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³DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL AGENTE CAUSAL DE TIZÓNFOLIAR EN TECA (Tectona grandis L. f.), EN HUIMANGUILLO, TABASCO´

Oscar Hernández Colula

ResumenSe realizo la identificación del agente causal del tizón foliar en plantas de teca ( Tectona

grandis) para el vivero del conjunto predial ³Los Halcones´ propiedad de la empresa de

plantaciones forestales comerciales MADPREVER S.A., localizado en el municipio de

Huimanguillo, Tabasco. En el vivero se seleccionaron plantas enfermas para ser trasladadas

al laboratorio de Patología Forestal de la División de Ciencias Forestales en la Universidad

Autónoma Chapingo para proceder a su análisis.

En el laboratorio se efectuaron los aislamientos para obtener los patógenos asociados a esta

enfermedad, se realizaron cortes de 1 cm cuadrado con tejido sano y enfermo, se sembraron

en medios de cultivo de PDA (Papa Dextrosa Agar ), se obtuvieron las cepas puras y se

dejaron a luz para su esporulación y posteriormente proceder a la identificación. La cepa

obtenida se identificó como Curvularia pallescens. En el caso del aislamiento para

bacterias se colocaron pedazos de follaje enfermo en tubos de ensaye con agua estéril y se

realizó el rallado en cajas con medio de PDA, también se aisló bacteria de semillas de Teca

puestas a germinar. Posteriormente se purifico la bacteria y se sometió a la prueba de PCR,los resultados se mandaron a secuenciar, con la que se determino que se trataba de

Ralstonia solanacearum en el caso de follaje y de Pseudomona sp para la obtenida de

semilla.

Se realizaron pruebas de patogenicidad empleando a C. pallescens y R. solanacearum, bajo

los siguientes tratamientos: T1 (Hongo), T2 (Bacteria), T3 (Bacteria-Hongo), T4 (Testigo).

Se contabilizaron los días transcurridos desde la inoculación hasta la presencia del primer

síntoma, los resultados fueron analizados con el programa SAS bajo el diseño experimentalaleatorio con las pruebas de Tukey y Duncan se concluyo que ambos agentes son

patógenos, la diferencia radica en la severidad de los daños y el tiempo en el que se

presentan los síntomas en las plantas, ya que C. pallescens ataca más rápido pero los daños

no son tan significativos como en el caso del complejo Hongo-bacteria.



Palabras clave: Curvularia pallescens, Pseudomona sp, Ralstonia solanacearum, Teca,

Tizón foliar,

Introducción

A la fecha el establecimiento de plantaciones en las zonas tropicales de nuestro país va enconsiderable aumento con especies como: Cedro, Caoba, Teca, Eucalipto, Gmelina, Hule,

Roble, entre otros, esto debido principalmente a su topografía, la cual le brinda a México un

carácter preferentemente forestal.

Dentro de estas especies, la Teca (Tectona grandis) originaria de la India y del Asia

sudoriental es una de las que más aceptación a tenido para el establecimiento de

plantaciones forestales comerciales en las zonas tropicales de nuestro país (México forestal,

revista electrónica), es la tercera especie en importancia en las plantaciones forestales

comerciales de México con un total de 130 proyectos ubicados en los estados de

Campeche, Chiapas, Nayarit, Tabasco y Veracruz, los cuales abarcaban una superficie total

de 34,700 ha hasta el año 2007 según datos de la CONAFOR, promovidos y apoyados por

ProÁrbol.

Sin embargo como en todo cultivo las plantaciones presentan problemas ocasionados por

plagas y enfermedades y la Teca no es la excepción, algunos de los problemas más

comunes que pueden presentarse en teca son los siguientes; Quema de los brotes

( Phomopsis sp.), Malla de la Teca ( Pseudomonas), El esqueletizador ( Hyblaea puera), El

defoliador ( Rabdopterus sp.), El defoliador (Walterianella sp.), Cancro múltiple por

( Botryosphaeria), Cancro nectria ( Nectria nauriticola), Cancro alargado, Corona de agallas

( Agrobacterium tumefaciens), El barrenador de tucas ( Neoclytus cassicus), El comedor de

raíces ( Phyllophaga spp.), Decline de la Teca, (Arguedas).

