaminas relacionados con la actividad

reproductiva asociada a la época del año. Además en M. galloprovincialis la concentración

de Adrenalina en el período invernal, es menor que la de Dopamina y Noradrenalina,

resultados similares a los observados en Helicella pomatica y H. virgata (Ottaviani, E. et

al., 1992).

Con el fin de analizar los posibles mecanismos de internalización de la señal, se ha

estudiado la presencia de catecolaminas (Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina) después

de incubar los hemocitos con LPS, PDGF e IL-2 y diferentes inhibidores

(Bisindolilmaleimida I, H-89 y Suramin), así como la expresión de la PKC en células

estimuladas con los efectores anteriormente mencionados y puestas en contacto con

Bisindolilmaleimida I, un inhibidor de la PKC.

Durante el estudio de esta enzima, se observa que LPS y PDGF no provocan

cambios en la presencia de la PKC en la fracción citosólica, mientras que en la membrana

desaparece, es decir, estos efectores parecen boquear la translocación de la enzima a la

membrana (figura 34 y 75).

Por otra parte, en células estimuladas con los efectores anteriores, e incubadas con

Bisindolilmaleimida I, se observa que el efecto provocado por LPS y PDGF desaparece, es

decir, la acción de estos efectores queda bloqueada por el inhibidor de la PKC, teniendo

lugar la translocación de la enzima a la membrana (figura 35 y 76). La dinámica del

tráfico de la proteína quinasa C por la membrana plasmática en respuesta a la activación de

receptores de superficie celular ocurre en tres pasos: la translocación a la membrana, el

anclaje y la disociación (Quest, A., 1996; Newton, A. y Jhonson, J., 1998), por lo tanto los

resultados sugieren que el inhibidor de la PKC además de bloquear la acción del LPS y

PDGF impide la disociación de la PKC de la membrana.

Por otra parte, en hemocitos estimulados con IL-2, se observa una desaparición de

la PKC en la membrana después de 30 segundos de incubación y una clara translocación a

los 30 minutos de incubar las células con dicho efector (figura 106).

Como consecuencia de la activación de la PKC se desencadenan una serie de

respuestas entre las que se ha estudiado la liberación de catecolaminas ya que actúan como

mediadoras en una amplia variedad de funciones metabólicas e inmunoreguladoras

(Collins, J.L. et al., 2001).

Las células estimuladas con LPS y tratadas con inhibidores de PKC, PKA y

proteínas G pierden la capacidad de liberar catecolaminas, por lo tanto, los resultados

sugieren que la proteína quinasa C, la proteína quinasa A y las proteínas G parecen estar

implicadas en la liberación de catecolaminas inducida por LPS (tabla 7). Además cuando

las células son estimuladas con PDGF se observa una liberación de Dopamina y

Noradrenalina cuyas concentraciones disminuyen al tratar las células con BSM, H-89 y

Suramin, llegando a la conclusión de que también la PKC, PKA y las proteínas G se hallan

implicadas en este tipo de respuesta inducida por PDGF. Sin embargo, este efector no

induce la liberación de Adrenalina (tabla 15).

No obstante, en células estimuladas con IL-2 se observa una liberación de

Adrenalina que decrece al tratar los hemocitos con BSM, H-89 y Suramin, lo que nos

sugiere una implicación de la proteína quinasa C, proteína quinasa A y proteínas G en la

liberación de Adrenalina. Sin embargo, este efector no induce la liberación de Dopamina.

En relación a la liberación de Noradrenalina se observa una disminución en la

concentración de esta catecolamina después de incubar los hemocitos con IL-2 e

inhibidores de la PKA y proteínas G, lo que nos sugiere una implicación de estas proteínas

en la liberación de Noradrenalina inducida por esta citoquina (figura 20).

Una misma citoquina puede dar lugar a diferentes respuestas (pleitropicidad),

dependiendo del tipo y del estado de desarrollo de la célula blanco (Arai, K. et al., 1990).

En hemocitos de M. galloprovincialis los resultados sugieren que cada citoquina

interacciona con un receptor específico generando diversas respuestas. Igualmente,

diferentes citoquinas mediante diferentes efectores dan lugar a aparentemente idénticas

respuestas biológicas (redundancia), circunstancia que también se observa en hemocitos de

mejillón. Parece ser, por tanto, que las citoquinas son moléculas funcionalmente

conservadas, que durante el proceso evolutivo han mantenido su pleiotropicidad, su

redundancia en el modo de acción y una alta promiscuidad de sus receptores, resultado

compartido con Ottaviani. E. et al., (1995b).

