Aragón, Carolina; Sobisch , Leonardo; Zambrano, Karen.
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OPTIMAZACIÓN DE LA REACCIÓN DE PCR en sangre periférica y deyecciones de triatominos en pacientes chagácicos.
Aragón, Carolina; Sobisch, Leonardo; Zambrano, Karen.Estudios Interdiciplinarios de la Enfermendad de Chagas.Año 2012.UNSL – FQByF.
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INTRODUCCIÓN
El presente estudio fue realizado en Chile.
Las regiones rurales y periurbanas de la III y IV región son hiperendémicas.
Se estima que hay 150000 individuos afectados.(2005)
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Ubicación Geográfica.
En la imagen se muestran las regiones del país de Chile
Regiones Hiperendémicas ( III y IV)
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En Chile existen 3 vectores: -Triatoma infestans - Mepraia spinolai
(autoctono de Chile) - Mepraia gajardoi
La transmisión vertical es el mecanismo mas importante.
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Pacientes en fase crónica
Se orienta a la pesquisa la detección de Ac específicos mediantes técnicas serológicas convencionales( ELISA, IFI) métodos de alta sensibilidad y especificidad.
Para el diagnostico parasitológico, las herramientas mas utilizadas son:
- Xenodiagnóstico XD- Reacción en cadena de la polimerasa
PCR
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PCR
Se utiliza para el diagnostico y en el seguimiento de individuos tratados.
Acelera la detección del parasito en pacientes de fase crónica.
Es una herramienta complementaria al XD, dada la capacidad del mismo de amplificar a T. cruzi al actuar como medio de cultivo biológico.
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OBJETIVO DEL ESTUDIO
Evaluar el diagnostico parasitológico en pacientes chagásicos crónicos mediante PCR en sangre periférica y deyecciones de Triatominos alimentados mediante XD en pacientes chagácicos crónicos, según técnicas de extracción y purificación del DNA.
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Materiales y Metodos utilizados
POBLACION: 50 pacientes en fase crónica de la IV región de Chile.
Se determina infección por T. cruzi mediante:
-IFI: con un titulo igual o superior a 1/20.
-ELISA: con D.O mayor o igual a 0,20. OBTECIÓN MUESTRA DE SANGRE:
2ml de sangre venosa con igual volumen de sc guanidina-HCl 6M y EDTA 0,2M.
Se incuba la sangre a 98 °C durante 15 min.
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XENODIAGNÓSTICO: esto se realiza de forma paralela a la toma de muestra de sangre.
Se preparó pool con las deyecciones obtenidas de cada período de incubación para la reacción de PCR-XD.
SE OBUVIERON DOS GRUPOS:1. 25 personas XD (+)2. 25 personas XD (-)
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Método de extracción y/o purificación de las muestras de sangre periférica.
Extracción con fenol-cloroformo (Caso 1).
Extracción con fenol-cloroformo y purificación con Sephadex (Caso 2).
Extracción y purificación con solución de CHOMEZYNSKI con fenol (Caso 3).
Extracción y purificación con el Kit comercial Jetquick Blood DNA purification (Caso 4).
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Métodos y purificación de las muestras de deyecciones.
Purificación con Sephadex G 25 (Caso 5).
Extracción y purificación con la solución de CHOMEZYNSKI con fenol (Caso 6).
Purificación con el Kit comercial Jetquick Blood DNA purification (Caso 7).
Verificación y presencia de DNA por espectofotometría.
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Reacción PCR
Mix PCR1. Primers Oligonucleótidos
Kinetoplastídicos 121 y 122: 3 µl (10 µM)
2. Buffer Taq Polimerasa: 4 ml3. MgCl2: 2 µl (2mM)4. 4 desoxiNTP: 0.4 µl (10mM)5. Taq Polimerasa: 0.2 µl (1U)6. H2O destilada: 2.4 µl
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Etapas de PCR
Desnaturalización a 98°C durante 1 min.
Hibridación 64°C por 1 min. Extención a 72°C por 2 min.
Se realizaron 33 ciclos intermediarios.
10 µl del amplificado se sometieron a ELECTROFORÉSIS.
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Resultados.
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Muestras de sangre periférica:
1. Caso 1: XD (-) evidencia que existen niveles indetectables de parásitos en el 96% de los casos. XD (+) el 76 % de los casos no se detectan T. cruzi mediante PCR.
2. Caso 2: XD (-) aumenta el 16 % de la detección de T. cruzi en las muestras. XD (+) no hay variaciones en el rendimiento.
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Caso 3: XD (+) tuvo mejor rendimiento en un 24 % con respecto a los dos métodos anteriores.
Caso 4: XD (-) es más eficaz, evidenciando parásitos en el 76 % de los casos. XD (+) evidencia parásitos en el 40% de los casos.
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Muestras de deyecciones:
Caso 5: XD (+) el rendimiento fue bajo.
Caso 6: resultados similares al anterior.
Caso 7: XD (-) se detectó parásitos en el 84% de los casos. XD (+) detecta parásitos en el 96% de los casos.
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Conclusión.
En relación a las extracción, es mejor trabajar con el Kit comercial, ya que proporciona mayor especificidad tanto en muestras de sangre como en deyecciones.
En cuanto a la elección del tipo de muestra, es óptimo trabajar con deyecciones ya que el Triatoma infestans actúa como medio de cultivo biológico, además, el ADN obtenido es de mayor calidad.
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Es crucial la cantidad de muestra a amplificar, debido a que contribuye a la optimización de la técnica.
En pacientes crónicos la parasitemia es baja y oscilante, en los casos negativos un factor a considerar puede ser el volumen de sangre tomado, y es por esto que la PCR es una herramienta eficaz en la detección de T. cruzi.
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Muchas Gracias…