Los problemas fitosanitarios representan una amenaza para los productores forestales, por

lo que el desarrollo de conocimientos en este dominio y la difusión de los mismos, es

fundamental dentro de la silvicultura de plantaciones, y específicamente para Teca

(Arguedas).



El diagnostico exacto de una enfermedad es el primer paso hacia un control exitoso de los

patógenos (Mendoza, 1993), es por ello que este trabajo tiene la finalidad de identificar los

agentes que ocasionan la enfermedad del tizón foliar en Teca, para lo que se recurrirá a

hacer aislamientos en plantas enfermas y posteriormente inocular los agentes que se

encuentren asociados con la enfermedad.

Materiales y métodos

Para poder realizar la detección del agente causal del tizón se hizo uso del material del

laboratorio de parasitología forestal de la División de Ciencias Forestales de la Universidad

Autónoma Chapingo, el cual consistió de: Agua estéril, Agujas de disección, Asa

bacteriológica, Cajas petri con medio PDA, Campana de flujo laminar, Cúter, Estufa,

Hipoclorito al 1.5%, Matraz, Mecheros, Microscopio, Pinzas, Porta y cubre objetos, Tubosde ensaye.

Del follaje de plantas enfermas se hicieron cortes de 1 cm cuadrado en las partes que

presentaban algunos de los siguientes síntomas: pequeñas manchas blancas, clorosis,

manchas de color café claro y necrosis, Una vez obtenidos los cortes, se dieron tres pasos

de agua destilada estéril, un paso de hipoclorito de sodio al 1.5% durante un minuto y

medio, en seguida se dieron tres pasos de agua destilada estéril y posteriormente se secó el

material vegetal con papel filtro estéril. Esto se realizó bajo la campana de flujo laminar

para tener condiciones asépticas.

El aislamiento de hongos se realizo empleando cajas petri con medio de cultivo PDA (Papa

Dextrosa Agar ), en las que se sembraron sin cortes del material foliar previamente

desinfectado, se sellaron con cinta autoadherible y se dejaron a la luz para su desarrollo,

posteriormente se transfirieron para obtener cepas puras.

Con los cortes de material foliar desinfectados, se elaboraron preparaciones en tubos de

ensaye que contenían agua estéril, introduciendo en ellos la suficiente cantidad de cortes de

follaje como para obtener una solución saturada, se taparon y se dejaron reposar.



Después de 30 minutos de reposo de las preparaciones, se procedió con el rayado con el asa

bacteriológica en cajas petri con medio de cultivo (PDA); se sellaron con cinta

autoadherible y se colocaron dentro de una estufa a una temperatura de 27 ºC para failitar

su desarrollo, se purificaron las colonias obtenidas.

Para la obtención de agentes procedentes de la semilla se pusieron a germinar un total de

150 semillas en el laboratorio de semillas de la división de ciencias forestales, la

temperatura fue de 22 a 27 ºC, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, los riegos se

realizaron cada tres días empleando una solución de clorotalonil al 1 % para evitar la

presencia de hongos.de algunas de ellas se aisló un exudado que brotaba de su interior, fue

sembrado en medio de cultivo PDA y purificado posteriormente.

Con los agentes obtenidos del material foliar se realizaron pruebas de patogenicidad para

las cuales se utilizó el invernadero del área de Parasitología Forestal de la División de

Ciencias Forestales, en el que se alcanzo una temperatura de 25 ºC ± 2ºC por tratarse de

meses fríos, el método de inoculación empleado fue aspersión para el caso de conidios de

hongo con una concentración de ��. y para las colonias de bacteria

fue por unción con palillos de madera esterilizados previamente. Se probaron los siguientes

tratamientos T1 hongo, T2 bacteria, T3 bacteria-hongo y T4 testigo.