CONCLUSIONES

6.- CONCLUSIONES

1.- En la fracción particulada de la hemolinfa del mejillón M. galloprovincialis

Lmk., se han identificado dos tipos de células (hemocitos) bien diferenciadas, unas (células

RH) son redondeadas con un núcleo muy grande en relación al tamaño celular y las otras

(células SH) tienen un citoplasma mucho más expandido.

2.- Sólo las células SH expresan la cadena ? del receptor de IL-2.

3.-La incubación de los hemocitos con los diferentes efectores induce un aumento

en la expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2 en la membrana celular.

4.- El efecto de diversos inductores se muestra variable a lo largo del año,

detectándose cambios en la expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2, en la

expresión de la proteína quinasa C, así como en la liberación de diferentes catecolaminas

(Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina).

4.-En hemocitos de M. galloprovincialis las citoquinas presentan las mismas

características de mamíferos: pleitropicidad, redundancia en el modo de acción y

promiscuidad del receptor.

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ABREVIATURAS

8.- ABREVIATURAS

AA ácido araquidónico

AC adenilato ciclasa

ACTH hormona adrenocorticotrópica

ACTH 1-24 fragmento de ACTH comprendido entre los aminoácidos 1 y 24

ADN ácido desoxirribonucleico

ALS solución antiagregante de Alsever

AMPc adenosina-3'-5'-monofosfato cíclico

BSA seroalbúmina bovina

BSM bisindolilmaleimida I

C citosol

CA catecolaminas

CD complejo diferenciado

COMT catecol-O-metiltransferasa

COX-2 ciclooxigenasa 2

cpm cuentas por minuto

CRF factor liberador de corticotropinas

CSFs factores estimulantes de colonias

DAG diacilglicerol

DCs células dendríticas

EDTA ácido etileno diamino tetraacético

EGF factor de crecimiento epidérmico

EGTA ácido etileno glicol tetraacético

Epo eritropoyetina

ERK proteínas quinasas reguladas por señales extracelulares

FCS suero fetal de ternero

FGF factor de crecimiento de fibroblastos

FS dispersión frontal

G-CSF factores estimulantes de colonias de granulocitos

GDP guanosín 5'-difosfato

GlcN glucosamina

GM-CSF factores estimulantes de colonias de granulocitos-macrófagos

GR/FL fluorescencia verde

GTP guanosín 5'-trifosfato

Hep D-glicero-mano-heptosa

Hepes ácido 4-(2-hidroxietileno)-1- piperazina-etano sulfónico

IFN interferón

IL interleuquina

IL-R receptor de interleuquinas

IP3 inositol 1,4,5-trifosfato

IRAK receptor de interleuquina-1 asociado a quinasas

JAKs quinasas Janus

Kd constante de disociación

kDa kilodalton

Kdo ácido 2-ceto-3-deoxioctulosónico

L-15 medio de cultivo Leibovitz 15

LBP proteína que se une al LPS

LIF factor inhibidor de leucemia

LPS lipopolisacárido

LRR regiones repetitivas ricas en leucina

M membrana

MA marcadores de peso molecular

MAPK proteínas quinasas activadas por mitógenos

mCD complejo diferenciado de membrana

M-CSF factor de crecimiento de cultivos de macrófagos

MES ácido 2-[n-Morfolino] etanesulfónico

MHC complejo mayor de histocompatibilidad

MKP-1 MAPK fosfatasa-1

ND no detectado

NK células agresoras naturales

NOS óxido nítrico sintetasa

OR/FL fluorescencia naranja

P probabilidad

PAMPs patrones moleculares asociados a patógenos

PDE fosfodiesterasa

PDGF factor de crecimiento derivado de plaquetas

PGE2 prostaglandina E2

PI fosfoinositol

PIAS proteínas inhibidoras de STAT activadas

PIP fosfatidilinositol 4-fosfato

PIP2 fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato

PKA proteína quinasa A

PKC proteína quinasa C

PLA2 fosfolipasa A2

PLC fosfolipasa C

PMA forbol 12-miristoato 13-acetato

POMC pro-opiomelanocorticoides

PRR patrón de reconocimiento de receptores

PS fosfatidil serina

PTK proteínas tirosina quinasas

RH hemocitos redondos

RNA ácido ribonucleico

SAM S-adenosil-metionina

SDS dodecil sulfato sódico

SDS-Page electoforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS

SH hemocitos expandidos

SHP tirosina fosfatasa

SS dispersión lateral

SSF factor de estrella de mar

TBS tampón tris salino

TEMED tetrametiletilendiamina

TGF factor de crecimiento transformante

TNF factor de necrosis tumoral

TRL receptor Toll

TTBS tampón tris salino tween