Para la prueba de PCR el DNA se extrajo con el protocolo comercial Plant DNAZOL®

(Vitrogen) de dos cepas bacterianas aisladas de hojas y semilla de Tectona grandis. Los

oligonucleótidos para Eubacterias fueron FD1 (5¶-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3¶ y

RD1 (5¶-AAGGAGGTGATCCAGCC-3¶) con un fragmento de 1600 pb. La amplificación

de la reacción DNA se preparó con un volumen final de 25 Ql que contenía: 1x Taq buffer

DNA polymerasa, 200 QM dNTPs, 20 ng DNA, 0.2 QM de cada iniciadores, 1.5 mM

MgCl2, 2U Go Taq polimerasa DNA (Promega, USA). La amplificación se llevó a cabocon una desnaturalización inicial a 97 ºC por 3 min; seguido por 30 ciclos de

desnaturalización con 94 ºC durante 1 min, 55ºC por 30 seg, y 72 ºC por 1 min. Finalmente,

un ciclo de extensión final de 72 ºC durante 7 min. (Rodríguez et al., 2003). Todas las

reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador Multigene Gradient (Mod.

TC9600-9); los productos de PCR se verificaron por electroforesis en gel de agarosa al 1%



y se tiño con bromuro de etidio, la banda se visualizó en un sistema de fotodocumentación

(Gel Logic 200, Kodak ). El producto se secuencio en ambas direcciones (5¶3¶ y 3¶5¶)

en Macrogen (Seoul, Korea). Las secuencias se compararon con las reportadas en la base de

datos del banco de genes del NCBI (National Center for Biotechnology Information;

www.ncbi.nih.gov).

El diseño experimental que se empleo para el análisis de las pruebas de patogenicidad fue

aleatorio y se les aplicaron las pruebas de Tukey y Duncan. Estas pruebas se realizaron

empleando el programa SAS 9.0.

Resultados y discusión

Se determino que los síntomas del tizon foliar inician con un amarillamiento del ápice y delos márgenes de la hoja, posteriormente una necrosis en la misma zona, los cuales coalecen

dando un aspecto papeloso, seguido por la caída de las hojas y muerte de la planta.

El hongo aislado y utilizado en la inoculación fue Curvularia pallescens el cual según

Rocha 1987, se encuentra ampliamente distribuido en las zonas tropicales del mundo y es

un patógeno que ataca exclusivamente las hojas provocando pequeñas lesiones ovales o

circulares de un color paja. Mendoza, 1993, menciona síntomas parecidos a los presentados

en Teca, sin embargo lo hace para plantas de maíz. En México no hay reportes de ataques

de este agente en especies forestales.

La bacteria aislada del follaje se identifico como Ralstonia solanacearum, mediante la

prueba de PCR y correspondiente al biovar cuatro según las pruebas bioquímicas

mencionadas por Denny and Hayward, 2001, esta se encuentra dentro del grupo de

bacterias cuarentenadas para México según la lista de la Dirección General de Sanidad

Vegetal de 1985 que cita Rueda, en el 2002.

Del aislamiento realizado de las semillas, la bacteria encontrada fue Pseudomona sp. sin

embargo no se hicieron pruebas de patogenicidad con esta bacteria.



Después de analizar los resultados de las inoculaciones se determino que no hay diferencia

significativa entre los tratamientos uno, dos y tres por lo que ambos agentes son patógenos

y la diferencia radica en la severidad y el tiempo de ataque ya que el más rápido es el hongo

pero el más severo es el complejo bacteria-hongo. La figura 1, ilustra aspectos importantes

del tizón foliar en teca.

Figura 1. Aspectos importantes encontrados en el tizón foliar de Teca. A Ciclo de la enfermedad de Tizón, B

Cepa de Curvularia pallescens con crecimiento de estromas, C Detalle de estroma, D Detalle de conidio de C.

pallescens, E Pseudomona sp brotando de semilla de Teca, F Colonias de Ralstonia solanacearum aislada de

follaje, G Colonias de Pseudomona sp aislada de semillas de Teca, H Síntomas en planta inoculada con R.

solanacearum..



Conclusiones

La sintomatología presentada por el tizón foliar en Teca inicia con un amarillamiento de los

márgenes de las hojas bajas seguido por una necrosis en la misma zona, las cuales coalecen

y crece la necrosis, dando un aspecto papeloso, posteriormente se da la caída de las hojas

Los síntomas presentes en campo y en las plantas inoculadas corresponden a los reportados

por varios autores para el hongo Curvularia pallescen.

Los síntomas presentados en las plantas inoculadas con Ralstonia solanacearum no

corresponden al cien por ciento con los descritos como característicos para esta enfermedad

ya que hay presencia de necrosis en lugar de marchitamiento en la parte aérea de la planta,

sin embargo también se reporta una pudrición café como síntoma de esta enfermedad elcual pudiese ser el caso de los síntomas presentes en Teca.

La variación de los síntomas reportados con respecto a los presentados en las plantas de

teca puede deberse a las características morfológicas de esta ya que su follaje es mas

coriáceo que el de las plantas que presentan el síntoma de marchites y que son reportadas

como hospedantes de esta enfermedad, ejemplos de estos son la papa, el jitomate y el

plátano en los cuales el contenido de agua es mayor.

La diseminación de la enfermedad en el vivero se ve favorecida con la aplicación de riegos

y con una alta densidad de plantas ya que tanto C. pallescens como R. solanacearum se

transmiten por salpicamiento y para el caso de Ralstonia una vez que se encuentra en el

suelo se puede mantener por largo tiempo y volver a infectar plantas al introducirse por la

raíz de estas.

Es necesario realizar más estudios para poder definir cómo interactúan estos dos agentes

para causar el tizón foliar en Teca.



Literatura citada

y Arguedas, Marcela, Problemas fitosanitarios en Teca (tectona grandis L.f .) en

América Central, Centro de Investigación en Integración Bosque Industria, ITCR,

Costa Rica, www.una.ac.cr/inis/docs/teca/temas/M.pdf.

y CONAFOR. Programa proarbol. http://www.conafor.gob.mx

y Mendoza Zamora, Cecilio. 1993. Diagnostico de enfermedades fungosas, Universidad

Autónoma Chapingo, Departamento de Parasitología Agrícola, Chapingo, México, 168p.

y Revista electrónica de la comisión nacional forestal.

www.mexicoforestal.gob.mx/nuestros_arboles.php?id=27, número 102 del 19 de enero

al 1 de febrero.de 2009.

y Rocha Peña, Mario A. 1987. Descripción de las enfermedades del maíz ( Z ea mays L.)

en el trópico. Taller de fitopatología tropical, segunda edición Centro de Enseñanza

Investigación y Capacitación Agropecuario, Forestal y Acuícola del Sureste

(CEICADES), Colegio de Posgraduados, Chapingo, México, 451 p.

y Rodriguez, J.L.M., M.E.S. Stenico, J.E. Gomes, J.R.S. Lopes, and S.M. Tsai. 2003.

Detection and Diversity Assessment of Xylella fastidiosa in Field-Collected Plant

and Insect Samples by Using 16S rRNA and gyrB Sequences. Applied and

Environmental Microbiology 69: 4249-4255.

y Rueda B, Maria Claudia. 2002. Estandarización de la reacción en cadena depolimerasa (PCR) para la detección de las bacterias cuarentenadas X ylella

fastidiosa Wills et al ., y Ralstonia solanacearum r3. Tesis de Maestría, Universidad

Autónoma Chapingo, Departamento de Parasitología Agrícola, Chapingo, México. 80 p.

y T. P. Denny and A. C. Hayward, 2001. Ralstonia. Laboratory guide for identification

of plant pathogenic bacteria, Thhird Edition, Editores N. W. Schaad, J. B. Jones, and

W. Chun. Fort he bacteriology committee of the American Phytopathological Society.

The American Phytopathological society, Minnesota, 155-168 p.

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